CN109030410B - 蜂王浆近红外定量校正模型的构建方法及蜂王浆的检测方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及红外检测领域，特别涉及蜂王浆近红外定量校正模型的构建方法及蜂王浆的检测方法。该方法具体为：选取已知10‑羟基癸烯酸含量蜂王浆，备用；采集蜂王浆近红外光谱数据；选取特征波段下的光谱信息与已知的所述蜂王浆的10‑羟基癸烯酸含量进行关联，采用偏最小二乘法、交叉‑验证法建立定量标准模型；对未知的蜂王浆样品进行近红外光谱扫描，并选取特征波段下的光谱信息，导入建立的定量校正模型中，得到未知蜂王浆样品的10‑羟基癸烯酸含量。利用近红外预测模型在用于蜂王浆中10‑羟基癸烯酸含量的检测，具有操作简单、分析速度快、预测结果准确性高等优点，本发明为蜂王浆品质的测定检验提供了实验基础，具有显著的应用价值和市场前景。
Description
技术领域
本发明涉及红外检测领域，特别涉及蜂王浆近红外定量校正模型的构建方法及蜂王浆的检测方法。
背景技术
蜂王浆是集营养、食疗及保健多位一体的天然物质，具有抑菌、抗氧化、抗衰老、降血糖、降血脂、抗肿瘤、调节免疫及护肤美容等其他多方面生理作用。主要含有蛋白质、氨基酸、有机酸以及维生素等方面，还有少量植物甾醇、乙酰胆碱、磷酸腺苷等成分。蜂王浆中含有丰富的10-羟基癸烯酸(10-HDA)，这种成分其他物质所没有，故被称作王浆酸。10-HDA近年来称为研究的重点，已经成为蜂王浆的标志性成分。目前最常用于检测蜂王浆中10-HDA的方法为高效液相色谱法，这类方法具有实验周期长、操作繁琐、药品消耗大、污染环境等缺点。因此寻找一种新的可以快速、简便、安全环保、无损的检测方法是非常有必要的。
近红外光谱(Near Infrared Reflectance Spectroscopy，NIR)是利用不同化学基团吸收特定的光谱从而形成特异的吸收峰来检测样品中各组分浓度或机构的技术。相较于传统的一些化学检测手段，近红外光谱具有很多优点，比如预测速度快，分析效率高；无损分析，无污染；分析精度好，重现性好；分析成本低等。
现有技术未有采用近红外光谱技术快速测定蜂王浆中10-HDA含量的相关报道。
发明内容
有鉴于此，本发明提供一种蜂王浆近红外定量校正模型的构建方法及蜂王浆的检测方法。该近红外测定方法，用于快速测定蜂王浆中10-HDA含量。该方法操作简便，分析速度快，并且预测结果准确性较高。可为蜂王浆成分的快速检测评估及产品质量控制提供理论依据和分析手段。
为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：
本发明提供了一种蜂王浆近红外定量校正模型的构建方法，取蜂王浆，以10-羟基癸烯酸作为关键质控指标，经高效液相色谱检测和近红外光谱检测，获得相应的高效液相色谱检测结果和近红外光谱结果，经偏最小二乘法、交叉-验证法获得蜂王浆近红外定量校正模型。
在本发明的一些具体实施方案中，10-羟基癸烯酸采用高效液相色谱法测定，所述高效液相色谱的条件为：
色谱柱为ACE-C18(250mm×4.6mm，5μm)；以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以甲醇-水-磷酸(45:55:0.2)为流动相；检测波长为210～250nm；流速0.5～1.5ml/min；柱温20～40℃；优选检测波长为235nm；流速1ml/min；柱温30℃；理论板数按10-羟基癸烯酸峰计算应不低于2000。
在本发明的一些具体实施方案中，所述高效液相色谱检测中10-羟基葵烯酸对照品溶液的制备方法为：取10-羟基癸烯酸对照品，加甲醇制成溶液，即得。优选的，取10-羟基癸烯酸对照品，加甲醇制成每1ml含10-羟基癸烯酸200μg的溶液，即得。
