CN104833651B - 金银花浓缩过程在线实时放行检测方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供一种金银花浓缩过程在线实时放行检测方法，通过采集金银花浓缩过程近红外透射光谱，建立在近红外模型，收集终点样本，测定各质控指标，利用Shewhart控制图建立定量实时放行检测标准，采集终点样本的近红外光谱，建立多变量统计过程控制模型，获得定性RTRT标准，采集异常批次样本，利用近红外模型预测异常批次并绘制Shewhart控制图，验证定量RTRT可行性，采集异常批次样本光谱，利用MSPC模型计算D统计量和Q统计量，验证RTRT可行性。本发明结合近红外和统计过程控制，实现金银花浓缩过程实时放行检测，同时符合定量和定性放行标准的批次方可放行进入后续精致纯化环节，提高了浓缩过程的质量控制水平。

Description

金银花浓缩过程在线实时放行检测方法

技术领域

本发明属于近红外检测和统计过程控制领域，具体涉及一种金银花浓缩过程在线实时放行检测方法。

背景技术

金银花为忍冬科忍冬属植物忍冬Lonicerajaponica Thumb. 的干燥花蕾或带初开的花，是一味应用十分广泛的药材，其性甘寒，气芳香，既能宣散风热，还善清解血毒，用于各种热性病，如身热、发疹、发斑、热毒疮痈、咽喉肿痛等症，均效果显著。目前金银花已是“热毒宁注射液”、“清开灵注射液”、“银黄注射液”等中药大品种的主要原药材。金银花浓缩过程作为生产浸膏的一个重要过程，其有效成分和溶剂含量的变化对后续精制过程有重要影响。

人用药物注册技术要求国际协调会（ICH）于2009年提出“实时放行检测（RTRT）”的理念，结合工艺控制和关键质量属性（CQA）等数据的分析，评估和保证中间产品或最终成品质量的能力。RTRT既可应用于连续的生产过程，也可应用不连续的生产单元，如蒸馏、结晶、分离纯化及各种化学反应等。欧盟药监局（EMA）于2012年发布RTRT指导文件，该文件中提出RTRT通常包含利用PAT工具的一系列过程控制的组合，比如近红外光谱分析技术和拉曼光谱分析技术结合多变量统计过程控制（MSPC）方法，以实现生产过程的实时放行检测。

近红外光谱技术是目前发展迅速和最具有应用前景的过程分析技术之一，具有样品处理简单、分析快速、绿色环保、无损、适于光纤远距离传输等特点，已陆续用于药效成分的含量测定、中药提取、浓缩、醇沉、萃取等过程的在线分析、天然药物鉴别、中药材的产地鉴别和成品的质量分析等，能够实现中药生产过程关键质量属性的实时放行检测。而统计过程控制通过对生产过程数据和近红外光谱的统计分析方法可得到实时放行科学合理的放行标准。将近红外光谱技术与统计过程控制方法联用可实现金银花浓缩过程的实时放行检测，同时符合定量和定性放行标准的金银花浓缩批次放行进入后续精制纯化环节，以提高金银花浓缩过程的质量控制水平，保证终产品质量的稳定和可控。

发明内容

本发明的目的是提供一种金银花浓缩过程在线实时放行检测方法。建立金银花浓缩过程新绿原酸、绿原酸、隐绿原酸、密度及含水率的在线近红外检测模型，并以Shewhart控制图建立定量放行控制限，实现金银花浓缩过程的5个质控指标的定量实时放行检测。同时利用多变量统计过程控制（MSPC）建立D统计量和Q统计量控制图，并得到定性放行控制限，实现金银花浓缩过程的定性实时放行检测。同时符合定量和定性放行标准的批次放行进入后续生产过程。

本发明的目的是通过以下技术方案实现：（在以下步骤中，要求将用到的）

1.在线采集金银花浓缩过程近红外透射光谱及浓缩液样本

金银花浓缩过程工艺条件为：浓缩温度80℃，真空度-0.04~-0.08 MPa，浓缩时间为150分钟，并以浓缩液密度达到1.10~1.12 g/mL为浓缩终点，浓缩过程中每隔1分钟在线采集浓缩液近红外透射光谱。浓缩开始后每隔15分钟采集浓缩液样品，1小时后每隔10分钟取样，浓缩液合并后每隔5分钟取样，达到浓缩终点后连续取样3份；

