CN107459545A - 红色糖多孢菌胞内辅酶a和有机酸的提取方法 - Google Patents

红色糖多孢菌胞内辅酶a和有机酸的提取方法 Download PDF

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Abstract

本发明涉及红色糖多孢菌胞内辅酶A和有机酸的提取方法。本发明人通过对多种胞内代谢物提取方法的比较和分析，揭示了一种适合于红色糖多孢菌胞内辅酶A类物质和有机酸提取的方法，从而可为从代谢角度分析红霉素的合成过程中的代谢特征提供基础。

Description

红色糖多孢菌胞内辅酶A和有机酸的提取方法
技术领域
本发明属于生物工程领域，更具体地，本发明涉及红色糖多孢菌胞内辅酶A和有机酸的高效提取方法。
背景技术
红色糖多孢菌是一种革兰氏阳性丝状细菌。它被用于生产一种广谱大环类抗生素，红霉素A。红霉素A的抗菌谱与青霉素类似，它可作为对青霉素过敏病人的备用药。除此以外，红霉素还能用于合成一系列的衍生药物，这些衍生药物具有抗寄生虫、抗肿瘤、免疫抑制、消炎和肠胃疾病治疗等功能。由于红霉素A具有很大的应用价值，人们对其生产菌株红色糖多孢菌进行了大量研究。
红霉素A分子由一个14元内酯环即6-脱氧红霉内酯B(dE-B)和2分子脱氧糖构成，其中6-脱氧红霉内酯B是由1分子丙酰辅酶A和6分子的甲基丙二酰辅酶A合成的。由于红霉素的合成与辅酶A类物质直接相关，胞内辅酶A的检测对于研究红霉素合成和调控机制具有重要意义。红霉素发酵过程是一个高耗氧的过程，而氧气的消耗在代谢过程中主要与TCA循环相关，通过对TCA循环过程中的代谢物即各种有机酸的分析和检测对于研究红霉素合成过程也具有重要意义。因此，对红色糖多孢菌胞内代谢物的分析具有重要的科学意义。
在过去的研究过程中，研究人员对于各种微生物的胞内代谢物的提取和测定进行了大量研究。Wentzel等人研究了天蓝色链霉菌在不同条件下胞内代谢物的浓度变化(Wentzel,A.等(2012)，Intracellular Metabolite Pool Changes in Response toNutrient Depletion Induced Metabolic Switching in Streptomycescoelicolor.Metabolites 2，178-194)；Villas-Boas等人对酿酒酵母胞内代谢物的分析测定进行了研究，找到了适合于酿酒酵母的胞内代谢物测定方法(Villas-Boas,S.G.等(2005)，Mass spectrometry in metabolome analysis.Mass spectrometry reviews 24,613-646)；Paczia等人对大肠杆菌和谷氨酸棒状杆菌等微生物的胞内代谢物进行测定，并比较了它们之间胞内代谢物浓度的差异(Paczia,N.等(2012)，Extensive exometabolomeanalysis reveals extended overflow metabolism in variousmicroorganisms.Microb Cell Fact 11)。通过对胞内代谢物的提取和分析，研究人员得到微生物代谢与产物合成之间的关系，从而为代谢改造和发酵优化等过程提供科学的指导依据。
虽然研究人员对于不同微生物的胞内代谢物提取和分析方法进行了研究，然而目前并没有对红色糖多孢菌胞内代谢物进行分析和研究的报道。同时，由于红色糖多孢菌属于放线菌，其细胞直径小，细胞壁相对较厚，胞内代谢物的提取比较困难，用于其它微生物胞内代谢物提取的方法并不能直接应用于红色糖多孢菌的胞内代谢物提取。
因此，本领域技术人员仍需探索对红色糖多孢菌胞内代谢物进行有效提取和分析的方法。
发明内容
本发明的目的在于提供红色糖多孢菌胞内辅酶A和有机酸的高效提取方法。
在本发明的第一方面，提供一种从红色糖多孢菌胞内提取辅酶A类物质的方法，所述方法包括：
