CN103439288A - 一种银杏叶药材实时放行检测方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供一种银杏叶药材实时放行检测方法，通过采集不同产地和批次的银杏叶药材，测定银杏叶中水分、浸出物及黄酮醇苷的含量，采集银杏叶药材粉末的近红外光谱数据，建立银杏叶各质控指标的定量分析模型和实时放行的定量标准，建立银杏叶药材质量评价的定性分析模型和实时放行的定性标准。本发明引入近红外光谱技术作为银杏叶药材实时放行检测方法，用于快速测定银杏叶药材中水分、浸出物和黄酮醇苷含量并定性判断药材质量是否合格，根据定量、定性测定结果对银杏叶药材进行实时放行检测，同时符合定性、定量实时放行标准的药材方可放行进入后续生产工艺环节，从而保证银杏叶制剂批次间的稳定性和均一性，提高银杏叶制剂的质量水平。

Description

一种银杏叶药材实时放行检测方法

技术领域

本发明属于过程分析技术领域，具体涉及一种银杏叶药材实时放行检测方法。

背景技术

银杏叶为银杏科植物银杏(Gonkgobiloba L.)的干燥绿叶，有效成分主要是黄酮醇苷类化合物和萜类内酯类化合物，具有很高的保健和药用价值，深受国内外学者和企业家的重视。我国药典中记载银杏叶有敛肺、平喘、活血化瘀、止痛功能，用于肺虚咳喘、冠心病、心绞痛、高血脂等均具有良好的药效。目前，银杏叶是我国中药制剂生产中常用的原料药材之一，但其来源广泛，品种繁多，同一品种药材因其生长条件、采收季节、加工方式及贮藏条件的不同而在质量上存在差异。这些质量参差不齐的银杏叶原药材如果直接进入到制剂的提取、浓缩等后续生产过程，将影响中药制剂成品的质量。

2004年，美国FDA为提高生产效率和产品质量，发布了过程分析技术（PAT）的工业指南——《PAT——创新药物的研发，生产和质量保证的框架》。在该指南中首次提出了“实时放行（RTR，Real-Time Release）”的概念，即根据工艺数据，评估和保证中间品和/或成品达到可接受质量的能力。在2009年，ICH Q8中“RTR”被修订为“RTRT”，即实时放行检测（RTRT，Real-Time Release Testing）。其定义与FDA关于“RTR”的表述一致，即将被测量物料属性和工艺控制等的数据进行有效结合，据此评估和保证中间产品或最终成品质量的能力。故针对银杏叶原药材的质量特点，引入实时放行检测，将符合实时放行标准的银杏叶药材放行进入下一个生产工艺环节，从而提高银杏叶制剂成品的质量。目前，拉曼光谱分析技术及近红外光谱分析技术等具有良好应用前景的过程分析技术，均可作为实时放行检测方法。

近红外光谱分析技术具有样品处理简单、无损耗、分析快速、无需试剂消耗等特点，已经陆续用于药效成分的含量测定、制药过程的在线检测和监控、天然药物鉴别、中药材的产地鉴别等。将近红外光谱技术应用于银杏叶药材的实时放行检测，对银杏叶药材质量在入库和投料前进行快速检测，符合实时放行标准的银杏叶药材方能进入后续提取、浓缩等生产工艺环节，从银杏叶制剂生产的源头上控制其质量，从而保证最终产品质量的安全性、稳定性、均一性和有效性。

发明内容

本发明目的是提供一种银杏叶药材实时放行检测方法，可作为实时放行检测的最小二乘法方法，应用该方法能方便快速地从定量（水分含量、浸出物含量及黄酮醇苷含量）和定性两个方面对银杏叶药材质量进行实时放行检测，同时符合定量、定性实时放行标准的银杏叶药材方可放行进入后续生产工艺环节，从而保证中药制剂成品质量的均一性、稳定性和安全性。