2.测定浓缩液样本各质控指标，包括新绿原酸、绿原酸、隐绿原酸、密度及含水率；

（1）新绿原酸、绿原酸和隐绿原酸浓度测定

高效液相色谱条件：色谱柱：Kromasil 100-5-C18分析柱（4.6×250 mm，5 μm）；流动相：0.1%磷酸水溶液-甲醇（80:20，v/v）；检测波长为327 nm；进样量为10 μL；柱温为30℃；流速为1 mL/min。

供试品溶液制备：称取浓缩合并前药液样本约1 g于25 mL量瓶中，称取浓缩合并后药液样本约1 g于100 mL量瓶，分别用纯化水稀释置刻度，于13000 r/min离心5 min，滤过（0.45 µm微孔滤膜），取续滤液用于液相分析。

标准曲线绘制：精密称取新绿原酸、绿原酸和隐绿原酸对照品各5 mg、25 mg和5mg于25 mL量瓶中，50%甲醇溶解定容，作为储备液。用移液管分别精密吸取对照品储备液1mL到100 mL，50 mL，25 mL和10 mL的量瓶中，精密吸取对照品储备液2 mL和4 mL 到10 mL量瓶中，并用50%甲醇稀释至刻度，得到不同浓度的对照品溶液，按高效液相色谱条件依次进样，并记录峰面积。结果显示新绿原酸、绿原酸和隐绿原酸分别在1.94~194.4 μg/mL、10.11~1011.2 μg/mL、1.98~198.0 μg/mL范围内线性关系良好，相关系数R均大于0.999。

（2） 密度值测定

将在线取得的样品于80℃水浴锅中恒温后，摇匀，精密吸取1 mL，体积记做，精密称定，质量记为。即可计算出浓缩液的密度值，密度的计算公式见公式（1），重复三次，取平均值。

（3）含水率测定

精密量取浓缩液3 mL至已烘干至恒重的扁形瓶（重量记为X0），精密称定，重量记为X1，置于水浴锅上挥干，放入105℃烘箱中烘干3 h，置于干燥器中冷却到室温，迅速称重记为X2。直至两次重量差异小于5 mg。含水率计算公式如下：

含水率（%）=（X1-X2）/（X1-X0）×100% （2）

3.采用偏最小二乘法建立各质控指标的近红外定量模型：

新绿原酸、绿原酸和隐绿原酸模型采用一阶导数和Savitzky-Golay平滑预处理，建模波段为6102~5446 cm^-1；密度和含水率模型采用一阶导数和Savitzky-Golay平滑预处理，建模波段为7502~4997 cm^-1；

4．在线收集多批次正常工艺条件浓缩终点样本，测定各质控指标，利用Shewhart控制图建立定量实时放行检测标准；

5．在线采集多批次正常和异常工艺条件浓缩终点样本的近红外透射光谱，建立多变量统计过程控制模型，通过D统计量和Q统计量控制图建立定性RTRT标准；

6．在线监测正常生产工艺的金银花浓缩过程，利用建立的近红外定量模型在线预测各指控指标含量，并利用建立的MSPC模型计算D统计量和Q统计量，符合定量和定性RTRT标准的批次方可放行进入下一生产环节。

其中Shewhart控制图和定量实时放行标准的建立：

（1）在线收集多批次正常工艺条件浓缩终点样本；（2）测定样本中新绿原酸、绿原酸、隐绿原酸、密度及含水率值，分别计算均值（）和标准差（σ）；（3）计算5个质控指标的控制下限（LCL）和控制上限（UCL），控制下限（LCL）和控制上限（UCL）的计算公式如下：

LCL为控制下限，UCL为控制上限，其中新绿原酸、绿原酸、隐绿原酸和含水率控制限公式中的k 值为3（±3σ），密度控制限公式中的k 值为2（±2σ）；（4）计算结果显示金银花浓缩过程的定量RTRT放行标准为：新绿原酸为0.98~1.64 mg/g，绿原酸为9.14~14.3mg/g，隐绿原酸为1.53~2.61 mg/g，密度为1.11~1.13 g/mL，含水率为61.84~75.22%。

通过Shewhart控制图可实现中药生产过程中影响中药药效和质量的某些关键质量属性的控制，若质量参数落在控制限范围内，则认为该质量参数在生产过程中处于受控（in control）状态，故Shewhart控制图计算所得的控制限可作为中药生产过程中关键质量指标的定量实时放行标准。通过D统计量和Q统计量控制图建立定性RTRT标准通过以下步骤实现：

