CN104101666B - 一种检测茶酊中没食子酸和蛇葡萄素的方法 - Google Patents
一种检测茶酊中没食子酸和蛇葡萄素的方法 Download PDFInfo
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Abstract
本发明涉及一种茶酊中没食子酸和蛇葡萄素的检测方法，该方法采用液相色谱串联质谱法测定，采用外标法定量。该检测方法具有检测时间短、操作简便、灵敏度高、回收率高及重复性好等优点，该方法色谱条件使得没食子酸和蛇葡萄素的色谱峰与杂质色谱峰分离较好，并且具有较好的线性范围，检测限均为0.002μg/mL，没食子酸的回收率在91.3％～109.2％之间，蛇葡萄素的回收率在84.1％～97.8％之间，样品测试结果的相对标准偏差均小于5％。
Description
技术领域
本发明涉及一种检测茶酊中没食子酸和蛇葡萄素含量的方法，属于痕量分析技术领域。
背景技术
茶为世界三大饮料之一，发源于我国。目前，普遍认为茶的基源植物为山茶科茶属植物茶及其变种大叶茶。在分类学上，二者均同为茶组植物。茶中含有多种营养物质，如多酚类，黄酮类，生物碱类，糖类，氨基酸类。
没食子酸(gallicacid,GA)是可水解单宁的组成部分，又称五倍子酸，化学名3,4,5-三羟基苯甲酸，是茶叶中具有生理活性的简单酚类化合物。蛇葡萄素，又称二氢杨梅素，是葡萄属植物藤茶的提取物，是藤茶中的主要活性成分黄酮类化合物。没食子酸和蛇葡萄素都具有抗菌、抗炎、抗肿瘤、抗突变等多种生物医药功效。
茶酊是常见的烟用香精香料，在烟草制品的加香、矫味中经常使用。烟用香精香料品质控制日益受到关注，香原料的主要成分及特有成分，尤其是具有免疫保健功能的成分的分析检测也成为热点。
目前，对没食子酸的检测方法主要是液相色谱结合紫外检测器的检测方法，但是香精香料样品成分复杂，用液相色谱法将目标物和干扰物基线分离需要较长的分析时间，且存在假阳性的问题。同时检测没食子酸和蛇葡萄素的方法未见报道。
发明内容
本发明的目的在于提供一种准确，且同时检测茶酊中没食子酸和蛇葡萄素含量的方法。
本发明的目的是通过以下技术方案来实现的：
一种茶酊中没食子酸和蛇葡萄素的检测方法，该方法采用液相色谱串联质谱法测定，采用外标法定量。
在一个优选的实施方案中，发明所述的茶酊中没食子酸和蛇葡萄素的检测方法包括以下步骤：
(1)标准溶液的配制；称取没食子酸和蛇葡萄素标准品，用甲醇分别配制成具有浓度梯度的没食子酸标准工作溶液和蛇葡萄素标准工作溶液；
(2)样品溶液的制备：使用甲醇稀释茶酊样品，然后过滤，得到样品溶液；
(3)液相色谱-串联质谱分析：利用液相色谱-串联质谱仪分别对标准溶液和样品溶液进行检测分析；
(4)绘制标准曲线，计算茶酊中没食子酸和蛇葡萄素的含量。
在一个优选的实施方案中，发明所述的茶酊中没食子酸和蛇葡萄素的检测方法，其中所述的茶酊为烟用香精香料的香原料，可以是各种茶叶的酊剂，例如绿茶酊、红茶酊、乌龙茶酊、普洱茶酊等等，可以商购获得，也可以依照酊剂的一般制备方法制备获得，例如，可以用40％-60％乙醇浸提研磨后的茶叶粉末得到。
优选地，所述的茶酊样品使用甲醇进行稀释；优选地，所用的甲醇为纯甲醇溶液。
在一个优选的实施方案中，发明所述的茶酊中没食子酸和蛇葡萄素的检测方法，其中步骤(2)所述的样品溶液的制备过程如下：称取适量待测茶酊样品，加入适量甲醇溶液,室温下超声震荡，过滤后，得到样品溶液。优选的过滤方式采用微孔滤膜过滤，例如0.22μm有机滤膜或0.45μm有机滤膜。
在一个具体的实施方案中，所述样品溶液的制备方法具体为：称取0.1g左右茶酊样品,置于25mL锥形瓶中；加入甲醇10mL,室温下超声震荡30min,用0.22μm有机滤膜过滤后得到样品溶液，可直接进样。
在一个优选的实施方案中，发明所述的茶酊中没食子酸和蛇葡萄素的检测方法，其中液相色谱的分析条件为以下(i)至(vi)中的一项或多项：
(i)采用C18色谱柱，
优选地，所述的色谱柱的规格为50mm×2.1mmi.d.,2.6μm粒径，
