CN110286178B - 一种检测保健食品口服液中22种真菌毒素的高通量分析法 - Google Patents

一种检测保健食品口服液中22种真菌毒素的高通量分析法 Download PDF

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Abstract

本发明属于食品检测技术领域，具体涉及一种检测保健食品口服液中22中真菌毒素的高通量分析法。所述分析法，包括如下步骤：1)待测保健食品口服液经固相萃取小柱进行样品前处理；2)液相色谱‑质谱测定所述待测保健食品口服液，通过与22种真菌毒素对照品溶液比较进行定性、定量分析。本发明建立了22种真菌毒素种真菌毒素的标准曲线，相关系数均大于0.99，线性良好。本发明所述分析法简单快速，灵敏度高，检出限好，在同一个体系中同时可以针对22种真菌毒素进行检测，显著提高保健食品口服液样品的前处理及其测定的真菌毒素的种类。本发明该方法可靠稳定、重复性好，具有较广的适用性。

Description

一种检测保健食品口服液中22种真菌毒素的高通量分析法
技术领域
本发明属于食品检测技术领域，具体涉及一种检测保健食品口服液中22中真菌毒素的高通量分析法。
背景技术
真菌毒素是真菌在食品或饲料里生长所产生的代谢产物，对人类和动物都有害。
作为食品和饲料等的重要污染物之一，真菌毒素具有肝、肾毒性、致癌和致突变性、生殖毒性、致畸性等毒性，严重影响农产品质量，对人畜带来严重的安全威胁。
常见的真菌毒素为黄曲霉毒素(Aflatoxins，AFT)，被WHO划定为1类致癌物。黄曲霉毒素是黄曲霉和寄生曲霉等菌种产生的次级代谢产物，为毒性和致癌性最强的天然污染物。黄曲霉毒素经常污染粮油及其制品。各种坚果、特别是花生和核桃中，大豆、稻谷、玉米、调味品、牛奶、奶制品、食用油等制品中也经常发现黄曲霉毒素。此外，真菌毒素还包括赭曲霉毒素、杂色曲霉素、桔青霉素、伏马菌素、玉米赤霉烯酮类毒素、镰刀真菌毒素等。
由于研究技术的发展，对各种真菌毒素毒性了解不断深入，发现多数真菌毒素在极低浓度下就有毒性。为了保证日常饮食的安全，需要对食品或饲料中真菌毒素的进行严格检验。保健食品口服液是市场销售量较大的一类保健食品剂型，由于其为液体制剂，因此，需要严格检测其中所含真菌毒素的种类及其含量。
目前大多的高通量检测方法是针对农残、防腐剂、化妆品中的违禁抗生素等开发的方法，虽有个别专利针对真菌毒素进行检测，但目前的检测方法中，最多的仅可检测到16种真菌毒素。另外，当前研究领域中，全部的研究都是针对食品、化妆品、药品等进行真菌毒素的检测，未专门对保健食品中的真菌毒素进行相关检测。
发明内容
有鉴于此，本发明的目的在于提供一种检测保健食品口服液中22种真菌毒素的高通量分析法。
为实现本发明的目的，本发明采用如下技术方案：
一种检测保健食品口服液中22种真菌毒素的高通量分析法，包括如下步骤：
1)待测保健食品口服液经固相萃取小柱进行样品前处理；
2)液相色谱-质谱测定所述待测保健食品口服液，通过与22种真菌毒素对照品溶液比较进行定性、定量分析；
所述真菌毒素对照品包括15-乙酰基脱氧雪腐镰刀菌烯醇、3-乙酰基脱氧雪腐镰刀菌烯醇、黄曲霉毒素B1、黄曲霉毒素B2、黄曲霉毒素G1、黄曲霉毒素G2、黄曲霉毒素M1、黄曲霉毒素M2、白僵菌素、桔青霉素、脱氧雪腐镰刀菌稀醇、伏马毒素FB1、伏马毒素FB2、伏马毒素FB3、胶黏毒素、HT-2毒素、赭曲霉毒素A、赭曲霉毒素B、赭曲霉毒素C、杂色曲霉素、T-2毒素、玉米赤霉烯酮类毒素。
作为优选，本发明所述的高通量分析法中所述前处理方法具体为待测保健食品口服液上固相萃取柱，然后依次以纯水和甲醇洗涤固相萃取柱，收集甲醇淋洗液，浓缩、过滤，收集滤液。
进一步的，在一些实施方案中，本发明所述的高通量分析法中所述前处理方法中所述固相萃取柱为Myco6in1免疫亲和柱；所述待测保健食品口服液、纯水和甲醇的流速均为1滴/秒；所述浓缩为氮吹浓缩；所述过滤为0.22μm滤膜过滤。
