CN107024446A - 一种六味地黄丸小蜜丸生药粉多指标快速检测方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供一种六味地黄丸小蜜丸生药粉多指标快速检测方法，包括以下步骤：(1)收集不同生产批次的六味地黄丸小蜜丸生药粉；(2)测定小六味地黄丸生药粉中的质控指标：包括水分、芍药苷、马钱苷、丹皮酚；(3)采集六味地黄丸小蜜丸生药粉的近红外光谱数据；(4)近红外光谱建模波段选择以及光谱预处理；(5)建立基于主成分分析的人工神经网络计算方法建立近红外光谱特征信息与六味地黄丸小蜜丸生药粉中水分、芍药苷、马钱苷和丹皮酚含量的定量校正模型；(6)用所建模型快速测定未知的六味地黄丸小蜜丸生药粉中水分、马钱苷、芍药苷和丹皮酚含量。本发明所建立的分析方法较传统方法更为快速、绿色。
Description
技术领域
本发明属于近红外检测领域，具体涉及一种基于主成分分析的反向人工神经网络算法的六味地黄丸小蜜丸生药粉多指标快速检测方法。
背景技术
六味地黄丸小蜜丸生药粉是熟地黄、酒萸肉、牡丹皮、山药、茯苓和泽泻这六种药材以一定的比例粉碎成细粉，过筛，混匀得到的粉末。六味地黄丸小蜜丸生药粉是六味地黄丸小蜜丸生产中重要的原药材。2010版中国药典中记载六味地黄丸具有滋阴补肾的功效，可用于肾阴亏损，头晕耳鸣，腰膝酸软，骨蒸潮热，盗汗遗精，消渴。六味地黄丸小蜜丸生药粉是多种药材的混合，其化学成分比较复杂，主要包括多糖、丹皮酚、芍药苷、马钱苷、莫诺苷等化学物质。
近红外(NIR)光谱技术作为一种快速无损的绿色分析技术，具有快速分析、样品处理简单、无需消耗试剂等特点。近年来，近红外光谱技术作为一种间接分析技术，已经陆续用于药效成分的含量测定、制药过程的在线检测和监控、天然药物鉴别、中药材的产地鉴别等。将近红外光谱技术应用于六味地黄丸小蜜丸生药粉的质量快速检测，从六味地黄丸小蜜丸生产的源头控制其质量，从而保证最终产品质量的安全性、稳定性和有效性，达到快速、高效质量控制的目的。
偏最小二乘回归法(PLSR)、人工神经网络法(ANN)、多元线性回归(MLR)、支持向量机法(SVM)等是近红外定量分析常用的建模方法。反向人工神经网络法(BP-ANN)是应用最广泛的人工神经网络，当样品物化性质区域较大及非线性效应较强时，其显示出较强的预测能力。BP人工神经网络是一种有监督的前馈运行的人工神经网络，它由输入层、隐含层、输出层以及各层之间的节点的连接权所组成。这个学习过程的算法由信息的正向传播和误差的反向传播构成。在正向传播过程中，输入信息从输入层经隐含层逐层处理，并传向输出层，每一层神经元只影响下一层神经元的输出。如果不能在输出层得到期望的输出，则转入反向传播。主成分分析-反向人工神经网络方法是先对光谱输入变量进行主成分分析，以消除变量间相关性和冗余信息，提取主特征变量。使用少数的主特征变量作为神经网络的输入，用于建立预测模型，使建模效率和预测精度大大提高。本研究建立一种基于主成分分析的反向人工神经网络算法的六味地黄丸小蜜丸生药粉中多个指标快速检测方法。
近年来，近红外光谱技术已经广泛应用于原药材、成品及制药过程中关键指标的检测。近红外光谱应用于六味地黄丸已有文献“六味地黄丸近红外光谱定性分析方法的建立”、“近红外光谱法快速检测六味地黄丸中的定量指标”、“近红外漫反射光谱法快速鉴别不同厂家的六味地黄丸”等。然而这些文献多数针对是六味地黄丸浓缩丸成品中单一或少数指标成分，且多数采用偏最小二乘回归算法作为定量模型的建模方法，将基于主成分分析的反向人工神经网络用于六味地黄丸小蜜丸生药粉中多个质控指标测定仍未见相关报道。本方法在六味地黄丸小蜜丸生药粉及其成品质量快速分析领域具有重要前景和意义。
发明内容
本发明目的在于提供一种六味地黄丸小蜜丸生药粉多指标同时快速检测方法，应用该方法建立的定量校正模型能快速准确地测定水分、芍药苷、马钱苷、丹皮酚4个质控指标的含量，实现对不同批次六味地黄丸小蜜丸生药粉整体质量的全面快速评价。