本发明的目的是通过以下技术方案实现： 

（1）采集银杏叶药材：采集不同产地的银杏叶药材样本，药材经粉碎后，过80目筛，得到粒度较均匀的银杏叶药材粉末。

（2）测定银杏叶药材质控指标：选取水分含量、浸出物含量、黄酮醇苷（黄酮醇苷含量以槲皮素、山奈酚和异鼠李素的含量折算）含量作为银杏叶药材的关键质控指标；水分含量采用烘干称重法测定，浸出物含量采用热浸法测定，水分含量和浸出物含量测定方法参照2010版《中国药典》中对银杏叶的相关测定方法；黄酮醇苷含量采用高效液相色谱法测定。

黄酮醇苷含量采用高效液相色谱测定方法：取银杏叶药材粉末约1 g，精密称定，精密加25 mL的70%乙醇，超声提取1 h，放冷，用70%（v/v）的乙醇补足失重，精密加6 mL的25%（v/v）盐酸，回流酸解1 h，温度为90 ℃，放冷，用70%的乙醇补足失重。酸解液置1.5 mL的离心管中离心10 min，转速为13000 r/min，取上清液，既得。液相色谱条件：色谱柱：Agilent SB-C₁₈分析柱（4.6×250 mm，5 μm）；流动相：甲醇-0.4%磷酸溶液（50:50，v/v）；检测波长360 nm，流速为1 mL/min，进样量为10 μL。理论塔板数按槲皮素算应不低于2500； 

总黄酮醇苷含量=（槲皮素含量+山奈酚含量+异鼠李素含量）×2.51 。

（3）采集银杏叶药材近红外光谱数据

精密称取银杏叶药材粉末2 g，置于称量瓶中，保持粉末表面平整，采用漫反射法采集近红外光谱，以空气为参比，扫描次数为32，分辨率为8 cm^-1，扫描光谱范围为4000-10000 cm^-1。

（4）建立银杏叶药材各质控指标的近红外定量模型和实时放行的定量标准

应用化学计量学软件将所得的近红外光谱信息与参比方法所测得的标准值进行关联，采用偏最小二乘（PLS）法建立近红外光谱与质控指标之间的定量校准模型；根据183个银杏叶样品的近红外光谱的马氏距离及杠杆值大小剔除异常光谱，并采用一阶导数、Savitzky-Golay平滑、Norris平滑、标准正则变换及多元散射校正（MSC）对所得光谱预处理，同时根据相关系数值和光谱标准偏差值的大小选择合适的波段，最后采用留一交互验证法比较不同预处理方法和波段对近红外模型性能的影响，从而确定各质控指标最优的定量模型。

最终确定各质控指标的最优建模条件：水分含量的模型采用一阶导数和MSC预处理，建模波段为4246.9-7501.9 cm^-1；浸出物含量模型采用一阶导数、MSC和Norris平滑预处理，建模波段为5150.0-7501.9 cm^-1；黄酮醇苷含量模型采用一阶导数、MSC和Norris平滑预处理，建模波段为4246.6-9403.4 cm^-1。

所建立的校正模型采用相关系数（R）、校正集均方差（RMSEC）和交叉验证均方根（RMSECV）三个参数考察模型性能，同时采用预测均方差（RMSEP）、相对偏差（RSEP）来评价模型对未知样品的预测能力，当R值接近于1，RMSEC和RMSEP值较小而且近时，评价模型稳定性好、预测精准度高，当RSEP 值小于10%时评价模型具有较好的预测能力，能够满足银杏叶药材质量实时放行检测的要求。

使用上述所建立的3个近红外定量模型来测定银杏叶药材中的3个质控指标的含量，当未知银杏叶药材中水分含量≤12%，浸出物含量≥25%，黄酮醇苷含量≥0.4%时，判断银杏叶药材的质控指标含量符合质量要求，方可放行进入原药材质量近红外定性判别环节；所述%均指质量%：指水分质量、浸出物质量及黄酮醇苷质量占干燥药材质量的百分比。

