CN102213698A - 一种甘油磷酰胆碱注射液有关物质的检测方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种甘油磷酰胆碱注射液有关物质的检测方法，该方法采用高效液相色谱法测定，以色谱柱SCX为色谱柱，用三氟乙酸调pH＝1.5的水为流动相，流速为1.0ml/分钟，蒸发光散射检测器检测；该方法测得甘油磷酰胆碱注射液有关物质不超过4.0％，且可以算出确定值；本发明所述检测方法能准确测定甘油磷酰胆碱注射液有关物质的含量，从而更能保证用药的安全有效。
Description
技术领域
本发明涉及一种甘油磷酰胆碱注射液有关物质的检测方法。
背景技术
目前，甘油磷酰胆碱的有关物质检测方法采用薄层色谱法，可以控制有关物质的含量不超过4.0％，但不能检测出确定的值，尚需要采用更精确的检测方法对甘油磷酰胆碱制剂的质量进行有效的控制，保证用药更加安全有效。
发明内容
本发明目的在于提供一种甘油磷酰胆碱注射液有关物质的检测方法。
本发明目的是通过如下技术方案实现的：
本发明甘油磷酰胆碱注射液有关物质的检测方法为：
照中国药典2005年版一部附录VID高效液相色谱法测定；
色谱条件与系统适用性试验：以色谱柱Hypersil Scx为色谱柱；用三氟乙酸调pH为1.4-2.1的水为流动相；流速为0.9-1.5ml/分钟；蒸发光散射检测器检测，采用分流模式，漂移管温度50-80℃，氮气或空气为载气，流速为1.8-2.5升/分钟；理论板数按甘油磷酰胆碱峰计算应不低于2000；
对照溶液：精密量取本发明所述甘油磷酰胆碱注射液10ml，置250ml量瓶中，加水溶解并稀释至刻度，摇匀，即得；
供试品溶液：取本发明所述甘油磷酰胆碱注射液作为供试品溶液；
测定法：取对照溶液10-30μl注入液相色谱仪，调节检测灵敏度，使主成分色谱峰的峰高约为满量程的75-85％，再精密量取供试品溶液与对照溶液各10-30μl，分别注入液相色谱仪，记录色谱图至主成分色谱峰保留时间的2-4倍，按下式计算：
其中：A1、A2、A3、…、An为各杂质峰的峰面积；Am为对照溶液主成分的峰面积；
本发明所述甘油磷酰胆碱注射液有关物质不得过4.0％，且可以算出确定值。
本发明甘油磷酰胆碱注射液有关物质的检测方法优选为：
照中国药典2005年版一部附录VID高效液相色谱法测定；
色谱条件与系统适用性试验：以色谱柱Hypersil Scx为色谱柱；用三氟乙酸调pH为1.5的水为流动相；流速为1.0ml/分钟；蒸发光散射检测器检测，采用分流模式，漂移管温度50℃，空气为载气，流速为2.0升/分钟；理论板数按甘油磷酰胆碱峰计算应不低于2000；
对照溶液：精密量取本发明所述甘油磷酰胆碱注射液10ml，置250ml量瓶中，加水溶解并稀释至刻度，摇匀，即得；
供试品溶液：取本发明所述甘油磷酰胆碱注射液作为供试品溶液；
测定法：取对照溶液20μl注入液相色谱仪，调节检测灵敏度，使主成分色谱峰的峰高约为满量程的80％，再精密量取供试品溶液与对照溶液各20μl，分别注入液相色谱仪，记录色谱图至主成分色谱峰保留时间的3倍，按下式计算：
其中：A1、A2、A3、…、An为各杂质峰的峰面积；Am为对照溶液主成分的峰面积；
本发明所述甘油磷酰胆碱注射液有关物质不得过4.0％，且可以算出确定值。
本发明所述甘油磷酰胆碱注射液的有关物质是指甘油磷酰胆碱注射液中除了主要成分甘油磷酰胆碱和辅料之外的杂质成分，如：甘油磷酰胆碱在制备过程中带入的成分和甘油磷酰胆碱在储藏过程中分解生成的杂质等。
本发明所述的甘油磷酰胆碱注射液由如下方法制成：
