CN112159804A - 一种蜱的核酸提取方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种蜱的核酸提取方法，其特征在于包括如下步骤：1)将蜱用缓冲液冲洗干净，之后转移至耐磨损、耐高压的容器中，于容器中放入研磨介质并将容器密封；2)将容器置于液氮中浸泡预冷1～5min；该步骤中，通过液氮对蜱进行低温预冷，可以使蜱质地坚硬的组织结构冻结变得容易破碎；3)将容器进行快速振动，控制振动频率控制为3～50Hz，振动时间为0.5～30min；该步骤中，利用不锈钢钢珠、碳化钨球、氧化锆球等研磨介质与冻结后蜱进行撞击和摩擦，能有效改善蜱的研磨效果；4)重复操作步骤(2)、步骤(3)，之后于容器中加入缓冲液，振荡混合均匀后离心，取上清液备用；5)以步骤(4)获得的上清液为原料，采用磁珠法进行核算提取。本发明方法能提高蜱的核酸提取效率，能减少核酸中的杂质，提高核酸的纯度，具有较好的推广利用价值。
Description
技术领域
本发明属于生物检测技术领域，具体涉及一种蜱的核酸提取方法。
背景技术
核酸即脱氧核糖核酸(DNA)及核糖核酸(RNA)。DNA是储存、复制和传递遗传信息的主要物质基础，RNA在蛋白质合成过程中起着重要作用。核酸是生命的最基本物质之一，是生命的根源，无论是DNA还是RNA都对生物科学的研究和发展具有重要作用，而如何从样品中将核酸提取出来是研究核酸的前提和基础。
蜱作为虫媒传染病重要的传播媒介之一,其携带的病原体给人类健康、野生动物和畜牧业发展带来了极大的威胁。我国幅员辽阔、地形多样、气候复杂，导致我国蜱种类繁多、分布广泛。近年来，新发或再发蜱传染病不断出现，例如非洲猪瘟正在我国大范围流行，给我国养猪业造成了毁灭性的打击，而蜱就是非洲猪瘟病毒重要的传播媒介。所以，对蜱开展流行病学调查和分子生物学研究对于畜牧业和公共卫生都具有重大意义。因为蜱的组织结构特殊，不同于一般的生物样品，用常规的核酸提取方法难以获得高质量的核酸。
现在常用的核酸提取方法是动物疫病病毒核酸提取磁珠法(湖南省地方标准DB43/T 1671-2019)，该标准中的样品处理方法是针对液体样品和动物肌肉、内脏组织，而蜱的组织结构特别，具有盾板等硬质结构，而且个体较小，用现有的提取方法难以高效提取核酸。本专利针对蜱的特点，采用新的样品处理方法，有效提高了蜱的核酸提取效率。
发明内容
针对上述问题，本发明提供了一种蜱的核酸提取方法，本发明方法能提高蜱的核酸提取效率，能减少核酸中的杂质，提高核酸的纯度，具有较好的推广利用价值。
本发明通过下述方案实现。
一种蜱的核酸提取方法，其特征在于包括如下步骤：
1)将蜱用缓冲液冲洗干净，之后转移至耐磨损、耐高压的容器中，于容器中放入研磨介质并将容器密封；
2)将容器置于液氮中浸泡预冷1～5min；该步骤中，通过液氮对蜱进行低温预冷，可以使蜱质地坚硬的组织结构冻结变得容易破碎；
3)将容器进行快速振动，控制振动频率控制为3～50Hz，振动时间为0.5～30min；该步骤中，利用不锈钢钢珠、碳化钨球、氧化锆球等研磨介质与冻结后蜱进行撞击和摩擦，能有效改善蜱的研磨效果；
4)重复操作步骤(2)、步骤(3)，之后于容器中加入缓冲液，振荡混合均匀后离心，取上清液备用；
5)以步骤(4)获得的上清液为原料，采用磁珠法进行核算提取。
