CN1338050A - 测定种子油的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及分析农产品的方法。更具体地说,本发明涉及分析一个或多个种子的含油量的方法,其包括以下步骤:利用一种溶剂将油从种子中萃取出来;在气流中蒸发所述溶剂以形成颗粒;检测反射光并测定含油量。

Description

测定种子油的方法
发明领域
本发明涉及农产品的分析方法。更具体地说，本发明涉及一个或多个种子的含油量的分析方法。
发明背景
长久以来为了所需性状而改进分析农产品的技术已经成为一种目标。为了分析样品中特定品质的存在，传统上业已使用几种方法。种子含油量的定量分析经常由几种常规方法来完成，这些方法例如包括近红外分析法(NIR)、核磁共振成象法(NMR)、索格利特萃取法、加速溶剂萃取法(ASE)、微波萃取法和超临界流体萃取法。然而，这些常规方法不能准确地辨别非常少的种子样品中的油的相对或绝对水平。
在过去十年中，近红外(NIR)光谱已经成为筛选种子样品的标准方法，而无论何时感兴趣的样品都利用该技术检验。所研究的样品包括小麦、玉米、大豆、canola、大米、苜蓿、燕麦和其它农作物(参见，例如Massie和Norris的“Spectral Reflectance and Transmittance Properties of Grain in the Visible and Near Infrared”，Transactions of the ASAE，Winter Meeting of the Amercan society of Agricultural Engineers，1965.pp.598-600；Archibald等人的“Development of Short-Wavelength Near-Infrared spectral Imaging for Grain Color Classification，”SPIE Vol.3543，1998.pp.189-198；Delwiche等人的“Single Wheat Kernel Analysis byNear-infrared Transmittance：Protein Content，”Analytical Techniques andInstrumentation，Vol.72，1995，pp.11-16；Dowell的“Automated Color Classification of Single Wheat Kernels Using Visible and Near-Infrared Spectroscopy Calibration Methods for the Prediction of Protein，Oil，and Starchin Maize Grain，”Vol.39，1991，pp.883-886；Robutti的“Maize Kernel Hardness Estimation in Breeding by Near-Infrared Transmission Analysis，”Vol.72(6)，1995，pp.632-636；Wfight等人的U.S.5,991,025和U.S.5,751,421；Daun等人的“Comparison of Three whole Seed Near-Infrared Analyzers forMeasuring Quality Components of Canola Seed”，Vol.71，no.10，1994，pp.1063-1068，这些资料在此全部作为本文的参考文献)。
业已报道了单个种子的NIR分析(参见Velasco等人的“Estimation of Seed Weight，Oil Content and Fatty Acid Composition in Intact SingleSeeds of Rapeseed(Brassica napus L.)by Rear-Infrared Reflectance Spectroscopy，”Euphytica，Vol.106，1999，pp.79-85；Delwiche的“Single WheatKernel Analysis by Near-Infrared Transmittance：Protein Content，”Analytical Techniques and Instrumentation，Vol.72，1995，pp.11-16；Dowell的“Automated Color Classification of Single Wheat Kernels Using Visible andNear-Infrared Reflectance，”Vol.75(1)，1998，pp.142-144；Dowell等人的“Automated Single Wheat Kernel Quality Measruement Using Near-Infrared Reflectance，”ASAE Annual International Meeting，1997，paper number973022，这些资料在此全部作为本文的参考文献)。然而，这些方法不够灵敏，从而不能准确测定非常少的种子的含油量，这限制了它们的使用。NMR也已被用来分析种子中的含油量(参见，例如Robertson and Morrison的“Analysis of Oil Content of Sunflower Seed by Wide-Line NMR，”Jorunal of the American Oil Chenists Society，1979，Vol.56，1979，pp.961-964，该资料在此全部作为本文的参考文献)。然而，当感兴趣的种子较少时，该非破坏性技术也经常不适于分析种子油。