在本发明的一些具体实施方案中，所述高效液相色谱检测中供试品溶液的制备方法为：取蜂王浆，加甲醇，摇匀，放置过夜，滤过，取续滤液，即得。
在本发明的一些具体实施方案中，所述近红外光谱检测包括光谱采集、光谱预处理的步骤；
所述光谱采集为：取蜂王浆，在25℃±5℃条件下，采用漫反射内置光源采集近红外光谱，以空气为参比背景，扫描次数为200～400，扫描光谱范围为1100～2300nm，扫描间隔为1～3nm。
在本发明的一些具体实施方案中，所述光谱预处理为：将所述光谱采集的原始光谱，通过反射比到吸光度的格式转化，再进行一阶微分9点平滑法处理。
在本发明的一些具体实施方案中，所述获得蜂王浆近红外定量校正模型具体为：用Unscrambler定量分析软件，采用偏最小二乘法、交叉-验证法，将预处理后光谱数据与样品HPLC含量数据关联，建立各指标的校正模型。
在本发明的一些具体实施方案中，所述获得蜂王浆近红外定量校正模型还包括采用光谱影响值Leverage和化学值误差Residual等统计量检验，剔除NIR光谱与测定结果的异常值，确定最终NIR定量校正模型。
在本发明的一些具体实施方案中，蜂王浆中10-HDA含量模型，内部验证直线方法为Y＝0.9870X+0.019，外部验证直线方程为Y＝0.9506X+0.072，其中X为化验值，Y为预测值，内部验证决定系数R2＝0.9935，外部验证决定系数R2＝0.9755，RMSEP＝0.0109。表明参与建模的10-HDA含量与其NIR光谱相关性较好，所建立的NIR检测模型性能良好。
本发明还提供了一种蜂王浆的检测方法，按照本发明所述的构建方法获得蜂王浆近红外定量校正模型，将蜂王浆待测样品的近红外光谱数据导入所述蜂王浆近红外定量校正模型，获得所述待测样品中10-羟基癸烯酸的含量。
本发明公开了一种蜂王浆中10-羟基癸烯酸含量的近红外快速测定方法。采用方法具体为：(1)选取已知10-羟基癸烯酸含量蜂王浆，备用；(2)采集蜂王浆近红外光谱数据；(3)选取特征波段下的光谱信息与已知的所述蜂王浆的10-羟基癸烯酸含量进行关联，采用偏最小二乘法、交叉-验证法建立定量标准模型；(4)按照步骤(2)的方法对未知的蜂王浆样品进行近红外光谱扫描，并选取特征波段下的光谱信息，导入建立的定量校正模型中，得到未知蜂王浆样品的10-羟基癸烯酸含量。本发明获得的近红外预测模型在用于蜂王浆中10-羟基癸烯酸含量的预测，具有操作简单、分析速度快、预测结果准确性高等优点，本发明为蜂王浆品质的测定检验提供了实验基础，具有显著的应用价值和市场前景。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍。
图1示实施例所述蜂王浆近红外原始吸收光谱图；
图2示实施例所述蜂王浆近红外预处理光谱图；
图3示实施例所述蜂王浆10-HDA含量建模结果图；
图4示实施例所述蜂王浆10-HDA含量测定的对照品色谱图；
图5示实施例所述蜂王浆10-HDA含量测定的样品色谱图。
具体实施方式
本发明公开了一种蜂王浆近红外定量校正模型的构建方法及蜂王浆的检测方法，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的方法及应用已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文所述的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。
本发明提供了一种蜂王浆中10-羟基癸烯酸含量的近红外快速测定方法，采用如下步骤：
(1)采集蜂王浆样品近红外光谱：取蜂王浆样品约8g，于15ml离心管中，将近红外探头深入液面以下，并保证蜂王浆完全包裹探头，以空气为参比，扣除背景后采集近红外光谱，得到样品近红外光谱图。
