CN102106939A - 一种六味地黄丸浓缩丸提取浓缩液质量控制方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供一种六味地黄丸浓缩丸提取浓缩液质量控制方法，包括如下步骤：步骤1、测定合格六味地黄丸浓缩丸提取浓缩液的比重、丹皮酚和马钱苷含量，并采集近红外光谱；步骤2、采用化学计量学软件分别建六味地黄丸浓缩丸提取浓缩液近红外光谱与比重、丹皮酚和马钱苷浓度之间的对应模型；步骤3、测定待测的六味地黄丸浓缩丸提取浓缩液样品的近红外光谱；步骤4、利用对应模型，通过化学计量学软件分别获得待测的六味地黄丸浓缩丸提取浓缩液样品的比重、丹皮酚和马钱苷浓度。

Description

一种六味地黄丸浓缩丸提取浓缩液质量控制方法

技术领域

本发明涉及中药成药质量控制，具体涉及一种快速测定六味地黄丸浓缩丸提取浓缩液比重及马钱苷、丹皮酚含量含量的方法。

技术背景

中药是我国最具有原创和自主知识产权的产业之一。中成药与饮片是中药的主要临床应用形式。由于中药疗效的物质基础的复杂性，中成药的质量控制技术手段较为粗放，体现在中成药的质量控制采用的是工艺制法控制，加上代表性的化学指标性成分定量检测和制剂定性检查。即，“过程上的定性加点上的定量”。没有全过程的以理化指标为基础的全面质量控制，这是导致中成药质量、临床疗效稳定性差的重要原因之一。

六味地黄丸系北宋名医钱仲阳之名方，始载于《小儿药证直诀》，由熟地黄、山萸肉、山药、泽泻、牡丹皮、茯苓等六味药以8-4-4-3-3-3重量比例组成。六味地黄丸滋补肾阴，为治疗肾阴不足的基本药方。现代药理研究表明该方具有免疫系统调节、延缓衰老、降血糖作用，具有对心血管系统的保护作用，抗肿瘤的作用，能改善肾功能、促进肾脏对体内代谢产物尿素的排泄等；临床用于治疗慢性肾炎、高血压、糖尿病、神经衰弱等。

六味地黄丸浓缩丸为六味地黄丸采用现代制剂工艺对部分药材进行提取浓缩后改剂而成，其制剂过程较长，制剂过程如下：处方熟地黄120g，山茱萸(制)60g，牡丹皮45g，山药60g，茯苓45g，泽泻45g六味，牡丹皮提取丹皮酚；药渣与山茱萸20.3g、熟地黄、茯苓、泽泻加水煎煮二次，每次2小时，合并煎液，滤过，滤液浓缩至相对密度为1.35-1.40的稠膏；山药与剩余山茱萸粉碎成细粉，过筛，混匀；将以上稠膏、细粉、丹皮酚混匀，制丸，干燥，打光，即得。该制剂过程主要为煎煮和浓缩，药材及提取物受热时间长，现有技术标准规定了成品需要进行【性状】、【鉴别】、【检查】、【含量测定】等内容，过程质量控制内容仅仅规定了操作工艺参数而无过程质量控制手段。

近红外光谱定性定量检测技术是建立在传统理化分析手段基础上的二级分析方法，依赖于近红外光谱仪、计算机技术和化学计量学软件基础，是目前应用在化工烟草、石油等行业较为成熟的在线和快速检测手段。

近红外光谱法技术应用于中成药的质量控制研究近年来逐渐增加。仅就六味地黄丸成品的单成分快速测定指标就包括水分、丹皮酚、熊果酸；还有多指标同时测定，如六味地黄丸成品水分、丹皮酚、马钱苷三指标的同时测定^[6]；也有进行近红外分析模型与毛细管电泳指纹(特征)图谱相关性^[7]，都获得了很好的预测模型。此外，文献^[8]还成功建立了从18种中药丸剂中定性鉴别六位地黄丸的近红外快速鉴别分析方法，文献^[9]还成功建立以均匀度为基础的六味地黄丸粉末混合过程在线近红外监测方法，文献^[10]还成功建立以标准样为基础的六味地黄丸近红外质量控制及真伪鉴别模型。但尚未见到以生产过程控制为目标，同时进行理化指标测定的研究报道。