(1)采用液氮灭活的方法对红色糖多孢菌培养物进行灭活，获得经处理的细胞样品；
(2)采用液氮研磨提取的方法对步骤(1)的经处理的细胞样品进行提取，获得含有辅酶A类物质的胞内提取物。
在一个优选例中，所述的辅酶A类物质包括：辅酶A(CoA)；乙酰辅酶A(AcCoA)；丙酰辅酶A(ProCoA)；丙二酰辅酶A(MalCoA)和/或琥珀酰辅酶A(SucCoA)。
在另一优选例中，步骤(1)中，所述的液氮灭活的方法包括：将红色糖多孢菌培养物加入到含有液氮的容器中，进行灭活。
在另一优选例中，在容器中，所述的红色糖多孢菌培养物与液氮按照体积比1:(1～5)存在；较佳地，按照体积比1:(2～4)存在。在此步骤中，液氮稍微多一些效果较为理想，但是超过1:4反而效果会降低，过多液氮使得红色糖多孢菌培养物与液氮之间形成界面，减弱了液氮迅速降温的效果。
在另一优选例中，步骤(2)中，所述的液氮研磨提取的方法包括：
(a)将细胞样品置于液氮预冷的研钵中，冻干；
(b)研钵中加入液氮，在存在液氮的情况下进行研磨；
(c)研磨完毕，向步骤(b)获得的样品中加入甲醇，转移至离心管中，振荡，离心，获取上清，其中含有辅酶A类物质。
在另一优选例中，步骤(b)中研钵中加入液氮的加入量为步骤(a)中初始的细胞样品体积的1～6倍；较佳地2～5倍；更佳地3～4倍。
在另一优选例中，冻干前，所述研钵以带小孔的保鲜膜覆盖。
在另一优选例中，步骤(a)中，冻干4～12小时；更佳地，冻干6～10小时。
在另一优选例中，步骤(a)中，冻干的温度为-60±5℃，压力10±2Pa。
在另一优选例中，步骤(b)中，低温下研磨；较佳地，所述的低温的温度约-200℃～-195℃。
在另一优选例中，步骤(c)中，所述的甲醇较佳地为50％甲醇。
在另一优选例中，步骤(c)中，在-5±1℃条件下，8000±1000rpm离心5±2min。
在另一优选例中，步骤(c)中，在获得上清后，还对该上清进行浓缩；较佳地，用旋蒸仪进行浓缩。
在另一优选例中，步骤(2)之后，还包括步骤：(3)从获得的含有辅酶A类物质的胞内提取物中，分离出辅酶A类物质。
在本发明的另一方面，提供一种从红色糖多孢菌胞内提取有机酸的方法，所述方法包括：
(i)采用液氮灭活的方法对红色糖多孢菌培养物进行灭活，获得经处理的细胞样品；
(ii)对步骤(i)获得的细胞样品进行洗涤，清除细胞外的有机酸，获得经洗涤的细胞样品；
(iii)采用沸乙醇提取法对步骤(ii)获得的经洗涤的细胞样品进行提取。
在一个优选例中，洗涤的次数是1～6次；较佳地为2～4次。
在另一优选例中，所述的有机酸包括：丙酮酸(PYR)，延胡索酸(FUM)，琥珀酸(SUC)，草酰乙酸(OAA)，苹果酸(MAL)，柠檬酸(CIT)和/或α-酮戊二酸(AKG)。
在另一优选例中，步骤(i)中，所述的液氮灭活的方法包括：将红色糖多孢菌培养物加入到含有液氮的容器中，进行灭活。
在另一优选例中，在容器中，所述的红色糖多孢菌培养物与液氮按照体积比1:(1～10)存在；较佳地，按照体积比1:(2～8)存在；更佳地，按照体积比1:(3～5)存在。
在另一优选例中，步骤(ii)中，所述的洗涤包括：采用0.9％NaCl水溶液试剂，洗涤1～5次；较佳地2～4次。
在另一优选例中，步骤(iii)中，所述的沸乙醇提取法包括：
(S1)使细胞样品悬浮于乙醇溶液中；
(S2)将步骤(S1)获得的样品放到沸水浴中加热；
(S3)将步骤(S2)加热完毕的样品冷却后，在0±2℃离心，获取上清，其中含有有机酸。
在另一优选例中，步骤(S1)中，所述的乙醇为70％乙醇。
在另一优选例中，步骤(S2)中，加热2～20分钟；更佳地为加热3～15分钟；如4、5、6、8、10分钟。
在另一优选例中，步骤(S3)中，离心时，在8000±2000rpm离心5±2min。
在另一优选例中，步骤(S3)中，还包括步骤：对该上清进行浓缩；较佳地，用旋蒸仪进行浓缩。
在另一优选例中，步骤(S3)之后，还包括步骤：(S4)从获得的含有辅酶A类物质的胞内提取物中，分离有机酸。