作为优选，本发明所述的高通量分析法中所述液相色谱的色谱条件为采用WatersBEH C18色谱柱(100mm×2.1mm，1.7μm)；柱温35℃，流速0.35mL/min，进样1μL；流动相组成为：A相为0.1％甲酸水溶液；B相为乙腈；流动相洗脱程序为
Figure BDA0002155763890000021
Figure BDA0002155763890000031
作为优选，本发明所述的高通量分析法中所述质谱在正离子模式下ESI源进行检测，采用MRM扫描模式。
作为优选，本发明所述的高通量分析法中所述定性分析为液相色谱-质谱测定所述待测保健食品口服液，如果检测出的色谱峰保留时间与标准品一致，并且在扣除背景后的待测保健食品口服液谱图中，各定性离子的相对丰度与浓度接近的同样条件下，与得到的对照品溶液谱图相比，来判定样品中是否存在对应的被测物。
在一些实施方案中，本发明所述的高通量分析法中样品检出真菌毒素的标准为在样品进行检测时，如果检出色谱峰的保留时间与对照品一致，并且在扣除背景后的质谱图中，所选择的监测离子对均出现，而且所选择的监测离子对峰面积比与对照品的监测离子对峰面积比一致(相对比例>50％，允许±20％偏差；相对比例>20％-50％，允许±25％偏差；相对比例>10％-20％，允许±30％偏差；相对比例≤10％，允许±50％偏差)，则判断样品中存在该成分。
作为优选，本发明所述的高通量分析法中所述定量分析为分别测定所述真菌毒素的响应，以浓度为横坐标，峰面积为纵坐标绘制标准曲线；液相色谱-质谱测定所述待测保健食品口服液，外标法进行定量分析。
由上述技术方案可知，本发明提供了一种检测保健食品口服液中22种真菌毒素的高通量分析法，包括如下步骤：1)待测保健食品口服液经固相萃取小柱进行样品前处理；2)液相色谱-质谱测定所述待测保健食品口服液，通过与22种真菌毒素对照品溶液比较进行定性、定量分析。本发明建立了15-乙酰基脱氧雪腐镰刀菌烯醇、3-乙酰基脱氧雪腐镰刀菌烯醇、黄曲霉毒素B1、黄曲霉毒素B2、黄曲霉毒素G1、黄曲霉毒素G2、黄曲霉毒素M1、黄曲霉毒素M2、白僵菌素、桔青霉素、脱氧雪腐镰刀菌稀醇、伏马毒素FB1、伏马毒素FB2、伏马毒素FB3、胶黏毒素、HT-2毒素、赭曲霉毒素A、赭曲霉毒素B、赭曲霉毒素C、杂色曲霉素、T-2毒素、玉米赤霉烯酮类毒素22种真菌毒素种真菌毒素的标准曲线，相关系数均大于0.99，线性良好。本发明所述分析法简单快速，灵敏度高，检出限好，在同一个体系中同时可以针对22种真菌毒素进行检测。显著提高保健食品口服液样品的前处理及其测定的真菌毒素的种类，具有广阔的应用价值和巨大的经济效益。本发明该方法可靠稳定、重复性好，具有较广的适用性，为保健食品口服液行业的质量安全提供一种有效的技术手段。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍。
图1为空白样品溶液总离子流图；
图2为混合标准品对照液总离子流图；
图3为22种真菌毒素检出结果图；
图4为保健食品口服液总离子流图。
具体实施方式
本发明公开了一种检测保健食品口服液中22中真菌毒素的高通量分析法。本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的方法及产品已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文所述的方法进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。
为了进一步理解本发明，下面将结合本发明实施例，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
