CN101231289A - 定量检测食品中赭曲霉毒素a含量试剂盒及其检测方法 - Google Patents

定量检测食品中赭曲霉毒素a含量试剂盒及其检测方法 Download PDF

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张燕
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Abstract

本发明属于免疫分析技术领域的一种定量检测食品中赭曲霉毒素A含量试剂盒及其检测方法，该试剂盒由包被板和试剂组构成，其中该试剂组的组成为：(1)缓冲液；(2)底物A；(3)底物B；(4)洗涤液；(5)终止液；(6)赭曲霉毒素A标准液；(7)酶标记赭曲霉毒素A抗原溶液。本发明具有操作简单、检测灵敏度高、特异性强、准确性好、检测成本低等特点，而且适用范围较广，既有经济效益又有社会效益，是一种创新性较高的具有良好的应用前景的定量检测食品中赭曲霉毒素A含量试剂盒及其检测方法。

Description

定量检测食品中赭曲霉毒素A含量试剂盒及其检测方法
技术领域
本发明属于免疫分析技术领域，尤其是一种定量检测食品中赭曲霉毒素A含量试剂盒及其检测方法。
背景技术
赭曲霉毒素是赭曲霉及青霉菌中某些产毒菌株侵染粮食、食品、饲料及其他农副产品后所产生的有毒代谢产物。赭曲霉毒素A(OTA)是赭曲霉毒素中毒性最强、产量最高的一种，对人和动物有强烈的毒害作用，可以导致动物的肾萎缩、胎儿畸形、流产、死亡，并且具有高度的致癌性。OTA在大多数谷物中存在，主要包括大麦、小麦、燕麦、玉米和咖啡等。同时，以这些谷物饲养的家禽也会受到污染。所以赭曲霉毒素是继黄曲霉毒素后又一个引起世界关注的毒素。1993年，国际癌症研究院(The International Agency forResearch on Cancer)将赭曲霉毒素定为2B组致癌物质(可能是人类致癌物)。由于赭曲霉毒素A对人体的毒副作用，各国纷纷制定了谷物中赭曲霉毒素A的限量标准，第56次FAO/WHO食品添加剂联合专家委员会会议对OTA进行了危险性评价并制定了谷物食品中OTA最大残留量标准为5μg/kg，我国和欧盟及其成员国也规定在谷物中最大残留量为5μg/kg。
目前赭曲霉毒素A的测定方法有多种，如：薄层层析法(TLC)、高效液相色谱法(HPLC)和液相色谱-质谱法(LC/MS)等方法。其中，国内外研究与应用较多的是HPLC法，，但是这种方法前处理过程繁琐，操作复杂，而且通常需要专业人员进行操作，仪器设备昂贵，检测过程耗时且费用较高，不适于大量样品的现场快速检测。酶联免疫测定法ELISA由于其特异性强，灵敏度高，准确性好，操作简便，适于大批量样品的检测等优点越来越受到人们的青睐。虽然很多科研机构和大专院校的科研人员对赭曲霉毒素A酶联免疫分析检测方法进行了研究，但是检测的灵敏度和试剂盒的稳定性方面离实际应用还有一定的距离。
酶联免疫吸附剂测定(enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA)的基本原理是：将酶与抗原或抗体用交联剂结合起来，此种酶标记抗原或抗体与待测样品中相应抗体或抗原发生特异反应，并牢固结合，在加入相应的酶的底物时，底物被酶催化生成呈色产物，可根据呈色物的有无和呈色深浅作定性或定量观察。由于此技术是建立在抗原抗体反应和酶的高效催化作用的基础上，故而该技术具有检测灵敏度高、特异性强、准确性好等特点。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术的不足，提供一种操作简单、检测灵敏度高、特异性强、准确性好、检测成本低的定量检测食品中赭曲霉毒素A含量试剂盒及其检测方法。