（5）建立银杏叶药材质量的近红外定性模型和实时放行的定性标准

采用判别分析（Discriminant Analysis）方法定性判别银杏叶药材质量是否合格。采用MSC和Savitzky- Golay平滑预处理银杏叶药材的近红外光谱数据，选择4500-5950 cm^-1为建模波段，主成分数为10，通过马氏距离计算未知样品到标准样品光谱中心的距离（MD_h）和到不合格样品光谱中心的距离（MD_n）。马氏距离值越小且越接近零时表示未知样品与该类样品的匹配程度越接近，当样品的MD_h＜MD_n且MD_h＜2时，判断银杏叶药材质量合格，可放行进入原药材投料及提取等后续生产工艺环节。

银杏叶药材分别经过近红外定量模型和定性模型的分析，其质量同时符合定量、定性的实时放行标准，方可放行进入原药材投料及提取等后续生产工艺环节。

本发明的另一个目的是提供上述方法在银杏叶药材实时放行检测中应用。

本发明对银杏叶药材进行实时放行检测，将近红外光谱分析技术引入到银杏叶药材的实时放行检测过程中，实现对银杏叶药材各质控指标（水分含量、浸出物含量及黄酮醇苷含量）的快速测定和药材质量是否合格的定性判断，同时符合定量、定性实时放行标准的银杏叶药材方可进入中药制剂的后续生产工艺环节，有利于提高银杏叶制剂的质量控制水平，保正银杏叶制剂成品质量的安全、有效。

附图说明

附图1是银杏叶药材粉末水分含量实测值与近红外预测值的相关图。

附图2是银杏叶药材粉末浸出物含量实测值与近红外预测值的相关图。

附图3是银杏叶药材粉末黄酮醇苷含量实测值与近红外预测值的相关图。

附图4是银杏叶药材粉末水分含量实测值与近红外预测值的趋势对照图。

附图5是银杏叶药材粉末浸出物含量实测值与近红外预测值的趋势对照图。

附图6是银杏叶药材粉末黄酮醇苷含量实测值与近红外预测值的趋势对照图。

附图7是银杏叶药材到合格样品光谱的马氏距离和到不合格样品的马氏距离的分布图。

具体实施方式

本发明结合附图和实施例作进一步的说明。

实施例1：银杏叶药材质量定量的实时放行检测方法

（1）银杏叶药材近红外光谱数据采集

将183个银杏叶药材经粉碎后，过80目筛，得到粒度较均匀的银杏叶药材粉末；精密称取银杏叶药材粉末2 g，置于称量瓶中，保持粉末表面平整，采用漫反射法采集近红外光谱，以空气为参比，扫描次数为32，分辨率为8 cm^-1，扫描光谱范围为4000-10000 cm^-1，重复采集183个银杏叶药材的光谱。

（2）银杏叶药材各质控指标的测定

①水分测定方法：银杏叶药材的水分测定根据药典的烘干称重法，取烘干至恒重（连续两次称重差异小于5 mg）的扁形瓶（X₀），取2 g银杏叶药材，精密称重（X₁），置真空烘箱中105 ℃烘5 h，取出置干燥器中冷却30 min，称重，再置真空烘箱中烘1 h，称重（X₂），重量差异5 mg以上者继续置烘箱中烘，直至差异小于5 mg。根据减失的重量，计算供试品中含水量（%）。

水分含量（%）=（X₁－X₂＋X₀）/X₁×100。

②浸出物测定方法：取样品1g，精密称定（X₁），置50 mL的锥形瓶中，精密加稀乙醇25 mL，密塞，称定重量，静置1 h后超声提取1 h。放冷后，再称定重量，用稀乙醇补足减失的重量，摇匀，置于15 mL离心管中离心30 min，转速为3800 r/min，精密量取上清液10 mL，置已干燥至恒重的扁形瓶中（X₀），在水浴上蒸干后，于105 ℃干燥3 h，置干燥器中冷却30 min，迅速精密称定重量（X₂）。以干燥品计算供试品中浸出物的含量（%）。

