CN112557342A - 一种五味藿香片中橙皮苷的近红外光谱在线监测方法 - Google Patents
一种五味藿香片中橙皮苷的近红外光谱在线监测方法 Download PDFInfo
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Abstract
本发明涉及医药、化学领域，具体五味藿香片制备过程中对橙皮苷含量的近远红外光谱在线监测方法。提供了一种五味藿香片中的橙皮苷的近红外光谱在线监测方法，其包含下述步骤：(1)取五味藿香片的原料药材，加水煎煮，经提取得到提取液；(2)将步骤(1)中得到的提取液用近红外光谱仪扫描得到近红外光谱数据；(3)根据近远红外校正模型测定待测液中的橙皮苷含量；(4)根据步骤(3)中测得的橙皮苷含量确定五味藿香片的目标提取时间。建立的NIR模型能够准确预测橙皮苷的含量，且与参考值间的偏差较小，实现快速、实时、在线、动态监控橙皮苷在提取过程中含量的变化，确保最终产品实物质量均一稳定。
Description
技术领域
本发明涉及医药、化学领域，具体五味藿香片制备过程中对橙皮苷含量 的近远红外光谱在线监测方法。
背景技术
五味藿香片由广藿香，陈皮，草豆蔻，苍术，豆蔻五味药材组成，是在 传统明方解郁丸的基础上依据五神脏理论研制而得，具有醒脾化湿，理气解 郁的功效，主要用于湿浊困脾、气机郁滞所致的情绪郁闷、低落、倦怠乏力、 思维迟钝，其中，芹菜素-7-O-β-D-葡萄糖苷的君药广藿香主要成分，具有抗 菌消炎，抗焦虑的作用；臣药陈皮中的橙皮苷、橘皮素，川陈皮素具有祛痰 平喘，和胃止吐等药理活性，原儿茶素及香草酸是君药广藿香，臣药陈皮、 草豆蔻，佐药苍术的共同成分，具有抗氧化，促进消化液分泌，抗炎之功效。 五味藿香片方剂以轻清芳香，苦温性燥之品为主组成，诸药配伍，入于中焦， 能醒脾化湿，是一种很有前景的中药治疗抑郁障碍的制剂。
五味藿香片中的有效成分橙皮苷，其传统监测工段指标的方法为HPLC 法，该前处理繁琐，易受杂质和溶剂背景吸收干扰。五味藿香片生产过程中 提取过程为生产过程的重要工段，目前，中药提取时间的控制主要是根据原 工艺的提取时间，没有考虑由于原药材质量的差异和工段波动等造成的终点 的提前和滞后。导致提取液质量不稳定，影响后续产品的质量。
发明内容
目前现有技术中存在的技术问题是，五味藿香片生产过程中提取过程为 生产过程的重要工段，中药提取时间的控制主要是浓缩点密度，或者规定的 提取时间，没有考虑由于原药材的质量差异和工段波动等造成的终点的提前 和滞后。导致提取液质量不稳定，影响后续的产品质量。造成能源，时间的 浪费。
本发明人为解决上述技术问题发现，将NIR分析技术应用于提取过程， 运用化学计量学软件提取NIR光谱数据与指标含量间的关联信息，将有效成 分(橙皮苷)与NIR光谱数据关联并建立定量校正模型，建立一种对五味藿 香片快速、实时、在线、动态监控的分析方法，从而保证五味藿香片质量稳 定性。
具体来说，本发明提出了如下技术方案：
本发明提供了一种五味藿香片中橙皮苷的近红外光谱在线监测方法，其包 含下述步骤：
(1)取五味藿香片的原料药材，加水煎煮，经提取得到提取液样品；
(2)将步骤(1)中得到的提取液用近红外光谱仪扫描得到近红外光谱 数据；
(3)HPLC法测定步骤(1)中得到的提取液中橙皮苷的含量指标；
(4)运用化学计量方法将步骤(2)所得光谱与步骤(3)所得含量指标 进行关联，通过重复下述步骤：光谱谱区选择、光谱预处理、数据降维、异 常点剔除、建立和优化五味藿香片所提过程橙皮苷的模型、模型检验，重复 操作直至建立的校正模型与样品相吻合即得。
优选的，其中，在步骤(1)中，所述加水煎煮次数为1-3次。
优选的，其中，所述煎煮次数为3次，第一次煎煮加8-12倍量的水，优 选为10倍量的水，和/或第二次煎煮加8-12倍量的水，优选为10倍量的水， 和/或第三次煎煮加8-12倍量的水，优选为10倍量的水。
优选的，其中，第一次煎煮时间为1.5h～2.5h，优选为2h，和/或第二次 煎煮时间为1.5h～2.5h，优选为2h，和/或第三次煎煮时间为1.5h～2.5h，优选 为2h。
优选的，其中，在步骤(1)中，所述五味藿香片的原料药材为广藿香， 陈皮，草豆蔻，苍术和豆蔻。
优选的，其中，在步骤(1)中，提取的时间为每次煎煮时沸腾前3-8min 取样，沸腾后8-12min取样，优选为，提取的时间为每次煎煮时沸腾前5min 取样，沸腾后10min取样。
优选的，其中，在步骤(2)中，所述提取液用近红外光谱仪的光谱条件 为：波长范围为：1100nm～2300nm；优选的，波长增量为2.0nm；扫描次数 为64；光程为2mm。
优选的，其中，步骤(4)中的校正模型的建立方法如下：