作为优选技术方案，所述提取方法包括如下步骤：
a)将蜱用缓冲液冲洗干净，之后转移至耐磨损、耐高压的容器中，于容器中放入研磨介质并将容器密封；
b)将容器置于液氮中浸泡预冷1～5min；
c)将容器进行快速振动，控制振动频率控制为3～50Hz，振动时间为0.5～30min，利用研磨介质与蜱进行撞击和摩擦使蜱被粉碎；
d)将容器置于超声波中处理2～10min；
e)重复操作步骤(b)、步骤(c)、步骤(d)，之后于容器中加入缓冲液，振荡混合均匀后离心，取上清液备用；通过该步骤，即利用超声波对研磨粉碎后仍未溶解的冻结物料进行快速解冻，而解冻过程后细胞液体积增加，这样通过冻结、解冻循环，利用细胞液的体积变化，可以加速蜱组织细胞结构的破裂，从而有利于核酸的溶出；
f)以步骤(e)获得的上清液为原料，采用磁珠法进行核算提取。
作为优选技术方案，所述步骤(d)具体为：将容器置于超声波中间歇处理2～10min，即处理总时间为2～10min，间歇时间为10～30s；通过间歇超声波处理，可以防止物料温度的急剧升高而对核酸的破坏。
作为优选技术方案，所述缓冲液为PBS缓冲液。
作为优选技术方案，所述研磨介质包括不锈钢钢珠、碳化钨球、氧化锆球。
作为优选技术方案，所述步骤(4)中离心条件为：离心转速6000～12000r/m、离心时间30～150s。
作为优选技术方案，所述步骤(3)将容器进行快速振动的同时施加超声波处理；该步骤中，由于在快速振动研磨的过程中，部分被冻结的物料将融解，而通过超声波辅助研磨，可以促进蜱组织结构中的核酸从破裂的细胞结构内扩散至缓冲液中，从而可提高核酸的提取效率。
作为优选技术方案，所述超声波的频率为20～40KHZ。
本发明有益效果：
(1)本发明方法通过液氮对蜱进行低温预冷，可以使蜱质地坚硬的组织结构冻结变得容易破碎，并且利用不锈钢钢珠、碳化钨球、氧化锆球等研磨介质与蜱进行撞击和摩擦，能有效改善蜱的研磨效果，提高蜱的核酸提取效率，能减少核酸中的杂质，提高核酸的纯度。
(2)本发明在快速振动研磨的过程中，部分被冻结的物料将融解，而同时施加超声波处理，可以促进蜱组织结构中的核酸从破裂的细胞结构内扩散至缓冲液中，从而可提高核酸的提取效率。
(3)本发明通过预冷冻结、超声波辅助研磨、超声波解冻进行循环，蜱的组织细胞结构中细胞液在预冷冻结中，细胞液体积减小，而解冻过程后细胞液体积增加，通过冻结、解冻循环，可以使加速蜱组织细胞结构的破裂，有利于核酸的溶出。
具体实施方式
下面结合具体实施方式对本发明做进一步的说明，需要指出的是以下实施方式仅是以例举的形式对本发明所做的解释性说明，但本发明的保护范围并不仅限于此，所有本领域的技术人员以本发明的精神对本发明所做的等效的替换均落入本发明的保护范围。
实施例1
一种蜱的核酸提取方法，包括如下步骤：
1)将蜱用缓冲液冲洗干净之后转移至耐磨损、耐高压的容器中，于容器中放入研磨介质并将容器密封；
2)将容器置于液氮中浸泡预冷1～5min；
3)将容器进行快速振动，控制振动频率控制为3～50Hz，振动时间为0.5～30min，利用研磨介质与蜱进行撞击和摩擦使蜱被粉碎；
4)重复操作步骤(2)、步骤(3)，之后于容器中加入缓冲液，振荡混合均匀后离心，取上清液备用；
5)以步骤(4)获得的上清液为原料，采用磁珠法进行核算提取。
实施例2
一种蜱的核酸提取方法，包括如下步骤：
