CN107219173A - 一种嗜酸乳杆菌s‑层蛋白分子印迹传感器及其制备方法和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种嗜酸乳杆菌S‑层蛋白分子印迹传感器及其制备方法和应用，所述传感器以二氧化硅为载体，S‑层蛋白为模板分子，甲基丙烯酸为功能单体，二甲基丙烯酸乙二醇酯为交联剂。本发明所述传感器以胶体晶体作为模板得到三维有序孔隙结构，通过分子印迹技术在孔隙结构中得到印迹空腔，保证了对目标分子的高度选择性和灵敏度；所述传感器内部结构相通，促进目标分子在其中扩散并容易到达识别位点，从而提高传感器对目标分子的响应时间，实现目标分子的快速检测和富集。
Description
技术领域
本发明属于材料制备和检测技术领域，涉及嗜酸乳杆菌S-层蛋白的检测和富集技术，具体为一种嗜酸乳杆菌S-层蛋白分子印迹传感器及其制备方法和应用。
背景技术
S-层蛋白是存在于细胞膜或细胞壁外的一种表层蛋白，是一类由蛋白质亚基组成的单层晶体结构，有多种乳酸菌表面存在S-层蛋白。嗜酸乳杆菌是黏附于肠道内的一种功能性益生菌，其表面的S-层蛋白在黏附中起到重要作用，对嗜酸乳杆菌发挥益生功能有重要贡献；S-层蛋白可以和肠上皮细胞表面的受体结合，阻断致病菌与病毒与其结合，因此对致病菌与病毒有一定抑制作用。对S-层蛋白进行快速、有效的检测可推进其进一步的研究。目前对S-层蛋白的检测技术主要有质谱技术、氨基酸组分分析技术等，这些方法成本较高且操作复杂。因此开发一种操作简便、准确快速且高效的检测方法十分重要。
光子晶体是一种介电常数周期性变化排布的材料，由于具有光学带隙的特征，与可见光作用可发生Bragg衍射。分子印迹技术以特定的目标分子为模板，构建能对该分子进行特异性识别的分子印迹聚合物。传统的分子印迹技术用于检测时，多数被检测物需要被修饰或标记，光子晶体分子印迹传感器克服了这一障碍，实现了无标记检测。分子印迹水凝胶与光子晶体结合，形成高度有序的三维孔隙结构，在受到外界环境刺激或与被检测分子结合后，水凝胶会发生收缩或溶胀，导致晶格间的间距减小或增大，从而使Bragg衍射特征峰发生蓝移或红移，使目标分子的状态直接转变为刻度的光学信号。
发明内容
解决的技术问题：为了克服现有技术的缺陷，获得一种简便、快速、高选择性及高灵敏度的嗜酸乳杆菌S-层蛋白的检测、富集方法，本发明提供了一种嗜酸乳杆菌S-层蛋白分子印迹传感器及其制备方法和应用。
技术方案：一种嗜酸乳杆菌S-层蛋白分子印迹传感器，所述传感器以二氧化硅为载体，S-层蛋白为模板分子，甲基丙烯酸为功能单体，二甲基丙烯酸乙二醇酯为交联剂。
一种嗜酸乳杆菌S-层蛋白分子印迹传感器的制备方法，包含以下步骤：
(1)将二氧化硅纳米颗粒分散于无水乙醇中，形成均一稳定的胶体分散体系，然后经垂直沉降将胶体颗粒自组装在基片上，形成三维有序的胶体颗粒阵列，待溶剂完全挥发，得到具有三维有序排列结构的胶体晶体，形成光子晶体薄膜；
(2)将光子晶体薄膜依次进行热处理、羟基化处理、氨基化处理及醛基化反应，然后置于S-层蛋白溶液中，缩合反应实现共价连接；
(3)以甲基丙烯酸为功能单体，二甲基丙烯酸乙二醇酯为交联剂，甲醇为溶剂配制水凝胶预聚液，向预聚液中加入光引发剂，超声混匀后通入氮气排气体系中的氧气；
