BRPI0615657B1 - polinucleotídeo recombinante, proteína e composição inseticidas, cassete de expressão e vetor, bem como métodos para controlar infestação por insetos lepidópteros em planta e para proteger colheita em campo de infestação por insetos lepidópteros - Google Patents

Abstract

seqüências de nucleotídeos que codificam proteínas inseticidas. a presente invenção refere-se a seqúências de nucleotídeos que codificam uma proteína inseticida exibindo atividade inibidora de lepidópteros, bem como uma nova proteína inseticida referida aqui como inseticida cryla.105, plantas transgênicas que expressam o inseticida, e métodos para detectar a presença das seqúências de nucleotídeos ou o inseticida em uma amostra biológica.

Description

Relatório Descritivo da Patente de Invenção para "POLINU-CLEOTÍDEO RECOMBINANTE, PROTEÍNA E COMPOSIÇÃO INSETICIDAS, CASSETE DE EXPRESSÃO E VETOR, BEM COMO MÉTODOS PARA CONTROLAR INFESTAÇÃO POR INSETOS LEPIDÓPTEROS EM PLANTA E PARA PROTEGER COLHEITA EM CAMPO DE INFESTAÇÃO POR INSETOS LEPIDÓPTEROS".

ANTECEDENTES DA INVENÇÃO A presente invenção refere-se a novas seqüências codificadoras para uso em plantas As seqüências codificadoras codificam uma proteína inseticida quimérica tóxica para uma grande variedade de pragas de plantações de espécies de lepidópteros.

Formulações comerciais de isolados de B. íhuringiensis que ocorre naturalmente têm sido usadas há longo tempo no controle biológico de pragas de insetos agrícolas. Esporos e cristais de Bt obtidos da fermentação da espécie Bacillus thuríengiensis são concentrados e formulados para aplicação foliar de acordo com práticas agrícolas convencionais.

Membros da família de proteínas cristal Cry1 são conhecidos por exibir atividade contra larvas de inseto lepidóptero e são úteis como agentes para controlar pragas de insetos lepidópteros. A forma precursora de Õ-endotoxinas de Cry1 consistem em dois segmentos de tamanhos aproximadamente iguais. A porção carbóxi-terminal da proteína precursora, ou um segmento de pró-toxina, estabiliza a formação de cristais e não exibe atividade inseticida A metade amino-temninal da proteína precursora compreende o segmento de toxina da proteína Cry1 e, com base no alinhamento de seqüências conservadas ou substancialmente conservadas dentro dos membros da família Cry1, pode ser ainda subdividido em três domínios estruturais. Esses três subdomínios são baseados em um modelo estrutural cristalográfico tridimensional de uma ivendotoxina de Cry1A onde os três subdomínios foram referidos como Domínio I, Domínio II, e Domínio III, respectivamente, como medidos a partir da terminação amino do segmento de toxina de proteína. O Domínio I compreende cerca do primeiro terço do segmento de toxina ativa e tem mostrado ser essencial para a formação de Segue-se folha 1 a e da δ-endotoxina que estão sendo examinados (Thompson et al., 1995). A probabilidade de se criar arbitrariamente uma proteína quimé-rica com propriedades intensificadas da variedade das estruturas de domínios das numerosas proteínas cristal inseticidas nativas conhecidas na técnica é remota. Esse é o resultado da natureza complexa da estrutura, do-bradura, oligomerização e ativação de proteína, incluindo o processamento proteolítico correto do' precursor dimérico, se expresso em tal forma, para liberar um segmento de toxina inseticida. Somente por cuidadosa seleção de regiões alvo específicas dentro de cada proteína parental para inclusão em uma estrutura quimérica podem as toxinas inseticidas funcionais ser construídas de modo a exibirem atividade inseticida aperfeiçoada em comparação com as proteínas parentais das quais as quimeras são derivadas. A experiência tem mostrado que a remontagem dos domínios de toxina, isto é montagem de uma toxina quimérica de domínio I, II, e III de quaisquer duas ou mais toxinas que são diferentes uma da outra, resulta na construção de uma proteína que exibe formação de cristal defeituoso e/ou a completa falta de qualquer atividade inseticida detectável direcionada a uma espécie de praga de insetos alvo, preferido. Em alguns casos, a toxina quimérica exibirá boas propriedades de formação de cristal, e ainda não exibirá nenhuma atividade inseticida detectável. Somente por experimento e erro são formuladas quimeras inseticidas eficazes, e assim mesmo, o técnico versado não está certo de chegar a uma quimera que exibe atividade inseticida que seja equivalente a ou aperfeiçoada em comparação com qualquer proteína de toxina parental única, cujos constituintes da quimera podem ter sido derivados.' A literatura relata exemplos da construção ou montagem de proteínas quiméricas de ou mais precursores de proteína cristal inseticida de Bt, embora nem todas tenham exibido propriedades inseticidas ou formadoras de cristal, que fossem equivalentes a ou aperfeiçoadas em comparação com as proteínas de precursor das quais as quimeras foram derivadas (Bosch et al. (WO 95/06730); Thompson et al. (WO 95/30753); Thompson et al. (WO 95/30752); Malvar ét al. (WO 98/22595); Gilroy et al. (Patente US 5.128.130); Gilroy (Patente US 5,055.294); Lee et al. (1992) Gene 267:3115- 3121; Honee et al. (1991) Mol. Microbiol. 5:2799-2806; Schnepf et al. (1990) J. Biol. Chem. 265:20923-20930; Perlak et al. (1990) Bio/Technol. 8:939-9943; Perlak et al. (1993) Plant Mol. Biol. 22:313-321). A expressão de δ-endotoxinas de B. thuringiensis em plantas de milho transgênico provou ser um meio eficaz de controlar pragas de inseto agricolamente importantes (Perlak et al., 1990; 1993). Colheitas transgênicas que expressam δ-endotoxinas de B. thuringiensis permitem que os plantadores reduzam sígnificantemente o tempo e os custos com aplicações de inseticidas químicas topicamente aplicadas. O uso de transgenes que codificam δ-endotoxinas de B. thuringiensis é particularmente vantajosa. Plantas de colheita que expressam δ-endotoxinas de B. thuringiensis em áreas sob pesada pressão de insetos exibem rendimentos aperfeiçoados que são melhores que de outro modo seriam variedades de plantas comerciais não transgênicas similares. Contudo, é antecipado que insetos podem evolver resistência às δ-endotoxinas de B. thuringiensis expressas em plantas transgênicas. Tal resistência, caso se torne disseminada, limitaria claramente o valor comercial do germoplasma contendo genes que codificam tais δ-endotoxinas de B. thuringiensis. Um meio possível de aumentar a eficácia dos inseticidas transgênicos contra pragas alvo e reduzir contemporaneamente o desenvolvimento de pragas resistentes a inseticidas seria assegurar que colheitas transgênicas expressem altos níveis de δ-endotoxinas de B. thuriengiensis (McGaughey e Whalon 1993; Roush 1994). Além disso, tendo um depósito de genes inseticidas que são eficazes contra grupos de pragas de insetos e que manifestam seus efeitos através de diferentes modos de ação pode salvaguardar contra qualquer desenvolvimento de resistência. A expressão em uma planta de duas ou mais composições inseticidas tóxicas às mesmas espécies de insetos, sendo cada inseticida expresso em níveis altos o bastante para retardar eficazmente o início da resistência, seria um outro modo de conseguir o controle do desenvolvimento de resistência. Exemplos de tais inseticidas úteis em tais combinações incluem, mas sem limitações, toxinas da Bt, proteínas inseticidas de Xenorhabdus sp. ou Photorhabdus sp., proteínas de patatinas desalergenizadas e desglicosiladas e/ou permuteínas, lec- tinas de vegetais, e similares. A obtenção de co-expressão de múltiplas proteínas inseticidamente ativada na mesma planta, e/ou altos níveis de expressão dessas proteínas inseticidas sem causar efeitos morfológicos na planta indesejáveis tem sido elusivo.