如无特殊说明，本发明实施例中所涉及的试剂均为市售产品，均可以通过商业渠道购买获得。其中各实施例涉及的仪器和试药如下：Waters Acquity UPLC液相色谱仪(Waters公司，美国)；Waters Xevo-TQS(Waters公司，美国)；Waters BEH C18色谱柱(100mm×2.1mm，1.7μm)；Milli-Q纯水仪(美国MILLIPORE公司)。乙腈(默克公司，色谱级)；甲酸(Sigma)；甲酸铵(Sigma)。Myco6in1免疫亲和柱(中检维康)。增健口服液(无限极有限公司提供，批号：17A05BEB01)，对照品见表1。
表1真菌毒素标准品信息
编号 名称 name CAS号
1 3-乙酰基脱氧雪腐镰刀菌烯醇 3-Acetyl-Deoxynivalenol,3-DON 149-29-1
2 15-乙酰基脱氧雪腐镰刀菌烯醇 15-Acetyl-Deoxynivalenol,15-DON 50722-38-8
3 黄曲霉毒素B1 Aflatoxin B1,AFB1 7220-81-7
4 黄曲霉毒素B2 Aflatoxin B2,AFB2 17924-92-4
5 黄曲霉毒素G1 Aflatoxin G1,AFG1 6795-23-9
6 黄曲霉毒素G2 Aflatoxin G2,AFG2 6885-57-0
7 黄曲霉毒素M1 Aflatoxin M1,AFM1 7241-98-7
8 黄曲霉毒素M2 Aflatoxin M2,AFM2 88337-96-6
9 白僵菌素 Beauvericin,BEA 26048-05-5
10 桔青霉素(桔霉素) Citrinin,CIT 51481-10-8
11 脱氧雪腐镰刀菌稀醇(呕吐毒素) deoxynivalenol,DON 1162-65-8
12 伏马毒素FB1 Fumonisin B1,FB1 116355-83-0
13 伏马毒素FB2 Fumonisin B2,FB2 116355-84-1
14 伏马毒素FB3 Fumonisin B3,FB3 1422359-85-0
15 胶黏毒素 Gliotoxin,GL 1165-39-5
16 HT-2毒素 HT-2Toxin,HT 26934-87-2
17 赭曲霉毒素A Ochratoxin A,OTA 303-47-9
18 赭曲霉毒素B Ochratoxin B,OTB 4825-86-9
19 赭曲霉毒素C Ochratoxin C,OTC 4865-85-4
20 杂色曲霉素/柄曲霉素 Sterigmatocystin,STE 67-99-2
21 T-2毒素 T-2Toxin,T2 21259-20-1
22 玉米赤霉烯酮类毒素 zearalenone,ZEN 10048-13-2
实施例1、溶液的配制
1、保健食品口服液样品的前处理：
精密量取5mL增健口服液置于Myco6in1免疫亲和柱内，以流速1滴/秒全部通过亲和柱，直至空气进入亲和柱。加入15ml纯水以流速1滴/秒全部通过亲和柱，直至空气进入亲和柱。加入7ml甲醇以流速1滴/秒全部通过亲和柱，直至空气进入亲和柱。甲醇淋洗液氮吹浓缩至1ml，0.22μm滤膜过滤即得。
2、对照品溶液的制备：
精密称取标准品各1mg(AFM1、AFM2为0.1mg)，按照标准品说明书分别加入甲醇、乙腈、二氯甲烷定容至1ml作为标准品母液。精密量取各标准品0.1ml，甲醇-二氯甲烷(V:V＝1:1)定容至1ml作为单标对照液。结合单标对照液检测所得响应值结果，配制混合标准品对照液一份，其中各化合物浓度如下表2所示。
表2混合标准品对照液中各化合物浓度
浓度(μg/mL) 化合物
25 BEA、DON、HT2
2 AFG1、FB1、FB2、FB3、ZEN、3-DON、15-DON、GL
1 T2
0.5 AFB1、AFB2、AFG2、OTA、OTB、OTC、CIT、STE
0.2 AFM1、AFM2
实施例2、测定条件
1、液相部分的色谱条件
Waters Acquity UPLC液相色谱仪，Waters BEH C18色谱柱(100mm×2.1mm，1.7μm)，柱温35℃，流速0.35mL/min，进样1μL。流动相组成为：A相为0.1％甲酸(含10mmol/L甲酸铵)水溶液；B相为乙腈。液相部分流动相洗脱程序见表3。