1)将蜱用缓冲液冲洗干净之后转移至耐磨损、耐高压的容器中，于容器中放入研磨介质并将容器密封；
2)将容器置于液氮中浸泡预冷1～5min；
3)将容器进行快速振动，控制振动频率控制为3～50Hz，振动时间为0.5～30min，利用研磨介质与蜱进行撞击和摩擦使蜱被粉碎；并且，同时施加超声波处理；其中，超声波的频率为20～40KHZ；
4)重复操作步骤(2)、步骤(3)2～8次，之后于容器中加入缓冲液，振荡混合均匀后离心，取上清液备用；
5)以步骤(4)获得的上清液为原料，采用磁珠法进行核算提取。
实施例3
一种蜱的核酸提取方法，包括如下步骤：
1)将蜱用PBS缓冲液冲洗干净，之后转移至容积为2mL的不锈钢研磨罐中，于容器中放入直径为2mm的不锈钢珠并将不锈钢研磨罐密封；
2)将不锈钢研磨罐置于液氮中浸泡预冷1min；
3)将不锈钢研磨罐进行快速振动，控制振动频率控制为24Hz，振动时间为5min，利用研磨介质与蜱进行撞击和摩擦使蜱被粉碎；
4)重复操作步骤(2)、步骤(3)3次，之后于容器中加入500μl缓冲液，振荡混合均匀后于8 000r/m离心1min，取上清液备用；
5)以步骤(4)获得的上清液为原料，采用磁珠法进行核算提取。
实施例4
一种蜱的核酸提取方法，包括如下步骤：
1)将蜱用缓冲液冲洗干净，之后转移至耐磨损、耐高压的容器中，于容器中放入研磨介质并将容器密封；
2)将容器置于液氮中浸泡预冷1～5min；
3)将容器进行快速振动，控制振动频率控制为3～50Hz，振动时间为0.5～30min，利用研磨介质与蜱进行撞击和摩擦使蜱被粉碎；
4)将容器置于超声波中处理2～10min；
5)重复操作步骤(2)、步骤(3)、步骤(4)，之后于容器中加入缓冲液，振荡混合均匀后离心，取上清液备用；
6)以步骤(5)获得的上清液为原料，采用磁珠法进行核算提取。
实施例5
一种蜱的核酸提取方法，包括如下步骤：
1)将蜱用缓冲液冲洗干净，之后转移至耐磨损、耐高压的容器中，于容器中放入研磨介质并将容器密封；
2)将容器置于液氮中浸泡预冷1～5min；
3)将容器进行快速振动，控制振动频率控制为3～50Hz，振动时间为0.5～30min，利用研磨介质与蜱进行撞击和摩擦使蜱被粉碎；
4)将容器置于超声波中处理2～10min；
5)重复操作步骤(2)、步骤(3)、步骤(4)，之后于容器中加入缓冲液，振荡混合均匀后离心，取上清液备用；
6)以步骤(5)获得的上清液为原料，采用磁珠法进行核算提取。
实施例6
一种蜱的核酸提取方法，包括如下步骤：
1)将蜱用PBS缓冲液冲洗干净，之后转移至耐磨损、耐高压的容器中，于容器中放入研磨介质并将容器密封；
2)将容器置于液氮中浸泡预冷1～5min；
3)将容器进行快速振动，控制振动频率控制为3～50Hz，振动时间为0.5～30min，利用研磨介质与蜱进行撞击和摩擦使蜱被粉碎；并且，同时施加超声波处理；其中，超声波的频率为20～40KHZ；
4)将容器置于超声波中间歇处理2～10min，即处理总时间为2～10min，间歇时间为10～30s；其中，超声波的频率为20～40KHZ；
5)重复操作步骤(2)、步骤(3)、步骤(4)2～8次，之后于容器中加入PBS缓冲液，振荡混合均匀后于转速6000～12000r/m的条件下离心30～150s，取上清液备用；
6)以步骤(5)获得的上清液为原料，采用磁珠法进行核算提取。
实施例7