Somente um punhado das mais de duzentos e cinqüenta proteínas inseticidas individuais, que foram identificadas da espécie de Bacillus thuringiensis, foi testado para expressão em plantas. Várias de CRy1’s, Cry3’s, Cry2Aa e Cry2Ab, toxinas binárias Cry33/34 e Cry23/37, e uma Cry9 tem sido expressas, com sucesso, em plantas. As proteínas Cry1 representam a maior classe de proteínas que tem sido expressa em plantas, mas nenhuma foi expressa em níveis altos. Foi necessário alvejar a Cry2Ab ao clo-ropJasto para evitar efeitos fitotóxicos indesejados. A maioria de milhares de metros quadrados plantados em plantas recombinantes expressa proteínas Cry1 A. A probabilidade do início de resistência à Cry1A por espécies de pragas de insetos alvejadas seria substancialmente maior se um alelo administrador de resistência fosse também expresso juntamente com o alelo cry1, ou se o alelo cry1 fosse expresso em níveis altos. Portanto, é desejável que genes de toxinas alternativos sejam desenvolvidos para expressão em plantas como suplementos e reposições para aqueles que estão sendo usados presentemente nas primeira e segunda gerações de plantas resistentes a insetos transgênicas.

SUMÁRIO DE INVENÇÃO A invenção proporciona sequências de nucleotídeos isoladas para expressão em plantas que codificam proteína inseticida, exibindo propriedades inibidoras de insetos lepidópteros. SEQ ID NO:1 é um exemplo de tais seqüências de nucleotídeos consistindo em um gene c/yl A. 105 e codifica uma proteína Cry1A.105 inibidora de insetos. A SEQ ID NO:1 é similar à SEQ ID NO:3, ambas codificando uma proteína Cry1 A.105. A SEQ ID NO:1 é preferida para uso em células dicotiledôneas, enquanto a SEQ ID NO:3 é preferida para uso em células monocotiledôneas. A SEQ ID NO:4 é codificada a partir da SEQ ID NO:3 e é idêntica em seqüência de aminoácidos à SEQ ID NO:2. A seqüência de nucleotídeos isolada é destinada a incluir se- qüências que exibem pelo menos cerca de 88% a cerca de 90% ou maior identidade de sequência de nucleotídeos com a seqüência conforme estabelecida em SEQ ID NO:1, ou que hibridizam para a SEQ ID NO:1 sob severas condições de hibridização. A seqüência de nucleotídeos isolada é também destinada a incluir seqüências que exibem pelo menos cerca de 90% de i-dentidade de seqüência de nucleotídeos com a seqüência conforme estabelecida na SEQ ID NO:3, ou que hibridizam para SEQ ID NO:3 sob condições severas de hibridização. A invenção também proporciona uma proteína inseticida isolada e purificada que exibe atividade inibidora direcionada à espécie de insetos lepidópteros. A proteína inseticida é designada aqui pelo menos como a porção de toxina de Cry1A.105 e exibe uma seqüência de aminoácidos como estabelecida em SEQ ID NO:2. A proteína precursora de comprimento inteiro consistindo em cerca de 1177 aminoácidos conforme estabelecida na SEQ ID NO:2 é também referida como uma proteína Cry1A.105 inseticida, contudo, qualquer fragmento da proteína precursora que exibe bioatividade inseticida é pretendida ser referida como uma proteína Cry1A.105 inseticida, e inclui, pelo menos, uma proteína inseticida Cry1A.105 correspondente a um segmento de seqüência de aminoácidos de cerca do aminoácido 1 até cerca do aminoácido 612 conforme estabelecida na SEQ ID NO:2, e pode incluir também um segmento de cerca do aminoácido 2 até cerca do aminoácido 610. Qualquer composição consistindo em uma quantidade inseticidamente eficaz da proteína inseticida tem por objetivo estar dentro do escopo da invenção. A invenção também proporciona um cassete de expressão para uso na expressão de uma proteína inseticida conforme estabelecida na SEQ ID NO:2 em uma célula hospedeira. O cassete de expressão contém preferivelmente um promotor funcional na célula hospedeira pretendida que é ligada a e regula a expressão de uma seqüência de nucleotídeos que codifica um segmento inseticida de um proteína Cry1A.105. Exemplos de cassetes de expressão são fornecidos aqui como estabelecidos na SEQ ID NO:5 e na SEQ ID NO:7, pretendidos para uso em uma célula de planta dicotiledônea ou uma célula de planta monocotiledônea, respectivamente. O promotor e a seqüência de codificação estão operavelmente ligados e funcionam juntos na célula hospedeira. O cassete de expressão pode ser destinado ao uso em qualquer célula hospedejra, mas é preferivelmente para uso em uma célula bacteriana, célula fúngica, célula de mamífero, ou célula vegetal. As células bacterianas são preferivelmente selecionadas do grupo que consiste em uma célula de espécie Bacilius, uma célula da espécie Enterobacteriaca-e, uma célula da espécie Pseudomonas, uma célula da espécie Clostridium, e uma célula da espécie fíhizobium, e uma célula da espécie Agrobacterium. Se a célula hospedeira é uma célula vegetal, é preferível que ela seja uma célula escolhida de uma espécie de colheita de célula vegetal, preferivelmente tanto uma célula de planta dicotiledônea como de planta monocotiledônea. Exemplos de células de planta dicotiledônea são alfafa, maçã, abricó, aspargo, feijão, frutinhas sem caroço, amora-preta, mirtilo, canola, cenoura, couve-flor, aipo, cereja, grão-de-bico, plantas cítricas, algodão, feijão-caupi, uva do monte, pepino, planta cucurbitácea, planta da berinjela, árvore frutífera, uva, limão, alface, linhaça, melão, mostarda, árvore contendo amêndoas, quiabo, laranja, ervilha, pêssego, amendoim, pêra, ameixa, batata, soja, a-bóbora, morango, beterraba, girassol, batata doce, tabaco, tomate, nabo e vegetais. Exemplos de células de planta monocotiledônea são milho, trigo, aveia, arroz, sorgo, milo, trigo sarraceno, centeio, gramínea (capim-do-prado, capim-de-rebanho (Phleum pratense), bromo, orquídea, Santo Agostinho, Bermuda, agróstea), e cevada. Cassetes de expressão destinados ao uso em célula vegetal contêm tipicamente seqüências em ligação operável que regulam os níveis e eficácias de expressão de uma substância pretendida, tal como uma proteína inseticida Cry1A.105. Tais seqüências podem ser úma seqüência intenstficadora de expressão, uma seqüência líder não traduzida, uma seqüência de íntrons, uma seqüência de codificação de peptí-deo alvejando cloroplastos, e uma seqüência de terminação de transcrição e de poliadenilação. O cassete de expressão é, preferivelmente, incorporado em um vetor para uso na estabilização da manutenção da seqüência de codificação de Cry1 A.105 dentro da célula hospedeira. Um vetor pode ser qualquer número de estruturas conhecidas da técnica, mas é tipicamente um plasmídio ou répltcon no qual o cassete de expressão é construído ou inserido antes da incorporação na célula hospedeira. Um vetor é destinado a incluir, mas sem limitação, um plasmídio, um cosmídio, um bacmídio, um fagomídio, um YAC, um BAC, um vetor suicida, uma seqüência de inserção, um transpo-son, ou ainda uma seqüência de nucleotídeos linear à qual o cassete de expressão é ligado ou no qual o cassete de expressão está embutido.