常规用于测定含油量的其它技术，包括索格利特萃取法、加速溶剂萃取法(ASE)、微波萃取法和超临界流体萃取法，都采用重力分析法作为最后的测定步骤(参见，例如Taylor等人的“Determination of OilContent in Oilseeds by Analytical Supercritical Fluid Extraction，”Vol.70(no.4)，1993，pp.427-432，该资料在此全部作为本文的参考文献)。然而，重力分析法不适用于少量样品(包括少量种子和含油量少的种子)，这是因为这些样品的含油量在该技术最低灵敏度之下。另外，使用重力分析法既耗时，又不适应高通量的自动化。
本技术领域需要快速准确地分析种子样品特别是少量种子样品的方法，以下方法可有效地分析各个种子的含油量并适应自动化生产。本发明正是提供了几种这样的方法。
发明概述
本发明包括并提供了一种测定种子含油量的方法，该方法包括：(1)利用一种溶剂将油从种子中萃取出来；(2)在气流中将溶剂蒸发掉，以形成油粒；(3)将光引入到气流和油粒中，借此形成反射光；(4)检测反射光；以及(5)根据该反射光测定含油量。
本发明包括并提供了一种测定种子含油量的方法，该方法包括：(1)利用一种溶剂将油从种子中萃取出来；(2)将溶剂与种子分离开；(3)在气流中将溶剂蒸发掉，以形成油粒；(4)将光引入到气流和油粒中，借此形成反射光；(5)检测反射光；以及(6)根据该反射光测定含油量。
本发明包括并提供了一种测定种子含油量的方法，该方法包括：(1)使种子破裂，从而得到磨碎的种子；(2)利用一种溶剂将油从磨碎的种子中萃取出来；(3)在气流中将溶剂蒸发掉，以形成油粒；(4)将光引入到气流和油粒中，借此形成反射光；(5)检测反射光；以及(6)根据该反射光测定含油量。
本发明包括并提供了一种测定农业材料含油量的方法，该方法包括：(1)利用一种溶剂将油从材料中萃取出来；(2)在气流中将溶剂蒸发掉，以形成油粒；(3)将光引入到气流和油粒中，借此形成反射光；(4)检测反射光；以及(5)根据该反射光测定含油量。
本发明包括并提供了一种测定成批的种子样品含油量的方法，该方法包括：(1)利用一种溶剂将油从成批的种子样品中萃取出来；(2)在气流中将溶剂蒸发掉，以形成油粒；(3)将光引入到气流和油粒中，借此形成反射光；(4)检测反射光；以及(5)根据该反射光测定含油量。
本发明包括并提供了一种用于选择含油量多的种子的方法，该方法包括：(1)利用一种溶剂将油从种子中萃取出来；(2)在气流中将溶剂蒸发掉，以形成油粒；(3)将光引入到气流和油粒中，借此形成反射光；(4)检测反射光；(5)根据该反射光测定含油量；以及(6)根据该含油量选择具有类似遗传背景的种子。
本发明包括并提供了一种将一种性状渐渗杂交到植物中的方法，该方法包括：(1)利用一种溶剂将油从种子中萃取出来；(2)在气流中将溶剂蒸发掉，以形成油粒；(3)将光引入到气流和油粒中，借此形成反射光；(4)检测反射光；(5)根据该反射光测定含油量；(6)根据该含油量选择具有类似遗传背景的种子；(7)由该相关的种子生长出能育植物；以及(8)将该能育植物用作母系或用作父系与第二种作物杂交。
本发明包括并提供了一种测定种子含油量的方法，该方法包括：(1)利用一种溶剂将油从种子中萃取出来；(2)在高压下将溶剂和油雾化到能够蒸发溶剂的装置中；(3)在气流中将溶剂蒸发掉，以形成油粒；(4)将光引入到气流和油粒中，借此形成反射光；(5)检测反射光；以及(6)根据该反射光测定含油量。
本发明包括并提供了一种用于选择含油量多的种子的方法，该方法包括：(1)利用一种溶剂将油从种子中萃取出来；(2)在气流中将溶剂蒸发掉，以形成油粒；(3)将光引入到气流和油粒中，借此形成反射光；(4)检测反射光；(5)根据该反射光测定含油量；(6)一次或多次地重复步骤a)至e)；以及(7)根据该含油量选择一个或多个种子。
附图描述
图1是能够完成本发明方法的一个系统实施例的截面示意图。
图2是含油量的校准曲线图。
图3是测定所提取的大豆含油量的色谱图。
图4是将利用本发明的方法和利用常规的加速溶剂萃取技术处理大豆所得到的结果进行比较的表格。
图5是将利用本发明的方法和利用常规的加速溶剂萃取技术处理高粱所得到的结果进行比较的图表。
图6是将利用本发明的方法和利用常规的加速溶剂萃取技术处理玉米所得到的结果进行比较的图表。
图7是表示利用本发明方法处理玉米的一个实施例的重现性的图表。
图8是用于测定一个、两个和三个拟南芥种子的含油量的重叠色谱图。
本发明的详细描述
分析方法
本发明提供了几种选择具有所需含油量的种子的方法。在一个实施例中，本发明的用于测定一个种子的含油量的方法包括：(1)利用一种溶剂将油从种子中萃取出来；(2)在气流中将溶剂蒸发掉，以形成油粒；(3)将光引入到气流和油粒中，借此形成反射光；(4)检测反射光；以及(5)根据该反射光测定含油量。