表3梯度洗脱程序表
时间(min) A相(％) B相(％)
0 90 10
10 70 30
15 50 50
25 5 95
2、质谱条件及调谐参数
质谱在正离子模式下ESI源进行检测，采用MRM扫描模式，分别设定1级(TOF MS)和2级(Product Ion)检测离子，质谱调谐参数如表4。
表4质谱调谐参数
Figure BDA0002155763890000061
Figure BDA0002155763890000071
3、质谱检测参数
质谱采用MRM监测，22种对照品的检测参数如表5所示。
表5真菌毒素对照品MRM检测参数
Figure BDA0002155763890000072
Figure BDA0002155763890000081
实施例3、样品检测谱图
以乙腈(流动相)作为空白样品溶液，按照实施例1配置混合标准品对照溶液。分别按照实施例2中的液相色谱-质谱条件进行空白样品溶液及混合标准品对照溶液的测定，结果见图1、2。分别为空白样品溶液及混合标准品对照液总离子流图。
图1为空白溶液检测结果谱图，作为背景图谱展示。在空白样品中，未检出真菌毒素。图2为混合标准品溶液检测结果谱图。
实施例4、标准曲线绘制
实施例1中的混合标准品对照液按1:10等比梯度稀释(乙腈为溶剂)，配制一系列不同浓度的标准品溶液，分别检测。以标准品浓度为横坐标，峰面积为纵坐标绘制标准曲线，其相关系数及线性范围等参数如表6所示。
表6二十二种成分的线性结果
Figure BDA0002155763890000082
Figure BDA0002155763890000091
结果显示，上述二十二种检出真菌毒素在各自线性范围内的相关系数均大于0.99，线性良好。
实施例5、精密度试验
取每一真菌毒素标准品样品，按照色谱条件进行测定，连续进样6次，测定上述二十二种化合物的响应，计算其平均值(Mean)和相对标准偏差(RSD％)。结果如表7所示。
表7精密度试验
Figure BDA0002155763890000092
Figure BDA0002155763890000101
结果表明各化合物响应值RSD％在1.05％-3.77％之间，仪器及整体系统精密度良好，分析结果稳定、可信。
实施例6、稳定性试验：
取每一真菌毒素标准品样品，按上述条件制备样本，分别在0、2、4、8、12、24h测定上述二十二种化合物的响应，计算其平均值(Mean)和相对标准偏差(RSD％)，结果如表8所示。
表8稳定性试验
名称 1 2 3 4 5 6 X S RSD％
15-DON 151733 156401 153616 153884 156760 153864 154376 1889 1.22
3-DON 78223 81701 81353 81166 78819 78262 79921 1651 2.07
AFB1 14118588 14393632 14338826 14104679 14223025 14511003 14281626 161094 1.13
AFB2 10878982 11180384 10991740 10869891 11110360 11136045 11027900 134311 1.22
AFG1 1679198 1722947 1675948 1673010 1709001 1720976 1696847 23356 1.38
AFG2 7206308 7407005 7318002 7371274 7433479 7452605 7364779 91170 1.24
AFM1 1374652 1432233 1412837 1406453 1427323 1419762 1412210 20642 1.46
AFM2 1378734 1428907 1426049 1422044 1452501 1441799 1425006 25315 1.78