本发明的其它方面由于本文的公开内容，对本领域的技术人员而言是显而易见的。
附图说明
图1、红色糖多孢菌生长曲线。
图2、“液氮灭活+液氮研磨”，“液氮灭活+液氮冻融”，“液氮灭活+沸乙醇提取”，“冷乙醇灭活+液氮研磨”四种不同方法条件下测定出的胞内辅酶A类物质浓度比较。CoA：辅酶A；AcCoA：乙酰辅酶A；ProCoA：丙酰辅酶A；MalCoA：丙二酰辅酶A；SucCoA：琥珀酰辅酶A。
图3、冷甲醇灭活后上清中的不同辅酶A类物质含量。
图4、菌体洗涤过程中上清中有机酸含量。PYR，丙酮酸；FUM，延胡索酸；SUC，琥珀酸；OAA，草酰乙酸；MAL，苹果酸；AKG，α-酮戊二酸；CIT，柠檬酸。
图5、液氮灭活条件下不同方法提取得到的胞内有机酸浓度。
具体实施方式
红色糖多孢菌是一种革兰氏阳性丝状细菌。它被用于生产一种广谱大环类抗生素，红霉素A。红霉素A及其衍生物具有很大的应用价值，因此研究人员对于红色糖多孢菌进行了大量研究。红霉素合成的重要前体是丙酰辅酶A和甲基丙二酰辅酶A，这些物质在红霉素合成过程中起到重要作用；同时，红霉素合成是一个高耗氧的过程，而菌体的有氧呼吸与TCA循环是紧密相连的，因此对于TCA循环的有机酸的对红霉素的合成也起到了重要作用。然而，红色糖多孢菌的胞内代谢物的分析并未见现有技术报道。
本发明人经过深入的研究，通过对多种胞内代谢物提取方法的比较和分析，找到了适合于红色糖多孢菌胞内辅酶A类物质和有机酸提取的方法，从而可为从代谢角度分析红霉素的合成过程中的代谢特征提供基础。
如本发明所用，所述的“辅酶A类物质”包括但不限于：辅酶A(CoA)；乙酰辅酶A(AcCoA)；丙酰辅酶A(ProCoA)；丙二酰辅酶A(MalCoA)和/或琥珀酰辅酶A(SucCoA)。
如本发明所用，所述的“有机酸”包括但不限于：丙酮酸(PYR)，延胡索酸(FUM)，琥珀酸(SUC)，草酰乙酸(OAA)，苹果酸(MAL)，柠檬酸(CIT)和/或α-酮戊二酸(AKG)。
本发明人发现，红色糖多孢菌的胞内代谢物的获取中，灭活和提取两个步骤是较为关键的。
在灭活过程中，需要将有关代谢反应的酶的活性降低甚至完全失活，使得代谢物在提取过程中不会因为转化或者降解而受到损失，以保证测定结果能够体现菌体的真实代谢状态。目前，菌体灭活的方法有多种，例如冷甲醇灭活，液氮灭活，高氯酸灭活，强酸强碱灭活等。目前液氮灭活已有被应用于提取细胞内的大分子活性物质，例如蛋白质；而未见将液氮灭活的方法应用于提取小分子物质，例如用于提取本发明中涉及的有机酸或辅酶A类物质。
在菌体灭活后，需要将胞内代谢物提取出来，然后通过检测得到胞内代谢物的浓度等信息，只有将胞内代谢物尽可能多的提取出来才能通过测定这些代谢物了解菌体的代谢状态。菌种在胞内代谢物提取过程中采用的提取方法有多种，例如沸乙醇法、液氮冻融法，混合有机溶剂提取法，液氮研磨提取法，高压匀浆提取法，超声破碎提取法等。
提取辅酶A类物质的方法
本发明人在实验中发现，在相同的提取方法条件下，液氮灭活比冷甲醇灭活效果好。在同时采用液氮研磨作为提取方法的条件下，采用液氮灭活方法提取得到的胞内辅酶A的量比采用冷甲醇灭活得到的辅酶A的量要高。同时，本发明人发现，虽然采用冷甲醇灭活得到的乙酰辅酶A和丙酰辅酶A的含量比采用液氮灭活得到的乙酰辅酶A和丙酰辅酶A的量略高，然而采用冷甲醇灭活的方法后无法测定到丙二酰辅酶A和琥珀酰辅酶A。
在液氮灭活条件下，本发明人发现，采用液氮研磨和液氮冻融法来提取胞内辅酶A类物质都有不错的效果，而沸乙醇法提取出来的辅酶A类物质含量较低。其中，效果最好的是液氮研磨。进一步地，组合比较不同灭活和提取方法，本发明人发现，采用液氮灭活和液氮研磨的组合方式来提取胞内辅酶A类物质可以得到最好的效果，获得的提取产物中存在较多的胞内辅酶A类物质。
因此，本发明提供一种从红色糖多孢菌胞内提取辅酶A类物质的方法，所述方法包括：(1)采用液氮灭活的方法对红色糖多孢菌培养物进行灭活，获得经处理的细胞样品；(2)采用液氮研磨提取的方法对步骤(1)的经处理的细胞样品进行提取，获得含有辅酶A类物质的胞内提取物。