Plantas transgênicas resistentes à infestação por insetos lepi-dópteros englobam uma modalidade da presente invenção. Tais plantas contêm uma seqüência de nucleotídeos que codifica uma proteína inseticida Cry1A.105 como estabelecida na SEQ ID NO:2 pelo menos de cerca do a-minoácido 2 a cerca do aminoácido 612. A planta transgênica é eficaz no controle de infestações por insetos lepidópteros produzidas por insetos, tais como lagartas de folhas verdes, lagartas de agrotídeo, lagartas dos cereais, brocas, bicho de cesto, e qualquer um que se alimente de forragem. As pragas preferidas são as lagartas dos cereais do outono, brocas de milho europeu, lagartas de espiga de milho (gorgulhos do algodão), brocas de milho do sudoeste, e lagartas de agrotídeo pretas. A presente invenção pretende incluir a progênie e semente ou frutas ou produto produzidos da planta transgênica da presente invenção, desde que a seqüência de nucleotídeos da presente invenção que codifica um segmento inseticida CryA.105 seja mantida dentro do genoma herdável e/ou de plastídio das células da planta, sua progênie, semente, e similares. A presente invenção também proporciona um ou mais métodos para controle da infestação por insetos lepidópteros de uma planta por fornecer na dieta de uma praga de insetos uma composição que contém uma quantidade inseticidamente eficaz de uma proteína Cry1A.105 inseticida. Tal composição seria de células vegetais que tivessem sido ou que são descendentes de uma célula vegetal transformada com uma seqüência de ácidos nucléicos que codifica um segmento inseticida de uma seqüência de amino-ácidos de CryA.105 como estabelecida na SEQ ID NO:2. Uma planta trans- gênica gerada de uma célula vegetal transformada para conter um cassete de expressão, exemplificado como estabelecido na SEQ ID NO:5 e na SEQ ID NO:7, que contém uma seqüência que codifica uma seqüência de amino-ácidos inseticidas de Cry1 A.105, seria um meio de proporcionar uma composição inseticida na dieta do inseto. Um outro meio seria produzir uma quantidade inseticidamente eficaz de uma proteína Cry1 A.105 em uma célula bacteriana ou fúngica e proporcionar a célula bacteriana ou célula fúngíca ou uma quantidade purificada da proteína CryiA.105 na dieta de uma ou mais pragas de insetos alvo suscetíveis à proteína Cry1 A. 105. É proporcionado um método para identificar uma seqüência de nucleotídeos que codifica uma sequência de aminoácidos de Cry1 A.105 em uma amostra biológica. O método consiste em contatar uma amostra que está sendo testada quanto à presença da seqüência de codificação de Cry1 A.105 com uma sonda de polinucleotídeo que se liga com especificidade à seqüência de codificação de Cry1A.105. Em particular, a seqüência de sonda se liga ou hibridiza para uma seqüência de codificação de Cry1A.105 sob condições severas de hibridização. A detecção de ligação em uma mistura racional é diagnostica quanto à presença da seqüência de codificação deCrytA.105.

Um método para identificar um fragmento inseticida de uma proteína Cry1A.105 em uma amostra é também proporcionado. O método consiste em contatar uma amostra que está sendo testada quanto à presença de um fragmento inseticida de Cry1 A.105 com um anticorpo que se liga es-pecificamente ao fragmento inseticida. A detecção da ligação em uma mistura reacional é diagnóstica para a presença da proteína Cry1A.105 na amostra.

Proteínas inseticidas quiméricas ou híbridas são também proporcionadas. Tais híbridos são compostos de duas ou mais proteínas inseticidas diferentes, cada uma das quais exibe atividade inseticida direcionada a pelo menos um membro da mesma espécie de inseto. A proteína inseticida híbrida é feita de partes de cada uma das diferentes proteínas inseticidas. Segmentos de proteínas inseticidas usadas na construção do híbrido consis- tem em pelo menos cerca de 50 a pelo menos cerca de 200 aminoácidos contíguos selecionados dos aminoácidos contíguos que perfazem qualquer uma das proteínas inseticidas diferentes. Uma proteína inseticida Cry1A.105 como estabelecida na SEQ ID NO:2. de cerca da posição de aminoácido 2 até cerca da posição de aminoácido 612 é destinada a ser incluída dentro do grupos das diferentes proteínas inseticidas das quais um segmento por ser selecionado para construir uma proteína inseticida híbrida.

Sendo aparentes várias vantagens e características da presente invenção, a natureza da invenção pode ser mais claramente entendida por referência à seguinte descrição detalhada, aos exemplos, e às reivindicações apensas.

BREVE DESCRICÃO DAS SEQÜÊNCIAS SEQ ID NO:1 é uma seqüência sintética para expressão de uma proteína inseticida Cry1 A.105, preferivelmente em uma célula dicotiledônea. SEQ ID NO:2 é uma proteína Cry1A.105 codificada a partir da seqüência de nucleotídeos como estabelecida na SEQ ID NO:1. SEQ ID NO:3 é uma seqüência sintética para expressão de uma proteína inseticida Cry1A.105, preferivelmente em uma célula monocotiledô-nea. SEQ ID NO:4 é uma proteína Cry1A.105 codificada da seqüência de nucleotídeos como estabelecida na SEQ ID NO:3. SEQ ID NO:5 representa uma seqüências de nucieotídèos consistindo em um cassete de expressão que funciona em uma célula vegetal, e, preferivelmente, em uma célula vegetal dicotiledônea, para expressar uma proteína inseticida Cry1A.105. SEQ ID NO:6 representa uma proteína inseticida Cry1 A.105 codificada por um segmento dentro do cassete de expressão como estabelecido na SEQ ID NO:5. SEQ ID NO:7 representa uma seqüência de nucleotídeos consistindo em um cassete de expressão que funciona em uma célula vegetal e, preferivelmente, em uma célula vegetal monocotiledônea, para expressar uma proteína inseticida Cry1 A. 105. SEQ ID N0:8 representa uma proteína inseticida Cry1A.105 codificada por um segmento dentro do cassete de expressão como estabelecido na SEQ ID NO:7.

DESCRICÂO DETALHADA DA INVENÇÃO

De acordo com a presente invenção, os inventores construíram seqüências de nucleotídeos que codificam uma nova proteína inseticida aqui identificada como proteína Cry1A.105. Foi identificado que a sequência de aminoácidos de Cry1A.105, estabelecida na SEQ ID NO:2, exibe propriedades que proporcionam vantagens sobre proteínas inseticidas de Bt que ocorrem naturalmente que são tóxicas para insetos lepidópteros. Em particular, a proteína Cry1 A.105 pode ser expressa em altos níveis tanto nas plantas mo-nocotiledôneas como nas dicotiledôneas sem que a maioria dos eventos transgênicos exiba efeitos tóxicos como resultado do níveis aumentados de expressão em comparação com os efeitos observados quando as proteínas Cry1 de ocorrência natural são expressas nas plantas. Além disso, a proteína Cry1A.105 forma cristais estáveis quando expressa em Bacillus thuringi-ensis, provavelmente por causa do efeito estabilizante do segmento de pro-toxina CrylAc ligado à porção toxina da proteína Cry1A.105 quimérica. Além disso, a proteína inseticida Cry1A.105 exibe uma faixa de bioatividade inseticida direcionada a espécies lepidópteras que não é observada com outras proteínas Cryl que ocorrem naturalmente que foram identificadas até hoje. Portanto, a expressão da proteína Cry1A.105 em plantas transgênicas resulta em números aumentados de eventos transgênicos moforlogicamente normais que expressam níveis mais altos de um análogo de uma toxina Cry1 que exibe uma ampla faixa de controle de espécies de pragas de insetos lepidópteros para qualquer evento que é selecionado para desenvolvimento comercial. Tais eventos resultam na vantagem de retardar o início de resistência ao análogo da toxina Cry1A, e quando em combinação com uma segunda toxina que é tóxica para uma ou mais das espécies de pragas de insetos às quais o análogo de Cryl A é também tóxico e que exerce seu modo de ação de um modo que é diferente daquele do análogo de Cry1A, qualquer probabilidade do desenvolvimento de resistência para cada toxina é dita ser extremamente remota.