步骤1：收集橙皮苷提取液的校正集和验证集样本；
步骤2：用HPLC法测定校正集和验证集样品中的橙皮苷的含量；
步骤3：用近红外光谱仪扫描校正样品集，得到校正集近远红外光谱数据， 选择合适的谱段区间和预处理方法；
步骤4：构建校正集样品橙皮苷含量与特征红外光谱数据之间关系的校正 模型；
步骤5：通过内部和外部验证对校正模型进行验证。
优选的，其中，步骤(4)中的校正模型的建立方法中的步骤2的HPLC 法的条件为：AgilentC18色谱柱(250mm×4.6mm,5μm)，优选的，流动 相为乙腈(A)-0.1％磷酸(B)。
优选的，其中，步骤(4)中的橙皮苷的含量指标测定方法为：AgilentC18 色谱柱(250mm×4.6mm,5μm)，流动相A为乙腈,流动相B为0.1％磷酸， 优选的，梯度洗脱程序为：0～30min，5％～19％A；30～40min，19％～20％A； 40～50min，20％～29％A；50～85min，29％～54％A；更优选的，流速1mL·min-1； 检测波长270nm；柱温30℃；进样量10μL。
优选的，其中，步骤(4)中的校正模型的建立方法中的步骤3中的光谱 预处理方法为选自数据中心化、一阶导数、二阶导数和散射校正中的一种或 两种以上。
优选的，其中，步骤(4)中的校正模型的建立方法中的步骤4中的校正 模型的建立采用最小二乘法。
本发明还提供了所述的方法在药品生产稳定性中的应用，优选的，在五 味藿香片生产过程中质量稳定性的应用。
本发明的有益效果包括：
本发明以五味藿香片提取第一次、第二次、第三次过程为研究对象，采 用AntarisII近红外光谱在线分析技术结合偏最小二乘法法建立提取液中橙 皮苷定量校正模型，结果表明所建立的NIR模型能够准确预测橙皮苷的含量， 且与参考值间的偏差较小，实现快速、实时、在线、动态监控橙皮苷在提取 过程中含量的变化，确保最终产品实物质量均一稳定。
采用AntarisII光谱仪器，进行对五味藿香片水提过程橙皮苷的含量监 测，并计算相对浓度变化率值和观察提取过程指标成分的溶出规律来判断终 点，结果表明五味藿香片提取第一次在100min，提取第二次在100min，提 取第三次在80min时提前完全，与现有技术中每次提取2个小时，提取三次， 共节省80min，该法既保证了有效成分提取完全，同时节省了时间和能源。
下面结合附图和各个具体实施方式，对本发明及其有益技术效果进行详 细说明。
附图说明
图1a是本发明的实施例2中提取第一次样品NIR光谱叠加图；
图1b是本发明的实施例2中提取第二次样品NIR光谱叠加图；
图1c是本发明的实施例2中提取第三次样品NIR光谱叠加图；
图2a是本发明的对照品橙皮苷的色谱图；
图2b是本发明的提取液的色谱图；
图3是本发明经MSC+S-G+Norris预处理后的提取过程近红外光谱图；
图4是本发明提取第一次橙皮苷定量模型马氏距离；
图5a提取第一次过程中橙皮苷模型的建立；
图5b提取第一次过程橙皮苷含量与NIRs绝对误差相关图；
图5c提取第一次模型RMSECV随不同主因子数变化图；
图5d提取第一次橙皮苷含量3D分布图；
图6是本发明提取第二次橙皮苷定量模型马氏距离；
图7a提取第二次过程炮制过程中橙皮苷模型的建立；
图7b提取第二次过程橙皮苷含量与NIRs绝对误差相关图；
图7c提取第二次模型RMSECV随不同主因子数变化图；
图7d提取第二次橙皮苷含量3D分布图；
图8提取第三次橙皮苷含量马氏距离；
图9a提取第三次过程炮制过程中橙皮苷模型的建立；
图9b提取第三次过程橙皮苷含量与NIRs绝对误差相关图；
图9c提取第三次模型RMSECV随不同主因子数变化图；
图9d提取第三次橙皮苷含量3D分布图；
图10a提取第一次过程橙皮苷含量的RCCR值变化趋势；
图10b提取第一次过程橙皮苷浓度变化趋势；
图11a提取第二次过程橙皮苷含量的RCCR值变化趋势；
图11b提取第二次过程橙皮苷浓度变化趋势；
图12a提取第三次过程橙皮苷含量的RCCR值变化趋势；
图12b提取第三次过程橙皮苷浓度变化趋势。
具体实施方式
如上所述，本发明的目的在于：将NIR分析技术应用于提取过程，运用 化学计量学软件提取NIR光谱数据与常规在线监测指标含量间的关联信息， 将有效成分(橙皮苷)与NIR光谱数据关联并建立定量校正模型，建立一种 对五味藿香片快速、实时、在线、动态监控的分析方法，从而保证五味藿香 片质量稳定性。
本发明提供了一种五味藿香片中橙皮苷的近红外光谱在线监测方法，其包 含下述步骤：
(1)取五味藿香片的原料药材，加水煎煮，经提取得到提取液样品；
(2)将步骤(1)中得到的提取液用近红外光谱仪扫描得到近红外光谱 数据；
