CN108107019A - 一种基于近红外光谱法快速检测玉米中杂色曲菌素含量的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种基于近红外光谱法快速检测玉米中的杂色曲菌素(Ver A)含量的方法。本发明所述的方法包括以下步骤：通过加标方法制备不同Ver A浓度的玉米样品；获取样品的光谱，对采集的原始光谱进行预处理，利用联合区间偏最小二乘法回归法siPLS构建VerA浓度的近红外快速检测模型；再利用模型快速测定Ver A含量。本发明所述方法将近红外光谱法结合多元校正法，无需繁琐的样品前处理，实现快速、准确地检测玉米中VerA含量，是一种无需溶剂的干法分析方法。
Description
技术领域
本发明涉及一种基于近红外光谱技术快速准确分析玉米中Ver A浓度的方法。具体涉及采用近红外光谱和数学预处理技术建立校正模型，实现对玉米中Ver A浓度进行快速简单准确分析的方法。
背景技术
杂色曲菌素(Versicolorin A，Ver A)是参与黄曲霉毒素B1(AFB1)生物合成的，并在AFB1生物合成途径中是第一个出现的与AFB1和杂色曲霉素(sterigmatocystin,ST)共同具有双呋喃环结构的化合物。在各种黄曲霉毒素中AFB1毒性最强，并且受黄曲霉毒素污染的样品中其AFB1的污染是最重要的，往往代表着黄曲霉毒素的污染水平。Ver A是黄曲霉毒素(AFs)的前体物。早期阶段Ver A的高水平潜在地预示了储存后作物的AFs污染。在粮食和谷物进行储存前进行快速的Ver A筛查可以评估黄曲霉毒素的污染风险，有助于粮食实时分类处理，而减少和控制黄曲霉毒素的污染发生。
目前检测VerA的手段包括高效液相色谱法(HPLC)、薄层色谱法(TLC)。HPLC法尽管具有低检测限和良好的灵敏度，但需要一定强度的劳动和专业的实验操作，尤其是复杂耗时的前处理工作，阻碍了潜在的实时可追溯性和现场快速筛查。因而，开发一种快速的，无需繁琐的样品前处理，准确的VerA检测方法显得尤为重要。
近红外反射光谱(NIR)具有检测方便，效率高，成分检测能力强等优点，已被广泛应用于检测和鉴定混合谷物中的真菌毒素。目前已有公开的专利运用光谱技术对糙米中黄曲霉毒素含量的快速检测，如专利：CN105158201A(一种基于FT-NIR技术的糙米中黄曲霉毒素含量的快速检测方法)利用傅立叶变换近红外光谱仪，光谱扫描范围为12000-3500cm-1，采用逐步多元线性回归法SMLR建立糙米样品粉末中黄曲霉毒素B1、B2、G1、G2及其总量与样品的光谱信息的化学计量模型；CN105445217A(基于衰减全反射傅里叶变换红外光谱技术的糙米中黄曲霉毒素含量的快速检测方法)利用Bruker傅里叶变换红外光谱仪，光谱扫描范围为4000-600cm-1，采用了偏最小二乘回归分析方法(PLSR)，建立了糙米样品中黄曲霉毒素B1、B2、G1、G2及其总量真实含量水平与预测水平的相关关系模型。
目前仍缺乏能够快速检测Ver A的方法。
发明内容
为克服已有技术的上述不足，本发明的目的是提供一种基于近红外光谱法快速检测玉米中Ver A含量的方法，该方法将近红外光谱法结合多元校正法，无需繁琐的样品前处理，实现快速、准确地检测玉米中VerA含量，是一种无需溶剂的干法分析方法。
本发明所述的基于近红外光谱法快速检测玉米中的Ver A含量的方法包括以下步骤：
A.选择未检出Ver A的玉米粉末，通过加标的方法，制备具有不同Ver A浓度的玉米样品作为分析样品；将所述分析样品随机划分为校正集合和验证集合；
B.使用FOSS的近红外光栅光谱分析仪，采用扫描波长为400-2498nm的光谱区间，对所述校正集合的每一个样品分别进行扫描并采集近红外光谱数据，以图谱形式储存所述校正集合的近红外光谱数据；
C.对所述校正集合的近红外光谱数据进行预处理以消除非目标因素的干扰；
D.采用联合区间偏最小二乘法，筛选建模的特征波长区间组合；将得到的特征波长作为建模波长，以步骤A中的VerA加标含量作为标准值，利用步骤C预处理后的近红外光谱建立Ver A的定量模型；