(4)取步骤(2)制得的覆盖有光子晶体薄膜的基片，在薄膜一边覆盖一层有机玻璃，固定后向缝隙中注入步骤(3)制得的预聚液，充分浸透后、冰浴条件下紫外照射反应；
(5)将步骤(4)处理后的光子晶体薄膜浸泡于氢氟酸中，接着采用蛋白洗涤工艺除去薄膜中的S-层蛋白，即可制得嗜酸乳杆菌S-层蛋白分子印迹传感器。
优选的，步骤(2)中热处理的条件为500℃、1小时。
优选的，步骤(2)中羟基化处理是采用piranha洗液处理12小时。
优选的，步骤(2)中氨基化处理是采用5％APTES的乙醇溶液处理1小时。
优选的，步骤(2)中醛基化反应是与含有5％戊二醛的PBS溶液反应2.5小时。
所述的嗜酸乳杆菌S-层蛋白分子印迹传感器在检测嗜酸乳杆菌S-层蛋白中的应用。
优选的，所述嗜酸乳杆菌S-层蛋白的浓度与Bragg衍射峰的位移呈线性关系。
优选的，所述传感器的响应速度小于3分钟。
所述的嗜酸乳杆菌S-层蛋白分子印迹传感器在嗜酸乳杆菌S-层蛋白富集中的应用。
有益效果：(1)本发明所述传感器以胶体晶体作为模板得到三维有序孔隙结构，通过分子印迹技术在孔隙结构中得到印迹空腔，保证了对目标分子的高度选择性和灵敏度；(2)所述传感器内部结构相通，促进目标分子在其中扩散并容易到达识别位点，从而提高传感器对目标分子的响应时间，实现目标分子的快速检测和富集。
附图说明
图1是本发明所述嗜酸乳杆菌S-层蛋白分子印迹传感器制备流程图；
图2是实施例2所述嗜酸乳杆菌S-层蛋白分子印迹传感器对不同浓度S-层蛋白响应曲线图；
图3是实施例2中嗜酸乳杆菌S-层蛋白的浓度与Bragg衍射峰的位移线性关系图；
图4是实施例2所述嗜酸乳杆菌S-层蛋白分子印迹传感器对嗜酸乳杆菌表层蛋白提取液中S-层蛋白的响应图；
图5是实施例2中嗜酸乳杆菌S-层蛋白分子印迹传感器对S-层蛋白的响应速度图；
图6是实施例3中嗜酸乳杆菌S-层蛋白分子印迹传感器富集S-层蛋白的SDS-PAGE鉴定图。
具体实施方式
以下实施例进一步说明本发明的内容，但不应理解为对本发明的限制。在不背离本发明精神和实质的情况下，对本发明方法、步骤或条件所作的修改和替换，均属于本发明的范围。若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。
实施例1
一种嗜酸乳杆菌S-层蛋白分子印迹传感器，所述传感器以二氧化硅为载体，S-层蛋白为模板分子，甲基丙烯酸为功能单体，二甲基丙烯酸乙二醇酯为交联剂。
一种嗜酸乳杆菌S-层蛋白分子印迹传感器的制备方法，包含以下步骤：
(1)将单分散性良好的SiO2颗粒超声分散在乙醇溶液中，浓度为0.3g/mL左右。取10mL分散好的SiO2乳液至小烧杯，然后载玻片垂直插入烧杯中固定好，通过垂直沉降法，使胶体颗粒自组装在洁净的载玻片上，形成三维有序的胶体颗粒阵列，待溶剂完全挥发后，得到具有三维有序排列结构的SiO2胶体晶体，形成光子晶体薄膜。