(3)HPLC法测定步骤(1)中得到的提取液中橙皮苷的含量指标；
(4)运用化学计量方法将步骤(2)所得光谱与步骤(3)所得含量指标 进行关联，通过重复下述步骤：光谱谱区选择、光谱预处理、数据降维、异 常点剔除、建立和优化五味藿香片所提过程橙皮苷的模型、模型检验，重复 操作直至建立的校正模型与样品相吻合即得。
优选的，其中，在步骤(1)中，所述加水煎煮次数为1-3次。
优选的，其中，所述煎煮次数为3次，第一次煎煮加8-12倍量的水，优 选为10倍量的水，和/或第二次煎煮加8-12倍量的水，优选为10倍量的水， 和/或第三次煎煮加8-12倍量的水，优选为10倍量的水。
优选的，其中，第一次煎煮时间为1.5h～2.5h，优选为2h，和/或第二次 煎煮时间为1.5h～2.5h，优选为2h，和/或第三次煎煮时间为1.5h～2.5h，优选 为2h。
优选的，其中，在步骤(1)中，所述五味藿香片的原料药材为广藿香， 陈皮，草豆蔻，苍术和豆蔻。
优选的，其中，在步骤(1)中，提取的时间为每次煎煮时沸腾前3-8min 取样，沸腾后8-12min取样，优选为，提取的时间为每次煎煮时沸腾前5min 取样，沸腾后10min取样。
优选的，其中，在步骤(2)中，所述提取液用近红外光谱仪的光谱条件 为：波长范围为：1100nm～2300nm；优选的，波长增量为2.0nm；扫描次数 为64；光程为2mm。
优选的，其中，步骤(4)中的校正模型的建立方法如下：
步骤1：收集橙皮苷提取液的校正集和验证集样本；
步骤2：用HPLC法测定校正集和验证集样品中的橙皮苷的含量；
步骤3：用近红外光谱仪扫描校正样品集，得到校正集近远红外光谱数据， 选择合适的谱段区间和预处理方法；
步骤4：构建校正集样品橙皮苷含量与特征红外光谱数据之间关系的校正 模型；
步骤5：通过内部和外部验证对校正模型进行验证。
优选的，其中，步骤(4)中的校正模型的建立方法中的步骤2的HPLC 法的条件为：AgilentC18色谱柱(250mm×4.6mm,5μm)，优选的，流动 相为乙腈(A)-0.1％磷酸(B)。
优选的，其中，步骤(4)中的橙皮苷的含量指标测定方法为：AgilentC18 色谱柱(250mm×4.6mm,5μm)，流动相A为乙腈,流动相B为0.1％磷酸， 优选的，梯度洗脱程序为：0～30min，5％～19％A；30～40min，19％～20％A； 40～50min，20％～29％A；50～85min，29％～54％A；更优选的，流速1mL·min-1； 检测波长270nm；柱温30℃；进样量10μL。
优选的，其中，步骤(4)中的校正模型的建立方法中的步骤3中的光谱 预处理方法为选自数据中心化、一阶导数、二阶导数和散射校正中的一种或 两种以上。
优选的，其中，步骤(4)中的校正模型的建立方法中的步骤4中的校正 模型的建立采用最小二乘法。
本发明还提供了所述的方法在药品生产稳定性中的应用，优选的，在五 味藿香片生产过程中质量稳定性的应用。
下面通过具体实施例来说明本发明的分析方法。
下面实施例中所用到各试剂和仪器来源如下：
表1实施例所用试剂和仪器
实施例1:样品的制备
陈皮药材分别购自全国各药店，具体来源如表2所示，经贵阳中医学院 魏升华教授做药材鉴定。
表2不同品种不同产地药材陈皮样品信息
| 样品编号 | 产地 | 品种 | 产地 | 来源 | 品种 |
| S1 | 广东新会 | 茶枝柑 | S12 | 广西桂林 | 蜜柑 |
| S2 | 广东新会 | 茶枝柑 | S13 | 广西桂林 | 蜜柑 |
| S3 | 广东惠州 | 茶枝柑 | S14 | 广东新会 | 茶枝柑 |
| S4 | 广东惠州 | 茶枝柑 | S15 | 江西抚州 | 蜜柑 |
| S5 | 江西南昌 | 蜜柑 | S16 | 浙江温州 | 蜜柑 |
| S6 | 江西南昌 | 蜜柑 | S17 | 江西南昌 | 蜜柑 |
| S7 | 浙江金华 | 蜜柑 | S18 | 江西莲塘 | 蜜柑 |
| S8 | 广西桂林 | 蜜柑 | S19 | 广西桂林 | 蜜柑 |
| S9 | 广东惠州 | 茶枝柑 | S20 | 广东惠州 | 茶枝柑 |
| S10 | 江西抚州 | 蜜柑 | S21 | 江西莲塘 | 蜜柑 |
| S11 | 广东惠州 | 茶枝柑 |
步骤1：提取开始
称取表2中标号为S1，S7，S9，S13和S21的5份等质量的陈皮，每份 为20g。按照专利(CN200510200474.1)处方比例称取其他药材，广藿香58.1g、 豆蔻29g、草豆蔻29g、苍术38.7g，得到5批试验样品。分别加入10倍量水， 并开启近红外透射采集模式放出提取液，加热煮沸2h后，再加入10倍量水 进行煎煮，重复煎煮三次。
步骤2：取样
