CN110907541B - 同时测定L-α-甘油磷酰胆碱中R-环氧丙醇和R-3-氯-1,2-丙二醇残留量方法 - Google Patents

同时测定L-α-甘油磷酰胆碱中R-环氧丙醇和R-3-氯-1,2-丙二醇残留量方法 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种采用液液萃取结合气相色谱‑质谱联用法同时测定L‑α‑甘油磷酰胆碱中R‑环氧丙醇和R‑3‑氯‑1,2‑丙二醇残留量的方法。该法具有灵敏度高、重复性良好而且操作方便等优点，可实现对GPC中缩水甘油和氯甘油的准确测定，从而可以保证产品的质量安全性。

Description

同时测定L-α-甘油磷酰胆碱中R-环氧丙醇和R-3-氯-1,2-丙 二醇残留量方法
技术领域
本发明属于分析检测领域，具体涉及一种采用液液萃取结合气相色谱-质谱联用法(GC/MS)同时测定L-α-甘油磷酰胆碱(以下简称甘油磷酰胆碱、GPC)中R-环氧丙醇(Glycidol，以下简称缩水甘油)和R-3-氯-1,2-丙二醇(3-Chloro-1,2-propanediol，以下简称氯甘油)残留量的方法。
背景技术
甘油磷酰胆碱(Glycerophosphorylcholine,GPC，CAS号28319-77-9)是磷脂酰胆碱(PC)分子上的两个脂肪酰基完全被水解的产物，是人机体内正常存在的水溶性小分子物质，也是重要的神经传递介质乙酰胆碱(Acetylcholine)的生物合成前体。目前产业化的甘油磷酰胆碱(GPC)常用制备方法有磷脂酰胆碱生物酶水解法、全化学合成法等。采用全化学合成法生产GPC会不可避免地使用到R-缩水甘油(缩水甘油，CAS号57044-25-4)和R-3-氯-1,2-丙二醇(氯甘油，CAS号57090-45-6)这两种化合物，其中缩水甘油具有诱变性和遗传毒性，氯甘油则具有基因毒性警示结构。为了保证合成GPC的质量安全性，应对缩水甘油和氯甘油的残留含量进行严格控制。
Figure BDA0001804134610000011
GPC的全化学合成以氯甘油为原料，合成中间体缩水甘油，再和磷酰胆碱反应生成GPC，粗品经阴阳离子交换树脂洗脱提纯，得到含水15-25wt.％的液体产品作为原料药或保健食品原料使用。该合成工艺得到的GPC液体产品常常
存在缩水甘油和氯甘油残留的风险，此时就需要一种高灵敏度的分析方法进行准确测定。
本发明提供液液萃取预处理方法并采用高灵敏度GC/MS法准确监测GPC产品中缩水甘油和氯甘油的残留量，从而保证产品的质量安全性。
发明内容
目前尚无针对GPC产品中缩水甘油和氯甘油残留量的检测方法的研究报道，因此建立一种灵敏度高和准确度高的测定方法尤为迫切。
为了解决上述问题，本发明的目的是提供一种液液萃取结合气相色谱-质谱联用法(GC/MS)同时测定甘油磷酰胆碱中缩水甘油和氯甘油残留量的方法。
本发明采用的技术方案为：
液液萃取结合气相色谱-质谱联用法，采用外标法定量，计算得到缩水甘油和氯甘油的残留量。
在一优选实施方式中，所述采用液液萃取结合气相色谱-质谱联用检测甘油磷酰胆碱中缩水甘油和氯甘油残留量的方法包括以下步骤：
1)将缩水甘油和氯甘油对照品用第一溶剂配制成具有一定浓度的限度对照溶液；
2)将待测甘油磷酰胆碱产品预处理后，在第二溶剂中配制成溶液；
3)采用气相色谱-质谱仪分析步骤1)和2)制得的溶液，计算得到缩水甘油和氯甘油的残留量。
优选地，步骤1)中第一溶剂选自甲苯、乙酸乙酯、乙酸丙酯、乙酸丁酯、甲酸乙酯、乙酸异丙酯、丙酸乙酯。
优选地，步骤2)中第二溶剂选自甲苯、乙酸乙酯、乙酸丙酯、乙酸丁酯、甲酸乙酯、乙酸异丙酯、丙酸乙酯。
优选地，所述的气相色谱-质谱仪采用涂渍有聚乙二醇或极性更强的固定液的毛细管柱为色谱柱。
优选地，所述的气相色谱-质谱仪采用程序升温法进行分离分析，起始柱温不超过40℃，以每分钟低于20℃的升温速率升至230℃以上。
优选地，所述的气相色谱-质谱仪进样模式采用不分流进行，以提高检测灵敏度。
优选地，所述的气相色谱-质谱仪的检测模式为单离子检测扫描(SIM)、选择反应检测扫描(SRM)或多反应检测扫描(MRM)模式。
优选地，步骤2)中所述甘油磷酰胆碱的预处理方法包括将GPC采用水溶解或稀释。
进一步优选地，所述甘油磷酰胆碱的预处理方法还包括液液萃取法和萃取液的浓缩处理，例如，取待测甘油磷酰胆碱产品适量，依据待测甘油磷酰胆碱产品中的水分，适量加水溶解稀释，再加入萃取溶剂萃取。
所述的萃取溶剂为与水不互溶性质的有机溶剂，非限制性地包括甲苯、乙酸乙酯、乙酸丙酯、乙酸丁酯、甲酸乙酯、乙酸异丙酯、丙酸乙酯等，或者以上一种或几种溶剂的混合。
所述萃取溶剂的一次用量与待测甘油磷酰胆碱产品的体积质量比约为0.01～10:1mL/g，优选约为4:1mL/g。