(ii)色谱柱温度为28～32℃，优选为30℃，
(iii)进样量为8～12μL，优选为10μL，
(iv)流动相：甲醇-水溶液，
优选的流动相：A为甲醇，B为水，采用等度洗脱程序，体积比90：10，
(v)流速为0.1～0.3ml/min，优选为0.2ml/min，
(vi)洗脱时间约10min。
在一个具体的实施方案中，发明所述的茶酊中没食子酸和蛇葡萄素的检测方法，其中液相色谱的分析条件为：色谱柱采用菲罗门C18液相色谱柱，色谱柱温度为30℃，进样量为10μL，流速为0.2ml/min；流动相：A为甲醇，B为水，采用等度洗脱程序，体积比90：10，洗脱时间总共约10min。
在一个优选的实施方案中，发明所述的茶酊中没食子酸和蛇葡萄素的检测方法，其中质谱的分析条件为以下(i)至(iii)中的一项或多项：
(i)用电喷雾离子阱串联质谱测定没食子酸和蛇葡萄素；
(ii)离子源：电喷雾电离源(ESI)；
(iii)以选择离子对定性，优选的离子对为：没食子酸的定性离子对m/z169.1>124.8，169.1>157.6，定量离子对m/z169.1>124.8；蛇葡萄素的定性离子对m/z319.0>193.2，319.0>300.7，定量离子对m/z319.0>193.2。
在一个优选的实施方案中，发明所述的茶酊中没食子酸和蛇葡萄素的检测方法，其中质谱分析条件为：扫描方式：负离子扫描；检测方式：多反应监测(MRM)；电喷雾电压：-4500V；离子源温度：500℃；辅助气Gas1压力：60psi；辅助气Gas2压力：50psi；去簇电压(DP)：40V；碰撞能(CE):-20V。
在一个具体的实施方案中，发明所述的茶酊中没食子酸和蛇葡萄素的检测方法，其中所述的质谱分析条件为离子源：电喷雾电离源(ESI)；扫描方式：负离子扫描；检测方式：多反应监测(MRM)；电喷雾电压：-4500V；离子源温度：500℃；辅助气Gas1压力：60psi；辅助气Gas2压力：50psi；去簇电压(DP)：40V；碰撞能(CE):-20V；离子对选择为：没食子酸：定性离子对m/z169.1>124.8，169.1>157.6，定量离子对m/z169.1>124.8，蛇葡萄素，定性离子对m/z319.0>193.2，319.0>300.7，定量离子对m/z319.0>193.2。
在一个优选的实施方案中，发明所述的茶酊中没食子酸和蛇葡萄素的检测方法的检测方法，其中外标法所用的标准溶液的配制步骤如下：称取没食子酸和蛇葡萄素各0.1g，精确至0.0001g，用甲醇溶解后转移至1000mL容量瓶中并定容，分别得到没食子酸标准储备液和蛇葡萄素标准储备液；分别移取0.01mL，0.05mL，0.1mL，0.5mL，1.0mL的标准储备液到100mL容量瓶中，用10％(v/v)的甲醇水溶液定容，则没食子酸和蛇葡萄素的浓度均为0.01μg/mL、0.05μg/mL、0.1μg/mL、0.5μg/mL、1.0μg/mL，分别得到没食子酸系列标准溶液和蛇葡萄素系列标准溶液。
在一个优选的实施方案中，发明所述的茶酊中没食子酸和蛇葡萄素的检测方法，其中没食子酸和蛇葡萄素含量的计算方法为：首先以标准溶液所检测出的目标物的色谱峰面积对其相应浓度进行回归分析，得到标准曲线；然后将样品溶液检出的目标物的色谱峰面积，代入标准曲线，即得到样品中的没食子酸和蛇葡萄素浓度，由此即可计算出茶酊中没食子酸和蛇葡萄素的含量。
本发明的检测方法对样品的处理方法和色谱条件进行了优化，达到了以下效果：
(1)检测时间短：采用本发明的方法测定茶酊中没食子酸和蛇葡萄素含量，检测周期仅需要10分钟左右。
(2)本发明的检测方法具有操作简便、灵敏度高、回收率高及重复性好的优点：本发明方法的色谱条件使没食子酸和蛇葡萄素的色谱峰与杂质色谱峰分离较好，并且具有较好的线性相关性，检测限为0.002μg/mL，没食子酸的回收率在91.3％～109.2％之间，蛇葡萄素的回收率在84.1％～97.8％之间，样品测试结果的相对标准偏差均小于5％。
附图说明