在步骤1所述的煎煮过程中，第一次溶液沸腾前90℃取一次样，第一次 溶液沸腾后10min取样一次，每次取样约为10ml，置于药瓶中，保存，备用， 后将煎煮后的液体进行过滤，收集滤液，滤渣继续加入10倍水进行煎煮，重 复此过程至三次。5批试验共收集提取液第一次样品60份，其样品编号为 1-60，提取液第二次样品60份，其样品编号为61-120，提取液第三次样品60份，其样品编号为121-180。
实施例2：NIR光谱的采集
AntarisII近红外光谱仪器参数设置如下：波长范围：1100nm～2300nm； 波长增量：2.0nm；扫描次数：64；光程：2mm。近红外在线投射自动模式 采集的间隔时间是每隔4s扫描得到一张提取液NIR光谱图，整个过程进行 实时监测。
5批提取第一次、提取第二次、提取第三次过程提取液样品的NIR光谱 叠加图见图1a、1b、1c。
实施例3：提取液指标成分的测定:HPLC法测定提取液中橙皮苷的含量
1.色谱条件
Agilent C18色谱柱(250mm×4.6mm,5μm)，流动相为乙腈(A)-0.1％(体 积浓度)磷酸(B)，梯度洗脱(0～30min，5％～19％A；30～40min，19％～20％A； 40～50min，20％～29％A；50～85min，29％～54％A)；流速1mL·min-1；检 测波长270nm；柱温30℃；进样量10μL。
2.对照品溶液的制备
精密称定橙皮苷，精密称定，加甲醇制成每1ml含橙皮苷108.2ug的溶 液，过0.45um微孔滤膜，即得。
3.供试品溶液的制备
精密吸取提取液2ml，过0.45um微孔滤膜，装入液相瓶，即得。
4.标准曲线的制备
精密吸取橙皮苷对照品溶液，按上述色谱条件分别进样1、2、5、10、 30ul，测定色谱峰面积，以峰面积为纵坐标，浓度(ug/ml)为横坐标X进行 线性回归，得到回归方程y＝16.162x(R2＝0.9991)，在10.82～324.6ug/ml间 具有良好的线性关系。对照品和供试品色谱图见图2a和图2b。
5.精密度试验
取第36号提取液，重复进样6次，每次10ul，按照1中的色谱条件下 进行测定，记录提取液样品橙皮苷峰面积并计算相对标准偏差(RSD)，结 果见表2。
6.重复性试验
取第36号提取液6份，按照“3供试品溶液的制备”下进行操作，按照“1 中的色谱条件”下进行测定，记录橙皮苷峰面积计算RSD，结果见表2。
7.稳定性试验
取第36号提取液，分别在0、2、4、8、12、24h进样10ul，记录橙皮 苷峰面积并计算RSD，结果见表2。
8.加样回收率试验
取已知含量的36号提取液(36号)，分别精密加入一定量的橙皮苷对 照品，按照“1中的色谱条件”下进行测定，记录峰面积积分值并计算RSD， 结果见表3。
表3橙皮苷含量检测方法学考察结果
结果表明，根据上述色谱条件测定橙皮苷的方法稳定、可靠、准确，可 用于样品中相关成分的测定。
9.提取液样品橙皮苷含量测定
提取液样品中橙皮苷含量见表4。
表4提取液中指标成分测定结果
实施例4：近红外定量模型的建立
1.定量模型建立方法
1.1校正集和验证集样品的选择
根据实施例1得到的180个样品，选取每次煎煮38个有代表性的样品组 成校正集，选择22个样品为验证集样品，表5列出了校正集和验证集样品橙 皮苷含量分布范围。
表5不同煎煮次数下校正集和验证集样品橙皮苷含量分布范围
1.2模型光谱区间的选择
光谱的数据一般有数百到数千个数据点，每个数据点不一定都包含了有 效的样品信息，还包括由检测器引起的噪声，谱区过宽会增加无效信息，谱 区过窄会漏掉有效信息降低模型的预测准确，在建立模型前选择合适的谱区 可以增高有效信息率。谱区的选择采用的方法是首先将分析的理化指标值与 整个近红外光谱区的每个光谱点的吸光度进行相关性计算，从而达到回归系 数，通过比较回归系数的趋势进行选择，相关性越高，谱区有效信息越多， 考虑到建模范围。
1.3光谱预处理方法的选择
光谱背景中包含了确定信息和不确定信息，确定的信息包括采集光谱的 噪声、样品的不均匀性、光的散射。一般采用物理、化学、数学等方法进行 控制，光谱预处理常用的方法有数据中心化、一阶导数、二阶导数、散射校 正等，光谱预处理的目的也是提高光谱的有效信息率。其中，导数光谱法常 常作为预处理方法，既可以消除背景干扰和基线漂移，还可以提高光谱分辨 率以及光谱轮廓更加清晰。
经预处理后的光谱如图3。以校正误差均方根RMSEC及预测误差均方 根RMSEP和RMC-r、预测均方根偏差相关系数(RMP-r)为指标来选择合 适的光谱预处理方式，RMC-r和RMP-r值越接近1，RMSEC和RMSEP越 小说明所建立的模型稳定性越好，预测能力较强。
1.4数据降维