E.采用扫描波长为400-2498nm的光谱区间，对所述验证集合的每一个样品分别进行三次扫描并采集近红外光谱数据，采集验证集合的近红外光谱数据，运用与所述步骤C中相同的预处理方法对验证集合的近红外光谱数据进行预处理，用所述步骤D所构建的校正模型预测验证集合Ver A浓度。
根据本发明所述的方法的进一步特征，所述步骤D中，筛选建模的特征波长区间组合及建立Ver A的定量模型包括以下步骤：
a.通过相关系数R、交互验证均方根误差(RMSECV)、预测均方根误差(RMSEP)判断模型精度，R越高，RMSECV和RMSEP越小，模型的精度越高；
b.联合区间偏最小二乘法(siPLS)算法步骤如下：
第一步：将整个光谱区域划分为n个等宽的子区间；
第二步：在每个子区间上进行偏最小二乘回归，建立待测品质的局部回归模型，得到n个局部回归模型；
第三步：以交互验证时的均方根误差值RMSECV为各局部模型的精度衡量标准，对各局部模型的精度进行比较，找出精度较好的模型所对应的m个子区间，把这m个子区间联合起来进行偏最小二乘回归，建立待测品质的联合局部回归模型；
第四步：以RMSEP值为各联合局部模型的精度衡量标准，对各个联合局部模型的精度进行比较，符合要求的RMSEP(RMSEP值＜17μg/kg)所对应的联合局部回归模型的子区间组合即为特征波长区间组合；
c.根据以上方法筛选出来的特征波长区间，以不同的组合方式，采用偏最小二乘法建立Ver A的回归模型，根据最低的RMSEP值得到最优的siPLS模型。
根据本发明所述的方法的进一步特征，所述步骤A中，将市售的高质量玉米粉碎后过20目筛网，取不含Ver A(HPLC检测)的玉米样品作为空白样品，每份1g，加入各种浓度的Ver A标准品甲醇溶液，充分混合，并在黑暗中环境温度下置于通风橱中过夜，使得分析物与基质之间达到平衡，制备成含量在0和210μg/kg之间的各种Ver A水平的99份加标样品，随机分组为73个校正集合与26个验证集合，所述校正集合用于建立校正模型，所述验证集合用于验证模型的稳健性。
根据本发明所述的方法的进一步特征，所述步骤B中，利用FOSS的近红外光栅光谱分析仪采集加标的玉米粉末的光谱信息包括：将FOSS的近红外光栅光谱分析仪自检约30min，取1g加标玉米粉末置于样品池进行光谱检测，每份样品测量3次，取3次光谱的平均值进行分析。
根据本发明所述的方法的进一步特征，所述特征波长区间是选自：440-852nm、1544-1818nm、2228-2498nm。
优选地，所述特征波长区间是506-610nm和2396-2498nm的组合。此时建立的模型稳健性最优。
根据本发明所述的方法的进一步特征，所述步骤C中，所述预处理的方法是选自以下之一：多元散射校正、标准正态变量变换、平滑方法和求导方法。
优选地，所述求导方法为一阶求导或二阶求导方法。
本发明所述的基于近红外光谱法快速检测玉米中的Ver A含量的方法的核心是：先建立模型，再利用模型快速测定Ver A含量。利用预处理后的近红外光谱建立Ver A的定量模型，当这种一一对应的关联校正模型建立后，利用该模型就可以从未知样品的近红外光谱数据直接读出(预测出)该样品中Ver A的含量。
与传统检测方法相比，本发明所述的方法能利用近红外技术实现玉米中杂色曲菌素的快速定量检测，具有以下显著优点：
(1)检测快捷，无需对玉米中杂色曲菌素进行提取等预处理，仅需使用近红外光谱技术采集样品的特征光谱信息。
(2)操作简便，无需专业技术人员。
(3)环保，无需配制化学试剂，无有毒废液生成，降低了对人体和环境的危害。
(4)成本低，无需购买昂贵的化学试剂、净化柱等试剂耗材。
附图说明
图1是不同VerA浓度的加标玉米样品的波长范围400-2498nm原始光谱图。
图2是SNV预处理后的原始光谱。
图3是原始光谱在SNV预处理方法下所测VerA建立模型校正集的实际值和预测值的关系散点图。
图4是原始光谱在SNV预处理方法下所测VerA建立模型验证集的实际值和预测值的关系散点图。