发明内容

为了进一步提高和稳定六味地黄丸浓缩丸的产品质量，克服中成药无生产过程的理化指标在线控制，本发明应用声光可调(AOTF)-近红外光谱技术对六味地黄丸浓缩丸比重和指标成分进行连续取样和现场分析，结合传统定量检测，建立了在线应用的六味地黄丸浓缩丸提取浓缩液比重、指标成分的近红外模型。

本发明的质量控制方法，具体涉及一种快速测定六味地黄丸浓缩丸提取浓缩液近红外光谱，比重及丹皮酚和马钱苷含量的方法，其特征在于包括如下步骤：

步骤1、测定合格六味地黄丸浓缩丸提取浓缩液的比重、丹皮酚和马钱苷含量，并采集近红外光谱；

步骤2、采用化学计量学软件分别建六味地黄丸浓缩丸提取浓缩液近红外光谱与比重、丹皮酚和马钱苷含量之间的对应模型；

步骤3、测定待测的六味地黄丸浓缩丸提取浓缩液样品的近红外光谱；

步骤4、利用对应模型，通过化学计量学软件分别获得待测的六味地黄丸浓缩丸提取浓缩液样品的比重、以及丹皮酚和马钱苷的含量。

所述六味地黄丸浓缩丸提取浓缩液制备及测定方法如下：

按照法定标准六味地黄丸浓缩丸处方，取处理好的牡丹皮，提取丹皮酚，收集丹皮酚；药渣与山茱萸、熟地黄、茯苓、泽泻加水煎煮二次，每次2小时，合并煎液；取煎煮液和丹皮酚蒸馏母液，滤过，滤液于50～70℃真空浓缩至相对比重为1.35～1.40的稠膏，现场收集浓缩液，取样测定比重、丹皮酚和马钱苷含量，并采集近红外光谱。

本发明所述的方法，其特征在于：采集六味地黄丸浓缩丸提取浓缩液近红外光谱采集时，采用透射方式进行，每一张光谱都是1-1000次扫描的平均结果，分辨率0.3-20nm，扫描光谱范围为1100-2300nm。

本发明所述的方法，其特征在于：采集六味地黄丸浓缩丸提取浓缩液近红外光谱时，采用透射方式进行，每一张光谱都是200-500次扫描的平均结果，分辨率1-5nm，扫描光谱范围为1100-2300nm。

本发明所述的方法，其特征在于：采集六味地黄丸浓缩丸提取浓缩液近红外光谱时，采用透射方式进行，每一张光谱都是300次扫描的平均结果，分辨率2nm，扫描光谱范围为1100-2300nm。

本发明所述的方法，其特征在于：采集六味地黄丸浓缩丸提取浓缩液近红外光谱时，以现场取样方式、在线取样方式和旁线取样方式之一进行。

本发明所述的方法，其特征在于：样品马钱苷采用RP-HPLC对连续收集的所有浓缩液样品进行含量分析，采用色谱柱YMC ODS分析柱(6×150mm，5μm，柱温25℃)，流动相为四氢呋喃-甲醇-乙腈-0.05％磷酸溶液(1∶4∶8∶87)，进样体积20uL，流速1ml/min，UV检测波长236nm；

本发明所述的方法，其特征在于：样品丹皮酚采用RP-HPLC对连续收集的所有浓缩液样品进行含量分析，采用色谱柱YMC ODS分析柱(6×150mm，5μm，柱温25℃)，流动相为甲醇-水(58∶42)，进样体积20uL，流速1ml/min，UV检测波长274nm。