(2)将光子晶体薄膜在500℃条件下处理1h，以增强其机械性能。然后对其进行表面修饰，具体操作为：将其浸泡在piranha洗液中12h，使SiO2微球表面暴露出羟基基团，然后用双蒸水清洗干净并用氮气流吹干；接下来将光子晶体薄膜浸泡于含有5％APTES的乙醇溶液中1h，使微球表面产生氨基基团；然后将光子晶体薄膜浸泡于含有5％戊二醛的PBS溶液2.5h，戊二醛一端的醛基与SiO2微球上的氨基发生反应，使微球醛基化。然后以PBST洗液多次清洗光子晶体薄膜，并将清洗后的薄膜置于浓度为1mg/mL S-层蛋白的PBS溶液中，4℃下保持12h，使S-层蛋白分子上的氨基与SiO2微球表面的醛基缩合，实现蛋白在微球表面的共价连接。
(3)配置水凝胶预聚液：甲基丙烯酸0.5mL，二甲基丙烯酸乙二醇酯0.25mL，甲醇1mL，将配置好的预聚液放置在4℃下静置12h，使其充分混合；然后向预聚液中加入10mg光引发剂偶氮二异丁腈，超声10min使其混合均匀，并持续通入氮气10min以排尽其中的氧气。
(4)取步骤(2)制备的光子晶体基片，在其表面覆盖一层75mm×25mm的有机玻璃，并用夹子固定好，形成上层为PMAA有机玻璃，中间为光子晶体薄膜，下层为载玻片的三明治结构；用移液枪预聚液缓慢地注入玻璃缝隙，在毛细作用力下预聚液会进入玻璃空隙，直到光子晶体薄膜的颜色变透明则预聚液得到了充分浸透。在冰浴条件下用紫外灯(UV＝365nm)照射30min引发预聚液发生光聚合。
(5)将步骤(4)处理后的光子晶体薄膜浸泡于2％氢氟酸溶液中，除去SiO2颗粒，得到三维有序的反蛋白石光子晶体水凝胶膜。接着将水凝胶膜在NaOH/NaClO(0.5/1.0％)溶液中处理6小时，然后用醋酸的SDS溶液反复清洗三次以除去水凝胶膜中的模板蛋白，即获得嗜酸乳杆菌S-层蛋白分子印迹传感器。
所述嗜酸乳杆菌S-层蛋白分子印迹传感器的制备流程如图1所示。
实施例2
将实施例1制备获得的嗜酸乳杆菌S-层蛋白分子印迹传感器应用于检测嗜酸乳杆菌S-层蛋白。
分别配置1mg/mL、0.1mg/mL、0.01mg/mL、1μg/mL、0.1μg/mL、0.01μg/mL、1ng/mL的S-层蛋白溶液，将嗜酸乳杆菌S-层蛋白分子印迹传感器分别浸没在各蛋白溶液中，室温下静置5min，然后用光纤光谱仪检测Bragg衍射峰的位置，得到衍射峰位移大小与蛋白浓度的数量关系，结果如图2所示。
如图3所示，在1ng/mL-1mg/mL的范围内，随着S-层蛋白浓度的增加，Bragg衍射峰的位移逐渐增大；S-层蛋白的浓度与Bragg衍射峰的位移有良好的线性关系，线性拟合方程为y＝1.7307x+0.0443，且R2＝0.9935。
嗜酸乳杆菌表层蛋白提取液中S-层蛋白含量的测定：将粗提液稀释10倍，用嗜酸乳杆菌S-层蛋白分子印迹传感器对其进行检测，采用光纤光谱仪分析其Bragg衍射峰。图4显示Bragg衍射峰的位移为10nm。经过线性拟合方程计算可得检测液中的S-层蛋白浓度为0.056mg/mL，则S-层蛋白粗提液中的S-层蛋白浓度为0.56mg/mL。
为检测嗜酸乳杆菌S-层蛋白分子印迹传感器的响应速度，用1μg/mL的S-层蛋白溶液对其进行光谱响应检测，即将水凝胶膜置于S-层蛋白溶液中，每隔1min进行一次光谱检测，并记录其Bragg衍射峰的位移值。图5为嗜酸乳杆菌S-层蛋白分子印迹传感器对S-层蛋白的响应速度图，以Bragg衍射峰位移为纵坐标，时间为横坐标，由图可见，响应时间在3min以内，实现了对S-层蛋白的快速检测。
实施例3
