CN102106956B - 一种测定肾宝合剂渗漉液近红外光谱，比重及淫羊藿苷含量的方法 - Google Patents

Abstract

一种肾宝合剂渗漉液的质量控制方法，具体涉及一种快速测定肾宝合剂渗漉液比重及淫羊藿苷含量的方法，包括如下步骤：步骤1、测定合格的肾宝合剂制备过程中渗漉液近红外光谱，比重及淫羊藿苷含量的标准图谱和数据；步骤2、采用化学计量学软件分别建立渗漉液近红外光谱与比重、淫羊藿苷浓度之间的对应模型；步骤3、测定待测的肾宝合剂制备过程中渗漉液近红外光谱；步骤4、利用步骤2建立的对应模型，通过化学计量学软件分别获得待测的肾宝合剂制备过程中渗漉液样品的比重、淫羊藿苷浓度。

Description

一种测定肾宝合剂渗漉液近红外光谱,比重及淫羊藿苷含量的方法

技术领域：

本发明涉及中药成药质量控制，具体涉及一种快速测定肾宝合剂渗漉液比重及淫羊藿苷含量的方法。 

技术背景：

中药是我国最具有原创和自主知识产权的产业之一。中成药与饮片是中药的主要临床应用形式。由于中药疗效的物质基础的复杂性，中成药的质量控制技术手段较为粗放，体现在中成药的质量控制采用的是工艺制法控制，加上代表性的化学指标性成分定量检测和制剂定性检查。即，“过程上的定性加点上的定量”。没有全过程的以理化指标为基础的全面质量控制，这是导致中成药质量、临床疗效稳定性差的重要原因之一。 

肾宝合剂(肾宝)收录于《中华人民共和国卫生部要药品标准-中药成方制剂(第十五册)》(标准编号WS3-B-2913-98)，由淫羊藿、当归、补骨脂、蛇床子等22味中药组成，具有调和阴阳、温阳补肾、安神固精、扶正固本的作用，是重要的补肾中成药，在中成药临床应用中占有特殊的地位。 

肾宝合剂制剂过程多、流程长，包括渗漉、煎煮、浓缩、醇沉等过程。上述标准中规定：处方二十二味，将蛇床子、淫羊藿、当归、川芎、小茴香粉碎成粗粉，照流浸膏剂与浸膏剂项下的渗漉法，用70％乙醇作溶剂，浸渍48小时，缓缓渗漉，收集渗漉液，回收乙醇减压浓缩至相对密度1.10(热测)，滤过，滤滤备用，将红参粉碎成粗粉，用20％乙醇作溶剂，浸渍8小时后，回流二次，每次2小时，合并回流液，滤过，滤液回收乙醇，浓缩至生药量的二分之一，备用；取覆盆子等十六味，与红参药渣一起，加水煎煮二次，每次2小时，合并煎煮液，滤过，滤液浓缩至稠膏，加三倍量乙醇沉淀48小时，取上清液回收乙醇，浓缩至相对密度1.10(热测)，备用；除红参药液外合并其余两次药液，加入蔗糖200g， 煮沸15分钟，滤过，滤液加入红参药液和苯甲酸钠1g，尼泊金乙酯0.5g，调整总量至1000ml，滤过，即得。其中，淫羊藿等药材渗漉过程时间最长，现有技术标准仅规定了操作工艺参数而无过程质量控制手段。上述标准中仅规定了产品需要进行【性状】、【鉴别】、【检查】。 

近红外定性定量检测技术是建立在传统理化分析手段基础上的二级分析方法，依赖于近红外光谱仪、计算机技术和化学计量学软件基础，是目前应用在化工烟草、石油等行业较为成熟的在线和快速检测手段，尚未应用于肾宝合剂制剂过程的质量控制。 

发明内容：

为了进一步提高和稳定肾宝合剂的产品质量，克服中成药无生产过程的理化指标在线控制，本发明应用声光可调(AOTF)-近红外光谱技术对肾宝渗漉液指标成分淫羊藿苷及渗漉液比重进行连续取样和现场分析，结合传统定量检测，建立了在线应用的肾宝合剂渗漉液指标成分淫羊藿苷及渗漉液比重的近红外模型。 