本发明的目的是通过以下技术方案实现：
一种六味地黄丸小蜜丸生药粉快速检测方法，包括如下步骤：
(1)采集不同生产批次的六味地黄丸小蜜丸生药粉：药材经过粉碎后，过80-120目筛，优选100目筛，混合，得到混合均匀的六味地黄丸小蜜丸生药粉粉末；
(2)测定六味地黄丸小蜜丸生药粉中的关键质控指标：选取水分含量、马钱苷含量、芍药苷含量和丹皮酚含量作为六味地黄丸小蜜丸生药粉的关键质控指标；其中水分含量采用烘干称重法测定，芍药苷、马钱苷和丹皮酚含量采用高效液相色谱法测定：其中液相色谱条件为：色谱柱：C18色谱柱，优选Waters CORTECS C18分析柱，4.6×150mm，2.7μm；流动相：水(A)-乙腈(B)，梯度洗脱；检测波长0-30min，240nm，30-60min，274nm；流速为0.8mL·min-1，进样量为10μL，柱温30℃，所述梯度洗脱按照如下表1进行，
表1梯度洗脱表
(3)采集六味地黄丸小蜜丸生药粉近红外光谱数据：采集六味地黄丸小蜜丸生药粉校正集样品和验证集样品的近红外原始光谱数据，称取六味地黄丸小蜜丸生药粉粉末，采用漫反射内置光源采集近红外光谱，粉末厚度为1cm，以空气为参比，扫描次数为32，分辨率为8cm-1，扫描光谱范围为4000～10000cm-1，通过3次重复装样扫描得到3张光谱，平均光谱后得到该药材样本的最终光谱图；
(4)选择合适的近红外光谱建模波段和近红外原始光谱预处理方法：针对步骤(3)采集的近红外原始光谱数据，包括校正集和验证集样本，采用标准正则化变换(SNV)和二阶导数法(Savitzky-Golay平滑)预处理，分别用于消除基线漂移、噪音及固体颗粒对光谱的影响；预处理后，建模波段选择为：水分和芍药苷含量模型采用4500～7500cm-1波段，马钱苷含量模型采用7400～8200cm-1和9291～9345cm-1波段，丹皮酚含量模型采用4600～6900cm-1波段；
(5)建立六味地黄丸小蜜丸生药粉中各关键质控指标的近红外定量校正模型：应用化学计量学软件将所得到的近红外光谱信息和参比方法所测得的标准值进行关联，采用基于主成分的反向人工神经网络(PCA-BPANN)建立近红外光谱和关键质控指标之间的定量校正模型；
(6)测定待测的六味地黄丸小蜜丸生药粉样品的近红外光谱数据，导入步骤(5)所述定量校正模型，经模型计算得到待测样品中水分、马钱苷、芍药苷、丹皮酚的预测含量。
本发明所述步骤(5)具体实现如下：经步骤(4)对光谱进行波段选择和预处理后，采用基于主成分分析的BP人工神经网络(PCA-BPANN)计算方法建立近红外特征光谱信息与水分含量、芍药苷含量、马钱苷含量和丹皮酚含量这4个质控指标的定量校正模型，并通过各模型性能评价指标考察模型性能，将验证集数据导入已建的PCA-BPANN定量校正模型，通过模型性能评价指标判断模型的稳定性和预测能力；其中应用主成分分析法(PCA)对六味地黄丸小蜜丸生药粉光谱特征变量进行数据降维处理，提取出有效的主特征变量，作为反向人工神经网络的输入层单元数，将已测得的校正集样本各质控指标的含量作为标准输出，建立隐藏层为2的反向人工神经网络(BP-ANN)网络模型；根据模型的精密度和预测的准确性，寻找最优隐藏层单元数，输入层到隐含层的传递函数为正切S形传递函数(Tansig)，隐含层到输出层的传递函数为线性传递函数(Purelin)，同时采用Levenberg-Marquardt规则训练网络，学习速率为0.1，重复训练次数为1000，训练终止目标为4×10-7；最终经校正集样本数据训练得到六味地黄丸小蜜丸生药粉各质控指标的基于主成分分析的反向人工神经网络(PCA-BP-ANN)定量模型；利用验证集样品对训练好的PCA-BPANN定量模型进行验证和测试，输入经同样预处理的验证集样本近红外光谱数据，输出为该样本近红外光谱所对应的六味地黄丸小蜜丸生药粉水分、芍药苷、马钱苷和丹皮酚的含量。通过模型性能评价指标判断4个定量模型的稳定性和预测能力；所述定量校正模型性能评价指标包括：相关系数(R)、校正集均方差(RMSEC)、预测集均方差(RMSEP)、相对偏差(RSEP)。当R值接近于1，RMSEC和RMSEP值较小且互相接近时，说明模型的稳定性好，预测精度高。当RSEP值小于10％时，评价模型具有较好的预测能力，能够满足六味地黄丸小蜜丸生药粉快速检测的要求。