取240-260重量份甘油磷酰胆碱，加注射用水至700-900体积份，搅拌充分溶解，加热至煮沸，加入0.9-1.1重量份活性炭煮沸吸附10-20分钟，脱碳过滤，加注射用水至1000体积份，用氢氧化钠溶液或盐酸溶液调节pH值至6.0-6.8，用孔径为0.20-0.24μm的微孔滤膜过滤，用安瓿瓶灌装；
其中，甘油磷酰胆碱用量优选为250重量份，还可以是240重量份或260重量份；
其中，第一次加注射用水优选为加至800体积份，还可以是加至700体积份或900体积份；
其中，活性炭用量优选为1重量份，还可以是0.9重量份或1.1重量份；
其中，加入活性炭煮沸吸附时间优选为15分钟，还可以是10分钟或20分钟；
其中，pH值优选调节至6.5，还可以调节至6.0或6.8；
其中，微孔滤膜过滤优选孔径为0.22μm的微孔滤膜，还可以是0.20μm或0.24μm。
本发明所述重量份与体积份的关系是g与ml的关系。
本发明对甘油磷酰胆碱注射液有关物质的检测方法进行了多次实验观察，对色谱条件进行了优选，对线性关系、稳定性等进行了反复实验，结果良好；本发明检测方法能准确测定甘油磷酰胆碱注射液有关物质的含量，从而更能保证用药的安全有效。
附图说明
图1为实验例2中采用本发明检测方法检测编号为C090423-1的试制品有关物质自身对照溶液的色谱图；
图2为实验例2中采用本发明检测方法检测编号为C090423-1的试制品有关物质供试品溶液的色谱图；
图3为实验例2中采用本发明检测方法检测编号为C090423-2的试制品有关物质自身对照溶液的色谱图；
图4为实验例2中采用本发明检测方法检测编号为C090423-2的试制品有关物质供试品溶液的色谱图；
图5为实验例2中采用本发明检测方法检测编号为C090423-3的试制品有关物质自身对照溶液的色谱图；
图6为实验例2中采用本发明检测方法检测编号为C090423-3的试制品有关物质供试品溶液的色谱图；
图7为实验例2中采用本发明检测方法检测编号为06006的国外上市样品有关物质自身对照溶液的色谱图；
图8为实验例2中采用本发明检测方法检测编号为06006的国外上市样品有关物质供试品溶液的色谱图。
下述实验例和实施例用于进一步说明但不限于本发明。
实验例1甘油磷酰胆碱注射液有关物质的检测方法的方法学考察
1.各种对照品溶液及供试品溶液的制备
样品的供试品溶液：取本发明实施例1所述甘油磷酰胆碱注射液作为样品的供试品溶液；
有关物质供试品溶液：同样品的供试品溶液；
有关物质测定的自身对照溶液：取有关物质供试品溶液10ml，置250ml量瓶中，加水溶解并稀释至刻度，摇匀，即得；
甘油磷酰胆碱对照品溶液：精密称取甘油磷酰胆碱对照品适量，用水溶解制成每1ml含1.0mg的溶液，即得；
甘油对照品溶液：精密称取甘油对照品适量，用水溶解制成每1ml含0.25mg的溶液，即得；
甘油磷酸钠对照品溶液：精密称取甘油磷酸钠对照品适量，用水溶解制成每1ml含1.25mg的溶液，即得。
2.色谱条件
(1)色谱柱的选择
其他条件不变的情况下，选择三种色谱柱进行试验，色谱柱1(HypersilScx 250×4.6mm，5μm)、色谱柱2(SUPELCOSIL LC-Scx)、色谱柱3(AlltimaC18250×4.6mm，5μm)。采用上述三种条件，分别对甘油磷酰胆碱对照品溶液、样品的供试品溶液、甘油对照品溶液、有关物质测定的自身对照溶液、有关物质供试品溶液、甘油磷酸钠对照品溶液进样测定，采集色谱图，即得。
结果说明：使用色谱柱2、色谱柱3，主成分不能与杂质完全分离，使用色谱柱1主成分可与杂质完全分离，所以选择色谱柱1：Hypersil Scx250×4.6mm，5μm。
