CN105158351B - 山西老陈醋液相指纹图谱的构建方法和应用 - Google Patents
山西老陈醋液相指纹图谱的构建方法和应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了一种山西老陈醋液相指纹图谱的构建方法和应用，涉及指纹图谱的构建技术领域。其构建方法，步骤包括：(1)取山西老陈醋1mL，用0.22μm微孔滤膜过滤后备用；(2)吸取过滤后的山西老陈醋至高压液相色谱仪测定，得到化学指纹图谱；本发明的样本前处理简洁、方便，且能较全面地反应山西老陈醋的化学成分和品质特性，可用于山西老陈醋的质量控制，同时，也可以为原产地域和地理标志的山西老陈醋的保护提供技术支撑。
Description
技术领域
本发明涉及指纹图谱的构建，具体是一种基于液相色谱技术的山西老陈醋指纹图谱构建方法及其在质量控制中的应用。
背景技术
山西老陈醋是山西省特色产业，具有悠久的历史，其独特的“蒸、酵、熏、淋、晒”五字工艺，使之具有酸、绵、香、甜的独特风味。随着各种分析手段鉴定方法和仪器的发展，食醋的化学成分系统研究逐步深入，已报道食醋中含有糖类、氨基酸、酸类、醇类、醛类、酯类、多酚类等成分。
近年来山西老陈醋的质量标准中增加了川芎嗪和总黄酮的含量。然而山西老陈醋的成分非常复杂，仅仅控制川芎嗪和总黄酮的含量难以保证品质的均一稳定。此外，川芎嗪和总黄酮在其他的粮食酿造食醋中也广泛存在，且含量并不低(几种中国传统名醋挥发性风味成分的比较研究.孙宗保等.中国调味品,第35卷第9期,2010.吴起荞麦醋与镇江香醋、山西老陈醋比较研究.李利军等.中国酿造,第21期,2008.)。因此，近年来在中药中广泛使用的指纹图谱成为食醋质量控制的有效手段。现有山西老陈醋指纹图谱主要是挥发性成分指纹(气相色谱/质谱法联用分析山西老陈醋香气成分.袁仲等.中国调味品,第36卷第5期,2011.)和有机酸类指纹(山西老陈醋中有机酸的HPLC测定分析.吕利华等.食品科学,第28卷第11期,2007.)。然而食醋中除少量的挥发性成分外主要为非挥发性的水溶性成分。水溶性成分除有机酸外还有其他具紫外吸收成分(如黄酮类成分等)，这些紫外吸收成分含量远远高于挥发性成分，也是反映老陈醋质量的重要指标，对于控制山西老陈醋的质量同等重要。已有研究或针对其香气即挥发性成分，或针对其有机酸类成分，不仅样本前处理过程繁琐，更重要的是检测范围窄，无法全面反映山西老陈醋的内在质量。因此，本发明目的在于建立一种与现有质量控制方法互补、样本前处理简单快速、检测指标针对老陈醋中紫外吸收成分的液相指纹图谱，用于更加全面控制老陈醋的质量。
发明内容
本发明的目的在于针对现有技术存在的问题，提供一种山西老陈醋液相指纹图谱构建方法及其在质量控制中的应用。
本发明的技术方案如下：
一种山西老陈醋液相指纹图谱构建方法，包括如下步骤：
(1)取山西老陈醋1mL，用0.22μm微孔滤膜过滤，取续滤液即得待测液；
(2)吸取待测液至高压液相色谱仪测定，得到化学指纹图谱；所述液相色谱条件：
流速：0.5～1mL/min；检测波长：240～290nm；柱温：25～30℃；进样量：3～5μL；色谱柱：Synrgi 4u Hydro-RP 80A(250×4.60mm)；流动相：A相为乙腈，B相为0.05～0.15％甲酸或磷酸水溶液，梯度洗脱，每1次完成后，系统平衡3min后再次进样。
所述步骤(2)中液相色谱的条件为流速：0.8mL/min；检测波长：254nm；柱温：26℃；进样量：5μL。
所述步骤(2)中流动相B相为0.1％甲酸溶液。
所述步骤(2)中梯度洗脱条件优选：0～5min，0％A相；5～21min，0％～6.4％A相；21～59min，6.4％～30％A相；59～62min，30％～0％A相，62～65min，0％A相。
所述步骤(2)中系统平衡3min为100％B相冲柱3min。
所述山西老陈醋是指在山西境内生产的陈酿时间较长的老陈醋和陈酿时间较短的陈醋。
山西老陈醋液相指纹图谱可用于生产质量监控，也可用于区分山西老陈醋和其它种类的醋如香醋、米醋等。