本发明所述的方法，其特征在于：步骤2中模型的建立包括(1)一阶导数9点平滑法(savitzky-golay)光谱预处理；(2)采用偏最小二乘法(PLS1)、交叉-验证法(cross-validation)用Unscrambler定量分析软件建立模型；(3)模型校正和预测效果验证。

本发明所述的方法，其特征在于：步骤2中模型的建立包括(1)一阶导数9点平滑法(savitzky-golay)光谱预处理；(2)采用偏最小二乘法(PLS1)、交叉-验证法(cross-validation)用Unscrambler定量分析软件建立模型；(3)模型校正和预测效果验证；(4)精密度试验；(5)稳定性试验。

本发明采用AOTF-近红外光谱技术建立六味地黄丸浓缩丸提取浓缩液比重、马钱苷及丹皮酚含量的数学模型，可以快速在线监测六味地黄丸浓缩丸提取浓缩过程。该方法操作简便、分析迅速，为六味地黄丸浓缩丸提取浓缩过程中指标成分及物理指标快速定量分析和生产过程中的在线检测，控制产品的质量提供了高效的分析方法。

附图说明

图1马钱苷对照品HPLC图谱

图2六味地黄丸浓缩丸提取浓缩液样品HPLC图谱1

图3丹皮酚对照品HPLC图谱

图4六味地黄丸浓缩丸提取浓缩液样品HPLC图谱2

图5六味地黄丸浓缩丸提取浓缩液样品近红外光谱原始总光谱图

图6六味地黄丸浓缩丸提取浓缩液样品近红外光谱一阶导数光谱图

具体实施方式

下面结合实施例进一步说明本发明，但不表明对本发明权利要求的限制。

实施例1

仪器与试药

仪器AOTF便携式Luminar 5030-731近红外光谱分析仪(美国BRIMROSE公司)，配套SNAP光谱采集软件和CAMO化学计量学软件；Aglient1100色谱仪(美国Agilent公司)，DAD二极管阵列检测器；安东帕便携式比重计DMA35(奥地利Anton Paar公司)；多功能提取罐(常熟市医药化工设备总厂)，真空减压浓缩罐(常熟市医药化工设备总厂)。

试药牡丹皮药材、山茱萸药材、熟地黄药材、茯苓药材、泽泻药材(江西汇仁药业有限公司)；丹皮酚对照品、马钱苷对照品(中国药品生物制品检定所)；甲醇、乙腈为色谱纯试剂，四氢呋喃，磷酸为分析纯，水为超纯水。

方法与结果

1样品制备与收集

取处理好的牡丹皮900g，提取丹皮酚，收集丹皮酚，总量约10g；丹皮酚药渣与山茱萸406g、熟地黄2400g、茯苓900g、泽泻900g加水煎煮二次，每次2小时，合并煎液，总量约2500ml；取煎煮液和丹皮酚蒸馏母液，滤过，滤液于50～70℃真空浓缩至相对比重为1.35～1.40的稠膏，现场收集浓缩液，每50ml一份，取样测定比重及丹皮酚和马钱苷含量，并采集近红外光谱，共收集样品50份。

2样品马钱苷、丹皮酚HPLC分析

2.1样品马钱苷HPLC分析 采用RP-HPLC对连续收集的所有浓缩液样品进行马钱苷量分析，分析条件：色谱柱YMC ODS分析柱(6×150mm，5μm，柱温25℃)，流动相为四氢呋喃-甲醇-乙腈-0.05％磷酸溶液(1∶4∶8∶87)，进样体积20uL，流速1ml/min，UV检测波长236nm，运行时间15min。重现性变异系数分别为0.66％(n＝3)，图谱见附图1、附图2。校正集样品结果带入软件建立模型，验证集样品用于模型验证。