BEA 196596 210490 188119 209081 199094 202930 201052 8343 4.15
CIT 10222739 10127441 9846719 10322610 10570457 10615000 10284161 287259 2.79
DON 8439 8605 8530 8319 8303 8605 8467 135 1.60
FB1 421690 411474 419951 399166 378256 403639 405696 16076 3.96
FB2 595341 578239 596127 547727 542117 583250 573800 23474 4.09
FB3 143902 138768 145999 132439 129597 138800 138251 6344 4.59
GL 873225 913771 875648 882854 886711 880234 885407 14718 1.66
HT2 11484 11489 11813 11071 10903 11251 11335 328 2.89
OTA 1093014 1092504 1130693 1090783 1094969 1139458 1106903 22038 1.99
OTB 4617065 4617231 4728700 4535376 4529381 4686981 4619122 79607 1.72
OTC 15742173 15888171 15856657 15951447 15918510 16719478 16012739 353610 2.21
STE 4501550 4564258 4659683 4649290 4606720 4711198 4615450 74752 1.62
T2 1713108 1707368 1771320 1692817 1649550 1730275 1710740 40334 2.36
ZEN 880437 909352 914979 895355 904846 915609 903430 13510 1.50
结果显示各化合物响应值RSD％在1.13％-4.59％之间，表明真菌毒素成分在常温实验条件下稳定性较好，在24h时间内能保证实验结果的科学可靠，可以获得可靠地定量结果。
实施例7、22种真菌毒素检出试验：
取实施例1中的单标对照液按照下表浓度，配制混合溶液一份，其中各化合物浓度如表9所示。
表9真菌毒素混合溶液浓度
浓度 真菌毒素名称
0.256ng/mL STE、OTC
1.28ng/mL AFB1、AFB2、OTB
6.4ng/mL AFG2
12.8ng/mL AFM1、FB1
0.064μg/mL AFM2
0.16μg/mL OTA
0.32μg/mL T2
0.64μg/mL AFG1、BEA、FB2
0.8μg/mL CIT
3.2μg/mL ZEN、GL、FB3
16μg/mL 3-DON
40μg/mL DON
80μg/mL 15-DON
1mg/mL HT2
按照实施例2的液相色谱-质谱条件测定混合溶液。如果检测出的色谱峰保留时间与标准品一致，并且在扣除背景后的供试品谱图中，各定性离子的相对丰度与浓度接近的同样条件下，与得到的对照品溶液谱图相比，来判定样品中存在对应的被测物。
结果如图3所示，混合溶液中检出全部22种真菌毒素类成分。
实施例8、22种真菌毒素定量分析
取22种标准品混合，按照上述LC-MS检测方法，测定样品中22种真菌毒素含量，以实施例4中标准曲线进行计算，所得结果见表10所示。结果显示，该方法可有效检测22种真菌毒素的含量，其偏差<15％，符合痕量检测要求。
表10 22种真菌毒素含量测定结果
Figure BDA0002155763890000111
Figure BDA0002155763890000121
实施例9、定性检测分析