图1为本发明的检测方法的流程图；
图2为实施例1中浓度为1μg/mL的标准溶液中没食子酸的色谱图；
图3为实施例1中浓度为1μg/mL的标准溶液中蛇葡萄素的色谱图；
图4为实施例1中样品溶液没食子酸的色谱图；
图5为实施例1中样品溶液蛇葡萄素的色谱图；
图6为没食子酸的质谱图；
图7为蛇葡萄素的质谱图；
图8为实施例1获得的没食子酸的标准曲线；
图9为实施例1获得的蛇葡萄素的标准曲线。
具体实施方式
下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述，但是本领域技术人员将会理解，下列实施例仅用于说明本发明，而不应视为限定本发明的范围。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。
实施例1
本实施例对茶酊中没食子酸和蛇葡萄素含量进行检测，检测方法如下所述，所述检测方法的流程图如图1所示。
(1)称取没食子酸和蛇葡萄素(分析纯)各0.1g，精确至0.0001g，用甲醇溶解后转移至1000mL容量瓶中，并用甲醇定容，分别得到没食子酸标准储备液和蛇葡萄素标准储备液；分别移取0.01mL，0.05mL，0.1mL，0.5mL，1.0mL的没食子酸标准储备液和蛇葡萄素标准储备液到100mL容量瓶中，用10％(v/v)甲醇水溶液定容，则没食子酸和蛇葡萄素的浓度分别为为0.01μg/mL、0.05μg/mL、0.1μg/mL、0.5μg/mL、1.0μg/mL，分别得到没食子酸系列标准溶液和蛇葡萄素系列标准溶液。标准溶液避光4℃保存，取用时放置于常温下，达到常温后方可使用。每周做一次标线；
(2)样品溶液的制备：称取0.1g左右的待测茶酊样品(本实施例中的茶酊是用40％-60％乙醇浸提研磨后的茶叶粉末所得到的一种香料),置于25mL锥形瓶中；准确加入甲醇10mL,室温下超声震荡30min,用0.22μm有机滤膜过滤后，得到样品溶液，于4℃保存待分析；
(3)色谱分析条件为采用菲罗门C18液相色谱柱，规格为50mm×2.1mmi.d.,2.6μm粒径。色谱柱温度为30℃，进样量为10μL，流速为0.2ml/min；流动相：A为甲醇，B为水，采用等度洗脱程序，体积比90﹕10。洗脱时间总共10min。浓度为0.5μg/mL的标准溶液的色谱分析结果见图2和图3；样品溶液的色谱分析结果见图4和图5；
(4)质谱分析条件为离子源：电喷雾电离源(ESI)；扫描方式：负离子扫描；检测方式：多反应监测(MRM)；电喷雾电压：-4500V；离子源温度：500℃；辅助气Gas1压力：60psi；辅助气Gas2压力：50psi；去簇电压(DP)：40V；碰撞能(CE):-20V。没食子酸和蛇葡萄素的质谱图见图6和图7。依据碎片丰度高、选择性高的原则顺序，确定离子对选择为：没食子酸的定性离子对m/z169.1>124.8，169.1>157.6，定量离子对m/z169.1>124.8；蛇葡萄素的定性离子对m/z319.0>193.2，319.0>300.7，定量离子对m/z319.0>193.2。
(4)茶酊中没食子酸和蛇葡萄素含量的计算：首先以标准溶液所检测出的目标物的色谱峰面积对其相应浓度进行回归分析，得到标准曲线(见图8和图9)；与标准曲线相对应的回归方程、相关系数等数据如表1所示。
表1没食子酸和蛇葡萄素的标准曲线和检测限
然后将样品测得的检出目标物的色谱峰面积，代入标准曲线，即得到样品中的没食子酸和蛇葡萄素浓度，由此计算茶酊中没食子酸和蛇葡萄素的含量，计算公式如下：
m＝(A×S)/n
式中：
m—每克茶酊中没食子酸和蛇葡萄素的含量，单位为微克每克(μg/g)；
A—样品中没食子酸和蛇葡萄素的浓度(μg/mL)；
S—溶液体积(mL)；
n—称取样品的质量(g)。
由表1和图4、5可知，所采用的色谱条件使没食子酸和蛇葡萄素的色谱峰与杂质色谱峰分离较好，并且具有较好的相关性，检测限在0.002μg/mL。本实施例样品的没食子酸和蛇葡萄素的含量分别为10.9μg/g和25.7μg/g。