在一个优选实施方式中，步骤(1)中，所述的液氮灭活的方法包括：将红色糖多孢菌培养物加入到含有液氮的容器中，进行灭活。在所述容器中，红色糖多孢菌培养物与液氮以适当的量存在。例如，所述的红色糖多孢菌培养物与液氮按照体积比1:(1～5)存在；较佳地，按照体积比1:(2～4)存在。
在一个优选实施方式中，步骤(2)中，所述的液氮研磨提取的方法包括：(a)将细胞样品置于液氮预冷的研钵中，冻干；(b)研钵中加入液氮，在存在液氮的情况下进行研磨；(c)研磨完毕，向步骤(b)获得的样品中加入甲醇，转移至离心管中，振荡，离心，获取上清，其中含有辅酶A类物质。
在一个优选实施方式中，在步骤(a)中，冻干的实施时间可以是4～12小时；更佳地，可以是冻干6～10小时。冻干的温度可以是-60±5℃，压力可以10±2Pa。应理解，在所述数值范围以外，但也能实现冻干的其它数值也是可用的。
在一个优选实施方式中，在步骤(b)中，在进行研磨时，研钵中液氮的加入量为步骤(a)中初始的细胞样品体积的1～6倍；较佳地2～5倍；更佳地3～4倍。较佳地，在低温下进行研磨，温度约-200～-195℃。
在一个优选实施方式中，步骤(c)中，离心的条件是：-5±1℃条件下，8000±1000rpm离心5±2min。
在一个优选实施方式中，步骤(c)中，在获得上清后，还对该上清进行浓缩；较佳地，用旋蒸仪进行浓缩。
在一个优选实施方式中，步骤(2)之后，还包括步骤：(3)从获得的含有辅酶A类物质的胞内提取物中，分离出辅酶A类物质。可以采用本领域已知的辅酶A类物质的方法实现进一步的分离。
提取有机酸的方法
本发明人发现，红色糖多孢菌培养物中，由于有机酸同时存在于胞内和胞外，在提取过程中必须保证胞外有机酸被清洗干净，避免影响胞内测定结果。
本发明人比较液氮灭活和冷甲醇灭活两种灭活方法，可以观察到当采用冷甲醇灭活时，胞外有机酸的含量比液氮灭活测定出的胞外有机酸的浓度高，冷甲醇灭活可能会引起胞内有机酸的较多的泄露，为了避免胞外有机酸对于胞内有机酸测定的影响，对于菌体的灭活应选择采用液氮灭活的方式。
本发明人还对几种提取方法进行了比较，发现在采用沸乙醇法提取得到的胞内有机酸的量比采用液氮研磨和采用液氮冻融法提取出来的有机酸的量要多得多。胞内各种有机酸中，丙酮酸的浓度最高。采用液氮研磨或者液氮冻融的方法几乎无法提取出延胡索酸、琥珀酸、苹果酸、α-酮戊二酸和柠檬酸。
因此，本发明提供了一种从红色糖多孢菌胞内提取有机酸的方法，所述方法包括：(i)采用液氮灭活的方法对红色糖多孢菌培养物进行灭活，获得经处理的细胞样品；(ii)对步骤(i)获得的细胞样品进行洗涤，清除细胞外的有机酸，获得经洗涤的细胞样品；(iii)采用沸乙醇提取法对步骤(ii)获得的经洗涤的细胞样品进行提取。
在一个优选实施方式中，步骤(i)中，所述的液氮灭活的方法包括：将红色糖多孢菌培养物加入到含有液氮的容器中，进行灭活。所述容器中，红色糖多孢菌培养物与液氮以适当的量存在。例如，所述的红色糖多孢菌培养物与液氮按照体积比1:(1～10)存在；较佳地，按照体积比1:(2～8)存在；更佳地，按照体积比1:(3～5)存在。
在一个优选实施方式中，步骤(ii)中，所述的洗涤包括：采用0.9％NaCl水溶液试剂，洗涤1～5次；较佳地2～4次。洗涤的次数例如可以是1～6次；较佳地为2～4次。应理解，其它可以有效地去除掉胞外的有机酸的试剂也是可以应用于本发明的。
在一个优选实施方式中，步骤(iii)中，所述的沸乙醇提取法包括：(S1)使细胞样品悬浮于乙醇溶液中；(S2)将步骤(S1)获得的样品放到沸水浴中加热；(S3)将步骤(S2)加热完毕的样品冷却后，在0±2℃离心，获取上清，其中含有有机酸。
在一个优选实施方式中，步骤(S1)中，所述的乙醇为70％乙醇。可以采用振荡的方法将细胞样品进行悬浮。