按照实施例2的液相色谱-质谱条件测定增健口服液(批号：17A12BBB01)和对照品溶液。如果检测出的色谱峰保留时间与标准品一致，并且在扣除背景后的供试品谱图中，各定性离子的相对丰度与浓度接近的同样条件下，与得到的对照品溶液谱图相比，来判定样品中存在对应的被测物。
结果显示，增健口服液中检出AFB1、AFB2、STE、OTB、OTC、FB1、FB2、FB3共8种真菌毒素类成分(图4)。
实施例10、增健口服液中真菌毒素含量测定
取增健口服液(批号：17A12BBB01)，按照上述样品处理和LC-MS检测方法，测定样品中8种真菌毒素含量，平行检测3针，结果见表11所示。
表11增健口服液中8种真菌毒素含量测定结果
名称 峰面积 RSD％
AFB1 29.77 4.33
AFB2 108.15 57.24
FB1 94.34 55.28
FB<sub>2</sub> 199.29 37.53
FB3 17.65 61.00
OTB 163.90 74.87
OTC 519.22 4.05
STE 1722.92 24.45
结果显示，增健口服液中各种检出真菌毒素的峰面积均低于标准曲线的线性范围的最低浓度，各响应的信噪比低于定量限要求的10:1。
综上所述，本发明建立了AFB1、AFB2、FB1、FB2、FB3、OTB、OTC、STE等22种真菌毒素种真菌毒素的标准曲线，相关系数均大于0.99，线性良好。采用本发明所述检测保健食品口服液中22种真菌毒素的高通量分析法，检测增健口服液，结果显示增健口服液中可检出AFB1、AFB2、FB1、FB2、FB3、OTB、OTC、STE8种检出真菌毒素，含量均低于定量限，未检出。

Claims (5)

1.一种检测保健食品口服液中22种真菌毒素的高通量分析法，其特征在于，包括如下步骤：
1)待测保健食品口服液经固相萃取小柱进行样品前处理；所述前处理方法具体为待测保健食品口服液上固相萃取柱，然后依次以纯水和甲醇洗涤固相萃取柱，收集甲醇淋洗液，浓缩、过滤，收集滤液；所述固相萃取柱为Myco6in1免疫亲和柱；
2)液相色谱-质谱测定所述待测保健食品口服液，通过与22种真菌毒素对照品溶液比较进行定性、定量分析；
所述液相色谱的色谱条件为采用Waters BEH C18色谱柱，所述色谱柱的尺寸为100mm×2.1mm，1.7μm；柱温35℃，流速0.35mL/min，进样1μL；
所述液相色谱的流动相组成为：A相为0.1％甲酸水溶液；B相为乙腈；流动相洗脱程序为
时间/min A相/％ B相/％ 0 90 10 10 70 30 15 50 50 25 5 95
；
所述真菌毒素对照品包括15-乙酰基脱氧雪腐镰刀菌烯醇、3-乙酰基脱氧雪腐镰刀菌烯醇、黄曲霉毒素B1、黄曲霉毒素B2、黄曲霉毒素G1、黄曲霉毒素G2、黄曲霉毒素M1、黄曲霉毒素M2、白僵菌素、桔青霉素、脱氧雪腐镰刀菌稀醇、伏马毒素FB1、伏马毒素FB2、伏马毒素FB3、胶黏毒素、HT-2毒素、赭曲霉毒素A、赭曲霉毒素B、赭曲霉毒素C、杂色曲霉素、T-2毒素、玉米赤霉烯酮类毒素。
2.根据权利要求1所述的高通量分析法，其特征在于，所述待测保健食品口服液、纯水和甲醇的流速均为1滴/秒；所述浓缩为氮吹浓缩；所述过滤为0.22μm滤膜过滤。
3.根据权利要求1所述的高通量分析法，其特征在于，所述质谱在正离子模式下ESI源进行检测，采用MRM扫描模式。
4.根据权利要求1所述的高通量分析法，其特征在于，所述定性分析为液相色谱-质谱测定所述待测保健食品口服液，如果检测出的色谱峰保留时间与标准品一致，并且在扣除背景后的待测保健食品口服液谱图中，各定性离子的相对丰度与浓度接近的同样条件下，与得到的对照品溶液谱图相比，来判定样品中是否存在对应的被测物。
5.根据权利要求1所述的高通量分析法，其特征在于，所述定量分析为分别测定所述真菌毒素的响应，以浓度为横坐标，峰面积为纵坐标绘制标准曲线；液相色谱-质谱测定所述待测保健食品口服液，外标法进行定量分析。
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