2.2样品丹皮酚HPLC分析 采用RP-HPLC对连续收集的所有浓缩液样品进行丹皮酚含量分析，分析条件：色谱柱YMC ODS分析柱(6×150mm，5μm，柱温25℃)，流动相为甲醇-水(58∶42)，进样体积20uL，流速1ml/min，UV检测波长274nm，运行时间30min。重现性变异系数分别为0.45％(n＝3)，图谱见附图3、附图4。校正集样品结果带入软件建立模型，验证集样品用于模型验证。

3样品比重测定

采用安东帕便携式比重计DMA35测定(室温)。

4获取NIR光谱

扫描光谱时在样品溶液中浸入NIR光谱仪自带的光纤透射式探头，光纤长2m，待溶液稳定并无气泡后进行扫描.测试条件为：扫描次数300次，分辨率2nm，扫描光谱范围为1100～2300nm。共得到50个样品的总光谱图，见附图5。

5建立模型

5.1光谱预处理 对扫描得到的原始吸收光谱进行光谱预处理，以消除噪音和基线漂移的影响。采用的预处理方法为一阶导数9点平滑法(savitzky-golay)，一阶导数光谱图见附图6。经一阶导数处理可以很好的消除样品由于颜色差别引起的光谱基线偏移和漂移。

5.2建立PLS1数学模型 样品分别顺序编号，随机选择10个作为外部验正集样品，其余作为建模样品。将经过预处理后的光谱数据与HPLC分析数据进行关联，采用偏最小二乘法(PLS1)，交叉-验证法(cross-validation)，用Unscrambler定量分析软件建立模型。NIR和HPLC测定的异常值分别采用光谱影响值Leverage和化学值误差Residual这2个统计量来检验剔除。经过异常值的剔除进行优化，得到较为理想的校正模型。得到的样品比重及马钱苷、丹皮酚的NIR光谱预测值与样品比重实测值及HPLC分析值之间相关性良好，测定数据偏差较小。样品比重模型的主成分维数为4，R²＝0.9945，RMSECV＝0.003760；马钱苷模型的主成分维数为4，R²＝0.9967，RMSECV＝0.010015，丹皮酚模型的主成分维数为5，R²＝0.9522，RMSECV＝0.430716。

5.3模型预测效果验证 以建立的校正模型对10份外部验正集样品进行分析。样品比重及马钱苷、丹皮酚的测试结果分别见附表1。NIR光谱预测值与样品比重真值、马钱苷及丹皮酚HPLC测定真值的相关系数R²分别为0.994，0.997，0.992。结果表明，NIR光谱预侧值与样品比重实测值及HPLC分析值之间相关性良好。

6精密度试验

取1个预测样品，重复扫描20次，将所得光谱带入建立的校正模型计算含量，以考察方法的精密度，结果浓缩液比重和马钱苷、丹皮酚含量的RSD分别为0.05％，0.83％，2.00％，表明仪器精精密度良好。

7稳定性试验

取1个预测样品，每1h扫描一次，于5h内重复扫描5次，考察样品的稳定性。结果样品比重的RSD为1.08％，马钱苷苷的RSD为1.97％，丹皮酚的RSD为1.46％，表明样品在5h内相对稳定。

8预测回收率试验

取5个预测样品，分别扫描，将所得光谱带入建立的校正模型，计算比重和马钱苷、丹皮酚预测值与比重测定及HPLC测定的真值之间的比值(预测回收率)，样品比重和马钱苷、丹皮酚的预测回收率分别为99.9％，100.2％，92.8％。本研究采用在线取样方式建立六味地黄丸浓缩丸提取浓缩液的AOTF-近红外光谱模型并校正确立后，完成1次测量只需2min；而HPLC测定以上指标需分别提取和测试，测试过程约需3h。AOTF-NIR技术测定浓缩六味地黄丸浓缩液中马钱苷、丹皮酚及浓缩液比重，集快速、直接、多成分同时测定和能够实现现场分析为一体，解决了六味地黄丸浓缩丸提取液浓缩过程中定量分析的操作复杂、分析周期长，不能用于在线检测的问题，分析结果令人满意，各项分析参数能够基本满足中药制剂生产过程中现场检测的要求。本方法为实现浓缩六味地黄丸浓缩丸制剂生产过程中的理化指标的在线质量控制提供了有效方法和技术基础。

