CN104749270B - 动物源食品中两对糖皮质激素同分异构体的同时检测方法 - Google Patents
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Abstract
动物源食品中两对糖皮质激素同分异构体的同时检测方法。本发明采用常规色谱柱分离倍他米松和地塞米松、氟米龙和去羟米松两对异构体，可同时检测动物源食品中倍他米松、地塞米松、氟米龙、去羟米松的残留量并进行确证。液相色谱使用C18色谱柱，流动相分别为含甲醇的乙腈和含甲醇的水，串联质谱检测。倍他米松和地塞米松、氟米龙和去羟米松两对异构体能够色谱分离，地塞米松检测限为0.2μg/kg，倍他米松、氟米龙和去羟米松检测限为0.4μg/kg，满足国内外残留量法规限制要求，方法简便准确、灵敏可靠。
Description
所属技术领域
本发明属于分析化学、食品安全检测领域，涉及一种动物源食品中倍他米松和地塞米松、氟米龙和去羟米松的液相色谱-串联质谱检测方法，尤其是能将倍他米松和地塞米松、氟米龙和去羟米松两对同分异构体色谱分离并确证分析。
背景技术
倍他米松(Betamethasone)和地塞米松(Dexamethasone)、氟米龙(Fluorometholone)和去羟米松(Desoxinetasone)属于糖皮质激素类兽药，在养殖业中存在滥用、误用的情况，使得一些动物源食品中会出现这类激素兽药的残留问题，长期食用含有糖皮质激素类兽药的动物源食品会影响机体的激素平衡，对幼儿可造成发育异常的后果，而且有致癌危险。国内外对其在食品中的最高残留量均做了限制，而对食品中糖皮质激素进行控制需要准确的分析方法做支持。但由于倍他米松和地塞米松、氟米龙和去羟米松是两对差向异构体，这种仅在碳原子构型上不同的非对映异构体在色谱行为上非常相似，难以完全分离。通常这类异构体的分离需要使用非常规的手性色谱分离柱，但成本较高，难以广泛应用。目前的检测分析方法均无法使用常规色谱柱对这两对异构体进行色谱分离，使得当样品显示阳性时，无法判断是含有混合物还是单一异构体，也无法确证是哪一种异构体，给检测结果的判定带来困难，容易造成错误判断。
发明内容
为降低检测成本、提高检测准确性，本发明目的是提供一种能够使用常规色谱柱分离倍他米松和地塞米松、氟米龙和去羟米松是两对异构体的方法，可同时检测动物源食品中倍他米松、地塞米松、氟米龙、去羟米松的残留量。
本发明为实现上述目的所采用的技术方案是：一种能够使用常规色谱柱检测动物源食品中倍他米松和地塞米松、氟米龙和去羟米松是两对异构体的方法，包括如下步骤：
(1)样品提取：称取2.5-5.0g样品，加入20mL甲醇，涡旋后振荡15min，超声10min，10000r/min离心5min，上清液移出至旋蒸瓶，40℃以下旋蒸至近干。将旋蒸瓶内液体转移至离心试管，用2ml甲醇洗涤旋蒸瓶，洗涤液转入试管，用水定容至14ml，涡旋混匀2min，10000r/min离心5min，收集上清液待用。
(2)提取液净化：将固相萃取柱装好，用甲醇5ml，水5ml活化，将提取液上柱，控制流速＜2ml/min，分别用淋洗液4ml，正己烷5ml淋洗，使用6ml甲醇洗脱。洗脱液40℃以下氮气吹干，加入1ml定容液定容，超声1min，过0.2μm滤膜过滤。
(3)使用液相色谱-串联质谱测定。
高效液相色谱条件：