本发明是通过以下技术方案来实现的：
一种定量检测食品中赭曲霉毒素A含量试剂盒，其特征在于：该试剂盒由试剂组和包被板构成。
而且，所述的试剂组为：
(1)缓冲液：为磷酸盐缓冲液，pH 7.4，使用时用二次水按1∶5稀释；
(2)底物A：为含过氧化氢脲的醋酸钠缓冲液；
(3)底物B：为含3，3′，5，5′-四甲基对二氨基联苯(TMB)的二甲基亚砜溶液；
(4)洗涤液：为含2.5％吐温的磷酸盐缓冲液，使用时用二次水按照1∶5稀释；
(5)终止液：为1.25mol/L硫酸；
(6)赭曲霉毒素A标准液：其赭曲霉毒素A标准溶液浓度为100μg/L，使用时用2％甲醇缓冲液稀释至1μg/L后，再按1∶3稀释六个梯度；
(7)酶标记赭曲霉毒素A抗原溶液：为赭曲霉毒素A-辣根过氧化物酶连接物(OTA-HRP)，使用时用缓冲液按照1∶30万倍稀释。
而且，所述的包被板为96孔或48孔微孔板，是由多克隆赭曲霉毒素A抗体包被于包被板微孔中，然后用pH值为9.6的Na2CO3-NaHCO3的缓冲液将多克隆赭曲霉毒素A抗体稀释为1μg/100μL作为包被液，向包被板中每孔各加入100μL，室温放置过夜或者37℃恒温温育2-3小时，洗涤液洗涤三次除去包被液，加入200μL冻干液封闭1小时，洗涤液洗涤四次后，冻干，4℃保存。
而且，所述的多克隆赭曲霉毒素A抗体是选用雌性大白兔进行五次免疫，三次免疫后10天由兔子的耳缘静脉采集血液离心获得抗血清进行效价检测，末次免疫后采用颈动脉采血法对动物采全血，经离心处理后收集全部血清，采取免疫亲合层析法进行抗体纯化，所得抗体添加0.1％(W/V)的叠氮钠后于4℃储存备用。
而且，所述的冻干液为含脱脂奶粉的磷酸盐缓冲液。
而且，所述的OTA-HRP连接物为将赭曲霉毒素A、N-羟基琥珀酰亚胺、N，N’-二环己基碳二亚胺溶于N，N-二甲基甲酰胺中，铝膜包裹360°室温摇动4-6小时，离心取上清夜；将辣根过氧化物酶(HRP)溶解于碳酸氢钠溶液中，将赭曲霉毒素A半抗原反应液在冰浴下滴加入HRP溶液中，滴加完全后4℃下将反应液360°摇匀反应过夜，最后将所有反应液放入透析袋中对0.01mol/L的PBS透析72h。
一种应用如权利要求1所述的定量检测食品中赭曲霉毒素A含量试剂盒的检测方法：包括以下步骤：
(1).在温度为15-30℃时进行样品前处理，得到样品提取液；
(2).打开试剂盒取出包被板，分别将不同浓度的赭曲霉毒素A标准液和样品提取液加入到包被板各自的微孔中，并且双孔平行加样，然后再在不同浓度赭曲霉毒素A标准液和样品提取液各自的微孔中加入酶标抗原溶液，震荡混匀5-10min，室温反应1-2小时；
(3).用洗涤液洗包被板3-4次，将孔内液体甩掉，用吸水纸扣干，加入底物A和底物B的混合液，室温下反应0.25-0.35小时；
(4).向各微孔中加入终止液，终止反应，用酶标仪读取吸光度值，根据不同浓度赭曲霉毒素A标准液的吸光度值绘制赭曲霉毒素A的标准曲线图，对照赭曲霉毒素A的标准曲线图得到样品提取液中赭曲霉毒素A的含量。
而且，所述的底物A和底物B的混合液的配比为14.6∶0.45。
而且，所述的样品前处理为将样品粉粹成粉末状，于干燥箱中40-60℃烘干，取样品加入萃取液，超声萃取18-22min，离心，取部分上清液用PBS 25倍稀释。
而且，所述的萃取液为50％甲醇。
本发明的有益效果和优点是：
1.本发明具有操作简单、检测灵敏度高、特异性强、准确性好、检测成本低等特点，而且适用范围较广。主要适用于食品和粮食中的赭曲霉毒素A含量的定量检测。其抗体具有良好的广谱性和灵敏度，所得抗体和酶标抗原稳定，具有常温保藏时间长的优点。