(2)高效液相色谱法测定样品中10-羟基癸烯酸含量：取10-羟基癸烯酸对照品，加甲醇制成每1ml含10-羟基癸烯酸200μg的溶液，即得。取本品约0.1～1(优选0.15)g，精密称定，置25ml量瓶中，加甲醇约20ml，摇匀，放置过夜，加甲醇至刻度，摇匀，滤过，取续滤液，即得。所制备的样品，利用HPLC测定蜂王浆中10-羟基癸烯酸含量，得到样品中10-羟基癸烯酸含量的化学值。
(3)在1100～2300nm扫描，扫描间隔为1.0～3.0nm，扫描平均次数为200～400次。每个样品测定3次，得到蜂王浆样品光谱图。利用SNAP软件中的光谱处理程序，采用一阶导数9点平滑法(Savitzky-Golay)对原始光谱进行预处理，消除颜色差别等因素引起的光谱基线偏移和漂移。用Unscrambler定量分析软件，采用偏最小二乘法、交叉-验证法，将预处理后光谱数据与样品HPLC含量数据关联，建立各指标的校正模型。采用光谱影响值Leverage和化学值误差Residual等统计量检验，剔除NIR光谱与测定结果的异常值，并根据模型主要参数进行筛选选优化，确定NIR检测模型。
(4)按照步骤(3)所述的方法对未知的蜂王浆样品进行近红外光谱扫描，并将得到的特征光谱信息导入建立的定量校准模型获得所述未知蜂王浆样品的10-羟基癸烯酸含量。
作为优选，步骤(3)所述主要参数是指：内外部验证决定系数(R2)、预测标准偏差(RMSEP)。
作为优选，所述样品集中的样品不少于50个。
作为优选，所述的蜂王浆中10-羟基癸烯酸含量的近红外快速测定方法，具体为：
(1)采集蜂王浆样品近红外光谱：取蜂王浆样品约8g，于15ml离心管中，将近红外探头深入液面以下，并保证蜂王浆完全包裹探头，以空气为参比，扣除背景后采集近红外光谱，得到样品近红外光谱图。
(2)高效液相色谱法测定样品中10-羟基癸烯酸含量：取10-羟基癸烯酸对照品，加甲醇制成每1ml含10-羟基癸烯酸200μg的溶液，即得。取本品约0.1～1(优选0.15)g，精密称定，置25ml量瓶中，加甲醇约20ml，摇匀，放置过夜，加甲醇至刻度，摇匀，滤过，取续滤液，即得。所制备的样品，利用HPLC测定蜂王浆中10-羟基癸烯酸含量，得到样品中10-羟基癸烯酸含量的化学值。
所述的高效液相色谱条件为：色谱柱为ACE-C18(250mm×4.6mm，5μm)；以甲醇-水-磷酸(45:55:0.2)为流动相；检测波长为210～250nm；流速0.5～1.5ml/min；柱温20～40℃；优选的，波长为235nm；流速1ml/min；柱温30℃。理论板数按10-羟基癸烯酸峰计算应不低于2000。
(3)在1100～2300nm扫描，扫描间隔为1.0～3.0nm，扫描平均次数为200～400次。每个样品测定3次，得到蜂王浆样品光谱图。利用SNAP软件中的光谱处理程序，采用一阶导数9点平滑法(Savitzky-Golay)对原始光谱进行预处理，消除颜色差别等因素引起的光谱基线偏移和漂移。用Unscrambler定量分析软件，采用偏最小二乘法、交叉-验证法，将预处理后光谱数据与样品HPLC含量数据关联，建立各指标的校正模型。采用光谱影响值Leverage和化学值误差Residual等统计量检验，剔除NIR光谱与测定结果的异常值，并根据模型主要参数进行筛选优化，确定NIR检测模型。
(4)对未知的蜂王浆样品进行近红外光谱扫描，并将得到的特征光谱信息导入建立的定量校准模型获得所述未知蜂王浆样品的10-羟基癸烯酸含量。
所述的外部验证，具体方法是利用校正模型对验证集光谱进行预测，即将验证集样品的近红外光谱值代入步骤(3)得到的最终的近红外预测模型中，获得预测化学值，将预测化学值与步骤(2)高效液相色谱测定得到的对应的验证集样品的化学值进行统计分析，通过分析结果判定模型的预测准确度。
高效液相色谱法测定样品中10-HDA含量：取本品约0.1～1(优选0.15)g，精密称定，置25ml量瓶中，加甲醇约20ml，摇匀，放置过夜，加甲醇至刻度，摇匀，滤过，取续滤液，即得。所制备的样品，利用HPLC测定蜂王浆中10-HDA含量。