在一个优选实施例中，提取样品的所有油馏分。在另一优选实施例中，将甘油三酯用作总的含油量的标志物。在该实施例中，由光散射检测产生的信号主要衍生于总的含油量的甘油三酯这一馏分。
然后通过离心将所提取的油与固体分开。为了测定含油量，将上清液注入到能够提供气流的装置中，而溶剂在气流中被蒸发掉，然后利用蒸发光散射检测器测定剩余油的质量。
此处所用的“含油量”意指样品中所存在的油或者油的特定馏分或几种馏分的量，例如，每个种子中含有5ng的总油，每10g干重的组织中含有5ng总油。或者每个种子中含有5ng甘油三酯，或者每10g干重的组织中含有5ng甘油三酯。特别优选的油馏分包括但不限于：甘油三酯、游离脂肪酸、蜡、磷脂、植物甾醇和维生素E。在一个优选实施例中，该馏分包括甘油三酯。此处所用的“组合物”意指农业样品的生化成分，例如甘油三酯与总的含油量之比。此处所用的“样品”意指被分析的一个或多个植物的任何部分，包括，例如部分种子、一个种子、多于一个的种子、一个或多个植物(而不是种子)的一部分、任何植物组织、农业材料或这些物质的组合。样品可以是任何形式，例如整个种子、完整的植物组织、整个农业材料以及这些物质的任何破裂形式。
任何种子都可用于本发明的方法。在一个优选实施例中，种子是从以下组合中选择的：苜蓿种子、苹果籽、拟南芥种子、香蕉种子、大麦种子、豆种子、茎椰菜籽、蓖麻豆种子、柑桔种子、三叶草籽、椰子种子、咖啡豆种子、玉米种子、棉籽、黄瓜籽、花旗松籽、桉树籽、火炬松籽、亚麻子种子、西瓜籽、燕麦种子、油橄榄种子、棕榈树种子、豌豆种子、花生种子、胡椒种子、杨木种子、放射松籽、油菜子种子、水稻种子、裸麦种子、高粱种子、南部松籽、大豆种子、草莓种子、甜菜籽、甘蔗种子、向日葵籽、枫香种子、茶籽、烟草种子、西红柿籽、草皮和小麦种子。在一个更优选的实施例中，种子是从以下组合中选择的：棉籽、拟南芥种子、玉米种子、大豆种子、油菜籽种子、水稻种子和小麦种子。在一个更更优选的实施例中，种子是油菜籽种子。在另一个更更优选的实施例中，种子是拟南芥种子。在另一个更更优选的实施例中，种子是大豆种子。在另一个更更优选的实施例中，种子是玉米种子
而且，上述这些种子的任一部分都能够被利用。例如，为了分析目的，任何上述种子都能够被细分。例如，将一个种子分开，从而使之等分成胚芽和胚乳，以便进行平行实验和种植两个半体。种子还可按组织类型来分割。在一个优选实施例中，样品可包括已经与胚芽组织机械分开的胚乳，以便为了得到含油量而利用本发明的方法分析胚芽或胚乳。
其它植物组织或农业材料(不限于此)可取代种子作为样品。此处所用的植物组织包括但不限于诸如叶、花、根、花瓣的植物的任何部分。此处所用的农业材料包括但不限于诸如种子的植物组织，然而也包括但不限于基于诸如非有机物材料的非植物或基于出现在农业领域中的物质的非植物。霉菌样品就是农业材料的一个例子。
利用本发明的方法可使用单个种子或成批种子。一批种子可具有大于一的任何种子数目。此处所用的一批中的“成员”是指该批内的任何单个种子。由数目限定一批种子。在一个实施例中，一批种子多于10,000、5,000、2,500、1,000、100、20、10、5、4或3个种子。在另一实施例中一批种子的数目在5,000-10,000个种子之间、1,000-5,000个种子之间、100-1,000个种子之间、10-100个种子之间、10-20个种子之间、5-10个种子之间、1-5个种子之间、1-4个种子之间以及1-3个种子之间。在另一实施例中，可根据来源将种子分成批，例如由来源于单个穗、单个植物或单个植物杂交的种子。
在一个实施例中，一个来源的种子被放在一起分析。在另一实施例中，一个来源可以是提供具有相似遗传背景的种子的任何来源，例如一个玉米穗、单个植物或单交植物。如果一个种子或一批种子被本发明的方法整个消耗，那么具有相同遗传背景的种子可用来增殖被分析的种子中所发现的所需性状。
此处所用的与第一种子具有相似遗传背景的种子，是指共有至少25％、更优选的是至少50％、更更优选的是75％或100％第一种子的遗传背景的种子。例如，两个作物之间的杂交产物可将50％的进行杂交的每一亲本的遗传背景分配到杂交后代中。
样品的质量可以是产生可测定结果的任何质量。在一优选实施例中，样品质量少于1,000克，更优选的是少于500、100、50、25、10、5和1克。在另一优选实施例中，样品是一个种子。
为了测定样品的含油量，将油从样品中萃取出来。可利用适当的溶剂对样品进行萃取。溶剂可以是能够将油从样品中萃取出来而不会将不要的杂质从样品中萃取出来的任何溶剂。在一个优选实施例中，该溶剂是任何非极性溶剂。在另一优选实施例中，溶剂是从以下组合中选择的：己烷、癸烷、石油醚、乙醇或乙腈。在一优选实施例中，该溶剂包括异丙醇。在一更优选实施例中，该溶剂包括己烷。
所用的溶剂的量取决于被分析的样品的量。“足以萃取检测量的油的溶剂体积”这一点在本技术领域内是公知的。在一优选实施例中，使用足够的溶剂将所有有用的油从样品中萃取出来。样品中有用的油可以是样品中的总油，或者少于总油量的任何量。在另一实施例中，每毫克被分析样品使用0.1-100毫升溶剂，优选的是每毫克被分析样品使用0.2-50毫升溶剂，更优选的是每毫克被分析样品使用0.25-10毫升溶剂，特别优选的是每毫克被分析样品使用0.5-3毫升溶剂。