本发明所述的磁珠法采用湖南省地方标准DB43/T 1671-2019规定的方法，具体如下：
(1)根据核酸提取仪的操作程序，设置96孔深孔板的功能布局，包括1列裂解孔、1列磁珠孔、2列洗涤孔、1列洗脱孔。
(2)在裂解孔中加入500μL裂解液、20μL蛋白酶K、200μL样品(即本发明获得的上清液)，磁珠孔中加入600μL磁珠稀释液、25μL磁珠悬液，洗涤孔中加入700μL洗涤液，洗脱孔中加入100μL洗脱液。
(3)将深孔板放入核酸提取仪内，安装好磁套。
(4)运行核酸提取程序：90℃混匀裂解15min；转移磁珠孔中的磁珠至裂解孔，释放磁珠，混匀，再磁吸90s；转移磁珠至第一个洗涤孔，释放磁珠，加热至85℃混匀洗涤2min，磁吸90s；转移磁珠至第二个洗涤孔，释放磁珠，加热至85℃混匀，磁吸30s；转移磁珠至洗脱孔，释放磁珠，加热至85℃混匀洗脱，洗脱时间5min，磁吸90s；转移磁珠至磁珠孔，释放磁珠。
(5)程序运行结束后，洗脱孔中的溶液为提取获得的病毒核酸溶液，可立即用于实验检测，也可冷冻保存备用。
以上操作可按核酸提取仪及其配套试剂盒的要求进行。
Claims (8)
1.一种蜱的核酸提取方法，其特征在于包括如下步骤：
1)将蜱用缓冲液冲洗干净，之后转移至耐磨损、耐高压的容器中，于容器中放入研磨介质并将容器密封；
2)将容器置于液氮中浸泡预冷1～5min；
3)将容器进行快速振动，控制振动频率控制为3～50Hz，振动时间为0.5～30min，利用研磨介质与蜱进行撞击和摩擦使蜱被粉碎；
4)重复操作步骤(2)、步骤(3)，之后于容器中加入缓冲液，振荡混合均匀后离心，取上清液备用；
5)以步骤(4)获得的上清液为原料，采用磁珠法进行核算提取。
2.如权利要求1所述的一种蜱的核酸提取方法，其特征在于包括如下步骤：
a)将蜱用缓冲液冲洗干净，之后转移至耐磨损、耐高压的容器中，于容器中放入研磨介质并将容器密封；
b)将容器置于液氮中浸泡预冷1～5min；
c)将容器进行快速振动，控制振动频率控制为3～50Hz，振动时间为0.5～30min，利用研磨介质与蜱进行撞击和摩擦使蜱被粉碎；
d)将容器置于超声波中处理2～10min；
e)重复操作步骤(b)、步骤(c)、步骤(d)，之后于容器中加入缓冲液，振荡混合均匀后离心，取上清液备用；
f)以步骤(e)获得的上清液为原料，采用磁珠法进行核算提取。
3.如权利要求2所述的一种蜱的核酸提取方法，其特征在于所述步骤(d)具体为：将容器置于超声波中间歇处理2～10min，即处理总时间为2～10min，间歇时间为10～30s。
4.如权利要求1所述的一种蜱的核酸提取方法，其特征在于所述缓冲液为PBS缓冲液。
5.如权利要求1所述的一种蜱的核酸提取方法，其特征在于所述研磨介质包括不锈钢钢珠、碳化钨球、氧化锆球。
6.如权利要求1所述的一种蜱的核酸提取方法，其特征在于所述步骤(4)中离心条件为：离心转速6000～12000r/m、离心时间30～150s。
7.如权利要求1所述的一种蜱的核酸提取方法，其特征在于所述步骤(3)将容器进行快速振动的同时施加超声波处理。
8.如权利要求2、3、7中任一所述的一种蜱的核酸提取方法，其特征在于所述超声波的频率为20～40KHZ。
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