本发明一种肾宝合剂渗漉液的质量控制方法，具体涉及一种快速测定肾宝合剂渗漉液近红外光谱，比重及淫羊藿苷含量的方法，其特征在于包括如下步骤： 

步骤1、测定合格的肾宝合剂渗漉液近红外光谱，比重及淫羊藿苷含量， 

步骤2、采用化学计量学软件分别建立渗漉液近红外光谱与比重、淫羊藿苷含量之间的对应模型； 

步骤3、测定待测的肾宝合剂渗漉液近红外光谱； 

步骤4、利用步骤2建立的对应模型，通过化学计量学软件分别获得待测的肾宝合剂制备过程中渗漉液样品的比重、淫羊藿苷含量。 

其中肾宝合剂渗漉液的制备方法，比重及淫羊藿苷含量的测定方法如下： 

按照肾宝合剂处方，取处理好的淫羊藿等药材，用乙醇渗漉，收集不同时间点的渗漉液样品，分别采集近红外光谱，同时测定对应样品比重和淫羊藿苷浓度； 

本发明所述的方法，其特征在于：利用一次近红外光谱采集，通过建立的软件模 型，同时获得肾宝合剂渗漉液比重及淫羊藿苷含量。 

本发明所述的方法，其特征在于：采集肾宝合剂渗漉液近红外光谱采集时，采用透射方式进行，每一张光谱都是1-1000次扫描的平均结果，分辨率0.3-20nm，扫描光谱范围为1100-2300nm。 

本发明所述的方法，其特征在于：采集肾宝合剂渗漉液近红外光谱时，采用透射方式进行，每一张光谱都是200-500次扫描的平均结果，分辨率1-5nm，扫描光谱范围为1100-2300nm。 

本发明所述的方法，其特征在于：采集肾宝合剂渗漉液近红外光谱时，采用透射方式进行，每一张光谱都是300次扫描的平均结果，分辨率2nm，扫描光谱范围为1100-2300nm。 

本发明所述的方法，其特征在于：采集肾宝合剂渗漉液近红外光谱时，以现场取样方式、在线取样方式和旁线取样方式之一进行。 

本发明所述的方法，其特征在于：采用RP-HPLC进行肾宝合剂淫羊藿苷含量分析，分析条件为——色谱柱为YMC ODS分析柱(6×150mm，5μm，柱温25℃)，流动相为乙腈-水-冰醋酸(28∶72∶1)，进样体积20μL，流速1ml/min，UV检测波长270nm。 

本发明所述的方法，其特征在于：步骤2中模型的建立包括(1)一阶导数9点平滑法(savitzky-golay)光谱预处理；(2)采用偏最小二乘法(PLS1)、交叉-验证法(cross-validation)用Unscrambler定量分析软件建立模型；(3)模型校正和预测效果验证。 

本发明所述的方法，其特征在于：步骤2中模型的建立包括(1)一阶导数9点平滑法(savitzky-golay)光谱预处理；(2)采用偏最小二乘法(PLS1)、交叉-验 证法(cross-validation)用Unscrambler定量分析软件建立模型；(3)模型校正和预测效果验证；(4)精密度试验；(5)稳定性试验。 

优选的本发明的方法，包括以下步骤： 

步骤1、测定合格的肾宝合剂制备过程中渗漉液近红外光谱，比重及淫羊藿苷含量的标准图谱和数据； 

取蛇床子、淫羊藿、当归、川芎、小茴香，用乙醇湿润后装填渗漉器，再用乙醇浸渍，以每分钟5ml-10ml/min速度缓缓渗漉，收集渗漉液，每100单位为一份，取样测定比重和淫羊藿苷浓度，并采集近红外光谱，共采集样品61份，总量约6500份，将61份样品分为校正集和验证集，将其中的10份设为验证集； 

其中样品淫羊藿苷HPLC含量测定方法如下： 

采用RP-HPLC连续收集的所有渗漉液样品进行淫羊藿苷含量分析，分析条件如下：色谱柱YMC ODS分析柱(6×150mm，5μm，柱温25℃)，流动相为乙腈-水-冰醋酸(28∶72∶1)，进样体积20uL，流速1ml/min，UV检测波长270nm，运行时间47min。重现性变异系数分别为1.7％(n＝3)， 