浸出物的含量（%）=（X₂－X₀）×2.5/X₁×100。

③黄酮醇苷采用高效液相色谱测定：a. 预处理方法为：取银杏叶药材粉末约1 g，精密称定，精密加25 ml的70%（v/v）乙醇，超声提取1 h，放冷，用70%（v/v）的乙醇补足失重，精密加6 mL的25%（v/v）盐酸，回流酸解1 h，温度为90 ℃，放冷，用70%（v/v）的乙醇补足失重。酸解液置1.5 mL的离心管中离心10 min，转速为13000 r/min，取上清液，既得；b. 液相色谱条件：色谱柱：Agilent SB-C₁₈分析柱（4.6×250 mm，5 μm）；流动相：甲醇-0.4%磷酸溶液（50:50，v/v）；检测波长360 nm，流速为1 mL/min，进样量为10 μL。理论塔板数按槲皮素算应不低于2500；

总黄酮醇苷含量=（槲皮素含量+山奈酚含量+异鼠李素含量）×2.51。

（3）建立银杏叶药材各质控指标的定量分析模型

运用偏最小二乘（PLS）法建立样品中3个指标的近红外定量分析模型。模型建立前对校正集光谱进行异常点判别，以提高模型精度，同时原始光谱在平滑、微分等适宜的光谱预处理方法下来消除仪器背景或漂移对信号的影响，选择合适的波段提取有效信息，减少计算量，缩短建模时间。选择合适的建模波段，以交互验证误差均方根（RMSECV）为指标，运用留一交互验证法确定最佳PLS主因子数。

剔除异常样本后，随机选择163个样本作为校正集，剩余15个样本作为验证集用于预测。模型对校正集样本和验证集样本的预测误差分别用校正集预测误差均方根（RMSEC）和验证集预测误差均方根（RMSEP）来考察。当模型相关系数R越接近1，说明模型越稳定，分析准确度越高。当RMSEC和RMSEP值越小且彼此越接近时，模型具有较高的预测能力。同时用相对偏差（RSEP）来评价模型预测的准确度，当RSEP 值小于10%时评价模型具有较好的预测能力，能够满足银杏叶药材质量实时放行检测的要求。

最终确定各质控指标的最优建模条件：水分含量的模型采用一阶导数和MSC预处理，建模波段为4246.9-7501.9cm^-1；浸出物含量模型采用一阶导数、MSC和Norris平滑预处理，建模波段为5150.0-7501.9 cm^-1；黄酮醇苷含量模型采用一阶导数、MSC和Norris平滑预处理，建模波段为4246.6-9403.4 cm^-1；

表1为3个指标的近红外模型的建模结果比较，从表1可以看出，3个指标的近红外模型的线性良好，相关系数均在0.94以上，RMSEC值在0.97以下，RMSECV值在1.5以下，说明所建立的近红外定量校正模型效果较好。水分含量的实测值和预测值之间的相关图见附图1，浸出物含量的实测值和预测值之间的相关图见附图2，黄酮醇苷含量的实测值和预测值之间的相关图见附图3。

（4）定量校正模型的验证

将3个定量模型分别用于预测15个验证集样品中水分、浸出物及黄酮醇苷的含量。水分含量的实测值和近红外预测值的比较见附图4，浸出物含量的实测值和近红外预测值的比较见附图5，黄酮醇苷含量实测值和近红外预测值比较见附图6，可以看出3个指标的含量实测值与近红外预测值十分接近，基本保持一致。

表2为3个不同指标的近红外模型预测结果的参数汇总，从表2可看出水分、浸出物及黄酮醇苷含量的模型预测相关系数均在0.9以上，RMSEP在0.9以下，RSEP在10%以内，说明所建立的3个质控指标的近红外分析模型具有较好的预测能力和稳定性。