附表1六味地黄丸浓缩丸提取浓缩液理化指标校正模型对外部验证集样品的分析结果(n＝10)

Claims (10)

1.一种测定六味地黄丸浓缩丸提取浓缩液比重及马钱苷、丹皮酚含量的方法，其特征在于包括如下步骤：

步骤1、测定合格六味地黄丸浓缩丸提取浓缩液的比重及丹皮酚和马钱苷含量，并采集近红外光谱；

步骤2、采用化学计量学软件分别建立六味地黄丸浓缩丸提取浓缩液近红外光谱与比重、丹皮酚和马钱苷含量之间的对应模型；

步骤3、测定待测的六味地黄丸浓缩丸提取浓缩液样品的近红外光谱；

步骤4、利用对应模型，通过化学计量学软件分别获得待测的六味地黄丸浓缩丸提取浓缩液样品的比重及丹皮酚和马钱苷含量。

2.如权利要求1所述的方法，其特征在于：其特征在于：采集六味地黄丸浓缩丸提取浓缩液近红外光谱采集时，采用透射方式进行，每一张光谱都是1-1000次扫描的平均结果，分辨率0.3-20nm，扫描光谱范围为1100-2300nm。

3.如权利要求1所述的方法，其特征在于：采集六味地黄丸浓缩丸提取浓缩液近红外光谱时，采用透射方式进行，每一张光谱都是200-500次扫描的平均结果，分辨率1-5nm，扫描光谱范围为1100-2300nm。

4.如权利要求1所述的方法，其特征在于：采集六味地黄丸浓缩丸提取浓缩液近红外光谱时，采用透射方式进行，每一张光谱都是300次扫描的平均结果，分辨率2nm，扫描光谱范围为1100-2300nm。

5.如权利要求1所述的方法，其特征在于：样品马钱苷采用RP-HPLC对连续收集的所有浓缩液样品进行含量分析，采用色谱柱YMC ODS分析柱(6×150mm，5μm，柱温25℃)，流动相为四氢呋喃-甲醇-乙腈-0.05％磷酸溶液(1∶4∶8∶87)，进样体积20uL，流速1ml/min，UV检测波长236nm。

6.如权利要求1所述的方法，其特征在于：样品样品丹皮酚采用RP-HPLC对连续收集的所有浓缩液样品进行含量分析，采用色谱柱YMC ODS分析柱(6×150mm，5μm，柱温25℃)，流动相为甲醇-水(58∶42)，进样体积20uL，流速1ml/min，UV检测波长274nm。

7.如权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤2中模型的建立包括(1)一阶导数9点平滑法(savitzky-golay)光谱预处理；(2)采用偏最小二乘法(PLS1)、交叉-验证法(cross-validation)用Unscrambler定量分析软件建立模型；(3)模型校正和预测效果验证。

8.如权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤2中模型的建立包括(1)一阶导数9点平滑法(savitzky-golay)光谱预处理；(2)采用偏最小二乘法(PLS1)、交叉-验证法(cross-validation)用Unscrambler定量分析软件建立模型；(3)模型校正和预测效果验证；(4)精密度试验；(5)稳定性试验。

9.如权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤如下：

步骤1、测定合格六味地黄丸浓缩丸提取浓缩液的比重、丹皮酚和马钱苷含量，并采集近红外光谱；

取处理好的牡丹皮900g，提取丹皮酚，收集丹皮酚，总量约10g；丹皮酚药渣与山茱萸406g、熟地黄2400g、茯苓900g、泽泻900g加水煎煮二次，每次2小时，合并煎液，总量约2500ml；取煎煮液和丹皮酚蒸馏母液，滤过，滤液于50～70℃真空浓缩至相对比重为1.35～1.40的稠膏，现场收集浓缩液，每50ml一份，取样测定比重及丹皮酚和马钱苷含量，并采集近红外光谱，共收集样品50份，