其中样品比重测定方法如下： 

采用安东帕便携式密度计DMA35测定； 

其中采集NIR光谱方法如下： 

扫描光谱时在样品溶液中浸入NIR光谱仪自带的光纤透射式探头，光纤长2m，待溶液稳定并无气泡后进行扫描.测试条件为：扫描次数300次，分辨率2nm，扫描光谱范围为1100～2300nm。共得到61个样品的总光谱图， 

步骤2、采用化学计量学软件分别建立渗漉液近红外光谱与比重、淫羊藿苷浓度之间的对应模型； 

光谱预处理：采用的预处理方法为一阶导数9点平滑法；将经过预处理后的光谱数据与HPLC分析数据进行关联，采用偏最小二乘法，交叉-验证法，用Unscrambler定量分析软件建立模型，得到的样品比重及淫羊藿苷的NIR光谱预测值与样品比重实测值及HPLC分析值之间相关性良好，样品比重模型的主成分维数为 

7，R²＝0.9766，RMSECV＝0.1013，淫羊藿苷模型的主成分维数为3，R²＝0.9633，RMSECV＝0.1868； 

步骤3、测定待测的肾宝合剂制备过程中渗漉液近红外光谱； 

步骤4、利用步骤2建立的对应模型，通过化学计量学软件分别获得待测的肾宝合剂制备过程中渗漉液样品的比重、淫羊藿苷浓度。 

最优选的方法包括以下步骤： 

步骤1、测定合格的肾宝合剂制备过程中渗漉液近红外光谱，比重及淫羊藿苷含量的标准图谱和数据； 

1)渗漉样品制备与收集 

取处理好的蛇床子、淫羊藿、当归、川芎、小茴香共850.4g，用70％乙醇湿润后装填入玻璃柱内，再用70％乙醇浸渍48小时(乙醇应高于药材面10cm以上)，以每分钟8ml-9ml/min速度缓缓渗漉，收集渗漉液，每100ml为一份，取样测定比重和淫羊藿苷浓度，并采集近红外光谱，共采集样品61份，总量约6500ml，将61份样品分为校正集和验证集，将其中的10份设为验证集； 

2)样品淫羊藿苷HPLC分析 

采用RP-HPLC连续收集的所有渗漉液样品进行淫羊藿苷含量分析，分析条件如下：色谱柱YMC ODS分析柱(6×150mm，5μm，柱温25℃)，流动相为乙腈-水-冰醋酸(28∶72∶1)，进样体积20uL，流速1ml/min，UV检测波长270nm，运行时间47min。重现性变异系数分别为1.7％(n＝3)，图谱见附图1、附图2。校正集样品结果带入软件建立模型，验证集样品用于模型验证； 

3)样品比重测定 

采用安东帕便携式密度计DMA35测定(室温)； 

4)获取NIR光谱 

扫描光谱时在样品溶液中浸入NIR光谱仪自带的光纤透射式探头，光纤长2m，待溶液稳定并无气泡后进行扫描.测试条件为：扫描次数300次，分辨率2nm，扫描光谱范围为1100～2300nm。共得到61个样品的总光谱图，见附图3； 

步骤2、采用化学计量学软件分别建立渗漉液近红外光谱与比重、淫羊藿苷浓度之间的对应模型； 

1)光谱预处理 

对扫描得到的原始吸收光谱进行光谱预处理，以消除噪音和基线漂移的影响。采用的预处理方法为一阶导数9点平滑法(savitzky-golay)。一阶导数光谱图见图4。经一阶导数处理可以很好的消除样品由于颜色差别引起的光谱基线偏移和漂移； 

2)建立PLS1数学模型 

将经过预处理后的光谱数据与HPLC分析数据进行关联，采用偏最小二乘法(PLS1)，交叉-验证法(cross-validation)，用Unscrambler定量分析软件建立模型。NIR和HPLC测定的异常值分别采用光谱影响值Leverage和化学值误差Residual这2个统计量来检验剔除。经过异常值的剔除进行优化，得到较为理想的校正模型； 