(2)色谱柱温度的选择
其他条件不变的情况下，选择三种色谱柱温度进行试验，柱温1(25℃)、柱温2(30℃)、柱温3(40℃)。采用上述三种条件，分别对甘油磷酰胆碱对照品溶液、样品的供试品溶液、甘油对照品溶液、有关物质测定的自身对照溶液、有关物质供试品溶液、甘油磷酸钠对照品溶液、进样测定，采集色谱图，即得。
结果说明：色谱柱温度为40℃主成分与杂质完全分离最好，所以确定柱温为：40℃。
(3)流动相的选择
其他条件不变的情况下，筛选流动相如下：(1)水(用三氟乙酸调pH1.5)、(2)水(用三氟乙酸调pH 1.2)、(3)水(用三氟乙酸调pH 2.3)、(4)甲醇-水(5∶95)。采用上述四种条件，分别对甘油磷酰胆碱对照品溶液、样品的供试品溶液、甘油磷酸钠对照品溶液、甘油对照品溶液、有关物质测定的自身对照溶液、有关物质供试品溶液进样测定，采集色谱图，即得。
结果说明：流动相(1)水(用三氟乙酸调pH 1.5)，主成分与杂质分离很好，流动相(2)、(4)主成分与杂质不能完全分离，流动相(3)分离较好，但杂质峰没有完全检出，为了有关物质测定与含量测定使用同一色谱条件，所以选择流动相(1)：水(用三氟乙酸调pH 1.5)。
(4)流动相流速的选择
其他条件不变的情况下，考察流动相流速如下：(1)0.6ml/min、(2)0.8ml/min、(3)1.0ml/min。采用上述三种条件，分别对甘油磷酰胆碱对照品溶液、样品的供试品溶液、甘油磷酸钠对照品溶液、甘油对照品溶液、有关物质测定的自身对照溶液、有关物质供试品溶液进样测定，采集色谱图，即得。
结果说明：流动相流速为0.6ml/min或0.8ml/min时，色谱峰的峰形较差，流速为1.0ml/min时，色谱峰的峰形较好，所以确定流动相流速为1.0ml/min。
(5)蒸发光散射检测器的撞击器模式的选择
以色谱柱Hypersil Scx为色谱柱；水(用三氟乙酸调pH 1.5)为流动相；流速为1.0ml/分钟；蒸发光散射检测器检测，条件如下：
1)撞击器模式选择为“开”(漂移管温度50℃，空气为载气，空气流速为2.0升/分钟)；
2)撞击器模式选择为“关”(漂移管温度115℃，空气为载气，空气流速为3.2升/分钟)。
采用上述两种条件，分别对样品的供试品溶液、甘油磷酰胆碱对照品溶液、甘油磷酸钠对照品溶液、甘油对照品溶液、有关物质测定的自身对照溶液、有关物质供试品溶液进样测定，采集色谱图，即得。
结果显示，当撞击器模式选择为“开”时，由于漂移管温度较低，能检测到甘油；当撞击器模式选择为“关”时，由于漂移管温度较高，不能检测到甘油。由于甘油是甘油磷酰胆碱注射液的有关物质之一，所以检测条件必须要检测到甘油，因此，选择撞击器的模式为“开”。
(6)蒸发光散射检测器漂移管温度的选择
参照蒸发光散射检测器的说明书，撞击器模式选择为“开”时，漂移管筛选如下温度：25℃、40℃、50℃、55℃、60℃、65℃、70℃、80℃，空气为载气，空气流速为2.0升/分钟，分别对甘油磷酰胆碱对照品溶液、样品的供试品溶液进样测定，采集色谱图，即得。
结果说明，撞击器模式选择为“开”，漂移管温度在50℃或50℃以上时，可以检测到主成分，并且基线噪声均较小，故蒸发光散射检测器漂移管温度选择50℃或50℃以上即可。
(7)蒸发光散射检测器气体流量的选择
参照蒸发光散射检测器的说明书，在撞击器模式选择为“开”时，对如下四种气体流量进行试验：1.0L/min、1.5L/min、2.0L/min、2.5L/min，分别对甘油磷酰胆碱对照品溶液、样品的供试品溶液进样测定，采集色谱图，即得。