2.本发明提供的快速检测方法操作简便、快速，完成全部检测操作过程只需几小时，而且检测的精确度可达90％以上，检测灵敏度可以达到μg/kg级非常适合现场检测的需要。由于抗体和酶标抗原，在常温下可以保藏1周、酶标抗原包备的酶标板在4℃下可以保藏6个月以上，从而为进行大规模样品的集中检测，提供了极大的方便。
3.本发明成本低廉、检测效率高、操作简便，既有经济效益又有社会效益，是一种创新性较高的具有良好的应用前景的定量检测食品中赭曲霉毒素A含量试剂盒及其检测方法。
附图说明
图1本发明赭曲霉毒素A-ELISA标准曲线图。
具体实施方式
本发明通过以下实施例进一步详述，下述实施例是说明性的，不是限定性的，不能以下述实施例来限定本发明的保护范围。
本发明为定量检测食品中赭曲霉毒素A含量试剂盒，由包被板和试剂组构成，其中该试剂组的组成为：
(1)缓冲液：为磷酸盐缓冲液，pH 7.4，使用时用二次水按1∶5稀释；
(2)底物A：为含过氧化氢脲的醋酸钠缓冲液；
(3)底物B：为含3，3′，5，5′-四甲基对二氨基联苯(TMB)的二甲基亚砜溶液；
(4)洗涤液：为含2.5％吐温的磷酸盐缓冲液；使用时用二次水按照1∶5稀释；
(5)终止液：为1.25mol/L硫酸；
(6)赭曲霉毒素A标准液：其赭曲霉毒素A标准溶液浓度为100μg/L，使用时用2％甲醇缓冲液稀释至1μg/L后，再按1∶3稀释六个梯度；
(7)酶标记赭曲霉毒素A抗原溶液：为赭曲霉毒素A-辣根过氧化物酶连接物(OTA-HRP)，使用时用缓冲液按照1∶30万倍稀释。
一种应用如权利要求1所述的定量检测食品中赭曲霉毒素A含量试剂盒的检测方法：包括以下步骤：
(1).在温度为15-30℃时进行样品前处理，得到样品提取液；
(2).打开试剂盒取出包被板，分别将不同浓度的赭曲霉毒素A标准液和样品提取液加入到包被板各自的微孔中，并且双孔平行加样，然后再在不同浓度赭曲霉毒素A标准液和样品提取液各自的微孔中加入酶标抗原溶液，震荡混匀5min，室温反应1-2小时；
(3).用洗涤液洗包被板3-4次，将孔内液体甩掉，用吸水纸扣干，加入底物A和底物B的混合液，室温下反应0.25-0.35小时；
(4).向各微孔中加入终止液，终止反应，用酶标仪读取吸光度值，根据不同浓度赭曲霉毒素A标准液的吸光度值绘制赭曲霉毒素A的标准曲线图，对照赭曲霉毒素A的标准曲线图得到样品提取液中赭曲霉毒素A的含量。
下面通过一具体实例，对本发明的效果进行叙述。
检测大麦样品中赭曲霉毒素A的含量：
(1).样品前处理：将大麦经粉碎机充分粉粹成粉末状，于干燥箱中50℃烘干，-20℃储存备用。分别取大麦样品各5g，加入10mL萃取液(50％甲醇)，超声萃取20min，离心，取部分上清液用PBS 25倍稀释；
(2).打开试剂盒取出包被板，分别将100μL赭曲霉毒素A梯度稀释的标准液和100μL样品提取液双孔平行加样加入到包被板各自的微孔中，然后再在赭曲霉毒素A标准液和样品提取液各自的微孔中各加入100μL1∶30万倍稀释的酶标抗原溶液，室温反应1h；
(3).用洗涤液洗板3次；在每孔中加入150μL底物A和底物B的混合液，室温下反应0.5小时；
(4).向各微孔中加入50μL终止液，进行终止反应，在双波长方式(450-650nm)下用酶标仪读取吸光度值，绘制赭曲霉毒素A的标准曲线图，对照赭曲霉毒素A的标准曲线图得到样品提取液中赭曲霉毒素A的含量。
(5)结果的计算
1)计算抑制率值
按公式(A)计算不同浓度赭曲霉毒素A对抗原抗体结合反应的抑制率：