在一个优选实施方式中，步骤(S2)中，加热2～20分钟；更佳地为加热3～15分钟；如4、5、6、8、10分钟。
在一个优选实施方式中，步骤(S3)中，离心时，在8000±2000rpm离心5±2min。
在一个优选实施方式中，步骤(S3)中，还包括步骤：对该上清进行浓缩；较佳地，用旋蒸仪进行浓缩。当然，其它可以实现有效浓缩的方法也可被应用于本发明中。
在一个优选实施方式中，步骤(S3)之后，还包括步骤：(S4)从获得的含有辅酶A类物质的胞内提取物中，分离有机酸。可以采用本领域已知的辅酶A类物质的方法实现进一步的分离。
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如J.萨姆布鲁克等编著，分子克隆实验指南，第三版，科学出版社，2002中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。
实施例1、菌体培养
1、菌种与培养
(1)菌种
红色糖多孢菌E3菌株(Saccharopolyspora erythraea E3)。保存方法：菌种置50％甘油中，-20℃保存。
(2)培养基
斜面培养基：
摇瓶培养基(g/L)
(3)培养条件
斜面培养
采用试管进行斜面培养。用竹签将甘油管中的孢子均匀涂抹在斜面培养基上，34℃培养10天。
摇瓶培养
取20ml无菌水倒入斜面试管中，用竹签将斜面上的孢子刮落，将悬浮液倒入含有5个小玻璃珠的250ml摇瓶中，然后用力震荡1min。取1ml孢子悬浮液加入到装有50ml摇瓶培养基的500ml摇瓶中。将摇瓶放入摇床中，220rpm，34℃，培养到72h(如图1所示，培养到72小时菌体浓度较高，而且菌体生长仍在对数期，胞内代谢物浓度较高)取样测定胞内代谢物。
(4)结果分析
在菌体生长的对数期菌体代谢活跃，胞内代谢物浓度较高，为了保证胞内代谢物提取的准确性，本发明人在菌体生长的对数期进行取样测定胞内代谢物的浓度。菌体生长曲线如图1所示，在72h菌体浓度较高，同时菌体生长依然维持在对数生长期，有利于胞内代谢物的提取与测定，因此胞内代谢物提取在菌体生长到72小时进行。
2、菌体干重测定
取5ml发酵液，4000rpm，离心5min。倒掉上清，加入5ml，1M HCl，震荡30s，重悬菌团，以除掉CaCO3。4000rpm离心5min，除去上清液。接着加入5ml去离子水，重悬菌丝团，并在4000rpm离心5min，以清洗菌丝团，重复清洗过程3遍，以除去菌丝团中附着的培养基成分。菌丝团清洗干净后，加入5ml去离子水，重悬菌丝团，并将悬浮液倒在事先称重并烘干的滤纸上，用抽滤瓶将滤纸上的悬浮液抽干。将滤纸放入80℃的烘箱中，烘24h至衡重。称取烘干后滤纸的质量，减去滤纸原始质量，即可计算出样品中的菌体干重。
实施例2、菌体灭活与胞内代谢物提取
通过菌体灭活和胞内提取物提取来从红色糖多孢菌胞内获得辅酶A类物质以及有机酸。
1、灭活方法
本发明人在研究中发现，从红色糖多孢菌胞内提取有机酸时，由于有机酸同时存在于红色糖多孢菌的胞内和胞外，灭活以后必须清洗菌体，除去胞外有机酸对胞内有机酸浓度测定的影响。辅酶A类物质只存在于细胞内，不存在于细胞外，提取过程中不必要除去培养基。因此在液氮灭活过程中，对于辅酶A类物质和有机酸类物质的提取采取了不同的操作方式。
液氮灭活：辅酶A类物质提取过程中菌体液氮灭活
从正在培养的摇瓶中直接取出5ml发酵液转移至装有20ml液氮的离心管中。将样品放入-80℃冰箱保存，备用。
液氮灭活：有机酸提取过程中菌体液氮灭活
从正在培养的摇瓶中直接取出5ml发酵液转移至装有20ml液氮的离心管中。将样品放入5℃冷水浴中，待样品融化后，在0℃条件下，4000rpm，离心5min。收集上清，放入-20℃冰箱备用(测定上清液中残留的有机酸含量)。连续清洗3次，除去菌丝团上附着的胞外有机酸，并将上清保留在-20℃下备用。菌丝沉淀放入-80℃保存。
冷甲醇灭活：辅酶A类物质提取过程中菌体冷甲醇灭活