使用上述所建立的3个近红外定量模型来测定银杏叶药材中的3个质控指标的含量，当水分含量≤12%，浸出物含量≥25%，黄酮醇苷含量≥0.4%时，判断银杏药材质量符合要求，方可放行进入原药材质量近红外定性判别环节；通过所建立的水分和浸出物的近红外定量模型测定结果表明15个样品的水分含量和浸出物含量均符合实时放行标准，该结果与实际测得的真实值一致，准确率为100%；通过黄酮醇苷的近红外定量模型测定结果表明15个样品中12个样品的黄酮醇苷的含量符合实时放行标准，剩余的3个样品不符合要求，其中有1个合格样品误判为不合格，该黄酮醇苷定量模型的预测的准确率为93%。通过上述3个指标的定量模型的预测，3个不符合实时放行的定量标准的样品被排除，12个符合实时放行的定量标准的样品可放行进入银杏叶药材定性判别的环节。实际测得的结果表明15个样品中有1个符合放行标准的样品误判为不符合要求的样品，说明该近红外的定量分析模型在银杏叶药材实时放行检测中的准确率为93%，可用于银杏叶药材的实时放行检测。

实施例2：银杏叶药材质量定性的实时放行检测方法

（1）银杏叶药材近红外光谱数据采集

精密称取银杏叶药材粉末2 g，置于称量瓶中，保持粉末表面平整，采用漫反射法采集近红外光谱，以空气为参比，扫描次数为32，分辨率为8 cm^-1，扫描光谱范围为4000-10000 cm^-1，重复采集183批银杏叶药材的光谱。

（2）光谱预处理

采集银杏叶药材近红外慢反射光谱过程中，药材粉末粒径大小、粉末厚度、粉末表面性质等均会对近红外光谱造成影响。一阶导数能够明显消除基线平移，MSC能消除样品表面性质差异和颗粒大小不同带来的光谱飘移，Savitzky-Golay平滑可降低高频随机噪声。本次实验中采用MSC和Savitzky-Golay平滑预处理银杏叶药材近红外光谱。

（4）波段的选择

采用相关系数法和方差分析法进行波段的选择，最终选择4500-5950cm^-1作为建模波段。

（5）定性分析模型的建立及预测

经过光谱预处理及波段选择后，随机选择168个样本（其中合格样本89个，不合格样本79个）作为校正集用于建立判别分析的定性模型，通过马氏距离计算未知样品到合格样品光谱中心的距离（MD_h）和到不合格样品光谱中心的距离（MD_n）判别样品是否合格，马氏距离值越小且越接近零时表示未知样品与该类样品的匹配程度越接近，其MD_h＜MD_n且MD_h＜2时，判断银杏叶药材质量合格。银杏叶样本到合格样本光谱中心的距离和到不合格样本光谱中心距离的分布情况见附图7，可看出合格的银杏叶样本和不合格的银杏叶样本各自比较集中的聚集在一起。

选择步骤（4）中质控指标含量符合定量实时放行标准的12个银杏叶样品，使用上述定性模型判别药材是否合格。分析结果显示12个样品中有8个样品合格，4个样品不合格，其中有1个合格样品误判为不合格样品，该判别分析的模型预测的准确率为92%，可见该判别分析法能较好地判断银杏叶药材质量的情况；

定量、定性的近红外模型预测结果表明，15个银杏叶样品通过定量、定性近红外模型的预测，共8个银杏叶样品符合定量、定性的实时放行标准，可放行进入提取、浓缩等后续生产工艺环节。实际检测结果显示15个样本中有2个符合定量、定性放行标准的银杏叶样本被误判为不合格样本，表明该实时放行检测方法的准确率为87%，满足实时放行检测的要求。

本发明提出一种银杏叶药材实时放行检测方法。结果表明，将近红外光谱分析技术应用于银杏叶药材的实时放行检测，可方便快速的从定性和定量两个方面对银杏叶进行质量评价，同时符合定性和定量的实时放行标准的药材放行进入后续生产工艺环节，本方法快速、无损，能全面反映银杏叶药材质量，从银杏叶制剂的生产源头控制其质量水平，保证制剂成品的安全可靠。同时还为实时放行检测在中药质量控制领域的推广和应用提供新的参考。