本发明的有益效果：
(1)本发明将近红外光谱技术引入到六味地黄丸小蜜丸生药粉检测领域中，并将反向人工神经网络理论与近红外光谱技术相结合，先利用主成分分析(PCA)进行光谱数据有效特征提取，提高数据处理效率和模型训练精度，建立六味地黄丸小蜜丸生药粉中水分含量、马钱苷含量、芍药苷含量、丹皮酚含量的近红外定量校正模型，可以同时对水分、芍药苷、马钱苷和丹皮酚含量进行快速无损分析，分析结果准确可靠，与常规的复杂分析方法相比，本发明所建立的近红外快速分析方法操作简便，准确有效，能用于六味地黄丸小蜜丸生药粉成分快速测定。
(2)本发明从源头上控制了原料药材的质量，缩短检测时间，节约生产成本，提高生产效率和经济效益，能全面反映六味地黄丸小蜜丸生药粉的质量，保证六味地黄丸小蜜丸成品质量的安全性、有效性和均一性。
附图说明
附图1是六味地黄丸小蜜丸生药粉近红外原始吸收光谱图
附图2是六味地黄丸小蜜丸生药粉水分含量实测值与近红外预测值的相关图
附图3是六味地黄丸小蜜丸生药粉验证集水分含量实测值与预测值柱状图
附图4是六味地黄丸小蜜丸生药粉芍药苷含量实测值与近红外预测值的相关图
附图5是六味地黄丸小蜜丸生药粉验证集芍药苷含量实测值与预测值柱状图
附图6是六味地黄丸小蜜丸生药粉马钱苷含量实测值与近红外预测值的相关图
附图7是六味地黄丸小蜜丸生药粉验证集马钱苷含量实测值与预测值柱状图
附图8是六味地黄丸小蜜丸生药粉丹皮酚含量实测值与近红外预测值的相关图
附图9是六味地黄丸小蜜丸生药粉验证集丹皮酚含量实测值与预测值柱状图
具体实施方式
实施例1
(1)采集不同生产批次的六味地黄丸小蜜丸生药粉：采集53批次六味地黄丸小蜜丸生药粉，由六味地黄丸小蜜丸处方药材经过粉碎后，过100目筛，混合，得到混合均匀的六味地黄丸小蜜丸生药粉粉末；
(2)测定六味地黄丸小蜜丸生药粉中的关键质控指标：
①六味地黄丸小蜜丸水分含量测定
水分测定方法：根据药典烘干法，取烘干至恒重(连续两次称重差异小于5mg)的扁形瓶(X0)，取2g六味地黄丸小蜜丸生药粉，精密称重(X1)，置真空烘箱中105℃烘5h，取出置干燥器中冷却30min，称重，再置真空烘箱中烘1h，称重(X2)，重量差异5mg以上者继续置烘箱中烘，直至差异小于5mg。根据减少的重量，计算供试品中含水量(％)。
水分含量(％)＝(X1－X2+X0)/X1×100
②六味地黄丸小蜜丸生药粉中芍药苷、马钱苷和丹皮酚含量测定
芍药苷、马钱苷和丹皮酚含量采用高效液相色谱法测定：a.预处理方法为：取六味地黄丸小蜜丸生药粉粉末约1g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加50mL的甲醇，超声0.5h，再称重，用甲醇补足失重。提取液至1.5mL的离心管中离心10min，转速为13000r·min-1，取上清液，既得。b.液相色谱条件：色谱柱：Waters CORTECS C18分析柱(4.6×150mm，2.7μm)；流动相：乙腈(B)-水(A)为流动相，梯度洗脱(按0～30min，流动相(B)5→15％，30～35min，流动相(B)15％，35～60min，15→60％)；检测波长0～30min:240nm，30～60min:274nm；流速为0.8mL·min-1；进样量为10μL；柱温30℃，理论塔板数按丹皮酚计算不应低于3500。
(3)采集六味地黄丸小蜜丸生药粉校正集样品和验证集样品的近红外原始光谱数据：