Os inventores construíram pelo menos duas diferentes seqüên-cias de nucleotídeos para uso em plantas, em que cada seqüência de nucle-otídeos codifica a mesma proteína inseticida Cry1A.105. O primeiro (ou ami-no-terminai) cerca de dois terços da porção inseticida da proteína Cry1 A. 105 consiste em sequências de aminoácidos derivadas de uma seqüência de aminoácidos de CrylAb. Essa seqüência é ligada à terminação carbóxi da porção da toxina e uma parte do domínio da protoxina de uma seqüência de aminoácidos derivada de uma proteína Cry1 inseticida obtida de uma cepa de Bt aizawai Ecogênica EG6346 (Chambers et al., 1991, J. Bacteriol. 174:3966-3976). O segmento de toxina Cry1A.105 é ligado então a um segmento que é substancialmente uma seqüência de peptídeos da protoxina CrylAc. Os inventores demonstraram que essa construção proporciona uma seqüência de aminoácidos única que exibe propriedades inseticidas surpreendentemente aperfeiçoadas quando comparadas com as propriedades exibidas pela proteína da qual a quimera é derivada. Além disso, a proteína precursora CrylA.105 exibe excelentes propriedades formadoras de cristal e é eficazmente solubilizada e processada para a forma da toxina ativa no intestino das pragas de insetos lepidópteros alvejados, específicos.

As seqüências de nucleotídeos englobadas aqui foram construídas usando-se métodos descritos nas Patentes US 5.500.365 e US 5.689.052, em particular por evitar que certas seqüências desfavoráveis na seqüência de codificação que se mostraram problemáticas para expressão de seqüências de genes heterólogos em células vegetais. O segmento que codifica a porção de toxina da proteína Cry1A.105 consiste em nucleotídeos conforme estabelecidos na SEQ ID NO:1 e na SEQ ID NO:3 de cerca de posição 1 até cerca de posição 1830, mais ou menos. A seqüência conforme estabelecida na SEQ ID NO:1 foi construída para uso em espécies de plantas dicotiledôneas, e, em particular, em plantas de algodão. A seqüência conforme estabelecida na SEQ ID NO:3 foi construída para expressão em plantas monocotiledôneas, e, em particular, em espécies de plantas de milho ("maize" ou "corn").

Seqüências de nucleotídeos da presente invenção exibem uma identidade global de cerca de 94,3% uma com a outra e são idênticas a partir de cerca da posição de nucleotídeo 1330 até cerca da posição de nucleo-tídeo 3534. O segmento de cada uma dessas seqüências de nucleotídeos que codificam a porção de toxina da proteína Cry1A.105 exibe, a partir de cerca da posição de nucleotídeo 1 até cerca da posição de nucleotídeo 1830, cerca de 88,9% de identidade uma com a outra. O segmento dessas seqüências de nucleotídeos que codificam as primeiras duas estruturas de domínio da proteína Cry1 A.105 é substancialmente mais diversa e exibe somente cerca de 84,7% de identidade uma com a outra, Os inventores construíram eventos de plantas transgênicas u-sando essas seqüências. SEQ ID NO:1 foi introduzida em um vetor de plasmídio contendo um cassete de expressão que consiste em uma seqüência de promotor do Vírus do Mosaico Figwort (eFMV) intensificada ligada operavelmente a uma seqüência líder não traduzida da Petunia hybrida Hsp70 (Ph.Hsp70, a.k.a., DnaK), uma seqüência de codificação de peptídeos alvejando cloroplasto de pequena subunidade de ribulose bisfosfato carboxilase da Arabidopsis thali-ana, e uma seqüência de terminação de transcrição de gene da pequena subunidade de ribulose bisfosfato carboxilase E9 da Pisum Sativum e de poliadenilação. A seqüência de codificação conforme estabelecida na SEQ ID NO:1 foi inserida em seu cassete de expressão em alinhamento com e imediatamente adjacente às seqüências de codificação de extremidade 3’ da seqüência de codificação de peptídeo alvejadora, e a montante da seqüência de terminação E9. A seqüência de nucleotídeos do cassete de expressão resultante é estabelecida na SEQ ID NO:5. Um segmento do vetor contendo o cassete de expressão de Cry1A.105 ligado a um segundo cassete de expressão contendo um marcador de GUS expressável em planta foi submetido à excisão e usado para gerar eventos de algodão transgênico usando métodos biolísticos. Os eventos transgênicos foram testados em um bioen-saio para atividade inseticida contra várias diferentes espécies de pragas lepidópteras e foi determinado que estes exibiram propriedades de controle de insetos de modo significante melhor que as plantas de algodão resistentes a insetos existentes previamente contendo somente CrylAcc ou uma combinação de proteínas CrylAc e Cry2Ab. Além disso, alguns dos eventos de algodão transgênico com Cry1A.105 exibiram níveis de acumulação de proteína Cry1A.105 excedendo 10 a 20 partes por milhão por toda a estação de crescimento, mesmo em gorgulhos de algodão, e sem exibirem quaisquer efeitos fitotóxicos na planta ou nos tecidos reprodutivos. Isso está em contraste com outras proteínas Cry1 que haviam sido testadas anteriormente, que foram em geral somente capazes de níveis de acumulação para menos que cerca de 10 partes por milhão, se ou não alvejadas ao cloroplasto. Os efeitos fitotóxicos foram observados quando outras proteínas tipo Cry1 foram testadas no algodão, especialmente quando os níveis de acumulação de Cry1 se aproximaram ou excederam cerca de 10 ppm. A SEQ ID NO:3 foi introduzida em um vetor de plasmídio contendo um cassete de expressão consistindo em uma sequência de promotor de Vírus de Mosaico de Couve-Flor (eCaMV) intensificada ligada operavel-mente a uma principal seqüência líder não traduzida de gene de proteína de ligação de clorofila a/b de Triticum aestivum e uma seqüência de íntrons de actina da Oryza sativa, e uma seqüência terminação de transcrição de gene hsp17 da Triticum aestivum e de poliadenilação. A seqüência de codificação de Cry1A.105 como estabelecida na SEQ ID NO:3 foi inserida em seu cassete de expressão Imediatamente adjacente a e 3’ da seqüência de íntrons e a montante da seqüência de terminação. A seqüência de nucfeotídeos do cassete de expressão resultante é estabelecida na SEQ ID NO:7. O vetor contém também um marcador selecionável do herbicida glifosato que foi u-sado para selecionar eventos transformados com cassete de expressão de Cry1A.105. Eventos de milho (“maize") selecionados depois da transformação com o cassete de expressão de Cry1A.105 foram testados em bioensai-os contra várias espécies de pragas de lepidópteros, determinando que eles exibem uma ampla faixa de atividade inseticida que não era prevatente com eventos transformados com outras proteínas inseticidas de Bt tal como Cry1 Ab. As atividades da lagarta de cereais do outono e lagarta de agrotídeo preta exibidas por eventos expressando níveis inseticidas de Cry1A.105 a-copladas com a atividade inseticida de Cry1A.105 direcionada à lagarta da espiga de milho e broca de milho equivalentes a ou maiores que aquela dos eventos expressando CrylAb, proporcionam um espectro mais amplo de atividade inseticida para eventos de CRY1A.105.