从正在培养的摇瓶中直接取出5ml发酵液转移至装有45ml-27℃预冷的60％甲醇的离心管中。在-5℃条件下，4000rpm离心5min。收集上清放入-20℃冰箱保存，菌丝团放入-80℃冰箱保存备用。
冷甲醇灭活：有机酸类物质提取过程中冷甲醇灭活
从正在培养的摇瓶中直接取出5ml发酵液转移至装有45ml-27℃预冷的60％甲醇的离心管中。在-5℃条件下，4000rpm离心5min。收集上清放入-20℃冰箱保存，菌丝团放入-80℃冰箱保存备用。
灭活后洗涤
向样品中加入20ml 0.9％NaCl水溶液，重悬菌丝团，在-5℃条件下，4000rpm离心5min，除去上清。重复洗涤3次；最后除去上清，保留菌丝团。
2、提取方法
(1)液氮研磨
从-80℃冰箱中取出保存好的菌体样品5ml，转移到液氮预冷的研钵中。在研钵上套上保鲜膜，在保鲜膜上扎几个孔，并立即将研钵放入冻干机中。冻干机型号为LGJ-10D，冷阱温度设置为-60℃，压力10Pa左右，在冻干机中冻干8h，除去水分。从冻干机中取出样品，向研钵中加入20ml液氮，研磨5min，研磨过程中液氮完全挥发则继续补充液氮，保证整个研磨过程中样品一直处于低温状态(温度约-195℃)。研磨完毕向样品中加入5ml 50％甲醇，将样品转移至10ml离心管中，在振荡器上震荡30s，然后在-5℃条件下，8000rpm离心5min。上清转移到新离心管中，沉淀用5ml 50％甲醇再提取一次，并将上清与第一次提取的上清混合，用旋蒸仪浓缩至300μl，样品(含有辅酶A)保存在-80℃，待测。
(2)液氮冻融
从-80℃冰箱中取出保存好的菌体样品，向样品中加入10ml 50％甲醇，在振荡器上震荡30s，重悬菌体。离心管盖好盖子，然后放入液氮中浸泡，2min后，离心管中的菌悬液被冷冻成固体状态。将冷冻好的样品放入-27℃冷冻槽中，至样品融化，然后在振荡器上再次震荡30s。重复冻-融过程3次。在-5℃条件8000rpm离心5min，将上清液转移到新离心管中，用旋转蒸发仪浓缩至300μl左右，样品保存在-80℃，待测。
(3)沸乙醇提取
从-80℃冰箱中取出保存好的菌体样品(原始取样为5ml，离心除去上清后，剩下固体菌丝团约2ml)，向样品中加入20ml 70％乙醇，在震荡器上震荡30s，使菌体悬浮于乙醇溶液中。将样品放到沸水浴中加热5min，加热结束，让样品自然冷却。然后在0℃条件下，8000rpm离心5min。将上清转移到新的离心管中，用旋蒸仪浓缩至300μl，样品保存在-80℃，待测。
3、辅酶A类物质和有机酸的测定
辅酶A类物质和有机酸采用热电UPLC系统偶联三重四级杆质谱进行检测(UPLC型号为Thermal Ultimate 3000，质谱型号为Thermal TSQ QUANTUM ULTRA)。数据通过Xcaliber软件记录并处理。离子源采用阴离子模式工作，质谱采用选择反应模式(selectedreaction monitoring，SRM)。LC-MS/MS参数如下：capillary temperature 270℃，vaporizer temperature 200℃，sheath gas pressure 15Arb，aux gas pressure 10Arb，spray voltage 3000V(negative mode)。在测定前需要优化每个物质的质谱检测方法，以得到较强的信号。将单个标品溶解在50％乙腈溶液中，以5μL/min的进样速度进入质谱，然后对该物质的质谱测定参数进行优化，优化后得到的测定参数如表1所示。首先，本发明人得到每种代谢物的主要二级质谱测定过程中的碎片类型，然后对该检测物质的透镜电压(Tube lens)和碰撞能(Collision energy，CE)进行优化。辅酶A类物质采用C18柱(ACQUITYUPLC BEH C18，1.7μm，2.1×150mm)进行色谱分离。流动相A：5％乙腈水溶液含5mM DBAA；流动相B：84％乙腈含5mM DBAA。流速2μl/min。洗脱梯度：0～15min流动相B由10％梯度变化到22％，15～20min流动相B由22％梯度增加到40％，20～22min流动相B的梯度降低到10％；22～30min，流动相B的比例保持在10％，以平衡柱子。进样体积为2μL。