得到的样品比重及淫羊藿苷的NIR光谱预测值与样品比重实测值及HPLC分析值之间相关性良好，测定数据偏差较小。样品比重模型的主成分维数为 

7，R²＝0.9766，RMSECV＝0.1013，淫羊藿苷模型的主成分维数为3，R²＝0.9633，RMSECV＝0.1868； 

步骤3、测定待测的肾宝合剂制备过程中渗漉液近红外光谱； 

步骤4、利用步骤2建立的对应模型，通过化学计量学软件分别获得待测的肾宝合剂制备过程中渗漉液样品的比重、淫羊藿苷浓度。 

本发明所述的方法，优点在于，利用一次近红外光谱采集，通过建立的软件模型，同时获得肾宝合剂渗漉液比重及淫羊藿苷含量。本发明采用AOTF-近红外光谱技术建立肾宝合剂渗漉液比重及淫羊藿苷含量的数学模型，可以快速在线监测肾宝合剂渗漉过程。该方法操作简便、分析迅速，为肾宝合剂渗漉过程中指标成分及物理指标快速定量分析和生产过程中的在线检测，控制产品的质量提供了高效的分析方法。 

附图说明：

图1淫羊藿苷对照品图谱 

图2肾宝渗漉样品液相图谱 

图3肾宝合剂渗漉液近红外光谱原始总光谱图 

图4肾宝合剂渗漉液的一阶导数光谱图 

具体实施方式：

下面结合实施例进一步说明本发明，但不表明对本发明权利要求的限制。 

仪器与试药 

仪器 AOTF便携式Luminar 5030-731近红外光谱分析仪(美国BRIMROSE公司)，配套使用的SNAP光谱采集软件和CAMO化学计量学软件；Aglient1100色谱仪(美国Agilent公司)，DAD二极管阵列检测器；安东帕便携式密度计DMA35(奥地利Anton Paar公司)；玻璃层析柱150×15cm(上海精工仪器公司) 

试药 蛇床子药材、淫羊藿药材、当归药材、川芎药材、小茴香药材(江西汇仁药业有限公司)；淫羊藿苷对照品(中国药品生物制品检定所，批号111562-200504，供含量测定用)；乙醇为药用乙醇(提取用)，乙腈为色谱纯试剂，冰醋酸为分析纯，水为超纯水。 

方法与结果 

1渗漉样品制备与收集 

取处理好的蛇床子、淫羊藿、当归、川芎、小茴香共850.4g，用70％乙醇湿润后装填入玻璃柱内，再用70％乙醇浸渍48小时(乙醇应高于药材面10cm以上)，以每分钟8ml-9ml/min速度缓缓渗漉，收集渗漉液，每100ml为一份，取样测定比重和淫羊藿苷浓度，并采集近红外光谱，共采集样品61份，总量约6500ml，将61份样品分为校正集和验证集，将其中的10份设为验证集。 

2样品淫羊藿苷HPLC分析 

采用RP-HPLC连续收集的所有渗漉液样品进行淫羊藿苷含量分析，分析条件如下：色谱柱YMC ODS分析柱(6×150mm，5μm，柱温25℃)，流动相为乙腈- 水-冰醋酸(28∶72∶1)，进样体积20uL，流速1ml/min，UV检测波长270nm，运行时间47min。重现性变异系数分别为1.7％(n＝3)，图谱见附图1、附图2。校正集样品结果带入软件建立模型，验证集样品用于模型验证。 

3样品比重测定 

采用安东帕便携式密度计DMA35测定(室温)。 

4获取NIR光谱 

扫描光谱时在样品溶液中浸入NIR光谱仪自带的光纤透射式探头，光纤长2m，待溶液稳定并无气泡后进行扫描.测试条件为：扫描次数300次，分辨率2nm，扫描光谱范围为1100～2300nm。共得到61个样品的总光谱图，见附图3。 

5建立模型 

5.1光谱预处理 

对扫描得到的原始吸收光谱进行光谱预处理，以消除噪音和基线漂移的影响。采用的预处理方法为一阶导数9点平滑法(savitzky-golay)。一阶导数光谱图见图4。经一阶导数处理可以很好的消除样品由于颜色差别引起的光谱基线偏移和漂移。 