As seqüências de nucleotídeos da presente invenção são exem-plificativas. Outras seqüências de nucleotídeos são capazes de expressar um fragmento de proteína inseticida Cry1A.105 em uma célula vegetal, e ainda outras seqüências de nucleotídeos são capazes de serem desenhadas que expressam bem em outros tipos de células hospedeiras. Sem limitar o escopo da descrição, é pretendido que uma seqüência de nucleotídeos para uso na expressão de um fragmento inseticida de Cry1A.105 exibam pelo menos cerca de 85%, ou pelo menos cerca de 90%, ou pelo menos cerca de 95%, ou pelo menos cerca de 99% ou maior identidade de seqüências de nucleotídeos com as seqüências de nucleotídeos exemplificadas aqui. Outras seqüências de nucleotídeos pretendidas para expressão de um fragmento inseticida de CryA.105 em uma célula hospedeira diferente de uma célula vegetal pode ser qualquer identidade percentual ou similaridade com as seqüências de nucleotídeos exemplificadas. As seqüências de nucleotídeos podem variar devido à redundância do código genético, e assim é possível sintetizar qualquer número de seqüências de ácidos nucléicos que codificam qualquer parte da seqüência de aminoácidos estabelecida na SEQ ID NO:2, e se pretende que todas estas seqüências estejam dentro do escopo da presente invenção. Qualquer seqüência de ácidos nucléicos isolada ou purificada codificando um fragmento inseticida de uma proteína Cry1A.105 está englobada pelo escopo da exposição, bem como qualquer composição na qual o ácido nucléico pode ser detectado por anticorpo, por sonda de ácido nucléico, ou por um ou mais pares de iniciadores desenhados para produzir um amplicon consistindo em tal seqüência. A seqüência de ácidos nucléicos exemplificada aqui e expressa em milho {"maize") consiste somente em uma seqüência de codificação de proteína precursora Cry1A.105, enquanto a seqüência expressa no algodão consiste em uma seqüência de codificação de proteína precursora Cry1A.105 alvejada para cloroplasto. A expressão de proteína Cry1 na plantas provou ser problemática. Não é sabido se ou se qualquer proteína Cry1 particular será expressa bem em qualquer planta particular, e assim tentativa e experimentação com erros e acertos são requeridas. Algumas proteínas Cry1 expressas em milho resultarão em efeitos fitotóxicos, e assim alvejar a proteína ao cloroplasto alivia algumas vezes tais efeitos. Circunstâncias similares são observadas com expressão de planta de milho de proteínas Cry1. Os exemplos aqui não têm o objetivo de ensinar que a expressão de Cry1A.105 é somente possível em milho ("maize") se localizada para o espaço citoplásmico, e, similarmente, não se pretende ensinar que a expressão de Cry1 A. 105 é somente possível em algodão se localizada para o plas-tídio. Os exemplos são destinados a ensinar que o método de localização de proteína funciona com essa proteína para obter plantas morfologicamente normais que exibem altos níveis de expressão e acumulação de proteína Cry1A.105, e que exibem níveis comerciais de resistência a uma ampla faixa de pragas em plantas por insetos lepidópteros no gênero selecionado dos grupos que consiste em Anticarsia, Pseudoplusia, fíachiplusia, Helicoverpa, Heliothis, Spodoptera, Epinotia, e Armigera. Acredita-se que qualquer seqüência de codificação de peptídeos alvejando o plastídio funcionaria eficazmente para direcionar a proteína precursora Cry1A.105 para o plastí-dio/cloroplasto.

Seqüências líder não traduzidas, sequências de íntrons e de terminação de transcrição 3’ e poliadenilação são conhecidas na técnica, e o versado na técnica entendería que em certas circunstâncias, a expressão pode ser intensificada ou estabilizada por incorporação dessas seqüências nos cassetes de expressão. Várias de tais seqüências são conhecidas da técnica e são destinadas a serem englobadas pelo escopo da presente descrição. De modo similar, promotores que funcionam para obter a expressão regulada de uma seqüência ligada são conhecidos na técnica e estão englobados pelo escopo da presente descrição. Os promotores podem ser selecionados para uso para acionar a expressão de uma seqüência ligada em qualquer número de combinações de parâmetros, incluindo, mas sem limitação, o controle temporal da expressão, controle espacial ou específico do tecido de expressão, e para controlar a quantidade de um particular produto gênico desejado para ser acumulado dentro de uma célula ou tecido vegetal particular. A proteína isolada e purificada compreendendo um fragmento inseticida da seqüência de aminoácidos de Cry1A.105 é também para ser englobada pelo escopo da presente invenção. Variantes são também pretendidas estarem dentro do escopo da invenção desde que a substituição ou substituições de aminoácidos que efetuam a variação sejam geralmente conservativas com respeito ao(s) aminoácido(s) substituído(s), e a(s) substi-tuição(Ões) não resulte(m) em uma redução da bioatividade inseticida ou da faixa de especificidade das espécies. É pretendido que o fragmento da proteína Cry1A.105 seja um segmento da seqüência de aminoácidos conforme estabelecida na SEQ ID NO:2 a partir de cerca da posição de aminoácido 1 até cerca a posição de aminoácido 650, ou de cerca de posição de aminoácido 2 até cerca de posição de aminoácido 612, ou de cerca da posição de aminoácido 5 até cerca da posição de aminoácido 610, ou de cerca da posição de aminoácido 10 até cerca da posição de aminoácido 600. Alternativamente, é pretendido que um fragmento inseticida de uma proteína Cry1A.105 consista em cerca de 550 a cerca de 650 aminoácidos contíguos do grupo que consiste em resíduos de aminoácidos 1 até cerca de 650 conforme estabelecido na SEQ ID NO:2. A proteína precursora de comprimento inteiro, consistindo em resíduo de aminoácidos 1 até cerca do aminoácido 3534, exibe excelentes propriedades formadoras de cristal e é bem-tolerada por ambas as espécies monocotiledôneas e dicotiledôneas. A proteína precursora também exibe excelente estabilidade quando na forma cristalina, e também exibe excelente solubilidade no pH alcalino, em particular pH alcalino dentro de uma faixa de cerca de 8,0 a cerca de 12,0, ou de cerca de 8,5 a cerca de 11,5, ou de cerca de pH 9,0 a cerca de pH 11,0. A proteína da presente invenção pode ser purificada e usada sozinha em uma quantidade inseticidamente eficaz em qualquer número de composições pretendidas para uso como agente de controle de praga por lepidópteros, ou pode ser combinada em uma quantidade inseticidamente eficaz com qualquer número de outros agentes pesticidas que são diferentes da proteína Cry1A.105. Outros de tais agentes pesticidas têm por objetivo incluir, mas sem limitação, Bt Cry ou outras composições inseticidas se ou não tóxicas a uma espécie de lepidóptero, incluindo inseticidas químicos, agentes fungicidas ou fungistáticos, antibióticos, agentes antibacterianos, agentes bacteriostáticos, e agentes nematicidas ou nematostáticos. Tais composições pesticidas incluindo uma Cry1A.105 juntamente com qualquer número de outros agentes pesticidas podem ser produzidas por uma célula transgênica, ou formuladas usando agentes pesticidas purificados ou substancialmente purificados para uma composição pesticida em uma forma que consiste em poeira, material granular, uma suspensão em óleo, uma suspensão em água, um mistura de emulsão em óleo e em água, ou um pó mo-Ihável, e então fornecida em um veículo agricolamente aceitável para aplicações foliares. As composições podem ser formuladas também para um tratamento de semente, ou junto com uma Cry1 A.105 na composição destinada à inclusão no tratamento de semente, ou como um composição aplicada a uma semente que é derivada de um planta transgênica transformada para expressar quantidades inseticidamente eficazes de uma Cry1A.105, de modo que a. composição de tratamento de semente contendo agentes pesticidas é proporcionada para; um praga de lepidópteros alvo juntamente com células de uma planta crescida das sementes que são produtoras de quantidades pesticidamente eficazes de uma proteína Cry1A.105. Uma combinação de proteínas inseticidas em que cada uma é tóxica para as mesmas espécies de insetos e ainda manifestam seus efeitos de toxicidade através de diferentes modos de ação seria uma combinação particularmente útil de a-gentes pesticidas para controlar espécies de lepidópteros ou retardar o início de resistência a qualquer agente pesticida simples de outro modo eficaz contra uma espécie particular de lepidóptero. Uma combinação exemplificativa de tais proteínas seria uma proteína Cry1 A. 105 da presente invenção, isto é uma primeira proteína inseticida, acoplada com pelo menos uma segunda proteína inseticida diferente da primeira. Tais diferentes proteínas inseticidas incluem, mas sem limitação, outras proteínas cristalinas de Bt. de lepidópte-ro (outras Cry1’s, Cry2’s, Cry5’s, Cry9’s), proteínas VIP, proteínas inseticidas de lepidópteros referidas como proteínas TIC, e proteínas inseticidas produzidas por espécies Xenorhabdus e Photorhabdus de bactérias. Proporcionar na dieta de uma praga de insetos uma combinação de uma ou mais proteínas inseticidas juntamente com um agente desenhado para atingir a supressão de gene mediada por dsRNA de um ou mais genes essenciais para a sobrevivência do inseto é uma combinação particularmente útil de agentes pesticidas para controlar espécies de lepidópteros ou retardar o início de resistência a qualquer agente pesticida simples de outro modo eficaz contra uma espécie de lepidóptero particular.