此处所用的从样品中“萃取油”是指使样品与溶剂接触，以便将油从样品中转移到溶剂中。在萃取过程中，以任何能够将检测量的油从样品转移到溶剂中的方式使样品暴露到溶剂中。例如可以完整的状态将样品加入到适当体积的溶剂中。然后将油从完整的样品中抽到溶剂中。在一实施例中，使油以溶液的状态保持在溶剂中。
为了加大油的转移速度或者萃取中被转移的油量，可使样品破裂。此处所用的“破裂”样品是指物理改变样品以便增加暴露到溶剂中的样品的表面积。其中可用任何适当的装置，包括研磨、磨削、压碎、切割和粉磨装置进行破裂。Tecator Cyclotec 1093yp研磨机(Fos Tecator，P.O.Box 70，S-26321 Hoeganaes，Sweden)是商业上可购得的研磨装置的一个例子。
为了加大油的转移速度或者萃取中被转移的油量，可搅拌所得到的样品与溶剂的混合物。此处所用的“搅拌”溶剂和样品是指利用任何技术来增加溶剂和样品之间的物理作用。例如可用振动器、搅拌器、回转轮和摇动器来进行溶剂和样品的搅拌。搅拌装置的一个例子是Glas-Col回转轮(Glas-Col Apparatus Co，711 Hulman Street，P O Box2128，TerreHaute，IN47802-0128 USA)。除此之外，可升高溶剂和样品的温度，以便改善油的转移速度或被转移的油的量。
样品破裂和搅拌的量取决于预期的分析结果。在一些例子中，需要比较两个或多个样品的相对含油量。在这些例子中，无需将总的油量从样品中提取出来。取而代之的是，可将部分总的油量从每个样品中提取出来并比较该量，以便测定样品的相对含油量。在一个实施例中，为了测定相对含油量，可使样品的破裂和搅拌最小化。例如，可将多个样品置于溶剂中，而无需先破裂样品；然后再进行搅拌。进行离心和蒸发光散射检测之后，就可确定样品的相对含油量。
在另一实施例中，通过破裂样品并在溶剂中搅拌样品以便将所有油的大部分从样品中转移到溶剂中，可得到总的含油量的定量评估结果。样品需要破裂和搅拌到何种程度，才能将全部油量释放出来，这取决于被分析的样品类型并且在本技术领域内是公知的。
在一个优选实施例中，在样品研磨机中将样品磨0.1-5分钟，更优选的是0.5-3分钟。在另一实施例中，将样品搅拌0.5-20分钟，更优选的是1-15分钟，更更优选的是3-8分钟。
萃取之后，将溶剂和在溶剂中以溶液状态存在的萃取油从剩余样品中分离出来，以便改善由溶剂和萃取油构成的组合物的均匀性。如果所得到的溶剂包括一定量的不会明显影响以后步骤中油的检测的非油杂质，则可使用任何用于将固体与溶液分离的装置和方法。合适的离心机的一个例子是Fisher Model 235B Micro-Centrifuge(Fisher Scientific，4500 Tumberry Dr.，Hanover Park，IL60103)。此处所用的使溶剂与种子“分离”是指从剩余样品中除去含有萃取油的溶剂。例如可利用任何常规技术，包括过滤、沉积和离心来进行分离。在一个优选实施例中，在萃取之后使溶剂和样品固体进行离心。离心使固体沉积并形成片状，而溶剂以上清液的形式被从中分离出来。然后将上清液从片中虹吸出来，从而完成了分离过程。在一个优选实施例中，使样品和溶剂离心0.1-5分钟，更优选的是0.5-3分钟，更更优选的是0.75-2分钟。
将油从溶剂中萃取出来之后，可利用蒸发光散射检测方法测定溶剂中的含油量。任何能够提供气流的装置都可与能够产生光的光源及能够检测反射光的光检测器结合使用，其中溶剂可在气流中蒸发并在溶剂蒸气中形成油粒，而油粒可反射所产生的光。
此处所用的“蒸发溶剂”是指使溶剂和油溶液中的溶剂从液相转化成气相，而同时使油保持在液相中。溶剂的蒸发导致游离的油粒或油滴的形成，然后为了测定油的质量，可使油粒或油滴通过光源和光检测器。可在任何能够提供气流的装置中完成溶剂的蒸发，而溶剂在气流中被蒸发。此处所用的“气流”是指溶剂可在其中被蒸发的连续气体流。气流中所用的气体可以是任何溶剂能够在其中被蒸发的气体。在一个实施例中，该气体是惰性或稀有气体。在另一实施例中，气体是从以下组合中选择的：氮气、惰性或稀有气体、二氧化碳以及这些气体的混合物。在另一优选实施例中，气流中所用的气体包括氮气。在一个又一优选实施例中，所用气体包括至少99％纯度的氮气。
能够提供溶剂可在其中蒸发的气流的装置是任何用于蒸发光散射检测的常规装置。在一实施例中，该装置是一个管，该管在一端粘结到一个用于以可控速度提供溶剂的不同装置上。正如本技术领域所公知的，这种管可是一种“漂移”管。该管可具有任何能使溶剂蒸发的几何形状，而优选的是近似圆柱的几何形状。在管的一端，提供了用于以可控速度将溶剂引入管内的装置。
气流的流速可是任何足以使溶剂在气流中蒸发的速度。气流的流速取决于所用的溶剂和气体的种类、每一种的相对量、每一种的温度以及二者的接触时间。在一优选实施例中，管内气体的流速在0.5-20升/分钟，更优选的是在1-10升/分钟，更更优选的是在1.5-5升/分钟。在一优选实施例中，溶剂以0.1-10毫升/分钟的速度被引入气流中，更优选的是0.2-5毫升/分钟，更更优选的是0.3-5毫升/分钟。在一优选实施例中，溶剂的温度在20-100℃之间，更优选的是在30-75℃之间，更更优选的是在30-50℃之间。在一优选实施例中，将管保持在20-200℃之间，更优选的是保持在50-150℃之间，更更优选的是保持在80-120℃之间。