与现有技术相比本发明的优点和效果：1.样本前处理简洁、方便、耗时短；2.可全面检测老陈醋中紫外吸收成分；3.可与现有的挥发性指纹图谱图谱互补应用于山西老陈醋生产质量监控中；4.可区分山西老陈醋和香醋、米醋。
附图说明
图1山西老陈醋对照特征图谱。
图2不同品牌山西老陈醋的液相图谱对比。
图3不同批次的东湖老陈醋的液相图谱相似度对比。
图4山西老陈醋、镇江香醋和米醋的液相指纹图谱对比。
图5山西老陈醋和镇江香醋的PCA分析。
具体实施方式：
以下将结合实施例对本发明做进一步的说明。各实施例中使用到的试剂和器材如下：
1.仪器
超声波清洗器(KQ5200E，昆山市超声仪器有限公司)，Waters Acquity UPLC H-Class超高效液相色谱系统、Empower工作站含四元梯度泵、自动进样器、PDA检测器(Waters公司)，色谱柱Synrgi 4u Hydro-RP 80A(250×4.60mm)。
2.试剂
乙腈(色谱纯，Fisher公司)，甲醇(色谱纯，Fisher公司)，水(娃哈哈纯净水)，磷酸(色谱纯，天津市致远化学试剂有限公司)，甲酸(色谱纯，Fisher公司)。
3.样品信息，见表1。
表1 32批食醋信息
| 编号 | 品牌 | 名称 | 陈酿期 | 批号 |
| 1 | 紫林 | 陈醋王酿造食醋 | 十年陈酿 | 2014117 |
| 2 | 紫林 | 紫林陈醋酿造食醋 | 二年陈酿 | 2015317 |
| 3 | 紫林 | 山西陈醋酿造食醋 | 一年陈酿 | 20141016 |
| 4 | 紫林 | 紫林陈醋酿造食醋 | 二年陈酿 | 2015330 |
| 5 | 紫林 | 陈醋王酿造食醋 | 五年陈酿 | 201358 |
| 6 | 宁化府益源庆 | 益源庆牌精酿老醋 | 一年陈酿 | 2015110 |
| 7 | 宁化府益源庆 | 宁化府精酿老醋 | 三年陈酿 | 2015315 |
| 8 | 宁化府益源庆 | 益源庆牌精酿老醋 | 三年陈酿 | 2015316 |
| 9 | 东湖 | 山西老陈醋酿造食醋 | 五年陈酿 | - |
| 10 | 东湖 | 东湖老陈醋 | 一年陈酿 | 2015116 |
| 11 | 东湖 | 山西老陈醋酿造食醋 | 五年陈酿 | - |
| 12 | 东湖 | 山西老陈醋酿造食醋 | 三年陈酿 | - |
| 13 | 东湖 | 东湖名醋 | - | - |
| 14 | 东湖 | 山西老陈醋酿造食醋 | 五年陈酿 | 201515 |
| 15 | 东湖 | 山西老陈醋酿造食醋 | 五年陈酿 | 2015320 |
| 16 | 东湖 | 山西老陈醋酿造食醋 | 三年陈酿 | 20141029 |
| 17 | 水塔 | 水塔陈醋 | - | - |
| 18 | 水塔 | 水塔老陈醋 | 三年陈酿 | 2014121 |
| 19 | 水塔 | 水塔老陈醋 | 二年陈酿 | 2013512 |
| 20 | 来福 | 山西老陈醋 | - | 2011811 |
| 21 | 上水井 | 上水井陈醋 | - | 20141224 |
| 22 | 乔家媳妇 | 乔家媳妇老陈醋 | 五年陈酿 | 2010918 |
| 23 | 钰泉庆 | 钰泉庆山西老陈醋 | 八年陈酿 | - |
| 24 | 恒顺 | 镇江香醋 | - | 20141228 |
| 25 | 恒顺 | 恒顺香醋 | - | 2015115 |
| 26 | 恒顺 | 镇江香醋 | - | 201519 |
| 27 | 恒顺 | 宴会香醋 | - | 20131230 |
| 28 | 恒顺 | 金优香醋 | - | 2015131 |
| 29 | 恒顺 | 恒顺香醋 | - | 2015112 |
| 30 | 珍极 | 9°米醋 | 20131218 | |
| 31 | 东湖 | 9°米醋(酿造食醋) | 2015124 | |
| 32 | 紫林 | 9°米醋 | 20141114 |
实施例1
取山西老陈醋样品1ml(1号样品)，以0.22μm微孔滤膜过滤，取续滤液即得待测液。以亲水色谱柱Synrgi 4u Hydro-RP 80A(250×4.60mm)为固定相，按照如下液相条件进行测试：