结果说明，撞击器模式选择为“开”，气体流量在2.0L/min或在2.0L/min以上时，主成分峰形较好，基线噪声也较好，故蒸发光散射检测器选择气体流量为：2.0L/min或在2.0L/min以上。
(8)检测限、定量限和线性范围
按照下表的进样量测定甘油磷酰胆碱对照品溶液，记录峰面积，结果见下表1。
表1线性范围的测定结果
根据峰面积的常用对数对进样量的常用对数进行回归统计，得回归方程如下：
Y＝212736.9X-416583.6(r＝0.9992)
进样量在0.343315μg～137.326μg范围内，峰面积与进样量呈线性关系。
3.溶剂、流动相对有关物质的干扰试验
以色谱柱Hypersil Scx为色谱柱；水(用三氟乙酸调pH 1.5)为流动相；流速为1.0ml/分钟；蒸发光散射检测器检测，采用分流模式，精密吸取有关物质供试品溶液、有关物质测定的自身对照溶液各20μl，同时精密吸取溶剂(水)、流动相各20μl，注入液相色谱仪中，记录色谱图，即得。
总结：根据色谱图可知，溶剂(水)、流动相对有关物质测定没有干扰。
4.强酸、强碱及强氧化的降解试验
取本发明实施例1所述的甘油磷酰胆碱注射液3份，每份4ml，分别加入1.0mol/L盐酸、1.0mol/L氢氧化钠、30％双氧水1ml，水浴加热30分钟，破坏后用水将各溶液加至5ml，得供试品溶液；对该供试品溶液进行有关物质检查，并与未降解样品进行比较，结果表明本发明所述甘油磷酰胆碱注射液经强酸、强碱及强氧化的降解后，有关物质量明显增加，故此方法进行有关物质检查，能够检测到降解物量的变化，此方法专属、可靠，见下表2。
表2强酸、强碱及强氧化的降解试验结果
5.稳定性实验
分别于0小时、2小时、4小时、8小时、24小时精密量取有关物质供试品溶液20μl，注入液相色谱仪，记录色谱图至主成分色谱峰保留时间的3倍，测定结果见表3。
表3有关物质供试品溶液的稳定性考察结果
总结：结果表明有关物质供试品溶液在24小时内稳定。实验例2样品考察实验
按本发明所述检测方法与原有旧的检测方法对试制品(湖南中南科伦药业股份有限公司生产)与国外上市样品(意大泛马克大药厂ItalfarmacoS.p.A生产)的有关物质进行考察，结果见表4，相关色谱图详见附图1-8，对应色谱峰结果见表5-12。
表4试制品与国外上市样品有关物质新旧方法考察结果比较
结果说明：本发明检测方法能准确测定甘油磷酰胆碱注射液有关物质的含量，而原有旧方法只能测定说明有关物质的含量小于4.0％。可见，本发明检测方法更准确地测定了有关物质的值，更有利于产品的质量控制。
表5本发明检测方法检测试制品C090423-1有关物质自身对照溶液色谱峰结果
表6本发明检测方法检测试制品C090423-1有关物质供试品溶液色谱峰结果
表7本发明检测方法检测试制品C090423-2有关物质自身对照溶液色谱峰结果
表8本发明检测方法检测试制品C090423-2有关物质供试品溶液色谱峰结果
表9本发明检测方法检测试制品C090423-3有关物质自身对照溶液色谱峰结果
表10本发明检测方法检测试制品C090423-3有关物质供试品溶液色谱峰结果
表11本发明检测方法检测国外样品06006有关物质自身对照溶液色谱峰结果
表12本发明检测方法检测国外样品06006有关物质供试品溶液色谱峰结果
下述实施例均能实现上述实验例的效果。
具体实施方式
实施例1：甘油磷酰胆碱注射液有关物质的检测方法
甘油磷酰胆碱注射液的制备：