Claims (4)

1.一种银杏叶药材实时放行检测方法，其特征在于，通过以下步骤实现： 

（1）采集银杏叶药材：采集不同产地的银杏叶药材样本，经粉碎后，过80目筛，得到粒度较均匀的银杏叶药材粉末；

（2）测定银杏叶药材质控指标：选取水分含量、浸出物含量、黄酮醇苷含量作为银杏叶药材的关键质控指标；水分含量采用烘干称重法测定，浸出物含量采用热浸法测定，均参照2010版《中国药典》中对银杏叶的相关测定方法；黄酮醇苷含量采用高效液相色谱法测定，其中液相色谱条件：色谱柱：Agilent SB-C₁₈分析柱，4.6×250 mm，5 μm；流动相：甲醇-0.4%磷酸溶液 50:50；检测波长360 nm，流速为1 mL/min，进样量为10 μL； 

（3）采集银杏叶药材近红外光谱数据：称取银杏叶药材粉末，置于称量瓶中，保持粉末表面平整，采用漫反射法采集近红外光谱，以空气为参比，扫描次数为32，分辨率为8 cm^-1，扫描光谱范围为4000-10000 cm^-1； 

（4）建立银杏叶药材各质控指标的近红外定量模型和实时放行的定量标准：应用化学计量学软件将所得的近红外光谱信息与参比方法所测得的标准值进行关联，采用偏最小二乘法建立近红外光谱与质控指标之间的定量校准模型；

（5）建立银杏叶药材质量的近红外定性模型和实时放行的定性标准：采用MSC和Savitzky- Golay平滑预处理银杏叶药材的近红外光谱数据，选择4500-5950 cm^-1为建模波段，主成分数为10，通过马氏距离计算未知样品到标准样品光谱中心的距离（MD_h）和到不合格样品光谱中心的距离（MD_n），马氏距离值越小且越接近零时表示未知样品与该类样品的匹配程度越接近，当样品的MD_h＜MD_n且MD_h＜2时，判断银杏叶药材质量合格，放行进入原药材投料及提取等后续生产工艺环节。

2.根据权利要求1所述的一种银杏叶药材实时放行检测方法，其特征在于，步骤（2）所述黄酮醇苷含量采用高效液相色谱测定方法：称定银杏叶药材粉末，加25 mL的70%乙醇，超声提取1 h，放冷，用70%的乙醇补足失重，精密加6 mL的25%盐酸，回流酸解1 h，温度为90 ℃，放冷，用70%的乙醇补足失重，酸解液置1.5 mL的离心管中离心10 min，转速为13000 r/min，取上清液，既得；液相色谱条件：色谱柱：Agilent SB-C₁₈分析柱，4.6×250 mm，5 μm；流动相：甲醇：0.4%磷酸溶液为50:50；检测波长360 nm，流速为1 mL/min，进样量为10 μL，理论塔板数按槲皮素算应不低于2500，黄酮醇苷以槲皮素、山奈酚和异鼠李素的含量折算，总黄酮醇苷含量=（槲皮素含量+山奈酚含量+异鼠李素含量）×2.51 。

3.根据权利要求1所述的一种银杏叶药材实时放行检测方法，其特征在于，步骤（4）所建水分含量的模型采用一阶导数和MSC预处理，建模波段为4246.9-7501.9 cm^-1；浸出物含量模型采用一阶导数、MSC和Norris平滑预处理，建模波段为5150.0-7501.9 cm^-1；黄酮醇苷含量模型采用一阶导数、MSC和Norris平滑预处理，建模波段为4246.6-9403.4 cm^-1；

当未知银杏叶药材中水分含量≤12%，浸出物含量≥25%，黄酮醇苷含量≥0.4%时，判断银杏叶药材的质控指标含量符合质量要求，放行进入原药材质量近红外定性判别环节。

4.根据权利要求1所述的一种银杏叶药材实时放行检测方法在银杏叶药材检测中的应用。

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