流速：0.8mL/min；检测波长：254nm；柱温：26℃；进样量：5μL；线性梯度洗脱；流动相为：流动相A为乙腈，流动相B为体积分数为0.1％的甲酸水溶液，洗脱程序：0～5min，0％A相；5～21min，0％～6.4％A相；21～59min，6.4％～30％A相；59～62min，30％～0％A相，62～65min，0％A相。
实施例2
取山西老陈醋样品1ml(1号样品)，以0.22μm微孔滤膜过滤，取续滤液即得待测液。以亲水柱Synrgi 4u Hydro-RP 80A(250×4.60mm)为固定相，按照如下液相条件进行测试：
流速：0.5mL/min；检测波长：260nm；柱温：26℃；进样量：5μL；线性梯度洗脱；流动相为：流动相A为乙腈，流动相B为体积分数为0.1％的甲酸水溶液，洗脱程序：0～5min，0％A相；5～21min，0％～6.4％A相；21～59min，6.4％～30％A相；59～62min，30％～0％A相，62～65min，0％A相。
实施例3
取山西老陈醋样品1ml(1号样品)，以0.22μm微孔滤膜过滤，取续滤液即得待测液。以亲水柱Synrgi 4u Hydro-RP 80A(250×4.60mm)为固定相，按照如下液相条件进行测试：
流速：0.8mL/min；检测波长：240nm；柱温：30℃；进样量：5μL；线性梯度洗脱；流动相为：流动相A为乙腈，流动相B为体积分数为0.1％的磷酸水溶液，洗脱程序：0～5min，0％A相；5～21min，0％～6.4％A相；21～59min，6.4％～30％A相；59～62min，30％～0％A相，62～65min，0％A相。
实施例4 方法学考察
精密度考察：取同一山西老陈醋样品(1号样品)，按照实施例1的方法和色谱条件，连续进样六次，测定指纹图谱。以7号峰为参照峰，计算样品中所含14个共有峰的相对保留时间和峰面积。结果显示，各共有峰的相对保留时间的RSD在0.07％～0.97％，相对峰面积的RSD在0.83％～4.9％，表明仪器的精密度良好。
重复性考察：按照实施例1的方法和色谱条件制备同一山西老陈醋样品(1号样品)6份，测定指纹图谱。考察14个共有峰的相对保留时间和相对峰面积，各色谱峰的相对保留时间的RSD在0.07％～0.99％，相对峰面积的RSD在0.87％～4.75％，表明方法的重复性良好。
稳定性考察：按照实施例1的方法，取同一份山西老陈醋样品(1号样品)，分别于0,2,4,6,8,12,24h共7个时间点进样测定，对14个共有峰的相对保留时间和峰面积进行考察，样品24h各色谱峰的相对保留时间的RSD在0.09％～1.49％，相对峰面积的RSD在1.39％～4.97％结果表明，样品在24h内稳定性良好。
实施例5
取不同批次(8、9、11、13、14、15号样品)的东湖老陈醋样品1ml，以0.22μm微孔滤膜过滤，取续滤液即得待测液。以亲水柱Synrgi 4u Hydro-RP 80A(250×4.60mm)为固定相，按照如下液相条件进行测试：
流速：0.8mL/min；检测波长：254nm；柱温：30℃；进样量：5μL；线性梯度洗脱；流动相为：流动相A为乙腈，流动相B为体积分数为0.1％的磷酸水溶液，洗脱程序：0～5min，0％A相；5～21min，0％～6.4％A相；21～59min，6.4％～30％A相；59～62min，30％～0％A相，62～65min，0％A相。
不同批次的东湖老陈醋样品液相指纹图谱(见图3)，采用《中药色谱指纹图谱相似度评价系统2008版》进行评价，相似度结果见表2，从表2中可知，各批次与对照图谱的相似度都在在0.8以上。此外，S1，S2，S3为不同批次的东湖老陈醋五年陈酿，三者之间的相似度达到0.9以上。这表明同一品牌的山西老陈醋相似度较好，且同一品牌同一酿造期的山西老陈醋的相似度更高。
表2 6批东湖老陈醋相似度计算结果
| S1 | S2 | S3 | S4 | S5 | S6 | 对照指纹图谱 | |