具体实施方式
下面结合本发明的具体实施例以及附图对本发明进行详细说明，本实施例在以本发明技术方案为前提下进行实施，给出了详细的实施方式和具体的操作过程，但本发明的保护范围不限于下述的实施例。
本发明所述的基于近红外光谱法快速检测玉米中的Ver A含量的方法包括以下步骤：
1.供试样的制备
将购买于市售的高质量玉米粉碎后过20目筛网，取不含Ver A(HPLC检测)的玉米样品作为空白样品，每份1g，加入各种浓度的VerA标准品甲醇溶液，充分混合，并在黑暗中环境温度下置于通风橱中过夜，使得分析物与基质之间达到平衡，制备成含量在0和210μg/kg之间的各种Ver A水平的99份加标样品。随机分组，校正集合73个用于建立校正模型，验证集合26个用于验证模型的稳健性。
2.使用FOSS的近红外光栅光谱分析仪，采用扫描波长为400-2498nm的光谱区间，对校正集合的每一份玉米分别进行扫描并采集近红外光谱数据，以图谱形式储存校正集合的近红外光谱数据；结果如图1所示。
3.对校正集合的近红外光谱数据进行预处理，消除非目标因素的干扰。结果如图2和图3、图4所示。
4.采用联合区间偏最小二乘法，建立校正集合VerA浓度的近红外光谱预测集与其化学值之间一一对应的关联校正模型；
1)通过相关系数R、交互验证均方根误差RMSEC、预测均方根误差RMSEP判断模型精度，R越高，RMSEC和RMSEP越小，模型的精度越高：
2)联合区间偏最小二乘法siPLS算法步骤如下：
第一步：将整个光谱区域划分为n个等宽的子区间；
第二步：在每个子区间上进行偏最小二乘回归，建立待测品质的局部回归模型，得到n个局部回归模型；
第三步：以交互验证时的均方根误差值RMSECV为各局部模型的精度衡量标准，对各局部模型的精度进行比较，找出精度较好的模型所对应的m个子区间，把这m个子区间联合起来进行偏最小二乘回归，建立待测品质的联合局部回归模型；
第四步：以RMSEP值为各联合局部模型的精度衡量标准，对各个联合局部模型的精度进行比较，最小的RMSEP所对应的联合局部回归模型的子区间组合即为特征波长区间组合；
3)联合区间偏最小二乘法siPLS模型的建立：
采用联合区间偏最小二乘回归法对上述样本的近红外光谱进行筛选时，将整个光谱区间划分为14、15、16、…、20个子区间，以考察不同数目的子区间划分对模型性能以及最佳波长区间的影响。在数据处理过程中，划分为相同子区间的情况下，又分别联合2、3和4个子区间建立模型，从中获得最优VerA含量的siPLS模型。表1为玉米中VerA含量的siPLS模型建立的数据分析结果。样品中VerA浓度siPLS校正模型的最优联合区间是依据最小RMSECV来选择的。
表1选择不同区间数的联合区间偏最小二乘VerA分析模型的结果
由表1可以看出，整个光谱区域划分20个区间并联合2个子区间，它的联合区间为【2 20】，主因子数8，对应于全光谱的506-610nm和2396-2498nm，共105个变量。此时获得最优VerA含量的siPLS模型。
5.采用扫描波长为400-2498nm的光谱区间，对验证集合的每一个样品分别进行三次扫描并采集近红外光谱数据，采集验证集合的近红外光谱数据，运用与上述步骤3中相同的标准正态变量变换(SNV)预处理方法对验证集合的近红外光谱数据进行预处理，用步骤4所构建的校正模型预测验证集合VerA浓度。
6.计算相对分析误差(RPD)
相对分析误差为验证集样品标准差(SD)与预测均方根误差之比，其可评价定量模型预测能力的优劣。一般RPD值大于2即可认为模型具有一定的预测能力，当值大于3则说明模型预测能力优异，可以进行准确的预测。该实施案例用选出的特征波长区间建立玉米中Ver A含量的模型，计算得到的RPD值为3.88，说明建立的模型预测可以进行准确的预测玉米中VerA的含量。
7.对于自然污染VerA样品的模型验证：分别用本发明的方法和传统的HPLC方法对自然污染的玉米样品进行Ver A含量的测量
(1)高效液相色谱(HPLC)法测量玉米中Ver A的含量