表1 有机酸和辅酶A类物质LC-MS/MS测定参数
简称：PYR，丙酮酸；FUM，延胡索酸；SUC，琥珀酸；OAA，草酰乙酸；MAL，苹果酸；CIT，柠檬酸；CoA，辅酶A；AcCoA，乙酰辅酶A；ProCoA，丙酰辅酶A；MalCoA，丙二酰辅酶A；SucCoA，琥珀酰辅酶A。AKG：α-酮戊二酸。
有机酸LC-MS/MS检测方法与辅酶A类物质检测方法基本相同。测定有机酸过程中，色谱分离的洗脱梯度有所不同。有机酸洗脱梯度：0～20min流动相B的比例由0％梯度增加到20％；20～22min，流动相B的比例由20％梯度降低到0％；22～27min，流动相B维持在0％。
实施例3、胞内代谢物提取方法比较
本发明人经比较后，着重考察了以下灭活方法：液氮灭活和冷甲醇灭活；同时，着重考察了以下几种提取方法：沸乙醇法、液氮冻融法和液氮研磨法，比较这些方法对于红色糖多孢菌胞内提取物的提取效果的优劣。
1、针对胞内辅酶类物质提取和测定的分析
本发明人针对液氮灭活+液氮冻融，液氮灭活+液氮研磨，冷甲醇灭活+液氮研磨，液氮灭活+沸乙醇提取这四种组合，对辅酶A类物质的提取方法的效果进行比较。测定结果如图2所示。
结合图2，本发明人发现，在相同的提取方法条件下，液氮灭活比冷甲醇灭活效果好。在同时采用液氮研磨作为提取方法的条件下，采用液氮灭活方法提取得到的胞内辅酶A的量比采用冷甲醇灭活得到的辅酶A的量要高。同时，本发明人发现，虽然采用冷甲醇灭活得到的乙酰辅酶A和丙酰辅酶A的含量比采用液氮灭活得到的乙酰辅酶A和丙酰辅酶A的量略高，但是采用冷甲醇灭活的方法后几乎无法测定到丙二酰辅酶A和琥珀酰辅酶A。
为了探索冷甲醇灭活后为何会有两种辅酶A类物质测定不出来，本发明人对冷甲醇灭活后过滤得到上清进行收集，并测定上清液中各种辅酶A的含量。如图3所示。
辅酶A类物质等大分子一般存在于胞内，在菌体细胞膜未被破坏条件下胞外一般不会含有大量辅酶A类物质。通过图3可以看到，经过冷甲醇灭活后，离心取得的上清液中含有各种辅酶A类物质，特别是丙二酰辅酶A和琥珀酰辅酶A，说明甲醇灭活后胞内辅酶A类物质存在大量的渗漏。而在液氮灭活后，本发明人直接将样品在冻干机中冻干，避免了辅酶A类物质的流失。因此，采用液氮灭活比冷甲醇灭活，更能减少胞内代谢物的流失。
在液氮灭活条件下，本发明人比较了几种提取方法的效果，发现采用液氮研磨和液氮冻融法来提取胞内辅酶A类物质都有不错的效果，而沸乙醇法提取出来的辅酶A类物质含量较低(图2，每个物质的第3根柱代表沸乙醇提取出的量)。在3种提取方法中，分别来看，效果最好的是液氮研磨。但是，组合比较不同灭活和提取方法，本发明人发现采用液氮灭活和液氮研磨的组合方式来提取胞内辅酶A类物质可以得到最好的效果，获得的提取产物中存在较多的胞内辅酶A类物质。
2、针对有机酸类物质提取和测定的分析
本发明人发现，红色糖多孢菌培养物中，由于有机酸同时存在于胞内和胞外，在提取过程中必须保证胞外有机酸被清洗干净，避免影响胞内测定结果。图4是样品在液氮灭活或冷乙醇后的清洗过程中胞外残余的有机酸含量，可见有机酸存在于胞外，可以通过清洗去除。
从图4中可以看出，无论是采取液氮灭活方式还是冷甲醇灭活的方式，经过3次洗涤后，胞外有机酸基本被清除干净，因此后续测定过程中得到胞内有机酸的浓度不会受到胞外物质的影响。比较两种灭活方法，可以观察到当采用冷甲醇灭活时，胞外有机酸的含量比液氮灭活测定出的胞外有机酸的浓度高，冷甲醇灭活可能会引起胞内有机酸的较多的泄露，为了避免胞外有机酸对于胞内有机酸测定的影响，对于菌体的灭活应选择采用液氮灭活的方式。