采集蜂王浆样品近红外光谱：取蜂王浆样品约8g，于15ml离心管中，将近红外探头深入液面以下，并保证蜂王浆完全包裹探头，在1100～2300nm扫描，扫描间隔为1～3(优选2.0)nm，扫描平均次数为200～400(优选300)次，得到样品近红外光谱图。
在建立模型前，需要消除噪音和基线漂移等因素对光谱采集的影响。利用SNAP软件中的光谱处理程序，采用一阶导数9点平滑法(Savitzky-Golay)对原始光谱进行预处理，消除颜色差别等因素引起的光谱基线偏移和漂移。
用Unscrambler定量分析软件，采用偏最小二乘法、交叉-验证法，将预处理后光谱数据与样品HPLC含量数据关联，建立各指标的校正模型。
采用光谱影响值Leverage和化学值误差Residual等统计量检验，剔除NIR光谱与标测定结果的异常值，并根据模型主要参数：内外部验证决定系数(R2)、预测标准偏差(RMSEP)等，进行筛选选优化，确定NIR检测模型。
利用已建立的指标模型，随机抽取未参与建模的样品进行分析，验证样品与建模样品光谱采集参数设置的一致性，获得各指标的预测结果，计算预测值与实测值偏差，验证模型准确性。
本发明使用的主要设备如下：
近红外光谱仪型号：AOTF便携式Luminar-5030型近红外光谱分析仪(美国BRIMROSE公司)，样品检测皿，SNAP光谱分析软件；戴安U3000高效液相色谱仪(美国Thermo公司)，紫外检测器，Chromeleon7色谱工作站。
本实施例在样品集的样品中选择校正集样品50个，验证集样品10个。
本发明提供的蜂王浆近红外定量校正模型的构建方法及蜂王浆的检测方法中所用原料及试剂均可由市场购得。
下面结合实施例，进一步阐述本发明：
实施例1
(1)采集蜂王浆样品近红外光谱：取蜂王浆样品约8g，于15ml离心管中，将近红外探头深入液面以下，并保证蜂王浆完全包裹探头，以空气为参比，扣除背景后采集近红外光谱，得到样品近红外光谱图。
(2)高效液相色谱法测定样品中10-HDA含量：取10-羟基癸烯酸对照品，加甲醇制成每1ml含10-羟基癸烯酸200μg的溶液，即得。取蜂王浆约0.15g，精密称定，置25ml量瓶中，加甲醇约20ml，摇匀，放置过夜，加甲醇至刻度，摇匀，滤过，取续滤液，即得。所制备的样品，利用HPLC测定蜂王浆中10-羟基癸烯酸含量，得到样品中10-HDA含量的化学值。
高效液相色谱条件为：色谱柱为ACE-C18(250mm×4.6mm，5μm)；以甲醇-水-磷酸(45:55:0.2)为流动相；波长为235nm；流速1ml/min；柱温30℃。理论板数按10-HDA计算应不低于2000。
(3)在1100～2300nm扫描，扫描间隔为1.0～3.0nm，扫描平均次数为200～400次。每个样品测定3次，得到蜂王浆样品光谱图。利用SNAP软件中的光谱处理程序，采用一阶导数9点平滑法(Savitzky-Golay)对原始光谱进行预处理，消除颜色差别等因素引起的光谱基线偏移和漂移。用Unscrambler定量分析软件，采用偏最小二乘法、交叉-验证法，将预处理后光谱数据与样品HPLC含量数据关联，建立各指标的校正模型。采用光谱影响值Leverage和化学值误差Residual等统计量检验，剔除NIR光谱与测定结果的异常值，并根据模型主要参数进行筛选优化，确定NIR检测模型。
(4)对未知的蜂王浆样品进行近红外光谱扫描，并将得到的特征光谱信息导入建立的定量校准模型获得所述未知蜂王浆样品的10-HDA含量。
外部验证，具体方法是利用校正模型对验证集光谱进行预测，即将验证集样品的近红外光谱值代入步骤(3)得到的最终的近红外预测模型中，获得预测化学值，将预测化学值与步骤(2)高效液相色谱测定得到的对应的验证集样品的化学值进行统计分析，通过分析结果判定模型的预测准确度。
实施例2