样品马钱苷HPLC分析 采用RP-HPLC对连续收集的所有浓缩液样品进行马钱苷量分析，分析条件：色谱柱YMC ODS分析柱(6×150mm，5μm，柱温25℃)，流动相为四氢呋喃-甲醇-乙腈-0.05％磷酸溶液(1∶4∶8∶87)，进样体积20uL，流速1ml/min，UV检测波长236nm，运行时间15min，重现性变异系数分别为0.66％(n＝3)，图谱见附图1、附图2，校正集样品结果带入软件建立模型，验证集样品用于模型验证，

样品丹皮酚HPLC分析 采用RP-HPLC对连续收集的所有浓缩液样品进行丹皮酚含量分析，分析条件：色谱柱YMC ODS分析柱(6×150mm，5μm，柱温25℃)，流动相为甲醇-水(58∶42)，进样体积20uL，流速1ml/min，UV检测波长274nm，运行时间30min，重现性变异系数分别为0.45％(n＝3)，图谱见附图3、附图4，校正集样品结果带入软件建立模型，验证集样品用于模型验证，

样品比重测定

采用安东帕便携式比重计DMA35测定(室温)，

获取NIR光谱

扫描光谱时在样品溶液中浸入NIR光谱仪自带的光纤透射式探头，光纤长2m，待溶液稳定并无气泡后进行扫描.测试条件为：扫描次数300次，分辨率2nm，扫描光谱范围为1100～2300nm，共得到50个样品的总光谱图，见附图5，

步骤2、采用化学计量学软件分别建六味地黄丸浓缩丸提取浓缩液近红外光谱与比重、丹皮酚和马钱苷浓度之间的对应模型；

光谱预处理 对扫描得到的原始吸收光谱进行光谱预处理，以消除噪音和基线漂移的影响，采用的预处理方法为一阶导数9点平滑法(savitzky-golay)，一阶导数光谱图见附图6，经一阶导数处理可以很好的消除样品由于颜色差别引起的光谱基线偏移和漂移，

建立PLS1数学模型 样品分别顺序编号，随机选择10个作为外部验正集样品，其余作为建模样品，将经过预处理后的光谱数据与HPLC分析数据进行关联，采用偏最小二乘法(PLS1)，交叉-验证法(cross-validation)，用Unscrambler定量分析软件建立模型，NIR和HPLC测定的异常值分别采用光谱影响值Leverage和化学值误差Residual这2个统计量来检验剔除，经过异常值的剔除进行优化，得到较为理想的校正模型，得到的样品比重及马钱苷、丹皮酚的NIR光谱预测值与样品比重实测值及HPLC分析值之间相关性良好，测定数据偏差较小，样品比重模型的主成分维数为4，R²＝0.9945，RMSECV＝0.003760；马钱苷模型的主成分维数为4，R²＝0.9967，RMSECV＝0.010015，丹皮酚模型的主成分维数为5，R²＝0.9522，RMSECV＝0.430716，

步骤3、测定待测的六味地黄丸浓缩丸提取浓缩液样品的近红外光谱；

步骤4、利用对应模型，通过化学计量学软件分别获得待测的六味地黄丸浓缩丸提取浓缩液样品的比重、丹皮酚和马钱苷含量。

10.如权利要求1所述的方法，其特征在于：所述六味地黄丸浓缩丸提取浓缩液制备及测定方法如下：

按照法定标准六味地黄丸浓缩丸处方，取处理好的牡丹皮，提取丹皮酚，收集丹皮酚；药渣与山茱萸、熟地黄、茯苓、泽泻加水煎煮二次，每次2小时，合并煎液；取煎煮液和丹皮酚蒸馏母液，滤过，滤液于50～70℃真空浓缩至相对比重为1.35～1.40的稠膏，现场收集浓缩液，取样测定比重、丹皮酚和马钱苷含量，并采集近红外光谱。

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