MSPC控制图和定性实时放行标准的建立：

在线收集多批次正常和异常工艺条件浓缩终点样本，在线采集近红外光谱；选择6500~5500 cm^-1波段的近红外光谱数据，经主成分分析后，选择的主成分数为2，建立MSPC模型；取临界水平计算光谱的D统计量和Q统计量的控制限，作为定性实时放行标准。

D统计量的计算公式如下：

其中是矩阵中的第行，由构成主成分模型的个主成分的得分向量

所组成，是由前个主成分所对应的特征值所组成的对角矩阵。是多个变量累加的标量，D统计量控制图通过PCA模型内部的主成分得分向量的波动来反映过程多变量变化的情况。D统计量的控制限（UCL）按照F分布计算公式如下：

其中是PCA模型中所保留的主成分个数，是用来建立PCA模型的样本个数，是检验水平，是对应于检验水平为、自由度为、个样本条件下的分布的临界值。当时，表明该时刻D统计量正常。

Q统计量的计算公式如下：

其中为为第个时刻过程变量向量，，是单位矩阵。Q统计量代表过程数据中没有被PCA模型所解释的变化。当Q统计量值过大时，说明过程中出现了异常。当检验水平为时，Q统计量的控制限可按下式计算：

其中：

是PCA模型中所保留的主成分个数，为协方差矩阵的特征值，是正态分布检验水平为的临界值，若，说明该时刻Q统计量正常。

根据计算结果，金银花浓缩过程的定性RTRT标准为：D统计量低于6.58，Q统计量低于0.04。

本发明的另一个目的是提供实时放行检测方法金银花浓缩过程中的应用。

本发明在线监测正常生产工艺的金银花浓缩过程，利用建立的近红外定量模型在线预测各指控指标含量，并利用建立的MSPC模型计算D统计量和Q统计量，符合定量和定性RTRT标准的批次方可放行进入下一生产环节。

本发明将近红外光谱技术和统计过程控制方法联用，实现金银花浓缩过程新绿原酸、绿原酸、隐绿原酸，密度及含水率5个关键质控指标的在线检测。同时利用Shewhart控制图、D统计量控制图和Q统计量控制图得到实时放行的标准，实现金银花浓缩过程的实时放行检测，有利于提高金银花浓缩过程的质量控制水平，充分保证种产品质量稳定、可靠。

附图说明

附图1是新绿原酸的Shewhart控制图。

附图2是绿原酸的Shewhart控制图。

附图3是隐绿原酸的的Shewhart控制图。

附图4是密度的的Shewhart控制图。

附图5是含水率的的Shewhart控制图。

附图6是金银花浓缩过程D统计量控制图。

附图7是金银花浓缩过程的Q统计量控制图。

具体实施方式

本发明结合附图和实施例作进一步的说明。以下实施例是对本发明的进一步说明，而不是对本发明的限制。

实施例1：金银花浓缩过程定量实时放行检测

本发明提出一种金银花浓缩过程在线实时放行检测方法。结果表明，近红外光谱技术和Shewhart控制图联用，实现金银花浓缩过程新绿原酸、绿原酸、隐绿原酸，密度及含水率5个关键质控指标的定量实时放行检测。本方法快速、无损，能及时监控金银花浓缩过程中各质控指标含量是否正常，为金银花浓缩过程的质量控制提供新的方法。

（1）近红外在线检测模型的建立

在线采集10批金银花浓缩液样本的近红外光谱，并取样利用高效液相色谱法和烘干称重法测定浓缩液中新绿原酸、绿原酸、隐绿原酸、密度及含水率的值。随机挑选1批样本作为验证集，剩余的9批样本作为校正集，经过光谱预处理及波段的选择，利用偏最小二乘法建立5个质控指标的在线检测模型。利用多建立的模型对验证集进行预测，预测结果见表1，结果显示新绿原酸、绿原酸、隐绿原酸和密度值的相关系数R均在0.98以上，且5个质控指标的相对偏差RSEP（%）均在10%以内，可见模型的预测能力良好。