Plantas transformadas com as seqüências de nucleotídeos da presente invenção são proporcionadas como uma outra modalidade da presente invenção. Métodos para introduzir estavelmente DNA em células vegetais são conhecidos na técnica, e incluem, mas sem limitação, infiltração a vácuo, transformação mediada por Agrobacteríum ou Rhizobium, eletropora-ção, e vários métodos balísticos. O DNA introduzido nas plantas é geralmente alvejado para inserção no cromossomo nuclear, embora inserção no clo-roplasto ou DNA de plastídio pode ser conseguida. DNA introduzido nas plantas está geralmente ligado ou associado a uma sequência que proporciona meios para identificar ou selecionar a célula ou células que tenham sido estavelmente transformadas com o DNA de interesse, incluindo, mas sem limitação, marcadores classificáveis tais como genes emissores de fluorescência ou de luz e genes que codificam pigmentos ou enzimas que, em presença do substrato apropriado, conferem uma característica colorimétrica à célula ou células transformadas, ou por inclusão de marcadores selecionáveis que permitem uma seleção positiva das células transformadas e tecido, proporcionado um vantagem de crescimento para as células transformadas e fazendo com que as células não transformadas ou tecido se tornem estáticos ou morram. Tais marcadores selecionáveis incluem, mas sem limitação, genes codificadores de basta, bar, resistência a metotrexato, neomicina fos- fotransferase, enzimas de EPSPS insensíveis ao glifosato, enzima de glifo-sato oxidorredutase (GOX), E. coli phnO ou seu equivalente, e similares.

Vetores e outros tipos de seqüências projetadas para manter, manipular, e/ou orientar as seqüências de nucleotídeos exemplificadas, enquanto estão sendo manipulados no laboratório ou para introdução em uma célula hospedeira, estão incluídos no escopo da invenção, e são destinados a incluir, mas sem limitação, fagos, plasmídios, bacmídios, yacmídios, cos-mídios, e similares.

As plantas transformadas estão dentro do escopo da presente invenção. As plantas transformadas para conterem uma seqüência de nucleotídeos que codifique pelo menos um fragmento inseticida de uma proteína Cry1A.105 estão especificamente habilitadas pela presente descrição. Tanto as plantas monocotiledôneas como dicotiledôneas são contempladas pela presente invenção. As plantas monocotiledôneas têm por objetivo incluir, mas sem limitação, milho, trigo, aveia, arroz, sorgo, milo, trigo sarraceno, centeio, gramínea (capim-do-prado, capim-de-rebanho (Phleum pratense), bromo, orquídea, Santo Agostinho, Bermuda, agróstea), e cevada e as dicotiledôneas têm por objetivo incluir pelo menos alfafa, maçã, abricó, aspargo, feijão, frutinhas sem caroço, amora-preta, mirtilo, canola, cenoura, couve-flor, aipo, cereja, grão-de-bico, plantas cítricas, algodão, feijão-caupi, uva do monte, pepino, planta cucurbitácea, planta da berinjela, árvore frutífera, uva, limão, alface, linhaça, melão, mostarda, árvore contendo amêndoas, quiabo, laranja, ervilha, pêssego, amendoim, pêra, ameixa, batata, soja, abóbora, morango, beterraba, girassol, batata doce, tabaco, tomate, nabo e vegetais. Os produtos agrícolas dessas plantas, bem como sementes e tecidos produzidos dessas plantas, estão especificamente incluídos na presente invenção, desde que a semente, tecido ou produto agrícola contenha um transgene que codifique um fragmento inseticida de um proteína Cry1A.105. Métodos para detectar, em uma amostra biológica, uma proteína Cry1A.105 ou uma seqüência de nucleotídeos que codifique um fragmento inseticida de uma proteína Cry1A.105 são proporcionados pela presente invenção. Cry1A.105 pode ser usada para imunizar animais para produzir an- ticorpos específicos para epítopos de CrylA.105. Anticorpos específicos para Cry1A.105 podem ser usados para detectar a presença de Cry1 A.105 em uma amostra biológica. Métodos para detectar a ligação de um anticorpo a um antígeno são conhecidos da técnica. Detecção da ligação de um anticorpo a um epítopo de Cry1 A.105 em uma amostra biológica é diagnóstico para a presença da proteína na amostra.

Seqüências de nucleotídeos que codificam um fragmento inseticida de Cry1 A.105 podem ser também detectadas. Sondas de nucleotídeo sintéticas podem ser usadas para ligação a uma seqüência alvo, isto é uma seqüência de nucleotídeos que codifica um fragmento inseticida de Cryl A.105. Métodos para detectar a ligação de uma sonda a uma seqüência alvo são conhecidos da técnica. Detecção da ligação de uma sonda à seqüência de codificação de Cryl A.105 alvo é diagnóstica para a presença da seqüência de codificação na amostra.

Iniciadores de nucleotídeos sintéticos podem ser usados nas reações de amplificação térmica para produzir um amplicon de uma amostra biológica suspeita de conter uma seqüência de nucleotídeos que codifica uma fragmento inseticida de um proteína Cryl A.105. A presença de um amplicon produzido em tal reação de amplificação térmica é diagnóstica para a presença da seqüência de nucleotídeos na amostra. Seqüências particularmente úteis como sondas, que são diagnósticos para detectar a presença de seqüências de codificação de Cryl A.105 da presente invenção em uma a-mostra biológica, são seqüências que correspondem a ou são perfeitamente complementares a (1) posição de nucleotídeo 1401-1420 como estabelecida na SEQ ID NO:1 ou na SEQ ID NO:3, ou (2) posição de nucleotídeo 1821— 1840, conforme estabelecida na SEQ ID NO:1 ou SEQ ID NO:3. Essas seqüências correspondem aos (1) 20 nucleotídeos que estendem a seqüência que codifica a junção entre o Domínio II e o Domínio III dos segmentos de diferentes proteínas inseticidas usadas para construir a porção inseticida das proteínas da presente invenção, e (2) aos 20 nucleotídeos que estendem a seqüência que codifica a junção entre o Domínio III e o segmento de codificação de protoxina.dos diferentes segmentos de codificação de proteína u- sados para construir a sequência de codificação da proteína Cry1 A.105 pré-protoxina. As seqüências de nucleotídeos que estão, ou são complementares a, qualquer um desses dois segmentos de DNA (1401-1420 ou 1821-1840) podem ser usadas como sondas para detectar a presença dessas seqüências de codificação em amostras biológicas. A detecção de tal ligação é diagnostica para a presença de tais seqüências de codificação em uma a-mostra biológica. Outras seqüências conforme serão reconhecidas por aquele versado na técnica que flanqueiam cada um dos lados desses segmentos de DNA podem ser usadas como iniciadores para amplificar vários segmentos de amplicon dimensionados de tais amostras biológicas, e tais amplicons são diagnósticos para a presença de tais seqüências de codificação na a-mostra. Por exemplo, a primeira sequência de iniciador correspondente à sequência de nucleotídeos estabelecida na SEQID NO:1 a partir da posição 1201-1220 poderia ser usada como um iniciador de avanço em uma reação de amplificação térmica com uma segunda seqüência de iniciador correspondente ao complemento reverso da seqüência de nucleotídeos como estabelecida na SEQ ID NO:1 a partir da posição 1581-1600. Tais iniciadores quando usados juntos em uma reação de amplificação térmica com uma amostra biológica contendo SEQ ID NO:1 resultariam na síntese de um amplicon correspondente à SEQ ID NO:1 a partir da posição 1201 até 1600, isto é, um ampiicon de 400 nucleotídeos, que conteria o segmento de 20 nucieo-tídeos da posição de nucleotídeo 1401-1420 como estabelecido na SEQ ID NO:1, e seria, portanto, diagnóstico para a presença da seqüência de codificação de Cry1 A.105 em tal amostra. É proporcionado um kit para detectar a presença de uma Cry1A.105 ou detectar a presença de uma seqüência de nucleotídeos que codifica uma Cry1 A. 105 em uma amostra. O kit é provido junto com todos os reagentes e amostras de controle necessários para efetuar o método para detectar o agente pretendido, bem como instruções de uso.