利用已建立的指标模型，随机抽取未参与建模的样品进行分析，验证样品与建模样品光谱采集参数设置的一致性，获得各指标的预测结果，计算预测值与实测值偏差，验证模型准确性。
表1用于模型精确度检验的蜂王浆中10-HDA含量的HPLC测定值和对应的近红外模型测定值(％)
NIR光谱模型显示，蜂王浆中10-HDA含量模型，内部验证直线方法为Y＝0.9870X+0.019，外部验证直线方程为Y＝0.9506X+0.072，其中X为化验值，Y为预测值，内部验证决定系数R2＝0.9935，外部验证决定系数R2＝0.9755，RMSEP＝0.0109。表明参与建模的10-HDA含量与其NIR光谱相关性较好，所建立的NIR检测模型性能良好。利用NIR检测模型，对未参与建模的10批次样品进行分析，各指标的预测结果见表1。
对已建立的蜂王浆中10-HDA定量模型，分别采用10批未参与建模的样品进行外部验证。
结果可知，10批次验证样品中10-HDA含量预测值与HPLC实测值偏差平均值为0.33％，小于5％，由此可见，10-HDA含量NIR检测模型预侧值与常规检测方法测定值之间相关性良好，测定准确性较高，可以采用NIR光谱模型快速检测分析蜂王浆中10-HDA含量。结果证明NIR技术预测结果与高效液相色谱法测定结果基本一致，无明显偏差。NIR快速检测准确度较高，可替代液相分析。
实施例3与原有检测技术对比评价
在应用及相关耗材方面也进行了对比，具体见表2。
表2检测技术对比
注：*示与传统方法相比，具有显著差异(P＜0.05)；#示与传统方法相比，具有极显著差异(P＜0.01)。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
Claims (2)
1.一种蜂王浆近红外定量校正模型的构建方法，其特征在于，取蜂王浆，以10-羟基癸烯酸作为关键质控指标，经高效液相色谱检测和近红外光谱检测，获得相应的高效液相色谱检测结果和近红外光谱结果，经偏最小二乘法、交叉-验证法获得蜂王浆近红外定量校正模型；
10-羟基癸烯酸采用高效液相色谱法测定，所述高效液相色谱的条件为：
色谱柱为ACE-C18；以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以甲醇-水-磷酸为流动相；检测波长为210~250nm；流速0.5~1.5ml/min；柱温20~40℃；理论板数按10-羟基癸烯酸峰计算应不低于2000；
所述高效液相色谱检测中10-羟基癸烯酸供试品溶液的制备方法为：取蜂王浆，加甲醇，摇匀，放置过夜，滤过，取续滤液，即得；
所述高效液相色谱检测中10-羟基葵烯酸对照品溶液的制备方法为：取10-羟基癸烯酸对照品，加甲醇制成溶液，即得；
所述近红外光谱检测包括光谱采集、光谱预处理的步骤；
所述光谱采集为：取蜂王浆，在25℃±5℃条件下，采用漫反射内置光源采集近红外光谱，以空气为参比背景，扫描次数为200~400，扫描光谱范围为1100~2300 nm，扫描间隔为1~3nm；
所述光谱预处理为：将所述光谱采集的原始光谱，通过反射比到吸光度的格式转化，再进行一阶微分9点平滑法处理；
所述获得蜂王浆近红外定量校正模型具体为：用Unscrambler定量分析软件，采用偏最小二乘法、交叉-验证法，将预处理后光谱数据与样品HPLC含量数据关联，建立各指标的校正模型；
所述获得蜂王浆近红外定量校正模型还包括采用光谱影响值Leverage和化学值误差Residual统计量检验，剔除NIR光谱与测定结果的异常值，确定最终NIR定量校正模型。
2.一种蜂王浆的检测方法，其特征在于，按照如权利要求1所述的构建方法获得蜂王浆近红外定量校正模型，将蜂王浆待测样品的近红外光谱数据导入所述蜂王浆近红外定量校正模型，获得所述待测样品中10-羟基癸烯酸的含量。
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