可用任何方式和任何以可控速度引入溶剂的装置将溶剂引入到能够提供气流的装置中，而溶剂可在气流中蒸发。按时传输恒定体积溶剂的装置包括任何以可控速度引入溶剂的装置。例如，该装置可以是具有压力调节器的液泵。以可控速度引入溶剂的装置连接到能够提供气流的装置上，而溶剂在气流中以任何可分配溶剂的方式被蒸发。在一实施例中，能够提供气流的装置包括喷雾器，而溶剂可在气流中蒸发，该喷雾器用于混合气体和溶剂并以分散喷雾的形式将得到的混合物注入到装置中。在该实施例中，利用以可控速度引入溶剂的装置将溶剂注入到喷雾器中，然后溶剂与气流混合并被注入到能够提供气流的装置中，而溶剂可在气流中蒸发。当气流和溶剂通过该装置时，溶剂被蒸发掉，而将分散的油粒留在气流中。然后油粒通过光线并形成可检测的反射光。在该实施例中，被引入到能够提供气流的装置中的溶剂将包括通常均一浓度的油，而溶剂在气流中可蒸发，并且由光检测器产生的最终信号从零读数改变到最大读数，然后又按时返回到零读数。
在另一实施例中，将连续体积的第二溶剂提供给能够提供气流的装置，而溶剂在气流中可蒸发。在该实施例中，含有油的溶剂被引入到第二溶剂中，而第二溶剂正恒定地被提供着。以这种方式，由光检测器产生的信号强度更逐渐地改变并准确地制成图，而含油量被表示成峰。此处所描述的所有组分可用于该实施例中的不同组分。
除此之外，常规的高效液相色谱(HPLC)装置可用作能够调节流体体积或压力的装置。在该实施例中，HPLC装置的流动相是第二溶剂，其包括但不限于此处所提到的任何溶剂，它可与含有被萃取的油的溶剂相同或不同。在一优选实施例中，第二溶剂包括异丙醇和己烷。在另一优选实施例中，第二溶剂包括10％的异丙醇和90％的己烷。可使用任何能够将溶剂供给可提供气流的装置的HPLC仪，而溶剂可在气流中蒸发。合适的HPLC仪的例子包括具有Micra NPS，33×4.6mm，1.5μplus Guard柱的Hewlett-Packard 1090。在该实施例中，可连续地提供第二溶剂
在将含有萃取油的溶剂加入到第二溶剂中之前，光检测器没有检测到任何反射光，这是因为第二溶剂在到达光线之前已经蒸发了。然后含有被萃取的油的溶剂被加入到第二溶剂流中，并且既可在HPLC柱中运行，也可直接引入到能够提供气流的装置中，而溶剂在气流中可蒸发。在另一实施例中，含有萃取油的溶剂在到达能够提供气流的装置之前分散到第二溶剂中，而溶剂可在气流中蒸发。
通过引入到能够提供气流(溶剂可在气流中蒸发)的装置中，两种溶剂都可蒸发掉，并且油在气流中朝向光和光检测器运行。由于含有萃取油的溶剂被分散到第二溶剂中，因此第二检测器发出的信号强度从被蒸发的第二溶剂的零基线增加到含油量的峰处，然后当油粒完全通过光检测器时，其又回到被蒸发的第二溶剂的零基线处。
HPLC用作以可控速度引入溶剂的易得的装置，并且此处不用于分离流动溶剂相中的组分。对于具有连续供给的第二溶剂的实施例，包括使用HPLC仪的实施例，流速和温度的优选值包括但不限于只用一种溶剂的实施例中所述的那些值。在一个优选实施例中，加入到第二溶剂的连续液流中的含有萃取油的溶剂体积在0.5-50ml之间，更优选的是在1-25ml之间，更更优选的是在1-10ml之间。虽然是将全部具有萃取油的溶剂样品加入到第二溶剂中，但是也可加入任何一部分具有萃取油的溶剂样品，以便产生与最初加入的具有萃取油的溶剂的一部分成比例的结果
可用光和光检测器测定溶剂的含油量。光可以是任何能够被油粒反射的光。任何产生这种光的光源都可用作该光源。潜在的光源包括激光和平行激光。在一个优选实施例中，光源是7毫瓦、670毫微米的激光二极管。光源设置得使其可将光线导入气流中。此处所用的“将光线导入气流”是指提供光源以便使从光源发射出的光线传入气流中。当油粒经过光线时，光线被反射。此处所用的“反射光”是指任何撞击油粒并重新指向光检测器的光线。
光检测器可以是任何能够检测光并输出与被检测的光量有关的信号的装置。在一个优选实施例中，被检测的光是反射光。此处所用的“检测反射光”是指产生响应以下光线的信号：该光线已经由光源产生，被萃取油反射并撞击光检测器。合适的光检测器包括但不限于硅光电二极管、光电倍增管和光子计数器。在一个优选实施例中，硅光电二极管的光检测器被用作光源。该实施例中的光检测器输出与撞击检测器的反射光量成比例的信号。光检测器最好设置在相对于光路的角度上。在一个实施例中，光线与光检测器之间的角度在45-135°之间，并且角的顶点在气流的长轴的中心，角的每条线都在同一平面内并垂直于气流的长轴。光源和光检测器与气流之间可以相距任何距离，只要可形成足够的反射光并足以检测该反射光即可。
为了使来自光检测器的信号与油量相关，利用本发明的方法，用溶剂中已知量的油可进行校准。此处所用的“基于反射光测定含油量”是指利用含油量和反射光的已知校准值来测定含油量。任何体积的油都可用来校准此处所述的装置，并且在一个优选实施例中，利用体积近似于样品的预测含油量的油来进行校准。可利用已知油浓度例如0.1-3.5mg/ml的光检测器信号来制作一个模型，用于使实际的油水平与含油量未知的样品所产生的光检测器信号相关。
光检测器产生的信号被发送到能够储存并显示信号数据的装置中。在一个实施例中，用色谱仪绘出反射光量与时间的图形。在另一实施例中，信号数据可被发送到数据储存装置、计算机或监测器中。一旦产生了反射光与时间的图形，就可利用标准计算来测定由图曲线上的峰面积所表示的含油量。