Os seguintes exemplos descrevem as modalidades preferidas da invenção. Outras modalidades dentro do escopo das reivindicações tor-nar-se-ão aparentes àquele versado na técnica ao considerar o relatório descritivo ou a prática de invenção como descrita aqui. É um objetivo aqui que o relatório descritivo, juntamente com os exemplos, seja considerado apenas exemplificativo, em que o escopo e o espírito da invenção são indicados pelas reivindicações que seguem os exemplos. EXEMPLOS EXEMPLO 1 Esse exemplo ilustra as seqüências de nucleotídeos sintéticas que codificam uma proteína Cry1 A. 105 inseticida.

Uma sequência de nucleotídeos como estabelecida na SEQ ID NO:1 que codifica a proteína inseticida Cry1A.105 foi construída para uso em plantas dicotiledôneas. A tradução da seqüência de aminoácidos é estabelecida na SEQ ID NO:2. O segmento de codificação da toxina consiste em nucleotídeos de cerca da posição 1 até cerca da posição 1830, mais ou menos.

Uma seqüência de nucleotídeos como estabelecida na SEQ ID NO:3 que codifica uma seqüência de aminoácidos de Cry1A.105 foi construída para expressão em plantas monocotiledôneas. A translação de seqüência de aminoácidos está estabelecida na SEQ ID NO:4. O segmento que codifica a toxina consiste em nucleotídeos de cerca da posição 1 até cerca da posição 1830, mais ou menos.

As seqüências de nucleotídeos conforme estabelecidas na SEQ ID NO:1 e na SEQ ID NO:3 são equivalentes substanciais uma da outra. ' SEQ ID NO:1 e SEQ ID NO:3 exibem uma identidade global de cerca de 94,3%. As duas seqüências de codificação são idênticas a partir de cerca de a posição de nucleotídeo 1330 até a posição de nucleotídeo 3534. A porção que codifica a toxina de cada seqüência consiste em de cerca da posição de nucleotídeo 1 até a posição de nucleotídeo 1830, e estes segmentos exibem cerca de 88,9% de identidade em relação um ao outro. As diferenças substanciais entre as duas seqüências residem dentro de cerca da posição de nucleotídeo 1 até cerca da posição de nucleotídeo 1329, ou cerca do primeiro dois terços de segmento que codifica a porção de toxina da proteína Cry1A.105. As duas seqüências exibem cerca de 84,7% de identidade atra- vés deste segmento.

Uma cepa de £ coli (TOP10, Invitrogen, Inc.) transformada com um plasmídio desenhado como pMON70522 contendo um marcador sele-cionáve! de beta-lactamase e uma seqüência conforme estabelecida na SEQ ID NO:3 que codifica uma Cry1A.105 foi depositada em 31 de agosto de 2005, na Autoridade de Depositário Internacional Agriculture Research Cuí-ture Collection (NRRL) na 1815 North University Street, em Peoria, Illinois 61604, E.U.A., de acordo com o Tratado de Budapeste sobre o Reconhecimento Internacional do Depósito de Microorganismos para Fins de Procedimentos de Patente e foi designada como NRRL B-30873. EXEMPLO 2 Esse exemplo ilustra plantas de algodão transgênicas que expressam uma proteína Cry1A.105.

Sementes de algodão Delta e Pineland DP50 foram esterilizadas na superfície e germinaram durante a noite. Explantes do meristema foram isoladas e a folhas primárias foram removidas por microdissecção. Os explantes dissecados foram colocados em um meio de alvejamento de modo que os meristemas foram orientados perpendicularmente à direção da distribuição de partículas, O vetor de transformação, pMON47740, compreende um cassete de expressão tendo uma seqüência de nucleotídeos estabelecida na SEQ ID NO:9. Um fragmento Kpnl com um gene marcador GUS sob o controle de um promotor e35S e uma seqüência de codificação de Cry1A.105 alvejada para o cloroplasto sob o controle de um promotor eFMV foi submetida à excisão deste plasmídio e isolada por HPLC e usada para transformação com pistola dos explantes de meristema de algodão. DNA purificado contendo ambos o cassete de expressão de Cry1A.105 e o marcador GUS foi precipitado sobre contas microscópicas de ouro e revestido em uma camada delgada de uma lâmina Mylar. O DNA foi acelerado no tecido de meristema por distribuição de partículas de descarga elétrica sob vácuo parcial. Seguinte ao bombardeio, os explantes foram desmarcados em meios isentos de hormônio sem agente seletivo. Foram feitas amostras de tecidos das folhas das plantículas e ensaiadas para expressão do marca- dor GUS. As plantas transgênicas exibindo um alto nível de expressão de GUS foram enviadas para a estufa para posterior triagem. Essas plantas foram novamente testadas quando à expressão de GUS e porções negativas das plantas foram podadas. Esse ciclo de amostragem e poda dos tecidos negativos para GUS foi repetido até que todos os setores de cada planta fossem positivos para o marcador de GUS. As plantas foram mantidas sob condições de estufa padrão até colheita das sementes.

Tecidos obtidos de plantas de algodão transgênicas positivos para GUS Ft foram testados em bioensaios para atividade inseticida contra gorgulhos de algodão (CBW) e lagarta dos cereais do outono (FAW). Plantas de algodão isogênicas geradas anteriormente expressando níveis inseticidas de CrylAc ou uma combinação de CrylAc e Cry2Ab foram usadas como controles positivos e uma isolina não transgênica foi usada como o controle negativo.

Ensaios em quadrados de CBW foram usados como um meio de determinar a atividade inseticida das plantas de algodão transgênicas (A-damczyck et al., (2001) J. Econ. Entomoi 94:284-290; Kranthi et al (2005) Current Science 89:291-298). Quadrados de tecido de folha (tamanho correspondente à cabeça e maior) foram coletados e colocados individualmente em cavidades de ensaio. Cada quadrado foi infestado com uma larva de CBW de terceiro instar simples. O número de insetos sobreviventes foi registrado cinco dias após a infestação.

Ensaios de gorgulhos CBW foram também usados para determinar a atividade inseticida do tecido de gorgulho coletado de plantas transgênicas, Oito gorgulhos verdes e duros (pós-florescimento) de cada evento foram coletados e colocados em taça individuais e infestados com larvas de CBW de terceiro instar. O número de insetos sobreviventes foi registrado cinco dias após a infestação.

Ensaios de folhas foram conduzidos para determinar a atividade inseticida de tecido de folha transgênica contra FAW. Novas folhas foram retiradas das terminações das plantas de algodão. 2 punções de folhas, cada com cerca de 1,91 cm (3/4") de diâmetro, foram colhidas e colocadas em cada uma das 16 cavidades individuais de ensaio. Cada cavidade foi infestada com uma simpies larva de FAW no segundo ou terceiro instar. O número de insetos sobreviventes foi registrado cinco dias depois da infestação.