色谱柱：Acquity UPLC BEH C18，1.7μm，2.1×100mm；
柱温：30℃；
进样量：5μl；
流动相A：含甲醇的乙腈，流动相B：含甲醇的水，梯度洗脱；
流速：0.3ml/min。
质谱条件：
离子化模式：ESI+；
源电压：2.5kV；
锥孔电压：30V；
源温度：120℃；
脱溶剂气温度：350℃；
脱溶剂气流量：650L/H；
锥孔气流量：50L/H。
在步骤(2)中所述固相萃取柱为ENVI-18固相萃取住或HLB固相萃取柱。
在步骤(2)中所述淋洗液为丙酮+水(2+8，v/v)。
在步骤(2)中所述定容液为乙腈+水(3+7，v/v)。
在步骤(3)中所述流动相A为乙腈+甲醇(90+5，v/v)，流动相B为水+甲醇(90+5，v/v)。
在步骤(3)中所述梯度洗脱的梯度变化为：
0～7分钟，流动相A30％，流动相B70％；
7～10分钟，流动相A30～50％，流动相B70～50％；
10～12分钟，流动相A50～70％，流动相B50～30％；
12～13分钟，流动相A70～30％，流动相B30～70％；
13～15分钟，流动相A30％，流动相B70％；
进一步地，所述动物源食品选自猪肉、牛肉、羊肉、羊肝、鸡蛋、牛奶、蜂蜜。
进一步地，所述糖皮质激素包括倍他米松和地塞米松、氟米龙和去羟米松的至少一种。
本发明的有益效果是：
1本发明的检测方法可以同时测定动物源食品中的倍他米松和地塞米松、氟米龙和去羟米松。
2本发明能够色谱分离倍他米松和地塞米松、氟米龙和去羟米松两对异构体，可以判断是含有混合物还是单一异构体。
3本发明使用串联质谱检测可以对结果进行确证。
4本发明的检测方法检测限地塞米松0.2μg/kg，倍他米松、氟米龙和去羟米松0.4μg/kg，满足国内外残留量法规限制要求。
附图说明
图1是本发明倍他米松和地塞米松、氟米龙和去羟米松的TIC谱图。
具体实施方式
下面将通过实例对本发明做进一步的描述，这些描述将有助于本领域的技术人员进一步理解本发明，但本发明并不局限于具体实施例。
实施例1羊肉中倍他米松和地塞米松、氟米龙和去羟米松的测定。
(1)样品提取：称取2.5g混匀样品，加入20mL甲醇，涡旋后振荡15min，超声10min，10000r/min离心5min，上清液移出至旋蒸瓶，40℃以下旋蒸至近干。将旋蒸瓶内液体转移至离心试管，用2ml甲醇洗涤旋蒸瓶，洗涤液转入试管，用水定容至14ml，涡旋混匀2min，10000r/min离心5min，收集上清液待用。
(2)提取液净化：将固相萃取柱装好，用甲醇5ml，水5ml活化，将提取液上柱，控制流速＜2ml/min，分别用淋洗液4ml，正己烷5ml淋洗，使用6ml甲醇洗脱。洗脱液40℃以下氮气吹干，加入1ml定容液定容，超声1min，过0.2μm滤膜过滤。
(3)使用液相色谱-串联质谱测定。
高效液相色谱条件：
色谱柱：Acquity UPLC BEH C18，1.7μm，2.1×100mm；柱温：30℃；进样量：5μl；流动相A：乙腈+甲醇(90+5，v/v)，流动相B：水+甲醇(90+5，v/v)；流速：0.3ml/min梯度洗条件见表1。
质谱条件：
离子化模式：ESI+；源电压：2.5kV；锥孔电压：30V；源温度：120℃；脱溶剂气温度：350℃；脱溶剂气流量：650L/H；锥孔气流量：50L/H。以多反应检测模式实验，各化合物离子对及其参数见表2.