本发明的方法理想的是适用于根据含油量变通量地筛分种子。这些方法的快速萃取时间适用于利用微滴定板的自动化系统。在一优选实施例中，样品中含油量的萃取和测定时间总计要少于10分钟，更优选的是少于8分钟，更更优选的是少于6.5分钟。在另一优选实施例中，测定样品的相对含油量并且含油量的萃取和测定是在少于5分钟的时间内进行的，优选的是少于3分钟，更更优选的是少于1.5分钟。
本方法的方法可用于育种方案，以便选择具有所需性状的植物或种子。一方面，本发明提供了一种用于选择具有增高的含油量的种子的方法，包括：(1)利用一种溶剂将油从种子中萃取出来；(2)在气流中将溶剂蒸发掉，以形成油粒；(3)将光引入到气流和油粒中，借此形成反射光；(4)检测反射光；(5)根据该反射光测定含油量；以及(6)根据该含油量选择具有类似遗传背景的种子。另一方面，本发明提供了一种将一种性状渐渗杂交到植物中的方法，该方法包括：(1)利用一种溶剂将油从种子中萃取出来；(2)在气流中将溶剂蒸发掉，以形成油粒；(3)将光引入到气流和油粒中，借此形成反射光；(4)检测反射光；(5)根据该反射光测定含油量；(6)根据该含油量选择具有类似遗传背景的种子；(7)由该相关的种子生长出能育植物；以及(8)将该能育植物用作母系或用作父系与第二种植物杂交。
本发明的渐进杂交和选择方法可与任何育种方案一起结合使用，并且可用于选择单代或多代。育种方法的选择取决于植物生殖的模式、一个或多个所改进性状的遗传力以及商业上所用的栽培品种类型(例如F1杂交栽培品种、纯系栽培品种等)。以下列举出本发明所选择的植物的育种方法(不局限于此)。利用有助于选择任何杂交后代的标志物改进育种方案。而且可理解的是，在育种方案中可利用任何商业上和非商业的栽培品种。通常诸如以下因素将决定选择结果：出芽活力、营养体活力、抗逆性、抗病能力、分枝、开花、结实、种子尺寸、种子密度、林分能力(standability)和脱粒率等。
对于高遗传性状，选择在一个部位评估的优质单个植物是有效的，反之，对于低遗传力性状，选择应该基于由对相关的植物系重复评估所得到的平均值。一般使用的选择方法包括纯种选择、改良的纯种选择、群选和轮回选择。在一个优选实施例中，进行了逆向杂交或轮回育种方案。
遗传的复杂性影响育种方法的选择。逆向杂交育种可用于将一个或一些高遗传性状的有利基因传给预期的栽培品种。该方法已经广泛地被用于繁殖抗病的栽培品种。利用不同的现行选择技术，可定量改进由许多基因控制的遗传性状。在自花授粉作物中轮回选择的利用取决于授粉的容易性、由每次授粉成功杂交的频率以及由每个成功杂交所得到的杂交产物的数目。
可试验育种品系并与代表两代或多代商业目标面积的环境中的合适标准进行比较。最佳品系是新的候选商业栽培品种；而那些在性状上有缺陷的品种可用作亲本，来为其它选择产生新的种群。
一个鉴定优质植物的方法是观察其相对于其它试验性植物和广泛生长的标准栽培品种的性能。如果单一观察得不到结论，则重复观察可较佳地评估其遗传价值。可选择种系并杂交两或多个亲本系，随后重复自花授粉并选择，从而产生许多新的基因组合体。
新的大豆栽培品种的开发导致大豆品种的开发和选择、这些品种的杂交和优质杂交后代的选择。通过所选择的雌雄亲代之间的人工杂交或利用雄性不育系统可产生杂交种子。杂交用于选择某一遗传性状例如豆荚颜色、花的颜色、种子收成、绒毛颜色或除莠剂抗性，而这些性状都显示出种子确实是杂交的。有关亲本系的其它数据以及杂交表型会影响育种者决定是否继续特定的杂交。
利用谱系育种和反复选择育种方法可从繁殖种群中开发栽培品种。育种方案将来自两个或多个栽培品种或各种广泛来源的理想性状结合到育种库中，而通过自花授粉和选择所需表型可从育种库中开发栽培品种。可评估新的栽培品种，以测定哪些具有商业潜力。
谱系育种一般可用于改进自花授粉作物。拥有受欢迎的互补性状的两个亲代进行杂交，从而产生F1。通过一个或几个F1的自花授粉可产生F2族系。选择最佳族系中的最佳单体。在F4代开始族系的重复试验，以改进选择低遗传力性状的效率。在近亲繁殖(即F6和F7)的晚期阶段，试验最佳品系或表型相似的品系是否可作为新的栽培品种。
业已利用逆向杂交育种，将简单遗传的基因、高度遗传性状传给预期的纯合栽培品种或近交系，从而产生回交亲本。待传送的性状源被称作供体亲本。期望最后得到的植物具有回交亲本(例如栽培品种)的属性和来自供体亲本的理想性状。最初杂交之后，选择拥有供体亲本表型的单体并重复杂交(逆向杂交)到回交亲本上。预期所得到的亲本具有回交亲本(例如栽培品种)的属性和来自供体亲本的理想性状。
单种遗传过程是指种植分离的种群，然后每一植物收获一个种子样品，并且利用这一个种子样品种植第二代。当种群已经从F2进化到近亲繁殖的所需水平时，衍生出品系的这些植物将各自追溯至不同的F2单体。种群中的植物数目每一代都下降，这是因为一些种子不发芽或者一些植物产生至少一个种子。其结果是，当世代进化完成时并不是所有最初在种群中取样的F2植物都将由后代代表。
在多种子过程中，大豆育种家一般从一个种群的每一植物上收获一或多个豆荚并将它们一起脱粒，从而形成一堆豆粒。这堆豆粒的一部分可用于种植第二代，而一部分可放置储存起来。该过程业已被称作改良的单种遗传或豆荚堆技术。
多种子过程已经被用于节省收获时的劳动力。用机器脱豆荚比单种过程中用手一个一个地剥出种子要快得多。多种子过程还使得近亲繁殖的每一代种植相同数目的一个种群的种子成为可能。
通常对用于不同性状和作物的其它育种方法的描述可在几本参考书之一(例如Fehr，Principles of Cultivar Development Vol.1，pp.2-3(1987))中看到，该书在此全部作为本文的参考文献。