所述用萃取溶剂萃取的次数不少于2次；所述萃取的时间不少于5分钟；所述萃取可辅助以搅拌，超声，振摇，涡旋等方式进行。
所述萃取后的萃取液处理可选自经浓缩或不经浓缩处理，所述浓缩的方式包括溶剂挥发(如，氮吹)、溶质富集(如，固相微萃取)等，得到供试品溶液。
步骤3)中，优选地为分别取限度对照溶液和供试品溶液各2μL注入气相色谱-质谱仪检测，记录色谱图，分别获得限度对照溶液和供试品溶液中的缩水甘油与氯甘油的峰面积，并依据单点外标法计算得到缩水甘油和氯甘油的残留量。
外标法计算公式：
Figure BDA0001804134610000041
其中：CR为限度对照溶液中待测物的浓度，μg/mL；
ms为GPC产品取样量，g；
AR，AX分别为限度对照溶液和供试品溶液中待测物的峰面积；
V为有机溶剂萃取总体积，mL。
在一优选实施方式中，步骤1)中所述一定浓度的限度对照溶液中缩水甘油和氯甘油分别约占GPC产品的0.4ppm和1ppm。
方法学验证
重复性分别取缩水甘油和氯甘油适量，加乙酸乙酯溶解稀释制成每1mL中约含缩水甘油和氯甘油分别为0.05μg和0.12μg的溶液，作为限度对照溶液，取限度对照溶液平行进样5次，缩水甘油和氯甘油以峰面积计算相对标准偏差分别为2.42％和4.84％，均小于5％，表明本法具有较好的重复性。
准确度取GPC产品适量，加入适量含有缩水甘油和氯甘油的水溶液(使得GPC中含缩水甘油0.4ppm和氯甘油1ppm)溶解稀释，再加入萃取溶剂萃取2次以上，得到缩水甘油和氯甘油的回收率均达80％以上，表明本法具有良好的准确度。
检出限逐级稀释限度对照溶液，记录质谱图，当信噪比(S/N)约为3时，此时的浓度为最低检测浓度。缩水甘油和氯甘油最低检出限分别为0.02mg/kg和0.1mg/kg。
定量限逐级稀释限度对照溶液，记录质谱图，当信噪比(S/N)约为10时，此时的浓度为最低定量浓度。缩水甘油和氯甘油最低定量限分别为0.07mg/kg和0.3mg/kg。
有益效果
本发明首次提供了一种液液萃取结合气质联用法测定GPC中缩水甘油和氯甘油残留量的方法，成功避免了GPC基质干扰，测得缩水甘油和氯甘油检出限分别为0.02mg/kg和0.1mg/kg，与上海为康质量检测技术有限公司测得的缩水甘油检出限10mg/kg和氯甘油检出限为50mg/kg的数据比较，本法具有更高的灵敏度。
附图说明
图1是实施例1的GC/MS图；(a)空白溶液；(b)限度对照溶液(1ppm)；(c)限度对照溶液(0.4ppm)；(d)经纯化后GPC产品溶液(缩水甘油未检出；氯甘油残留量0.2ppm)；(e)GPC粗品溶液(缩水甘油残留量为2ppm；氯甘油残留量为40ppm)。
具体实施方式
下面详细描述本发明的实施例，需要说明的是下面描述的对比实施例是示例性的，仅用于解释本发明，而不能理解为对本发明的限制。另外，如果没有明确说明，在实施例中采用的试剂均为市场上可以获得。
GPC粗品和纯化品均为上海伊耀精细化工厂自产，缩水甘油购自西格玛奥德里奇(上海)贸易有限公司、氯甘油购自梯希爱(上海)化成工业发展有限公司，乙酸乙酯购自国药集团化学试剂有限公司。
实施例1.GPC粗品及经纯化后的GPC产品中缩水甘油和氯甘油残留量的测定
GC/MS色谱条件为以聚乙二醇为固定液的毛细管气相色谱柱，起始柱温为40℃，维持5分钟，以每分钟10℃升温至250℃，维持10分钟；进样口温度为200℃；进样模式为不分流；离子源温度为200℃；采用SIM模式总离子流进行定量，其中缩水甘油选用m/z为44.05、31.05，氯甘油选用m/z为61.05，79.00。
乙酸乙酯作为空白溶液。
分别取缩水甘油和氯甘油适量，加乙酸乙酯溶解稀释制成每1mL中约含缩水甘油和氯甘油分别为0.05μg和0.12μg，分别作为限度对照溶液(0.4ppm)和限度对照溶液(1ppm)。
取GPC粗品1g，加0.4mL的水搅拌溶解，加乙酸乙酯4mL搅拌萃取15分钟，反复萃取2次，合并萃取液，混匀，制得粗品溶液。
取纯化后的GPC产品1g，加0.4mL的水搅拌溶解，加乙酸乙酯4mL搅拌萃取15分钟，反复萃取2次，合并萃取液，混匀，制得经纯化后GPC产品溶液。
取空白溶液、限度对照溶液(0.4ppm)、限度对照溶液(1ppm)、粗品溶液及经纯化后GPC产品溶液各2μL注入气质联用仪，记录色谱图(见图1)。按外标法以峰面积计算。
外标法计算公式：
Figure BDA0001804134610000061
其中：CR为限度对照溶液中待测物的浓度，μg/mL；
ms为GPC产品取样量，g；
AR，AX分别为限度对照溶液和供试品溶液中待测物的峰面积；
V为有机溶剂萃取总体积，mL。
结果得到GPC粗品中缩水甘油残留量2ppm，氯甘油残留量40ppm；经纯化后的GPC产品中缩水甘油未检出，氯甘油残留量为0.2ppm。