表1流动相梯度洗脱条件
表2各化合物离子对质谱参数
标*号为定量离子
表3羊肉中倍他米松和地塞米松、氟米龙和去羟米松的线性关系
表4羊肉中倍他米松和地塞米松、氟米龙和去羟米松添加回收率和重复性结果(n＝6)
实施例2牛奶中倍他米松和地塞米松、氟米龙和去羟米松的测定。
(1)样品提取：称取5.0g混匀样品，加入20mL甲醇，涡旋后振荡15min，超声10min，10000r/min离心5min，上清液移出至旋蒸瓶，40℃以下旋蒸至近干。将旋蒸瓶内液体转移至离心试管，用2ml甲醇洗涤旋蒸瓶，洗涤液转入试管，用水定容至14ml，涡旋混匀2min，10000r/min离心5min，收集上清液待用。
(2)提取液净化：将固相萃取柱装好，用甲醇5ml，水5ml活化，将提取液上柱，控制流速＜2ml/min，分别用淋洗液4ml，正己烷5ml淋洗，使用6ml甲醇洗脱。洗脱液40℃以下氮气吹干，加入1ml定容液定容，超声1min，过0.2μm滤膜过滤。
(3)使用液相色谱-串联质谱测定。
条件同实施例1。
牛奶中倍他米松和地塞米松、氟米龙和去羟米松的线性关系见表5，牛奶中倍他米松和地塞米松、氟米龙和去羟米松添加回收率和重复性结果见表6。
表5牛奶中倍他米松和地塞米松、氟米龙和去羟米松的线性关系
表6牛奶中倍他米松和地塞米松、氟米龙和去羟米松添加回收率和重复性结果(n＝6)
Claims (4)
1.动物源食品中两对糖皮质激素同分异构体的同时检测方法，其特征在于本方法包括以下步骤：
(1)样品提取：称取2.5-5.0g样品，加入20mL甲醇，涡旋后振荡15min，超声10min，10000r/min离心5min，上清液移出至旋蒸瓶，40℃以下旋蒸至近干，将旋蒸瓶内液体转移至离心试管，用2ml甲醇洗涤旋蒸瓶，洗涤液转入试管，用水定容至14ml，涡旋混匀2min，10000r/min离心5min，收集上清液待用；
(2)提取液净化：将固相萃取柱装好，用甲醇5ml，水5ml活化，将提取液上柱，控制流速＜2ml/min，分别用淋洗液4ml，正己烷5ml淋洗，使用6ml甲醇洗脱，洗脱液40℃以下氮气吹干，加入1ml定容液定容，超声1min，过0.2μm滤膜过滤；
(3)使用液相色谱-串联质谱测定；
液相色谱-串联质谱测定条件为：
高效液相色谱条件：
色谱柱：Acquity UPLC BEH C18，1.7μm，2.1×100mm；
柱温：30℃；
进样量：5μl；
流动相A：含甲醇的乙腈，流动相B：含甲醇的水，梯度洗脱；
流速：0.3ml/min；
质谱条件：
离子化模式：ESI+；
源电压：2.5kV；
锥孔电压：30V；
源温度：120℃；
脱溶剂气温度：350℃；
脱溶剂气流量：650L/H；
锥孔气流量：50L/H；
所述梯度洗脱的梯度变化为：
0～7分钟，流动相A30％，流动相B70％；
7～10分钟，流动相A30～50％，流动相B70～50％；
10～12分钟，流动相A50～70％，流动相B50～30％；
12～13分钟，流动相A70～30％，流动相B30～70％；
13～15分钟，流动相A30％，流动相B70％；
所述流动相A为乙腈+甲醇，体积比为90∶5，流动相B为水+甲醇，体积比为90∶5；
所述两对糖皮质激素同分异构体为倍他米松与地塞米松的同分异构体组和氟米龙与去羟米松的同分异构体组。
2.根据权利要求1所述的动物源食品中两对糖皮质激素同分异构体的同时检测方法，其特征在于步骤(2)中所用固相萃取柱为ENVI-18固相萃取柱或HLB固相萃取柱。
3.根据权利要求1所述的动物源食品中两对糖皮质激素同分异构体的同时检测方法，其特征在于步骤(2)中淋洗液为丙酮+水，体积比为2∶8。
4.根据权利要求1所述的动物源食品中两对糖皮质激素同分异构体的同时检测方法，其特征在于步骤(2)中定容液为乙腈+水，体积比为3∶7。
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