图1提供了能够完成本发明方法的一个系统的一个实施例，该系统一般表示为10。用于以可控速度引入溶剂的装置12与第二溶剂源14连接。装置12以可控速度将第二溶剂泵压到能够提供气流的装置16中，而溶剂可在气流中蒸发，此时装置16中包括喷雾器18和热飘管20。气源22与喷雾器18连接。第二溶剂和气体在喷雾器18内混合，从而导致在飘管20中形成溶剂滴24的分散流。光源26和光检测器28的设置使其在一个垂直于飘管20的长轴30的平面上成θ角。在该例中，θ角是90°。光检测器28输出与撞击检测器28的反射光量成比例的信号32。
为了将具有萃取油的溶剂引入到第二溶剂流中，孔34置于输入管36内或装置12内。最后，光检测器28可连接色谱仪38，以便图示显示分析结果。
例1
可用已知浓度为0.1-3.5mg油/ml溶剂的大豆油校准检测器。校准结果如图2所示。图2是色谱峰面积(Y轴)-溶剂中含有的萃取油的量(X轴)的曲线。用Tecator Cyclotec 1093样品研磨机(Fos Tecator，P.O.Box 70，S-26321 Hoeganaes，Sweden)压碎大豆样品。将20mg压碎的种子加入到微离心管中。将1ml己烷加入到管中，在室温下在转轮上将管搅拌5分钟。然后使该管在微离心机上离心5分钟。将上清液转移到HPLC自动取样管形瓶内并注入到HPLC仪中。加入5ml含有萃取油的己烷。HPLC仪是具有Micra NPS，33×4.6mm，1.5μplus Guard柱的Hewlett-Packard 1090。第二溶剂是10％/90％的异丙醇/己烷，流速是0.5ml/分钟，柱温是40℃，运行时间为8分钟。在出口温度为55℃、衰减为1的条件下，在115℃的Varex蒸发光散射检测器中喷溶剂。由该过程产生的色谱图如图3所示。在图3中，Y轴表示毫吸收度单位，这是与经过光检测器的油质量成比例的反射光强度单位。X轴表示时间(分钟)。正如在图3中所看到的，从零时间处获得反射光的基线。从零时间一直到0.5分钟的运行过程中，只有第二溶剂经过光检测器。恰恰在0.5分钟之后，萃取油开始经过光检测器。萃取油全部经过光检测器可产生0.8分钟的运行脉冲标记。中心在0.594的峰面积与经过光检测器的油质量成比例。所计算的峰曲线下的面积可在图2所示的校准图上就位，以便测定经过光检测器的油质量。
例2
图4-6示出了本发明的含油量(光散射或LS)与加速溶剂萃取法(ASE)这一常规技术的比较结果。LS的含油量测定条件与例1相同，而利用常规操作进行ASE。图4示出了利用LS和ASE测定的油的百分含量，已经利用每种方法对12个不同样品进行测定得到的含油量之比(LS/ASE)。如图4所示，含油量之比明显地在0.80-0.90之间。图5示出了10个高粱样品的相同的含油量之比。而且，含油量之比在一个较窄的范围内，即明显地在0.60-0.65之间。图6示出了玉米的相同的含油量之比。在此情况中，含油量之比明显地在0.7-0.8之间。
例3
图7证实了本发明方法的一个实施例的重复性。如图7所示，10个玉米样品在10个相同运行过程中测定的含油量范围在2.75-3.25油的百分含量之间。样品的含油量测定与例1相同。
例4
图8三个分离的运行过程的重叠色谱图。Y轴和X轴分别是毫吸收度单位和时间。所显示的三个峰代表一个、两个和三个拟南芥种子的运行过程所产生的峰。这三个样品的每一个都用250ml己烷萃取。第二溶剂是5/95的异丙醇/己烷的混合物，并且溶剂以1.0ml/分钟的速度分散在飘管中。另外，分析条件如以上的例2所述。这三个重叠的峰显示了本发明方法的异常灵敏性和较低的检测水平，正如在图中所看到的，所包括的每个拟南芥种子的峰面积都相等地增加。
以上发明提供了比常规方法具有较高灵敏度和较低检测极限的测定样品的含油量的方法，并且该方法可用于自动化过程。利用容易掌握的装置可对各种种子、植物组织和农业材料快速进行这些方法。而且，不象紫外检测技术，本发明的方法对质量是灵敏的，因此可测定油的绝对含量。
上述描述、附图和例子只是为了说明能够具备本发明的目的、性状和优点的实施例。但是不能认为本发明就局限于所示的这些实施例上。

Claims (45)

1.一种测定种子含油量的方法，包括以下步骤：
利用一种溶剂将油从所述种子中萃取出来；
在气流中蒸发所述溶剂以形成油粒；
将光引入到所述气流和所述油粒中，借此形成反射光；
检测所述反射光；以及
根据所述反射光测定所述含油量。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于所述种子的质量少于100mg。
3.如权利要求1所述的方法，其特征在于所述种子的质量少于大约50mg。
4.如权利要求1所述的方法，其特征在于所述种子的质量少于大约25mg。
5.如权利要求1所述的方法，其特征在于所述溶剂包括一有机溶剂。
6.如权利要求1所述的方法，其特征在于所述溶剂包括一非极性溶剂。
7.如权利要求1所述的方法，其特征在于所述溶剂是从以下组合中选择的：己烷、石油醚、乙醇、癸烷和乙腈。
8.如权利要求1所述的方法，其特征在于使用0.5-50mL的所述溶剂
9.如权利要求1所述的方法，其特征在于使用1-3mL的所述溶剂。
10.如权利要求1所述的方法，其特征在于所述蒸发是在蒸发光散射检测器中进行的。
11.如权利要求1所述的方法，其特征在于所述气流包括氮气。