近红外模型在关联之前需要抽取特征光谱，将原来样品光谱的吸光度压 缩为几个特征变量值矩阵。将高维度光谱变换维数低的矩阵类型，数据降维 度最常用的方法是主成分分析法，提取主成分查看累积贡献率。最佳主成分 个数选择的方法是：首先观察SECV随Rank变化趋势图，如果SECV随Rank 的增加，变化趋势是向下逐步变小的过程，则转折点为代表的主成分代替原 始光谱效果较好。本实验通过交叉互验证方法，用预测残差平方和(prediction residual error sum of squares，PRESS)探讨主因子数对RMSECV的影响。对应于PRESS图最低点即为最佳主因子数，如果没有最小值，当PRESS值大 约达到一固定水平的第一个点，可作为主因子数。
1.5建模方法的选择
本实验通过对不同化学计量方法的比较分析，比较了逐步多元线性回归、 偏最小二乘法、主成分分析回归三种方法对所建立的橙皮苷预测模型的各项 评价指标，结果显示，偏最小二乘法的预测精度最高。本实验最终确定PLS (PLS偏最小二乘法)来建立五味藿香片水提过程橙皮苷校正模型，以校正 样品的校正均方根误差(RMSEC)及其相关系数(R)，验证样品的预测均 方根误差(RMSEP)及其(R)为指标优化建模参数。所有数据通过TQAnalyst 数据处理软件进行处理。
1.6异常点统计检验
建立模型之前需要对异常点进行排除，异常点通常是组分浓度较大或者 较小，表现出与样品集中其他样品的明显差异。由于理想的校正集的组分浓 度要求是整个浓度范围内是要均匀分布，针对这一现象，异常点的去除通过 马氏距离实现。
2.提取第一次的模型
2.1异常样品的剔除
建立模型之前需要对异常点进行排除，异常点通常是组分浓度较大或者 较小，表现出与样品集中其他样品的明显差异。由于理想的校正集的组分浓 度要求是整个浓度范围内是要均匀分布，针对这一现象，异常点的去除通过 马氏距离实现。橙皮苷含量异常样品的马氏距离计算结果见图4，可以看出1 个样品的马氏距离值超过模型中所设定阈值，所以将样品剔除，以减小异常 样品对橙皮苷含量定标模型准确性和预测能力的影响。
2.2光谱预处理方式选择和光谱区间的筛选
采用偏最小二乘法建立橙皮苷定量校正模型，首先通过比较不同预处理 方法的RMC-r、RMSEC、RMSEP、RMP-r。结果表明：选用MSC+F,D+N,D (7,3)作为光谱预处理方式，结果见表6。确定好光谱预处理方式后，比较部 分光谱和全部光谱的模型性能参数，得出以4801.88～5037.15和 6117.10～6900.05cm-1两段区间作为光谱条件时，橙皮苷含量的模型精密度和 准确度能力较好，结果见表7。
表6提取过程橙皮苷含量光谱预处理方式结果
| 光谱预处理方式 | RMC-r | RMSEC | RMSEP | RMP-r |
| MSC+S,D+S,G(5,5) | 0.4949 | 1.50 | 0.975 | 0.8293 |
| MSC+F,D+S,G(5,3) | 0.8714 | 1.48 | 1.010 | 0.8942 |
| MSC+F,D+S,G(7,3) | 0.5877 | 1.38 | 0.621 | 0.9189 |
| MSC+F,D+N,D(5,3) | 0.9287 | 1.12 | 1.060 | 0.9113 |
| MSC+F,D+N,D(7,3) | 0.9438 | 0.0265 | 0.0294 | 0.9311 |
备注：MSC+F,D+S,G为标准证则变换+一阶导数+Savitizky-Golay；MSC+S,D+S,G为标准正则变换 +二阶导数+Savitizky-Golay；MSC+S,D+N,D为标准正则变换+二阶导数+NorrisDervative
表7提取过程橙皮苷含量模型光谱区间选择
2.3不同回归方法对橙皮苷模型建立的影响
表8不同回归方法建模性能参数
从表8中可以得出，优化后的光谱预处理和光谱范围进行不同回归方法 进行模型建立，其中偏最小二乘进行模型校正时，校正集和交叉验证性能参 数均比PCR、MLR方法性能较好。五味藿香片水提第一次橙皮苷含量的定 量模型见图5a，可以看出，样品均匀地分布在回归线的两侧，橙皮苷模型 RMSEC为0.0259，相关系数为0.9438。橙皮苷含量与NIRs绝对误差相关图 见图5b，相对误差均小于2.0％，在允许误差范围之内；图5c为优化后RMSECV随主因子数的变化图，最佳主因子数为4，说明所建立模型准确性 和预测能力较好；图5d为提取第一次橙皮苷含量3D分布图。
2.4提取第一次NIR模型参数的确定
采用原始光谱，并在4801.88～5037.15和6117.10～6900.05光谱范围下， 剔除异常点后，运用PLS法建立橙皮苷定量校正模型，根据RMSECV及累 积贡献率选择主成分数为4。