采用嗜酸乳杆菌S-层蛋白分子印迹传感器对嗜酸乳杆菌表层蛋白提取液中S-层蛋白的富集：将嗜酸乳杆菌S-层蛋白分子印迹传感器浸没在嗜酸乳杆菌表层蛋白提取液中5min，接着浸入PBS溶液振荡清洗30min，收集清洗所得的PBS溶液，并用SDS-PAGE检测该溶液中是否存在目标蛋白。
图6为SDS-PAGE结果，从图中可以看出有一条清晰的目标条带，表明经过PBS溶液振荡洗涤，有部分S-蛋白被洗脱下来。在S-层蛋白粗提液中存在一些杂蛋白，该结果说明嗜酸乳杆菌S-层蛋白分子印迹传感器选择性捕获了S-层蛋白，不受溶液中其他蛋白的影响。则该嗜酸乳杆菌S-层蛋白分子印迹传感器可以实现对S-层蛋白的富集所用。
Claims (10)
1.一种嗜酸乳杆菌S-层蛋白分子印迹传感器，其特征在于，所述传感器以二氧化硅为载体，S-层蛋白为模板分子，甲基丙烯酸为功能单体，二甲基丙烯酸乙二醇酯为交联剂。
2.一种嗜酸乳杆菌S-层蛋白分子印迹传感器的制备方法，其特征在于，包含以下步骤：
(1)将二氧化硅纳米颗粒分散于无水乙醇中，形成均一稳定的胶体分散体系，然后经垂直沉降将胶体颗粒自组装在基片上，形成三维有序的胶体颗粒阵列，待溶剂完全挥发，得到具有三维有序排列结构的胶体晶体，形成光子晶体薄膜；
(2)将光子晶体薄膜依次进行热处理、羟基化处理、氨基化处理及醛基化反应，然后置于S-层蛋白溶液中，缩合反应实现共价连接；
(3)以甲基丙烯酸为功能单体，二甲基丙烯酸乙二醇酯为交联剂，甲醇为溶剂配制水凝胶预聚液，向预聚液中加入光引发剂，超声混匀后通入氮气排气体系中的氧气；
(4)取步骤(2)制得的覆盖有光子晶体薄膜的基片，在薄膜一边覆盖一层有机玻璃，固定后向缝隙中注入步骤(3)制得的预聚液，充分浸透后、冰浴条件下紫外照射反应；
(5)将步骤(4)处理后的光子晶体薄膜浸泡于氢氟酸中，接着采用蛋白洗涤工艺除去薄膜中的S-层蛋白，即可制得嗜酸乳杆菌S-层蛋白分子印迹传感器。
3.根据权利要求2所述的一种嗜酸乳杆菌S-层蛋白分子印迹传感器的制备方法，其特征在于，步骤(2)中热处理的条件为500℃、1小时。
4.根据权利要求2所述的一种嗜酸乳杆菌S-层蛋白分子印迹传感器的制备方法，其特征在于，步骤(2)中羟基化处理是采用piranha洗液处理12小时。
5.根据权利要求2所述的一种嗜酸乳杆菌S-层蛋白分子印迹传感器的制备方法，其特征在于，步骤(2)中氨基化处理是采用5％APTES的乙醇溶液处理1小时。
6.根据权利要求2所述的一种嗜酸乳杆菌S-层蛋白分子印迹传感器的制备方法，其特征在于，步骤(2)中醛基化反应是与含有5％戊二醛的PBS溶液反应2.5小时。
7.权利要求1所述的嗜酸乳杆菌S-层蛋白分子印迹传感器在检测嗜酸乳杆菌S-层蛋白中的应用。
8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，所述嗜酸乳杆菌S-层蛋白的浓度与Bragg衍射峰的位移呈线性关系。
9.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，所述传感器的响应速度小于3分钟。
10.权利要求1所述的嗜酸乳杆菌S-层蛋白分子印迹传感器在嗜酸乳杆菌S-层蛋白富集中的应用。
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