（2）Shewhart控制图和定量实时放行标准的建立

13批正常工艺下的终点浓缩液样本的新绿原酸、绿原酸、隐绿原酸、密度及含水率的均值（）和标准差（σ）见表2。根据公式（3）和公式（4）计算终点浓缩液的控制下限（LCL）和控制上限（UCL），k 通常取2或3，本研究除密度值以外的4个指标的控制限计算k 均取3，而密度值由于实际生产上要求在1.10~1.12 g/mL，变化范围较小，故k 取2计算其控制限，5个质控指标的LCL和UCL值见表2。

从表2可得金银花浓缩过程的定量放行标准为：新绿原酸为0.98~1.64 mg/g，绿原酸为9.14~14.3 mg/g，隐绿原酸为1.53~2.61 mg/g，密度为1.11~1.13 g/mL，含水率为61.84~75.22%。

（3）异常批次样本的制备

金银花浓缩过程的正常生产工艺条件为：温度80℃，真空度-0.04~-0.08 MPa，浓缩时间为150 min，并以浓缩液密度达到1.10~1.12 g/mL为浓缩终点。从生产线上取得金银花提取终点的药液，在70℃、80℃和90℃的温度水平下，在实验室模拟金银花浓缩过程的异常批次（DoE），使终点浓缩液的密度在实际生产正常范围（1.10~1.12 g/mL）以外，共得到9批不同温度和密度值的异常批次样本，见表3，每批异常批次浓缩液在浓缩终点时取3个样本，共得27个异常终点样本。用于验证定量实时放行检测的可行性。

（4）定量实时放行检测的验证

9批实验室模拟的异常批次（DoE）和3批正常生产工艺下的终点浓缩液样本（NOC）用于验证定量实时放行检测。利用建立的近红外模型预测9批实验室模拟的异常批次（DoE）和3批正常生产工艺下的终点浓缩液样本（NOC）的5个关键质控指标，并将近红外预测值和参比方法实测值绘制于Shewhart控制图上，结果见图1-5。

从图1-5可看出，3批正常批次的样本（28~36号）均在控制限内，而9批异常批次样本绝大部分落在控制限之外。但有3批异常批次（YC-5、YC-7、YC-8）样本的部分质控指标也落在控制限内，定量放行正确率为78%，故有必要进一步结合定性实时放行检测，更全面的对浓缩液样本进行放行检测。

实施例2：金银花浓缩过程定性实时放行检测

本发明提出一种金银花浓缩过程在线实时放行检测方法。通过联用近红外光谱技术和MSPC，建立金银花浓缩过程的D统计量和Q统计量控制图，得到定性放行标准，实现金银花浓缩过程的定性实时放行检测。本方法快速、无损，能及时监控金银花浓缩过程中综合质量是否正常，为金银花浓缩过程的质量控制提供新的方法。

采用近红外光谱技术，可获取大量的过程信息，所得近红外光谱采用MSPC方法建立基于PCA模型的D统计量和Q统计量控制图，得到的控制限作为金银花浓缩过程的定性实时放行标准。

（1） MSPC监控模型的建立

采集13批正常工艺水平下的终点浓缩液样本的近红外光谱，选择相应的波段进行主成分分析，用主成分贡献率累积和百分比（CPV）方法，计算各主成分贡献率。取临界水平计算D统计量和Q统计量的控制限（具体计算公式参见公式6和公式8），建立MSPC监控模型。不同波段对MSPC模型的影响见表4，结果显示6500~5500 cm^-1近红外光谱数据，经主成分分析后，选择2个主成分数，其主成分贡献率为99.91%，得到D统计量控制限为6.58，Q统计量控制限为0.04，Q统计图的正确率为100%，所取得的放行效果较好。

（2） 定性实时放行检测的验证

利用上述所建立的MSPC模型计算9批实验室模拟的异常批次（DoE）和3批正常生产工艺下的终点浓缩液样本（NOC）的D统计量和Q统计量值，并分别绘制在D统计量和Q统计量的控制图上，见图6和图7。结果显示所有异常和正常批次样本的D统计量均在控制限以下，无法检测异常批次。而在Q统计量控制图中，正常批次样本的Q统计量值均在控制限以下，而异常批次的样本均超出了控制限（1~27号样本为实验室模型的异常批次样本，28~36号样本为正常生产工艺样本）。故以Q统计量<0.04作为金银花浓缩过程的定性放行标准，定性放行正确率为100%。