2.5模型的验证
2.5.1内部验证
本试验采用留一内部交叉验证的方法对模型进行内部检验橙皮苷模型： 与HPLC法测定值相比模型对校正集样品的AREP为3.98％。
2.5.2外部验证
外部预测检验是利用建立好的NIR模型预测没有参加建模的已知标准值 的样品，并计算预测值与标准值(编号39-60的样品的HPLC值)之间的误 差。见表9。
表9 NIR预测值与含量测定标准值测定结果比较
3.提取第二次模型
3.1异常样品的剔除
建立模型之前需要对异常点进行排除，异常点通常是组分浓度较大或者 较小，表现出与样品集中其他样品的明显差异。由于理想的校正集的组分浓 度要求是整个浓度范围内是要均匀分布，针对这一现象，异常点的去除通过 马氏距离实现。第二次提取橙皮苷含量异常样品的马氏距离计算结果见图6， 可以看出1个样品的马氏距离值超过模型中所设定阈值，所以将样品剔除， 以减小异常样品对橙皮苷含量定标模型准确性和预测能力的影响。
3.2光谱预处理方式选择和光谱区间的筛选
采用偏最小二乘法建立橙皮苷定量校正模型，首先通过比较不同预处理 方法的RMC-r、RMSEC、RMSEP、RMP-r。结果表明：选用MSC+F,D+N,D(5,5) 作为光谱预处理方式，结果见表10。确定好光谱预处理方式后，比较部分光 谱和全部光谱的模型性能参数，得出以4204.06～4593.61和 4813.45～4890.59cm-1两段区间作为光谱条件时，橙皮苷含量的模型精密度和 准确度能力较好，结果见表11。
表10提取过程橙皮苷含量光谱预处理方式结果
| 光谱预处理方式 | RMC-r | RMSEC | RMSEP | RMP-r |
| MSC+S,D+S,G(5,5) | 0.4726 | 1.96 | 0.975 | 0.7993 |
| MSC+F,D+S,G(5,3) | 0.8642 | 1.35 | 1.010 | 0.8942 |
| MSC+F,D+S,G(5,3) | 0.5357 | 1.24 | 0.621 | 0.8189 |
| MSC+F,D+N,D(5,3) | 0.8987 | 0.95 | 1.060 | 0.9213 |
| MSC+F,D+N,D(5,5) | 0.9204 | 0.0126 | 0.0115 | 0.9642 |
备注：MSC+F,D+S,G为标准证则变换+一阶导数+Savitizky-Golay；MSC+S,D+S,G为标准正则变换 +二阶导数+Savitizky-Golay；MSC+S,D+N,D为标准正则变换+二阶导数+NorrisDervative
表11提取过程橙皮苷含量模型光谱区间选择
3.3不同回归方法对橙皮苷模型建立的影响
表12不同回归方法建模性能参数
从表12中可以得出，优化后的光谱预处理和光谱范围进行不同回归方法 进行模型建立，其中偏最小二乘进行模型校正时，校正集和交叉验证性能参 数均比PCR、MLR方法性能较好。五味藿香片水提第二次橙皮苷含量的定 量模型见图7a，可以看出，样品均匀地分布在回归线的两侧，橙皮苷模型 RMSEC为0.0126，相关系数为0.9204。橙皮苷含量与NIRs绝对误差相关图 见图7b，相对误差均小于2.0％，在允许误差范围之内；图7c为优化后RMSECV随主因子数的变化图，最佳主因子数为5，说明所建立模型准确性 和预测能力较好；图7d为提取第二次橙皮苷含量3D分布图。
3.4提取第二次NIR模型参数的确定
采用原始光谱，并在4204.06～4593.61和4813.45～4890.59光谱范围下， 剔除异常点后，运用PLS法建立橙皮苷定量校正模型，根据RMSECV及累 积贡献率选择主成分数为5。
3.5模型的验证
3.5.1内部验证
本试验采用留一内部交叉验证的方法对模型进行内部检验橙皮苷模型： 与HPLC法测定值相比模型对校正集样品的AREP为3.08％。
3.5.2外部验证
外部预测检验是利用建立好的NIR模型预测没有参加建模的已知标准值 的一批样品，并计算预测值与标准值(编号99-120的样品的HPLC值)之间 的误差。见表13。
表13 NIR预测值与含量测定标准值测定结果比较
4.提取第三次模型
4.1异常样品的剔除
建立模型之前需要对异常点进行排除，异常点通常是组分浓度较大或者 较小，表现出与样品集中其他样品的明显差异。由于理想的校正集的组分浓 度要求是整个浓度范围内是要均匀分布，针对这一现象，异常点的去除通过 马氏距离实现。第三次提取橙皮苷含量异常样品的马氏距离计算结果见图8， 可以看出1个样品的马氏距离值超过模型中所设定阈值，所以将样品剔除， 以减小异常样品对橙皮苷含量定标模型准确性和预测能力的影响。