HPLC是测量样品Ver A较为权威和公认的方法，该方法包括样品的预处理和测量。
1)自然污染Ver A玉米样品的萃取与纯化
自然污染的样品：购自四川河南等农户的玉米样品，存放1至2个月可发现该玉米样品已经受到Ver A的污染(HPLC方法测量)。
称取25g磨碎的上述玉米样品(50-200目)于烧杯中，加入150ml丙酮避光200rpm搅拌15min萃取玉米中的Ver A，过滤混合液后，旋转蒸发仪蒸干，加入20mL丙酮溶液溶解,并与1g 60-100目硅胶(48-75μm，中国青岛海洋化工厂)混合。然后将样品在室温下避光完全蒸发。使用以下清洁程序制备存在于硅胶中的提取物。使用湿法制备填充有5.0g 200-300目硅胶(用石油醚活化并在使用前脱气)的清洁柱。然后将已经吸附到1g硅胶粉末上的制备的Ver A提取物小心地加入到清洁柱中。使用15mL石油醚，然后以1滴/s的流速，用30mL二氯甲烷/丙酮(v/v:9/1)洗脱提取物。使用旋转蒸发器(在50℃和0.09MPa)收集包含Ver A的第二洗脱液并干燥。然后将提取的Ver A重新溶解并稀释在2mL甲醇(HPLC级，ThermoScientific，USA)中，进一步分析。
2)高效液相色谱(HPLC)法测量自然污染玉米样品的VerA
使用具有荧光检测器和氙灯源的HPLC系统(UltiMate3000，Thermo Scientific，New York，USA)测量Ver A水平。在梯度模式下，两种流动相由A(500:1M/M的乙酸铵/乙酸钠甲醇溶液)和B(500:1M/M的乙酸铵/乙酸钠水溶液)组成。使用波长288nm的PAD(光电二极管阵列)检测器(3000，Thermo Fisher Scientific)和分别在激发和发射波长为365nm和425nm的荧光检测器(3x00，Thermo Fisher Scientific)进行检测。该方法的检出限(LOD)为250ng/mL。对于样品含量低于该水平的样品，以加入VerA内标的方法解决。
(2)用本发明的NIR方法测量玉米中Ver A的含量
对10个上述自然污染的玉米样品分别进行粉碎处理后，各取5g进行近红外光谱扫描，读取各个样品的特征波长区间组合506-610nm，2396-2498nm波段的光谱吸收数据。再将得到的光谱吸收数据预处理(预处理方法与建模时的预处理方法一致)后代入上述已建好的siPLS模型，得到每个玉米样品的VerA预测含量值。所得结果如表2所示，统计学(配对t检验)分析(如表3)表明：p＝0.422＞0.05。说明本发明所建立的近红外方法的测量结果与高效液相色谱法测量结果无显著差异。
表2：HPLC法与本发明的NIR方法对10个自然污染VerA的玉米样品测量的结果
表3：成对样本检定
综上所述，本发明运用联合区间偏最小二乘法筛选特征波长，能优化信息区间，因为全光谱区间内存在大量冗余信息，如果将这些冗余信息参与建模，将会大大降低模型的稳健性。而且，选择特征波长建模大大减少了建模的波长变量，从1050个波长变量减少到105个变量。这在一定程度上可提高数据的处理效率，缩短从光谱检测到结果呈现的时间，这个优点在实际粮食仓储中面对大量样品的检测任务时显得尤为重要。另一方面，本发明的方法与HPLC相比，检测快捷，无需对玉米中杂色曲菌素进行提取，省去了繁琐的前提取步骤，仅需直接将样品磨成粉末，再应用近红外技术采集样品的特征光谱信息，只需几分钟就可以得到样品的光谱信息。操作简便，无需专业技术人员。环保，无需配制化学试剂，无有毒废液生成，降低了对人体和环境的危害。成本低，无需购买昂贵的化学试剂、净化柱等试剂耗材。由结果可知，本发明建立的NIR方法在一定程度上可以作为检测VerA的另一种选择。
Claims (8)
1.一种基于近红外光谱法快速检测玉米中的Ver A含量的方法，其特征在于，包括以下步骤：
A.选择未检出Ver A的玉米粉末，通过加标的方法，制备具有不同Ver A浓度的玉米样品作为分析样品；将所述分析样品随机划分为校正集合和验证集合；