对于红色糖多孢菌胞内有机酸的测定方法，本发明人对几种提取方法进行了比较，结果如图5所示。从图5中可以看出，在采用沸乙醇法提取得到的胞内有机酸的量比采用液氮研磨和采用液氮冻融法提取出来的有机酸的量要多得多。胞内各种有机酸中，丙酮酸的浓度最高。采用液氮研磨或者液氮冻融的方法几乎无法提取出延胡索酸、琥珀酸、苹果酸、α-酮戊二酸和柠檬酸。三种提取方法提取出的草酰乙酸的含量都很低。
同时，本发明人也试验了在洗涤后，进行液氮研磨，之后再进行沸乙醇提取，然而本发明人很惊讶地发现，液氮研磨后再用沸乙醇处理后，菌体会变成凝胶状固体，无法提取内部代谢物。本发明人估计这可能是液氮研磨后胞内溢出的大量蛋白质在操作过程中发生了变性造成的。因此，在沸乙醇提取前进行液氮研磨并不合适。
因此，通过对不同提取方法的比较，选择液氮灭活和沸乙醇提取的方法来进行胞内有机酸的提取。
3、总结
综上，通过对不同灭活和提取方法比较，本发明人找到了提取红色糖多孢菌胞内辅酶A类物和有机酸的有效方法。采用液氮灭活和液氮研磨的方法可以高效地提取出胞内辅酶A类物质。采用冷甲醇灭活时胞内辅酶A类物质会渗漏，导致测定出的辅酶A类物质的浓度偏低甚至无法检测到。采用液氮灭活和沸乙醇提取的方法可以有效提取得到胞内有机酸。采用冷甲醇灭时，胞内有机酸有较多的渗漏，因此提取胞内有机酸的过程中，不应采用冷甲醇灭活菌体。
在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

Claims (10)

1.一种从红色糖多孢菌胞内提取辅酶A类物质的方法，其特征在于，所述方法包括：
(1)采用液氮灭活的方法对红色糖多孢菌培养物进行灭活，获得经处理的细胞样品；
(2)采用液氮研磨提取的方法对步骤(1)的经处理的细胞样品进行提取，获得含有辅酶A类物质的胞内提取物。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的辅酶A类物质包括：辅酶A；乙酰辅酶A；丙酰辅酶A；丙二酰辅酶A和/或琥珀酰辅酶A。
3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(1)中，所述的液氮灭活的方法包括：将红色糖多孢菌培养物加入到含有液氮的容器中，进行灭活。
4.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(2)中，所述的液氮研磨提取的方法包括：
(a)将细胞样品置于液氮预冷的研钵中，冻干；
(b)研钵中加入液氮，在存在液氮的情况下进行研磨；
(c)研磨完毕，向步骤(b)获得的样品中加入甲醇，转移至离心管中，振荡，离心，获取上清，其中含有辅酶A类物质。
5.如权利要求1-4任一所述的方法，其特征在于，步骤(2)之后，还包括步骤：
(3)从获得的含有辅酶A类物质的胞内提取物中，分离出辅酶A类物质。
6.一种从红色糖多孢菌胞内提取有机酸的方法，其特征在于，所述方法包括：
(i)采用液氮灭活的方法对红色糖多孢菌培养物进行灭活，获得经处理的细胞样品；
(ii)对步骤(i)获得的细胞样品进行洗涤，清除细胞外的有机酸，获得经洗涤的细胞样品；
(iii)采用沸乙醇提取法对步骤(ii)获得的经洗涤的细胞样品进行提取。
7.如权利要求6所述的方法，其特征在于，所述的有机酸包括：丙酮酸，延胡索酸，琥珀酸，草酰乙酸，苹果酸，柠檬酸和/或α-酮戊二酸。
8.如权利要求6所述的方法，其特征在于，步骤(i)中，所述的液氮灭活的方法包括：将红色糖多孢菌培养物加入到含有液氮的容器中，进行灭活。
9.如权利要求6所述的方法，其特征在于，步骤(ii)中，所述的洗涤包括：采用0.9％NaCl水溶液试剂，洗涤1～5次；较佳地2～4次。
10.如权利要求6所述的方法，其特征在于，步骤(iii)中，所述的沸乙醇提取法包括：
(S1)使细胞样品悬浮于乙醇溶液中；
(S2)将步骤(S1)获得的样品放到沸水浴中加热；
(S3)将步骤(S2)加热完毕的样品冷却后，在0±2℃离心，获取上清，其中含有有机酸。
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