4.2光谱预处理方式选择和光谱区间的筛选
采用偏最小二乘法建立橙皮苷定量校正模型，首先通过比较不同预处理 方法的RMC-r、RMSEC、RMSEP、RMP-r。结果表明：选用MSC+F,D+N,D(5,5) 作为光谱预处理方式，结果见表14。确定好光谱预处理方式后，比较部分光 谱和全部光谱的模型性能参数，得出以4817.31～4971.59和 7089.04～8724.38cm-1两段区间作为光谱条件时，橙皮苷含量的模型精密度和 准确度能力较好，结果见表15。
表14提取过程橙皮苷含量光谱预处理方式结果
| 光谱预处理方式 | RMC-r | RMSEC | RMSEP | RMP-r |
| MSC+S,D+S,G(5,5) | 0.5342 | 1.50 | 1.3476 | 0.7645 |
| MSC+F,D+S,G(5,5) | 0.8974 | 1.02 | 0.836 | 0.9538 |
| MSC+F,D+S,G(7,5) | 0.6247 | 1.14 | 1.156 | 0.8794 |
| MSC+F,D+N,D(5,5) | 0.9578 | 0.094 | 0.638 | 0.9673 |
| MSC+F,D+N,D(7,5) | 0.9698 | 0.00910 | 0.00679 | 0.9892 |
备注：MSC+F,D+S,G为标准证则变换+一阶导数+Savitizky-Golay；MSC+S,D+S,G为标准正则变换 +二阶导数+Savitizky-Golay；MSC+S,D+N,D为标准正则变换+二阶导数+NorrisDervative
表15提取过程橙皮苷含量模型光谱区间选择
4.3不同回归方法对橙皮苷模型建立的影响
表16不同回归方法建模性能参数
从表16中可以得出，优化后的光谱预处理和光谱范围进行不同回归方法 进行模型建立，其中偏最小二乘进行模型校正时，校正集和交叉验证性能参 数均比PCR、MLR方法性能较好。
五味藿香片水提第三次橙皮苷含量的定量模型见图9a，可以看出，样品 均匀地分布在回归线的两侧，橙皮苷模型RMSEC为0.00910，相关系数为 0.9698。橙皮苷含量与NIRs绝对误差相关图见图9b，相对误差均小于2.0％， 在允许误差范围之内；图9c为优化后RMSECV随主因子数的变化图，最佳 主因子数为6，说明所建立模型准确性和预测能力较好；图9d为提取第三次 橙皮苷含量3D分布图。
4.4提取第三次NIR模型参数的确定
采用原始光谱，并在4817.31～4971.59和7089.04～8724.38光谱范围下， 剔除异常点后，运用PLS法建立橙皮苷定量校正模型，根据RMSECV及累 积贡献率选择主成分数为10。
4.5模型的验证
4.5.1内部验证
本试验采用留一内部交叉验证的方法对模型进行内部检验橙皮苷模型： 与HPLC法测定值相比模型对校正集样品的AREP为4.01％。
4.5.2外部验证
外部预测检验是利用建立好的NIR模型预测没有参加建模的已知标准值 的一批样品，并计算预测值与标准值(编号159-180的样品的HPLC值)之 间的误差。结果见表17。
表17 NIR预测值与含量测定标准值测定结果比较
5.提取终点的判断
本试验通过计算相对浓度变化率(RCCR)来判断和监控提取终点，RCCR 值按如下公式进行计算：
其中，Ci为第i时刻取样时间下所检测到有效成分的的浓度，Ci+1为第i+1 时刻取样时间下所检测到有效成分的浓度。以橙皮苷为例，模型预测值在提 取第一次过程第100min、提取第二次过程第100min、提取三次过程第80min 后，变化趋于稳定。如图10a、10b、11a、11b、12a和12b。
五味藿香片中的有效成分橙皮苷，其传统监测工段指标的方法为HPLC 法，该前处理繁琐，易受杂质和溶剂背景吸收干扰，近红外检测技术快速、 方便、准确的可实时监测到含量变化。本章采用AntarisII光谱仪器，进行对 五味藿香片水提过程橙皮苷的含量监测，并计算相对浓度变化率值和观察提 取过程指标成分的溶出规律来判断终点，结果表明五味藿香片提取第一次在 100min，提取第二次在100min，提取第三次在80min时提前完全，与处方中 每次提取2个小时，提取三次，共节省80min，该法既保证了有效成分提取 完全，同时节省了时间和能源。
五味藿香片生产过程中提取过程为生产过程的重要工段，目前，中药提 取时间的控制主要是根据原工艺的提取时间，没有考虑由于原药材质量的差 异和工段波动等造成的终点的提前和滞后。导致提取液质量不稳定，影响后 续产品的质量。为了确保提取液质量的稳定均一且可控，本章以提取第一次、 第二次、第三次过程为研究对象，采用AntarisII近红外光谱在线分析技术结 合偏最小二乘法法建立提取液中橙皮苷定量校正模型，结果表明所建立的 NIR模型能够准确预测橙皮苷的含量，且与参考值间的偏差较小，实现快速、 实时、在线、动态监控橙皮苷在提取过程中含量的变化，确保最终产品实物 质量均一稳定。