Figure A20071005655700081
式中：
IC％——赭曲霉毒素A对抗原抗体结合反应的抑制率；
A——450nm吸光值与650nm吸光值的差值；
A样品——赭曲霉毒素标准液或样液的平均吸光度值；
A空白——不加入酶标及赭曲霉毒素A标准液的平均吸光度值。
2)绘制标准曲线
以抑制率为纵坐标，赭曲霉毒素A浓度对数为横坐标绘制校正曲线。每次试验均应重新绘制标准曲线，见图1。
3)结果计算
从图1绘制的标准曲线上读取样液抑制率所对应的赭曲霉毒素A浓度(C)，按公式(B)计算试样中的赭曲霉毒素A残留量：
X＝C×R    ....................................(B)
式中：
X——试样中赭曲霉毒素A残留量，单位为微克每千克(μg/kg)；
C——根据样品孔的抑制率查得试样中赭曲霉毒素A浓度，单位为微克每升(μg/L)；
R——换算系数，例如大麦为50。
加标试验：
在加标试验中，分别向样品中添加不同浓度的赭曲霉毒素A，将加标样品充分混匀，室温静置过夜。其余处理过程同上。在对大麦样品的检测中，分别在2.5、5和10ng水平进行加标回收试验，其回收率为105％和95％和95％。
酶标记赭曲霉毒素A抗原溶液制备：
准确称取赭曲霉毒素A 10.0mg、N-羟基琥珀酰亚胺3.4mg、N，N’-二环己基碳二亚胺12.4mg溶于150μL N，N-二甲基甲酰胺中，铝膜包裹360°室温摇动4小时，离心取上清夜；另称取10.0mg卵清蛋白溶解于130mmol碳酸氢钠溶液中，将赭曲霉毒素A半抗原反应液在冰浴下滴加入蛋白溶液中，滴加完全后4℃下将反应液360°摇匀反应过夜，最后将所有反应液放入透析袋中对0.01mol/L的PBS透析72h，备用。
包被板的制备：
多克隆赭曲霉毒素A抗体包被于微孔板中，用pH9.6Na2CO3-NaHCO3的缓冲液将多克隆赭曲霉毒素A抗体稀释为1μg/100μL作为包被液，96孔微孔板每孔各加入100μL，室温放置过夜或者37℃恒温温育2-3小时，洗涤液洗涤三次除去包被液，加入200μL冻干液封闭1小时，洗涤液洗涤四次后，冻干，4℃保存。
赭曲霉毒素A是一种小分子半抗原，分子量为403.8，只有反应原性而无免疫原性，需要与载体蛋白偶联后才能使动物产生免疫应答。本试验以合成的赭曲霉毒素A-BSA作为免疫原进行动物免疫。
多克隆赭曲霉毒素A抗体的制备：
1、免疫动物选择日本大耳白兔3只，月龄3个月，体重1.5公斤左右，分别编号为1号、2号和3号。免疫采取皮下和肌肉注射法共同进行。2、免疫程序：初次免疫：为提高抗原的免疫性，采用由弗氏完全佐剂乳化的免疫原，剂量为1mg(溶于1mL 0.9％的NaCl和1mL的弗氏完全佐剂)。加强免疫：初次免疫后第14天进行加强免疫，剂量为0.5mg(溶于1mL 0.9％的NaCl及1mL的弗氏不完全佐剂)。以后每隔30天加强免疫一次，共免疫6次。从第2次加强免疫开始，每次免疫10天后对动物试采血进行血清效价测定和亲和力测定。末次免疫后采用颈动脉采血法对动物采全血，经离心处理后收集全部血清，采取免疫亲合层析法进行抗体纯化，所得抗体添加0.1％(W/V)的叠氮钠后于4℃储存备用。

Claims (10)

1.一种定量检测食品中赭曲霉毒素A含量试剂盒，其特征在于：该试剂盒由试剂组和包被板构成。
2.根据权利要求1所述的定量检测食品中赭曲霉毒素A含量试剂盒，其特征在于：所述的试剂组为：
(1)缓冲液：为磷酸盐缓冲液，pH 7.4，使用时用二次水按1∶5稀释；
(2)底物A：为含过氧化氢脲的醋酸钠缓冲液；
(3)底物B：为含3，3′，5，5′-四甲基对二氨基联苯(TMB)的二甲基亚砜溶液；