取甘油磷酰胆碱250g，加注射用水至800ml，搅拌充分溶解；加热至煮沸，加入活性炭1g煮沸吸附15分钟；脱碳过滤，加注射用水至1000ml；用氢氧化钠溶液调节pH值至6.5，用0.22μm的微孔滤膜过滤；用安瓿瓶灌装，规格：4ml/瓶，含甘油磷酰胆碱1.0g；熔封；121℃灭菌12分钟，检漏，灯检，包装，即得；
照中国药典2005年版一部附录VI D高效液相色谱法测定；
色谱条件与系统适用性试验：以色谱柱Hypersil Scx为色谱柱；用三氟乙酸调pH为1.5的水为流动相；流速为1ml/分钟；蒸发光散射检测器检测，采用分流模式，漂移管温度50℃，氮气或空气为载气，流速为2.0升/分钟；理论板数按甘油磷酰胆碱峰计算应不低于2000；
对照溶液：精密量取甘油磷酰胆碱注射液10ml，置250ml量瓶中，加水溶解并稀释至刻度，摇匀，即得；
供试品溶液：取甘油磷酰胆碱注射液作为供试品溶液；
测定法：取对照溶液20μl注入液相色谱仪，调节检测灵敏度，使主成分色谱峰的峰高约为满量程的80％，再精密量取供试品溶液与对照溶液各20μl，分别注入液相色谱仪，记录色谱图至主成分色谱峰保留时间的3倍，按下式计算：
其中：A1、A2、A3、…、An为各杂质峰的峰面积；Am为对照溶液主成分的峰面积；
本发明所述甘油磷酰胆碱注射液有关物质不得过4.0％，确定值为0.082％。
实施例2：甘油磷酰胆碱注射液有关物质的检测方法
甘油磷酰胆碱注射液的制备：
取甘油磷酰胆碱240g，加注射用水至900ml，搅拌充分溶解；加热至煮沸，加入活性炭1.1g煮沸吸附10分钟；脱碳过滤，加注射用水至1000ml；用盐酸溶液调节pH值至6.8，用0.20μm的微孔滤膜过滤；用安瓿瓶灌装，规格：3ml/瓶，含甘油磷酰胆碱0.72g；熔封；118℃灭菌15分钟，检漏，灯检，包装，即得；
照中国药典2005年版一部附录VID高效液相色谱法测定；
色谱条件与系统适用性试验：以色谱柱Hypersil Scx为色谱柱；用三氟乙酸调pH为1.8的水为流动相；流速为1.5ml/分钟；蒸发光散射检测器检测，采用分流模式，漂移管温度80℃，氮气为载气，流速为2.5升/分钟；理论板数按甘油磷酰胆碱峰计算应不低于2000；
对照溶液：精密量取甘油磷酰胆碱注射液10ml，置250ml量瓶中，加水溶解并稀释至刻度，摇匀，即得；
供试品溶液：取甘油磷酰胆碱注射液作为供试品溶液；
测定法：取对照溶液15μl注入液相色谱仪，调节检测灵敏度，使主成分色谱峰的峰高约为满量程的85％，再精密量取供试品溶液与对照溶液各15μl，分别注入液相色谱仪，记录色谱图至主成分色谱峰保留时间的4倍，按下式计算：
其中：A1、A2、A3、…、An为各杂质峰的峰面积；Am为对照溶液主成分的峰面积；
本发明所述甘油磷酰胆碱注射液有关物质不得过4.0％，确定值为0.096％。
实施例3：甘油磷酰胆碱注射液有关物质的检测方法
甘油磷酰胆碱注射液的制备：
取甘油磷酰胆碱260g，加注射用水至700ml，搅拌充分溶解；加热至煮沸，加入活性炭0.9g煮沸吸附20分钟；脱碳过滤，加注射用水至1000ml；用氢氧化钠溶液调节pH值至6.0，用0.24μm的微孔滤膜过滤；用安瓿瓶灌装，规格：5ml/瓶，含甘油磷酰胆碱1.3g；熔封；125℃灭菌10分钟，检漏，灯检，包装，即得；
照中国药典2005年版一部附录VID高效液相色谱法测定；
色谱条件与系统适用性试验：以色谱柱Hypersil Scx为色谱柱；用三氟乙酸调pH为2.0的水为流动相；流速为0.9ml/分钟；蒸发光散射检测器检测，采用分流模式，漂移管温度60℃，空气为载气，流速为2.3升/分钟；理论板数按甘油磷酰胆碱峰计算应不低于2000；