D统计量表征PCA模型内部变化的一种测度，只能检验主成分子空间中某些变量的变动，如果某一测量变量没有被很好地体现在主成分模型中，那么这种变量的故障也就无法通过该方法进行检测。Q统计量代表数据中未被主成分所解释的变化，描述了生产过程和统计模型的偏离程度，是模型外部数据变化的一种测度，能够检测主成分模型外的变量波动。故两种统计量联用可比较灵敏的检测金银花浓缩液过程的异常批次。

本发明提出一种金银花浓缩过程在线实时放行检测方法。结果表明，近红外光谱技术和Shewhart控制图联用，实现金银花浓缩过程新绿原酸、绿原酸、隐绿原酸，密度及含水率5个关键质控指标的定量实时放行检测；近红外光谱技术和MSPC联用，建立金银花浓缩过程的D统计量和Q统计量控制图，得到定性放行标准，实现金银花浓缩过程的定性实时放行检测。本方法快速、无损，能及时监控金银花浓缩过程是否正常，为金银花浓缩过程的质量控制提供新的方法。同时还为实时放行检测在中药质量控制领域的推广和应用提供新的参考。

Claims (4)

1.一种金银花浓缩过程在线实时放行检测方法，其特征在于，通过以下步骤实现：

(1)在线采集金银花浓缩过程近红外透射光谱及浓缩液样本：金银花浓缩过程正常工艺条件为：浓缩温度80℃，真空度-0.04～-0.08MPa，浓缩时间为150分钟，并以浓缩液密度达到1.10～1.12g/mL为浓缩终点，浓缩过程中每隔1分钟在线采集浓缩液近红外透射光谱，浓缩开始后每隔15分钟采集浓缩液样品，1小时后每隔10分钟取样，浓缩液合并后每隔5分钟取样，达到浓缩终点后连续取样3份；

(2)测定浓缩液样本中各质控指标数据：新绿原酸、绿原酸、隐绿原酸、密度及含水率；

(3)采用偏最小二乘法建立各质控指标的近红外定量模型，新绿原酸、绿原酸和隐绿原酸模型采用一阶导数和Savitzky-Golay平滑预处理，建模波段为6102～5446cm^-1；密度和含水率模型采用一阶导数和Savitzky-Golay平滑预处理，建模波段为7502～4997cm^-1；

(4)在线收集多批次正常工艺条件浓缩终点样本，测定各质控指标，利用Shewhart控制图建立定量实时放行检测标准；

(5)在线采集多批次正常和异常工艺条件浓缩终点样本的近红外透射光谱，建立多变量统计过程控制模型，通过D统计量和Q统计量控制图建立定性RTRT标准；

(6)在线监测正常生产工艺的金银花浓缩过程，利用建立的近红外定量模型在线预测各指控指标含量，并利用建立的MSPC模型计算D统计量和Q统计量，符合定量和定性RTRT标准的批次方可放行进入下一生产环节。

2.根据权利要求1所述的一种金银花浓缩过程在线实时放行检测方法，其特征在于，步骤(4)中的利用Shewhart控制图建立定量RTRT标准通过以下步骤实现：(1)在线收集多批次正常工艺条件浓缩终点样本；(2)测定样本中新绿原酸、绿原酸、隐绿原酸、密度及含水率值，分别计算均值和标准差σ；(3)计算5个质控指标的控制下限(LCL)和控制上限(UCL)，其中新绿原酸、绿原酸、隐绿原酸和含水率的控制限为密度的控制限为(4)金银花浓缩过程的定量RTRT放行标准为：新绿原酸为0.98～1.64mg/g，绿原酸为9.14～14.3mg/g，隐绿原酸为1.53～2.61mg/g，密度为1.11～1.13g/mL，含水率为61.84～75.22％。

3.根据权利要求1所述的一种金银花浓缩过程在线实时放行检测方法，其特征在于，步骤(5)中的通过D统计量和Q统计量控制图建立定性RTRT标准通过以下步骤实现：(1)在线收集多批次正常和异常工艺条件浓缩终点样本，在线采集近红外光谱；(2)选择6500～5500cm^-1波段的近红外光谱数据，经主成分分析后，选择的主成分数为2，建立MSPC模型；(3)取临界水平α＝0.95计算光谱的D统计量和Q统计量的控制限，作为定性实时放行标准；(4)金银花浓缩过程的定性RTRT标准为：D统计量低于6.58，Q统计量低于0.04。

4.根据权利要求1所述的一种金银花浓缩过程在线实时放行检测方法在金银花浓缩过程中的应用。