B.使用FOSS的近红外光栅光谱分析仪，采用扫描波长为400-2498nm的光谱区间，对所述校正集合的每一个样品分别进行扫描并采集近红外光谱数据，以图谱形式储存所述校正集合的近红外光谱数据；
C.对所述校正集合的近红外光谱数据进行预处理以消除非目标因素的干扰；
D.采用联合区间偏最小二乘法，筛选建模的特征波长区间组合；将得到的特征波长作为建模波长，以步骤A中的VerA加标含量作为标准值，利用步骤C预处理后的近红外光谱建立Ver A的定量模型；
E.采用扫描波长为400-2498nm的光谱区间，对所述验证集合的每一个样品分别进行三次扫描并采集近红外光谱数据，采集验证集合的近红外光谱数据，运用与所述步骤C中相同的预处理方法对验证集合的近红外光谱数据进行预处理，用所述步骤D所构建的校正模型预测验证集合Ver A浓度。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤D中，筛选建模的特征波长区间组合及建立Ver A的定量模型包括以下步骤：
a.通过相关系数R、交互验证均方根误差(RMSECV)、预测均方根误差(RMSEP)判断模型精度，R越高，RMSECV和RMSEP越小，模型的精度越高；
b.联合区间偏最小二乘法(siPLS)算法步骤如下：
第一步：将整个光谱区域划分为n个等宽的子区间；
第二步：在每个子区间上进行偏最小二乘回归，建立待测品质的局部回归模型，得到n个局部回归模型；
第三步：以交互验证时的均方根误差值RMSECV为各局部模型的精度衡量标准，对各局部模型的精度进行比较，找出精度较好的模型所对应的m个子区间，把这m个子区间联合起来进行偏最小二乘回归，建立待测品质的联合局部回归模型；
第四步：以RMSEP值为各联合局部模型的精度衡量标准，对各个联合局部模型的精度进行比较，符合要求的RMSEP(RMSEP值＜17μg/kg)所对应的联合局部回归模型的子区间组合即为特征波长区间组合；
c.根据以上方法筛选出来的特征波长区间，以不同的组合方式，采用偏最小二乘法建立Ver A的回归模型，根据最低的RMSEP值得到最优的siPLS模型。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述步骤A中，将市售的高质量玉米粉碎后过20目筛网，取不含Ver A(HPLC检测)的玉米样品作为空白样品，每份1g，加入各种浓度的Ver A标准品甲醇溶液，充分混合，并在黑暗中环境温度下置于通风橱中过夜，使得分析物与基质之间达到平衡，制备成含量在0和210μg/kg之间的各种Ver A水平的99份加标样品，随机分组为73个校正集合与26个验证集合，所述校正集合用于建立校正模型，所述验证集合用于验证模型的稳健性。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述步骤B中，利用FOSS的近红外光栅光谱分析仪采集加标的玉米粉末的光谱信息包括：将FOSS的近红外光栅光谱分析仪自检约30min，取1g加标玉米粉末置于样品池进行光谱检测，每份样品测量3次，取3次光谱的平均值进行分析。
5.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述特征波长区间是选自：440-852nm、1544-1818nm、2228-2498nm。
6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于：所述特征波长区间是506-610nm和2396-2498nm的组合。
7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述步骤C中，所述预处理的方法是选自以下之一：多元散射校正、标准正态变量变换、平滑方法和求导方法。
8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于：所述求导方法为一阶求导或二阶求导方法。
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