最后应说明的是：以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限 制本发明，尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的 技术人员来说，其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或 者对其中部分技术特征进行等同替换。凡在本发明的精神和原则之内，所作 的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
Claims (13)
1.一种五味藿香片中橙皮苷的近红外光谱在线监测方法，其包含下述步骤：
(1)取五味藿香片的原料药材，加水煎煮，经提取得到提取液样品；
(2)将步骤(1)中得到的提取液用近红外光谱仪扫描得到近红外光谱数据；
(3)HPLC法测定步骤(1)中得到的提取液中橙皮苷的含量指标；
(4)运用化学计量方法将步骤(2)所得光谱与步骤(3)所得含量指标进行关联，通过重复下述步骤：光谱谱区选择、光谱预处理、数据降维、异常点剔除、建立和优化五味藿香片所提过程橙皮苷的模型、模型检验，重复操作直至建立的校正模型与样品相吻合即得。
2.根据权利要求1所述的在线监测方法，其中，在步骤(1)中，所述加水煎煮次数为1-3次。
3.根据权利要求1或2所述的在线监测方法，其中，所述煎煮次数为3次，第一次煎煮加8-12倍量的水，优选为10倍量的水，和/或第二次煎煮加8-12倍量的水，优选为10倍量的水，和/或第三次煎煮加8-12倍量的水，优选为10倍量的水。
4.根据权利要求1-3中任一项所述的在线监测方法，其中，第一次煎煮时间为1.5h～2.5h，优选为2h，和/或第二次煎煮时间为1.5h～2.5h，优选为2h，和/或第三次煎煮时间为1.5h～2.5h，优选为2h。
5.根据权利要求1-4任一项所述的在线监测方法，其中，在步骤(1)中，所述五味藿香片的原料药材为广藿香，陈皮，草豆蔻，苍术和豆蔻。
6.根据权利要求1-5任一项所述的在线监测方法，其中，在步骤(1)中，提取的时间为每次煎煮时沸腾前3-8min取样，沸腾后8-12min取样，优选为，提取的时间为每次煎煮时沸腾前5min取样，沸腾后10min取样。
7.根据权利要求1-6任一项所述的在线监测方法，其中，在步骤(2)中，所述提取液用近红外光谱仪的光谱条件为：波长范围为：1100nm～2300nm；优选的，波长增量为2.0nm；扫描次数为64；光程为2mm。
8.根据权利要求1-7任一项所述的在线监测方法，其中，步骤(4)中的校正模型的建立方法如下：
步骤1：收集橙皮苷提取液的校正集和验证集样本；
步骤2：用HPLC法测定校正集和验证集样品中的橙皮苷的含量；
步骤3：用近红外光谱仪扫描校正样品集，得到校正集近远红外光谱数据，选择合适的谱段区间和预处理方法；
步骤4：构建校正集样品橙皮苷含量与特征红外光谱数据之间关系的校正模型；
步骤5：通过内部和外部验证对校正模型进行验证。
9.根据权利要求8所述的在线监测方法，其中，步骤(4)中的校正模型的建立方法中的步骤2的HPLC法的条件为：Agilent C18色谱柱(250mm×4.6mm,5μm)，优选的，流动相为乙腈(A)-0.1％磷酸(B)。
10.根据权利要求8或9中所述的在线监测方法，其中，步骤(4)中的橙皮苷的含量指标测定方法为：Agilent C18色谱柱(250mm×4.6mm,5μm)，流动相A为乙腈,流动相B为0.1％磷酸，优选的，梯度洗脱程序为：0～30min，5％～19％A；30～40min，19％～20％A；40～50min，20％～29％A；50～85min，29％～54％A；更优选的，流速1mL·min-1；检测波长270nm；柱温30℃；进样量10μL。
11.根据权利要求8-11中任一项所述的在线监测方法，其中，步骤(4)中的校正模型的建立方法中的步骤3中的光谱预处理方法为选自数据中心化、一阶导数、二阶导数和散射校正中的一种或两种以上。
12.根据权利要求8-12中任一项所述的在线监测方法，其中，步骤(4)中的校正模型的建立方法中的步骤4中的校正模型的建立采用最小二乘法。
13.权利要求1-12中任一项所述的方法在药品生产稳定性中的应用，优选的，在五味藿香片生产过程中质量稳定性的应用。
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