对照溶液：精密量取甘油磷酰胆碱注射液10ml，置250ml量瓶中，加水溶解并稀释至刻度，摇匀，即得；
供试品溶液：取甘油磷酰胆碱注射液作为供试品溶液；
测定法：取对照溶液30μl注入液相色谱仪，调节检测灵敏度，使主成分色谱峰的峰高约为满量程的75％，再精密量取供试品溶液与对照溶液各30μl，分别注入液相色谱仪，记录色谱图至主成分色谱峰保留时间的2倍，按下式计算：
其中：A1、A2、A3、…、An为各杂质峰的峰面积；Am为对照溶液主成分的峰面积；
本发明所述甘油磷酰胆碱注射液有关物质不得过4.0％，确定值为0.11％。
Claims (5)
1.一种甘油磷酰胆碱注射液有关物质的检测方法，其特征在于该方法为：
高效液相色谱法测定；
色谱条件与系统适用性试验：以色谱柱Hypersil Scx为色谱柱；用三氟乙酸调pH为1.4-2.1的水为流动相；流速为0.9-1.5ml/分钟；蒸发光散射检测器检测，采用分流模式，漂移管温度50-80℃，氮气或空气为载气，流速为1.8-2.5升/分钟；理论板数按甘油磷酰胆碱峰计算应不低于2000；
对照溶液：精密量取甘油磷酰胆碱注射液10ml，置250ml量瓶中，加水溶解并稀释至刻度，摇匀，即得；
供试品溶液：取甘油磷酰胆碱注射液作为供试品溶液；
测定法：取对照溶液10-30μl注入液相色谱仪，调节检测灵敏度，使主成分色谱峰的峰高约为满量程的75-85％，再精密量取供试品溶液与对照溶液各10-30μl，分别注入液相色谱仪，记录色谱图至主成分色谱峰保留时间的2-4倍，按下式计算：
其中：A1、A2、A3、…、An为各杂质峰的峰面积；Am为对照溶液主成分的峰面积；
其中，所述甘油磷酰胆碱注射液由如下方法制成：
取240-260重量份甘油磷酰胆碱，加注射用水至700-900体积份，搅拌充分溶解，加热至煮沸，加入0.9-1.1重量份活性炭煮沸吸附10-20分钟，脱碳过滤，加注射用水至1000体积份，用氢氧化钠溶液或盐酸溶液调节pH值至6.0-6.8，用0.20-0.24μm的微孔滤膜过滤，用安瓿瓶灌装。
2.如权利要求1所述的检测方法，其特征在于该方法为：
高效液相色谱法测定；
色谱条件与系统适用性试验：以色谱柱Hypersil Scx为色谱柱；用三氟乙酸调pH为1.5的水为流动相；流速为1.0ml/分钟；蒸发光散射检测器检测，采用分流模式，漂移管温度50℃，空气为载气，流速为2.0升/分钟；理论板数按甘油磷酰胆碱峰计算应不低于2000；
对照溶液：精密量取甘油磷酰胆碱注射液10ml，置250ml量瓶中，加水溶解并稀释至刻度，摇匀，即得；
供试品溶液：取甘油磷酰胆碱注射液作为供试品溶液；
测定法：取对照溶液20μl注入液相色谱仪，调节检测灵敏度，使主成分色谱峰的峰高约为满量程的80％，再精密量取供试品溶液与对照溶液各20μl，分别注入液相色谱仪，记录色谱图至主成分色谱峰保留时间的3倍，按下式计算：
其中：A1、A2、A3、…、An为各杂质峰的峰面积；Am为对照溶液主成分的峰面积。
3.如权利要求1或2所述的检测方法，其特征在于该方法中所述的制成甘油磷酰胆碱注射液时甘油磷酰胆碱的用量为250重量份，或240重量份，或260重量份。
4.如权利要求1或2所述的检测方法，其特征在于该方法中所述的制成甘油磷酰胆碱注射液时用氢氧化钠溶液或盐酸溶液调节pH值至6.5，或6.0，或6.8。
5.如权利要求3所述的检测方法，其特征在于该方法中所述的制成甘油磷酰胆碱注射液时用氢氧化钠溶液或盐酸溶液调节pH值至6.5，或6.0，或6.8。
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