5.2建立PLS1数学模型 

将经过预处理后的光谱数据与HPLC分析数据进行关联，采用偏最小二乘法(PLS1)，交叉-验证法(cross-validation)，用Unscrambler定量分析软件建立模型。NIR和HPLC测定的异常值分别采用光谱影响值Leverage和化学值误差Residual这2个统计量来检验剔除。经过异常值的剔除进行优化，得到较为理想的校正模型。 

得到的样品比重及淫羊藿苷的NIR光谱预测值与样品比重实测值及HPLC分析值之间相关性良好，测定数据偏差较小。样品比重模型的主成分维数为 

7，R²＝0.9766，RMSECV＝0.1013，淫羊藿苷模型的主成分维数为3，R²＝0.9633，RMSECV＝0.1868。 

5.3模型预测效果验证 

以建立的校正模型对10份外部验正集样品进行分析。样品比重及淫羊藿苷的测试结果分别见表1，表2。NIR光谱预测值与样品比重真值、淫羊藿苷HPLC测定真值的相关系数R²分别为0.9706和0.9890。结果表明，NIR光谱预侧值与样品比重实测值及HPLC分析值之间相关性良好。 

表1渗漉液比重校正模型对外部验证集样品的分析结果(n＝10) 

表2淫羊藿苷校正模型对外部验证集样品的分析结果(n＝10) 

6精密度试验 

取1个预测样品，重复扫描20次，将所得光谱带入建立的校正模型计算含量，以考察方法的精比重，结果渗漉液比重和淫羊藿苷的RSD分别为1.5263％，1.6130％，说明仪器精比重良好。 

7稳定性试验 

取1个预测样品，每1h扫描一次，于5h内重复扫描5次，考察样品的稳定性。结果样品比重的RSD1.156％，淫羊藿苷的RSD1.869％，说明样品在5h内相对稳定。 

8预测回收率试验 

取5个预测样品，分别扫描，将所得光谱带入建立的校正模型，计算比重和淫羊藿苷预测值与比重测定及HPLC测定的真值之间的比值(预测回收率)，样品比重和淫羊藿苷的预测回收率分别为103.0％，99.0％。 

结果表明，AOTF-近红外光谱校正模型确立后，完成1次测量只需2min，而HPLC测定以上2种成分需分别提取和测试，整个测试过程约需3h。 

AOTF-近红外光谱测定肾宝合剂渗漉液中淫羊藿苷及渗漉液比重的新方法，集快速、直接、多成分同时测定和能够实现现场分析为一体，解决了肾宝合剂渗漉过程中定量分析的操作复杂、分析周期长，不能用于在线检测的问题，分析结果令人满意，各项分析参数能够满足药品生产过程中含量测定的要求。 

若进一步加大样本的数量，增加样本的代表性，可以建立更加稳定的模型，为肾宝合剂在线质量控制提供有效的分析方法。 

Claims (2)

1.一种测定肾宝合剂渗漉液近红外光谱，比重及淫羊藿苷含量的方法，其特征在于，包括如下步骤：

步骤1、测定合格的肾宝合剂制备过程中渗漉液近红外光谱，比重及淫羊藿苷含量的标准图谱和数据；

取蛇床子、淫羊藿、当归、川芎、小茴香，用乙醇湿润后装填渗漉器，再用乙醇浸渍，以每分钟5ml-10ml/min速度缓缓渗漉，收集渗漉液，每100单位为一份，取样测定比重和淫羊藿苷浓度，并采集近红外光谱，共采集样品61份，总量约6500份，将61份样品分为校正集和验证集，将其中的10份设为验证集；

其中样品淫羊藿苷HPLC含量测定方法如下：

采用RP-HPLC连续收集的所有渗漉液样品进行淫羊藿苷含量分析，分析条件如下：色谱柱YMC ODS分析柱，型号6×150mm，5μm，柱温25℃，流动相为乙腈-水-冰醋酸＝28∶72∶1，进样体积20uL，流速1ml/min，UV检测波长270nm，运行时间47min，重现性变异系数分别为1.7％，n＝3，

其中样品比重测定方法如下：

采用安东帕便携式密度计DMA35测定；

其中采集NIR光谱方法如下：

扫描光谱时在样品溶液中浸入NIR光谱仪自带的光纤透射式探头，光纤长2m，待溶液稳定并无气泡后进行扫描.测试条件为：扫描次数300次，分辨率2nm，扫描光谱范围为1100～2300nm，共得到61个样品的总光谱图，