将53批次(包括37个校正集，16个验证集)六味地黄丸小蜜丸生药粉，称取一定质量的六味地黄丸小蜜丸生药粉，采用漫反射内置光源采集近红外光谱，粉末厚度为1cm，以空气为参比，扫描次数为32，分辨率为8cm-1，扫描光谱范围为4000-10000cm-1，通过3次重复装样扫描得到3张光谱，平均光谱后得到该药材样本的最终光谱图。六味地黄丸小蜜丸生药粉近红外吸收光谱图见附图1。
(4)选择合适的近红外光谱建模波段和近红外原始光谱预处理方法
采用标准正则化变换(SNV)和二阶导数法(Savitzky-Golay平滑)预处理近红外光谱原始数据，分别用于消除基线漂移、噪音及固体颗粒等对光谱的影响。光谱预处理后，进行建模波段选择：水分和芍药苷含量模型采用4500～7500cm-1波段，马钱苷含量模型采用7400～8200cm-1和9291～9345cm-1波段，丹皮酚含量模型采用4600～6900cm-1波段。
(5)六味地黄丸小蜜丸生药粉的近红外定量校正模型建立：
①水指标的近红外定量校正模型：在4500～7500cm-1范围内，对预处理后的近红外光谱数据(包括37个校正集，16个验证集)，首先应用主成分分析法(PCA)对六味地黄丸小蜜丸生药粉校正集样本光谱特征变量进行降维，提取出前25个主成分，其累计贡献率达到99％以上，作为反向人工神经网络(BP-ANN)的输入层单元数，将已测得的37个校正集样本水分含量作为标准输出层，建立2层结构BPANN模型。通过选择不同的中间隐藏层单元数进行反复试验，最终确定了经校正集样本训练得到PCA-BPANN定量校正模型。
②马钱苷、芍药苷和丹皮酚近红外定量模型：对预处理后的近红外光谱数据，利用主成分分析法进行数据降维，对于芍药苷、丹皮酚和马钱苷分别提取出前35、33、33个主成分为主特征变量，其累计总贡献率均大于99％。因此将主特征变量作为BP神经网络的输入，将已测得的37个校正集样品的马钱苷、芍药苷和丹皮酚含量作为标准输出，建立隐藏层为2的BPANN模型。最终确定隐藏层单元数分别为10，10时，训练结束后得到的芍药苷、丹皮酚和马钱苷含量的PCA-BPANN模型精度最高。
③六味地黄丸小蜜丸生药粉中各指标近红外定量模型的建立及验证
随机选择约三分之二样本作为校正集，剩余的三分之一样本作为验证集用于预测。建立隐藏层为2的BP-ANN网络模型。根据模型的精密度和预测的准确性，寻找最优隐藏层单元数，输入层到隐含层的传递函数为正切S形传递函数(Tansig)，隐含层到输出层的传递函数为线性传递函数(Purelin)，同时采用Levenberg-Marquardt规则训练网络，学习速率为0.1，重复训练次数为1000，训练终止目标为4×10-7。最终经校正集样本数据训练得到六味地黄丸小蜜丸生药粉各质控指标的PCA-BP-ANN定量模型。
所建立的定量校正模型采用相关系数(R)、校正集均方差(RMSEC)、预测集均方差(RMSEP)等参数来考察模型性能，当模型相关系数R越接近1，分析准确度越高，当RMSEC和RMSEP值越小且彼此越接近时，模型具有较高的预测能力。同时采用预测相对偏差(RSEP)来评价模型对未知样品的预测能力，当RSEP值小于10％且越小时评价模型具有较好的预测能力，能够满足六味地黄丸生药粉有效成分指标成分快速检测的要求。
表2为六味地黄丸小蜜丸生药粉中各个指标模型评价结果。从表2中可以看出四个指标的PCA-BPANN模型校正集相关系数均大于0.89，线性良好，RMSEC和RMSEP均较小，且比较接近。对已建立模型进行预测，可以从表中看出已建立的水分模型预测能力较好，RSEP小于5％，另外芍药苷和丹皮酚模型的RSEP小于12％，能够满足粉末近红外光谱建模的预测能力要求。所建立的PCA-BPANN模型的校正和验证结果相近，泛化能力强，具有较好的预测能力和模型稳定性。
表2六味地黄丸小蜜丸生药粉中各指标含量模型评价结果
(6)测定待测的六味地黄丸小蜜丸生药粉样品的近红外光谱数据，导入步骤(5)所述定量校正模型，经模型计算得到待测样品中水分、马钱苷、芍药苷、丹皮酚的预测含量。