12.如权利要求1所述的方法，其特征在于将所述溶剂以0.3-5ml/分钟的速度引入到所述气流中。
13.如权利要求1所述的方法，其特征在于所述光线是激光。
14.如权利要求1所述的方法，其特征在于利用硅光电二极管来完成所述检测所述反射光的步骤。
15.如权利要求1所述的方法，其特征在于所述气流被加热。
16.如权利要求1所述的方法，其特征在于还包括在所述萃取之后，将所述种子与所述溶剂分离开。
17.如权利要求16所述的方法，其特征在于所述分离包括离心。
18.如权利要求1所述的方法，其特征在于还包括在所述蒸发之前将所述溶剂引入到第二溶剂中。
19.如权利要求1所述的方法，其特征在于所述方法是在少于6.5分钟的时间内完成的。
20.如权利要求1所述的方法，其特征在于所述方法是在少于1.5分钟的时间内完成的。
21.如权利要求1所述的方法，其特征在于所述种子是玉米。
22.如权利要求1所述的方法，其特征在于所述种子是大豆。
23.如权利要求1所述的方法，其特征在于所述种子是油菜籽。
24.一种测定种子含油量的方法，包括以下步骤：
利用一种溶剂将油从种子中萃取出来；
使所述溶剂与所述种子分离开；
在气流中蒸发所述溶剂以形成油粒；
将光引入到所述气流和所述油粒中，借此形成反射光；
检测所述反射光；以及
根据所述反射光测定所述含油量。
25.如权利要求24所述的方法，其特征在于还包括在所述蒸发之前将所述溶剂引入到第二溶剂中。
26.如权利要求24所述的方法，其特征在于所述分离包括离心。
27.一种测定种子含油量的方法，包括以下步骤：
破裂所述种子以产生磨碎的种子；
利用一种溶剂将油从所述磨碎的种子中萃取出来；
在气流中蒸发所述溶剂以形成油粒；
将光引入到所述气流和所述油粒中，借此形成反射光；
检测所述反射光；
根据所述反射光测定所述含油量。
28.如权利要求27所述的方法，其特征在于还包括在所述蒸发之前将所述溶剂引入到第二溶剂中。
29.如权利要求27所述的方法，其特征在于所述破裂包括研磨。
30.一种测定农业材料中含油量的方法，包括以下步骤：
利用一种溶剂将油从所述材料中萃取出来；
在气流中蒸发所述溶剂以形成油粒；
将光引入到所述气流和所述油粒中，借此形成反射光；
检测所述反射光；以及
根据所述反射光测定所述含油量。
31.一种测定一批种子样品中含油量的方法，包括以下步骤：
利用一种溶剂将油从该批种子样品中萃取出来；
在气流中蒸发所述溶剂以形成油粒；
将光引入到所述气流和所述油粒中，借此形成反射光；
检测所述反射光；以及
根据所述反射光测定所述含油量。
32.一种用于选择含油量多的种子的方法，该方法包括：
利用一种溶剂将油从种子中萃取出来；
在气流中将所述溶剂蒸发掉，以形成油粒；
将光引入到所述气流和所述油粒中，借此形成反射光；
检测所述反射光；
根据所述反射光测定所述含油量；以及
根据所述含油量选择具有类似遗传背景的种子。
33.如权利要求32所述的方法，其特征在于还包括使具有类似遗传背景的所述种子发芽。
34.如权利要求32所述的方法，其特征在于还包括将所述相关的种子放置在一容器内。
35.一种将一种性状渐渗杂交到植物中的方法，该方法包括：
利用一种溶剂将油从种子中萃取出来；
在气流中将所述溶剂蒸发掉，以形成油粒；
将光引入到所述气流和所述油粒中，借此形成反射光；
检测所述反射光；
根据所述反射光测定所述含油量；
根据所述含油量选择具有类似遗传背景的种子；
由所述相关的种子生长出能育植物；以及
将所述能育植物用作母系或用作父系与第二植物杂交。
36.如权利要求35所述的方法，其特征在于还包括选择具有所述性状的所述杂交的后代。
37.如权利要求35所述的方法，其特征在于所述能育植物是所述杂交的所述父系。
38.如权利要求35所述的方法，其特征在于所述能育植物是所述杂交的所述母系。
39.如权利要求35所述的方法，其特征在于所述植物是从以下组合中选择的：苜蓿、苹果、香蕉、大麦、豆、茎椰菜、蓖麻豆、柑桔、三叶草、椰子、咖啡、玉米、棉花、黄瓜、花旗松、桉树、火炬松、亚麻子、西瓜、燕麦、油橄榄、棕榈树、豌豆、花生、胡椒、杨木、放射松、油菜、水稻、裸麦、高粱、南部松、大豆、草莓、甜菜、甘蔗、向日葵、枫香、茶、烟草、西红柿、草皮和小麦。
40.如权利要求35所述的方法，其特征在于所述植物是从以下组合中选择的：棉花、玉米、大豆、油菜、水稻和小麦。
41.如权利要求35所述的方法，其特征在于所述植物是玉米。
42.如权利要求35所述的方法，其特征在于所述植物是大豆。
43.如权利要求35所述的方法，其特征在于所述植物是油菜。
44.一种测定种子含油量的方法，该方法包括：
利用一种溶剂将油从种子中萃取出来；
在高压下使所述溶剂和所述油在一种能够蒸发所述溶剂的装置中雾化；
在所述装置中在气流中将所述溶剂蒸发掉，以形成油粒；
将光引入到所述气流和所述油粒中，借此形成反射光；
检测所述反射光；
根据所述反射光测定所述含油量。
45.一种用于选择含油量多的种子的方法，该方法包括：
a)利用一种溶剂将油从种子中萃取出来；
b)在气流中将所述溶剂蒸发掉，以形成油粒；
c)将光引入到所述气流和所述油粒中，借此形成反射光；
d)检测所述反射光；
e)根据所述反射光测定所述含油量；
f)一次或多次地重复步骤a)至e)；以及
g)根据所述含油量选择一个或多个种子。
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