步骤2、采用化学计量学软件分别建立渗漉液近红外光谱与比重、淫羊藿苷浓度之间的对应模型；

光谱预处理：采用的预处理方法为一阶导数9点平滑法；将经过预处理后的光谱数据与HPLC分析数据进行关联，采用偏最小二乘法，交叉-验证法，用Unscrambler定量分析软件建立模型，得到的样品比重及淫羊藿苷的NIR光谱预测值与样品比重实测值及HPLC分析值之间相关性良好，样品比重模型的主成分维数为7，R²＝0.9766，RMSECV＝0.1013，淫羊藿苷模型的主成分维数为3，R²＝0.9633，RMSECV＝0.1868；

步骤3、测定待测的肾宝合剂制备过程中渗漉液近红外光谱；

步骤4、利用步骤2建立的对应模型，通过化学计量学软件分别获得待测的肾宝合剂制备过程中渗漉液样品的比重、淫羊藿苷浓度。

2.如权利要求1所述的方法，其特征在于：包括以下步骤：

步骤1、测定合格的肾宝合剂制备过程中渗漉液近红外光谱，比重及淫羊藿苷含量的标准图谱和数据；

1)渗漉样品制备与收集

取处理好的蛇床子、淫羊藿、当归、川芎、小茴香共850.4g，用70％乙醇湿润后装填入玻璃柱内，再用70％乙醇浸渍48小时，其中乙醇应高于药材面10cm以上，以每分钟8ml-9ml/min速度缓缓渗漉，收集渗漉液，每100ml为一份，取样测定比重和淫羊藿苷浓度，并采集近红外光谱，共采集样品61份，总量约6500ml，将61份样品分为校正集和验证集，将其中的10份设为验证集；

2)样品淫羊藿苷HPLC分析

采用RP-HPLC连续收集的所有渗漉液样品进行淫羊藿苷含量分析，分析条件如下：色谱柱YMC ODS分析柱，型号6×150mm，5μm，柱温25℃，流动相为乙腈-水-冰醋酸＝28∶72∶1，进样体积20uL，流速1ml/min，UV检测波长270nm，运行时间47min，重现性变异系数分别为1.7％，n＝3，图谱见附图1、附图2，校正集样品结果带入软件建立模型，验证集样品用于模型验证；

3)样品比重测定

采用安东帕便携式密度计DMA35在室温下测定；

4)获取NIR光谱

扫描光谱时在样品溶液中浸入NIR光谱仪自带的光纤透射式探头，光纤长2m，待溶液稳定并无气泡后进行扫描.测试条件为：扫描次数300次，分辨率2nm，扫描光谱范围为1100～2300nm，共得到61个样品的总光谱图，见附图3；

步骤2、采用化学计量学软件分别建立渗漉液近红外光谱与比重、淫羊藿苷浓度之间的对应模型；

1)光谱预处理

对扫描得到的原始吸收光谱进行光谱预处理，以消除噪音和基线漂移的影响，采用的预处理方法为一阶导数9点平滑法savitzky-golay，一阶导数光谱图见图4，经一阶导数处理可以很好的消除样品由于颜色差别引起的光谱基线偏移和漂移；

2)建立PLS1数学模型

将经过预处理后的光谱数据与HPLC分析数据进行关联，采用偏最小二乘法PLS1，交叉-验证法cross-validation，用Unscrambler定量分析软件建立模型，NIR和HPLC测定的异常值分别采用光谱影响值Leverage和化学值误差Residual这2个统计量来检验剔除，经过异常值的剔除进行优化，得到较为理想的校正模型；

得到的样品比重及淫羊藿苷的NIR光谱预测值与样品比重实测值及HPLC分析值之间相关性良好，测定数据偏差较小，样品比重模型的主成分维数为7，R²＝0.9766，RMSECV＝0.1013，淫羊藿苷模型的主成分维数为3，R²＝0.9633，RMSECV＝0.1868；

步骤3、测定待测的肾宝合剂制备过程中渗漉液近红外光谱；

步骤4、利用步骤2建立的对应模型，通过化学计量学软件分别获得待测的肾宝合剂制备过程中渗漉液样品的比重、淫羊藿苷浓度。

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