实施例2
本实施例对本发明方法的重复性和加标回收率进行检测，检测方法如下所述。
采用标准加入法测定本发明的方法的回收率。称取待测茶酊样品(该样品与实施例1步骤(2)中所用的茶酊样品相同)0.1g，各三份，向其中分别加入0.005mL、0.01mL、0.02mL、0.05mL实施例1步骤(1)中配制的没食子酸标准储备液和蛇葡萄素标准储备液，然后按照实施例1步骤(2)“样品溶液的制备”中的配制方法制备加标样品溶液，每个样品分别测定6次，色谱和质谱分析的条件同实施例1，根据分析结果计算本方法茶酊中没食子酸和蛇葡萄素的加标回收率，结果如表2所示；
表2茶酊中没食子酸的回收率和重复性(n＝6)
表3茶酊中蛇葡萄素的回收率和重复性(n＝6)
由表2可以看出，在3个加标水平上，利用此方法检测茶酊中没食子酸的回收率在91.3％～109.2％之间，蛇葡萄素的回收率在84.1％～97.8％之间，样品测试结果的相对标准偏差均小于5％，说明本法的回收率较高，重复性较好。
Claims (6)
1.一种茶酊中没食子酸和蛇葡萄素的检测方法，该方法采用液相色谱串联质谱法测定，采用外标法定量，包括以下步骤：
(1)标准溶液的配制；称取没食子酸和蛇葡萄素标准品，用甲醇分别配制成具有浓度梯度的没食子酸标准工作溶液和蛇葡萄素标准工作溶液；
(2)样品溶液的制备：使用甲醇稀释茶酊样品，然后过滤，得到样品溶液；
(3)液相色谱-串联质谱分析：利用液相色谱-串联质谱仪分别对标准溶液和样品溶液进行检测分析；
(4)绘制标准曲线，计算茶酊中没食子酸和蛇葡萄素的含量，
其中，液相色谱的分析条件为：采用C18色谱柱，色谱柱温度为28～32℃，进样量为8～12μL，流动相：体积比90:10的甲醇-水溶液，等度洗脱，流速为0.1～0.3ml/min，
质谱分析条件为：用电喷雾离子阱串联质谱测定没食子酸和蛇葡萄素，离子源为电喷雾电离源(ESI)，以选择离子对定性，扫描方式：负离子扫描；检测方式：多反应监测(MRM)；电喷雾电压：-4500V；离子源温度：500℃；辅助气Gas1压力：60psi；辅助气Gas2压力：50psi；去簇电压(DP)：-40V；碰撞能(CE):-20V。
2.权利要求1的检测方法，其中步骤(2)所述的样品溶液的制备过程如下：称取适量待测茶酊样品，加入适量甲醇溶液,室温下超声震荡,过滤后，得到样品溶液。
3.权利要求1的检测方法，其中液相色谱的分析条件为以下(i)至(v)中的一项或多项：
(i)所述的色谱柱的规格为50mm×2.1mmi.d.,2.6μm粒径，
(ii)色谱柱温度为30℃，
(iii)进样量为10μL，
(iv)流速为0.2ml/min，
(v)洗脱时间约10min。
4.权利要求3的检测方法，其中液相色谱的分析条件为：色谱柱采用菲罗门C18液相色谱柱，色谱柱温度为30℃，进样量为10μL，流速为0.2ml/min；流动相：A为甲醇，B为水，采用等度洗脱程序，体积比90：10，洗脱时间总共约10min。
5.权利要求1的检测方法，其中没食子酸的定性离子对为m/z169.1>124.8，169.1>157.6，定量离子对为m/z169.1>124.8；蛇葡萄素的定性离子对为m/z319.0>193.2，319.0>300.7，定量离子对为m/z319.0>193.2。
6.权利要求1或2的检测方法，其中外标法所用的标准溶液的配制步骤如下：称取没食子酸和蛇葡萄素各0.1g，精确至0.0001g，用甲醇溶解后转移至1000mL容量瓶中并定容，分别得到没食子酸标准储备液和蛇葡萄素标准储备液；分别移取0.01mL，0.05mL，0.1mL，0.5mL，1.0mL的标准储备液到100mL容量瓶中，用10v/v％的甲醇水溶液定容，则没食子酸和蛇葡萄素的浓度均为0.01μg/mL、0.05μg/mL、0.1μg/mL、0.5μg/mL、1.0μg/mL，分别得到没食子酸系列标准溶液和蛇葡萄素系列标准溶液。
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