将4个定量模型分别用于预测验证集样品中水分、芍药苷、马钱苷和丹皮酚的含量。水分含量的实测值和近红外预测值的比较见附图2-3，芍药苷含量的实测值和近红外预测值的比较见附图4-5，马钱苷含量的实测值和近红外预测值的比较见附图6-7，丹皮酚含量的实测值和近红外预测值的比较见附图8-9。可以看出六味地黄丸小蜜丸生药粉的4个指标含量实测值与近红外预测值接近。表明本发明所采用的方法适用于六味地黄丸小蜜丸生药粉中各指标的快速定量分析，该方法的稳定性和适用性较好。
Claims (6)
1.一种六味地黄丸小蜜丸生药粉快速检测方法，其特征在于，包括如下步骤：
(1)采集不同生产批次的六味地黄丸小蜜丸生药粉：药材经过粉碎后，过80-120目筛，混合，得到混合均匀的六味地黄丸小蜜丸生药粉粉末；
(2)测定六味地黄丸小蜜丸生药粉中的关键质控指标：选取水分含量、马钱苷含量、芍药苷含量和丹皮酚含量作为六味地黄丸小蜜丸生药粉的关键质控指标；
(3)采集六味地黄丸小蜜丸生药粉近红外光谱数据；
(4)选择合适的近红外光谱建模波段和近红外原始光谱预处理方法；
(5)建立六味地黄丸小蜜丸生药粉中各关键质控指标的近红外定量校正模型：应用化学计量学软件将所得到的近红外光谱信息和参比方法所测得的标准值进行关联，采用基于主成分的反向人工神经网络法(PCA-BPANN)建立近红外光谱和关键质控指标之间的定量校正模型；
(6)测定待测的六味地黄丸小蜜丸生药粉样品的近红外光谱数据，导入步骤(5)所述定量校正模型，经模型计算得到待测样品中水分、马钱苷、芍药苷、丹皮酚的预测含量。
2.根据权利要求1所述的快速检测方法，其特征在于，所述步骤(1)中药材经过粉碎后，过100目筛。
3.根据权利要求1所述的快速检测方法，其特征在于，步骤(2)中所述芍药苷、马钱苷和丹皮酚含量采用高效液相色谱法测定：其中液相色谱条件为：色谱柱：C18色谱柱；流动相：水(A)-乙腈(B)，梯度洗脱；检测波长0-30min，240nm，30-60min，274nm；流速为0.8mL·min-1，进样量为10μL，柱温30℃，所述梯度洗脱按照如下表1进行，
表1 梯度洗脱表
4.根据权利要求1所述的快速检测方法，其特征在于，所述步骤(3)通过以下步骤采集近红外光谱数据：称取六味地黄丸小蜜丸生药粉粉末，采用漫反射内置光源采集近红外光谱，粉末厚度为1cm，以空气为参比，扫描次数为32，分辨率为8cm-1，扫描光谱范围为4000～10000cm-1。
5.根据权利要求1所述的快速检测方法，其特征在于，所述步骤(4)通过如下步骤处理：近红外光谱原始数据采用标准正则化变换(SNV)和二阶导数法(Savitzky-Golay平滑)预处理，预处理后，建模波段选择为：水分和芍药苷含量模型采用4500～7500cm-1波段，马钱苷含量模型采用7400～8200cm-1和9291～9345cm-1波段，丹皮酚含量模型采用4600～6900cm-1波段。
6.根据权利要求1所述的快速检测方法，其特征在于，所述步骤(5)中通过如下步骤处理：将预处理并选择波段的近红外光谱进行主成分分析(PCA)以提取六味地黄丸小蜜丸生药粉光谱的主特征变量，作为反向人工神经网络(BP-ANN)的输入层单元数，构建两层结构的人工神经网络模型；经测试得输入层到隐含层的传递函数为正切S形传递函数(Tansig)，隐含层到输出层的传递函数为线性传递函数(Purelin)，同时采用Levenberg-Marquardt规则训练网络，学习速率为0.1，重复训练次数为1000，训练终止目标为4×10-7；最终经校正集样本数据训练得到六味地黄丸小蜜丸生药粉中各关键质控指标的基于主成分分析的反向人工神经网络(PCA-BPANN)定量校正模型，并通过综合评价指标全面考察模型，利用验证集样品对训练好的PCA-BPANN定量模型的稳定性和预测能力进行测试。
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