Claims (6)

1.一种测定甘油磷酰胆碱中缩水甘油和氯甘油残留量的方法，其特征在于，该方法为液液萃取结合气相色谱-质谱联用法，采用外标法定量，计算得到缩水甘油和氯甘油的残留量；
所述方法包括以下步骤：
1）将缩水甘油和氯甘油对照品用第一溶剂配制成具有一定浓度的限度对照溶液；
2）将待测甘油磷酰胆碱产品预处理；
3）采用气相色谱-质谱仪分析步骤1）和2）制得的溶液，计算得到缩水甘油和氯甘油的残留量；
其中，
步骤1）中第一溶剂选自乙酸乙酯、乙酸丙酯、乙酸丁酯、甲酸乙酯、乙酸异丙酯、丙酸乙酯；
步骤2）中所述甘油磷酰胆碱的预处理方法包括液液萃取法，所述液液萃取法包括：取待测甘油磷酰胆碱产品适量，依据待测甘油磷酰胆碱产品中的水分，适量加水溶解稀释，再加入萃取溶剂萃取；
所述的萃取溶剂为乙酸乙酯；
所述方法采用涂渍有聚乙二醇固定液的气相色谱柱；
所述方法的柱升温程序为起始柱温为40 ℃，维持5分钟，以每分钟10 ℃升温至250℃，维持10分钟；
所述方法采用质谱检测器，检测模式为单离子检测扫描、选择反应检测扫描或多反应检测扫描模式。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述方法的进样模式为不分流进样。
3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述萃取溶剂的一次用量与待测甘油磷酰胆碱产品的体积质量比为0.01~10: 1 mL/g。
4.如权利要求3所述的方法，其特征在于，所述萃取溶剂的一次用量与待测甘油磷酰胆碱产品的体积质量比为4:1 mL/g。
5.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述用萃取溶剂萃取的次数不少于2次；所述萃取的时间不少于5分钟。
6.如权利要求5所述的方法，其特征在于，所述萃取辅助以搅拌，超声，振摇或涡旋方式进行。
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