| S1 | 1 | 0.973 | 0.926 | 0.768 | 0.837 | 0.957 | 0.971 |
| S2 | 0.973 | 1 | 0.936 | 0.754 | 0.85 | 0.96 | 0.974 |
| S3 | 0.926 | 0.936 | 1 | 0.854 | 0.873 | 0.898 | 0.974 |
| S4 | 0.768 | 0.754 | 0.854 | 1 | 0.915 | 0.697 | 0.866 |
| S5 | 0.837 | 0.85 | 0.873 | 0.915 | 1 | 0.795 | 0.919 |
| S6 | 0.957 | 0.96 | 0.898 | 0.697 | 0.795 | 1 | 0.947 |
| 对照指纹图谱 | 0.971 | 0.974 | 0.974 | 0.866 | 0.919 | 0.947 | 1 |
实施例6
取所有镇江香醋样品和米醋样品1ml，以0.22μm微孔滤膜过滤，取续滤液即得待测液。以亲水柱Synrgi 4u Hydro-RP 80A(250×4.60mm)为固定相，按照如下液相条件进行测试：
流速：0.8mL/min；检测波长：254nm；柱温：26℃；进样量：5μL；线性梯度洗脱；流动相为：流动相A为乙腈，流动相B为体积分数为0.1％的磷酸水溶液，洗脱程序：0～5min，0％A相；5～21min，0％～6.4％A相；21～59min，6.4％～30％A相；59～62min，30％～0％A相，62～65min，0％A相。
比较三种食醋液相指纹图谱，如图4所示，从图谱中可直接观测到米醋中成分的含量特别小，而无法直接观测到山西老陈醋和镇江香醋的差异，故将山西陈醋和镇江香醋14个共有峰的峰面积进行主成分分析(图5)，从图5中可以直接看出，山西老陈醋能与镇江香明显分开，这表明本方法可以区分山西老陈醋与镇江香醋。
以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。
说明书附图中，图1是山西老陈醋对照特征图谱，图2是不同品牌山西老陈醋的液相图谱对比。它们是按照实施例1方法测定表一中(1-23号样品)不同品牌山西老陈醋，所得液相指纹图谱导入《中药色谱指纹图谱相似度评价系统2008版》软件得到不同品牌山西老陈醋的液相图谱对比图(见图2)，并进一步生成山西老陈醋对照特征图谱(见图1)。
Claims (6)
1.一种山西老陈醋液相指纹图谱的构建方法，其特征在于，包括如下步骤：
(1)取山西老陈醋1mL，用0.22μm微孔滤膜过滤，取续滤液即得待测液；
(2)吸取待测液至高压液相色谱仪测定，得到化学指纹图谱；所述液相色谱条件：流速：0.5～1mL/min；检测波长：240～290nm；柱温：25～30℃；进样量：3～5μL；色谱柱：Synrgi 4uHydro-RP 80A，柱长250mm，内径4.6mm；流动相：A相为乙腈，B相为0.05～0.15％甲酸或磷酸水溶液，梯度洗脱，每1次完成后，系统平衡3min后再次进样；
所述梯度洗脱条件：0～5min，0％A相；5～21min，0％～6.4％A相；21～59min，6.4％～30％A相；59～62min，30％～0％A相，62～65min，0％A相。
2.如权利要求1所述的一种山西老陈醋液相指纹图谱的构建方法，其特征在于，所述步骤(2)中液相色谱的条件为流速：0.8mL/min；检测波长：254nm；柱温：26℃；进样量：5μL。
3.如权利要求1所述的一种山西老陈醋液相指纹图谱的构建方法，其特征在于，所述步骤(2)中流动相B相为0.1％甲酸溶液。
4.如权利要求1所述的一种山西老陈醋液相指纹图谱的构建方法，其特征在于，所述步骤(2)中系统平衡3min为100％B相冲柱3min。
5.如权利要求1所述方法构建的山西老陈醋液相指纹图谱在山西老陈醋生产质量监控中的应用。
6.如权利要求1所述方法构建的山西老陈醋液相指纹图谱在区分山西老陈醋与米醋或镇江香醋中的应用。
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