(4)洗涤液：为含2.5％吐温的磷酸盐缓冲液；使用时用二次水按照1∶5稀释；
(5)终止液：为1.25mol/L硫酸；
(6)赭曲霉毒素A标准液：其赭曲霉毒素A标准溶液浓度为100μg/L，使用时用2％甲醇缓冲液稀释至1μg/L后，再按1∶3稀释六个梯度；
(7)酶标记赭曲霉毒素A抗原溶液：为赭曲霉毒素A-辣根过氧化物酶连接物(OTA-HRP)，使用时用缓冲液按照1∶30万倍稀释。
3.根据权利要求1所述的定量检测食品中赭曲霉毒素A含量试剂盒，其特征在于：所述的包被板为96孔或48孔微孔板，是由多克隆赭曲霉毒素A抗体包被于包被板微孔中，然后用pH值为9.6的Na2CO3-NaHCO3的缓冲液将多克隆赭曲霉毒素A抗体稀释为1μg/100μL作为包被液，向包被板中每孔各加入100μL，室温放置过夜或者37℃恒温温育2-3小时，洗涤液洗涤三次除去包被液，加入200μL冻干液封闭1小时，洗涤液洗涤四次后，冻干，4℃保存。
4.根据权利要求3所述的定量检测食品中赭曲霉毒素A含量试剂盒，其特征在于：所述的多克隆赭曲霉毒素A抗体是选用雌性大白兔进行五次免疫，三次免疫后10天由兔子的耳缘静脉采集血液离心获得抗血清进行效价检测，末次免疫后采用颈动脉采血法对动物采全血，经离心处理后收集全部血清，采取免疫亲合层析法进行抗体纯化，所得抗体添加0.1％(W/V)的叠氮钠后于4℃储存备用。
5.根据权利要求3所述的定量检测食品中赭曲霉毒素A含量试剂盒，其特征在于：所述的冻干液为含脱脂奶粉的磷酸盐缓冲液。
6.根据权利要求2所述的定量检测食品中赭曲霉毒素A含量试剂盒，其特征在于：所述的OTA-HRP连接物为将赭曲霉毒素A、N-羟基琥珀酰亚胺、N，N’-二环己基碳二亚胺溶于N，N-二甲基甲酰胺中，铝膜包裹360°室温摇动4-6小时，离心取上清夜；将辣根过氧化物酶(HRP)溶解于碳酸氢钠溶液中，将赭曲霉毒素A半抗原反应液在冰浴下滴加入HRP溶液中，滴加完全后4℃下将反应液360°摇匀反应过夜，最后将所有反应液放入透析袋中对0.01mol/L的PBS透析72h。
7.一种应用如权利要求1所述的定量检测食品中赭曲霉毒素A含量试剂盒的检测方法：包括以下步骤：
(1).在温度为15-30℃时进行样品前处理，得到样品提取液；
(2).打开试剂盒取出包被板，分别将不同浓度的赭曲霉毒素A标准液和样品提取液加入到包被板各自的微孔中，并且双孔平行加样，然后再在不同浓度赭曲霉毒素A标准液和样品提取液各自的微孔中加入酶标抗原溶液，震荡混匀5-10min，室温反应1-2小时；
(3).用洗涤液洗包被板3-4次，将孔内液体甩掉，用吸水纸扣干，加入底物A和底物B的混合液，室温下反应0.25-0.35小时；
(4).向各微孔中加入终止液，终止反应，用酶标仪读取吸光度值，根据不同浓度赭曲霉毒素A标准液的吸光度值绘制赭曲霉毒素A的标准曲线图，对照赭曲霉毒素A的标准曲线图得到样品提取液中赭曲霉毒素A的含量。
8.根据权利要求7所述的定量检测食品中赭曲霉毒素A含量试剂盒的检测方法，其特征在于：所述的底物A和底物B的混合液的配比为14.6∶0.45。
9.根据权利要求7所述的定量检测食品中赭曲霉毒素A含量试剂盒的检测方法，其特征在于：所述的样品前处理为将样品粉粹成粉末状，于干燥箱中40-60℃烘干，取样品加入萃取液，超声萃取18-22min，离心，取部分上清液用PBS 25倍稀释。
10.根据权利要求9所述的定量检测食品中赭曲霉毒素A含量试剂盒的检测方法，其特征在于：所述的萃取液为50％甲醇。
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