Os resultados dos bioensaios estão mostrados na Tabela 1. Os resultados mostram que eventos de algodão transgênicos expressando Cry1A.105 exibiram maior atividade inseticida que eventos transgênicos expressando ou CrylAc ou uma combinação de CrytAc e Cry2Ab contra ambos FAW eCBW. TABELA 1. RESULTADOS DOS BIOENSAIOS DE FAW E CBW USANDO O TECIDO DA PLANTA DE ALGODÃO TRANSGÊNICA.

Lagartas de broto de tabaco e lagartas de espiga de milho foram testadas também em bioensaios similares. Em cada caso, as plantas com Cry1A.105 exibiram atividade inseticida também contra essas pragas. EXEMPLO 3 Esse exemplo ilustra plantas de milho transgênicas que expressam uma proteína Cry1A.105.

Plantas de milho transgênicas foram regeneradas de células transformadas com o vetor pMON4032. pMON402232 contém um cassete de expressão tendo uma seqüência de nucleotídeos como estabelecida na SEQ ID NO:7 que contém, em ligação operável, um promotor do CAMV 35S intensificado, uma seqüência líder CAB de milho, íntron de actina 1 de arroz, um seqüência de codificação de Cry1A.105 e uma seqüência de terminação de transcrição 3’ do gene hsp17 de trigo e de poliadenilação. Uma sequência de nucleotídeos que codifica uma seqüência marcadora de cloroplasto de Arabidopsis thaliana EPSPS (At.EPSES-CTP2) está posicionada a montante de e em alinhamento com a seqüência de codificação de Cry1A.105. pMON40232 contém um gene recombinante que codifica uma EPSPS que é insensível ao herbicida glifosato, para uso na seleção de eventos transgêni-cos. Os eventos transgênicos que surgem de tecido transformado com pMON40232 foram designados como LAJ 105. Eventos transgênicos passaram por triagem para verificação da ausência de qualquer cadeia principal de vetor, da presença de um seqüência inserida simples e única, e da intatilidade do cassete de expressão contendo a seqüência de nucleotídeos que codifica a proteína Cry1A.105.

Os bioensaios foram conduzidos com eventos que satisfizeram as limitações da seleção de eventos. Plantas de milho transgênicas LAJ105 foram comparadas no bioensaio a um controle negativo para LH198 e uma variedade de MON810 de controle positivo expressando a porção inseticida de uma proteína CrylAb. Cincos discos de folhas, cada um com cerca de um centímetro de diâmetro, foram obtidos de cada um dos 10 eventos transgênicos de Cryl A.105 individuais e dos controles. Os discos de folhas foram colocados em cavidades preenchidas com ágar para manter a turgidez do material da planta. Os discos foram então submetidos à alimentação por larvas neonatas de FAW, lagarta de agrotídeo preta {BCW), broca de milho europeu (ECB), lagarta de espiga de milho (CEW), e de broca de milho do sudoeste (SWCB). Uma única larva neonata de FAW, uma única larva neo-nata de CEW, duas larvas neonatas de BCW, duas larvas noenatas de SWCB, ou quatro larvas neonatas de ECB foram aplicadas a cada cavidade. Dano por alimentação foi avaliado depois de quatro dias, usando uma escala de classificação de dano à folha (LDR) de 0 a 11,0 indicando dano por alimentação visível, 11 indicando que pelo menos 50% do disco havia sido comido, e cada ponto na classificação da escala entre 0 e 11 indicando um aumento de 5% em dano de alimentação observada no disco de folha em observação.

Os resultados dos bioensaios indicaram que eventos expressando a proteína Cry1A.105 exibiram maior atividade inseticida para FAW, ECB e CEW que a LDR exibida pelo controle com Cry1 Ab contra as mesmas larvas de pragas. LDR para essas três pragas nos eventos de Cry1A.105 foi menor que 1 enquanto para o controle com CrylAb exibiu LDR de cerca de 8 a cerca de 10. A LDR ficou consistentemente entre 1 e 2 ambos para os eventos de Cry1A.105 e para o controle com CrylAb quando testados para atividade contra SWCB, indicando que a proteína Cry1A.105 não era mais tóxica para SWCB que era para CrylAb. Os resultados desse bioensaio suportaram os resultados prévios que indicaram que CrylAb é ineficaz no controle de BCW. Os eventos de Cry1A.105 não foram mais eficazes contra BCW que foi o controle CrylAb. Assim, nos níveis de expressão da proteína Cry1A.105 in planta, essas plantas seriam eficazes no controle de pragas de plantas do gênero lepidóptero incluindo, mas sem limitação, Anticarsia, Pseudoplusia, fíachiplusia, Helicoverpa, Heliothis, Spodoptera, Epinotia, e Armigera.

REIVINDICAÇÕES

Claims (17)

1. Polinucleotídeo recombinante, caracterizado pelo fato de que é selecionado do grupo que consiste em SEQ ID NO:1 e SEQ ID NO:3., em que o referido polinucleotídeo recombinante codifica uma proteína inseticida compreendendo a sequência de aminoácidos como estabelecida na SEQ ID NO:2 da posição de aminoácido 10 até a posição de aminoácido 600.

2. Polinucleotídeo recombinante de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que é expresso em uma planta de colheita.

3. Polinucleotídeo recombinante de acordo com a reivindicação 2, caracterizado pelo fato de que a planta de colheita é selecionada do grupo que consiste em planta de colheita monocotiledônea e planta de colheita dicotiledônea.

4. Polinucleotídeo recombinante de acordo com a reivindicação 3, caracterizado pelo fato de que a referida planta monocotiledônea é selecionada do grupo que consiste em milho, trigo, aveia, arroz, sorgo, milo, trigo sarraceno, centeio, capim-de-rebanho (Phleum pratense), bromo, orquídea, Santo Agostinho, Bermuda, agróstea, e cevada.

5. Polinucleotídeo recombinante de acordo com a reivindicação 2, caracterizado pelo fato de que a referida planta dicotiledônea é selecionada do grupo de plantas que consiste em alfafa, maçã, abricó, aspargo, feijão, frutinhas sem caroço, amora-preta, mirtilo, canola, cenoura, couve-flor, aipo, cereja, grão-de-bico, plantas cítricas, algodão, feijão-caupi, uva do monte, pepino, planta cucurbitácea, planta da berinjela, árvore frutífera, uva, limão, alface, linhaça, melão, mostarda, árvore contendo amêndoas, quiabo, laranja, ervilha, pêssego, amendoim, pêra, ameixa, batata, soja, abóbora, morango, beterraba, girassol, batata doce, tabaco, tomate, nabo e vegetais.

6. Proteína inseticida, caracterizada pelo fato de que é expressa a partir do polinucleotídeo recombinante, como definido na reivindicação 1, a referida proteína compreendendo a sequência de aminoácidos como estabelecida na SEQ ID NO:2 da posição de aminoácido 10 até a posição de aminoácido 600.

7. Composição inseticida, caracterizada pelo fato de que com- preende a proteína inseticida, como definida na reivindicação 6 e um veículo agricolamente aceitável.

8. Cassete de expressão, caracterizado pelo fato de que compreende, em ligação operável, uma sequência de promotor funcional em uma célula hospedeira e o polinucleotídeo recombinante, como definido na reivindicação 1.

9. Cassete de expressão de acordo com a reivindicação 8, caracterizado pelo fato de que a referida célula hospedeira é selecionada do grupo que consiste em uma célula bacteriana, uma célula fúngica, uma célula de mamífero e uma célula vegetal.

10. Cassete de expressão de acordo com a reivindicação 9, caracterizado pelo fato de que: (a) a referida célula bacteriana é selecionada de uma célula da espécie Bacillus, uma célula da espécie Enterobacteriacae, uma célula da espécie Pseudomonas, uma célula da espécie Clostridium, e uma célula da espécie Rhizobium, e uma célula da espécie Agrobacteriurrr, e (b) a referida célula vegetal é selecionada do grupo de plantas que consiste em de uma planta dicotiledônea e uma planta monocotiledô-nea, em que a referida planta dicotiledônea é ainda selecionada do grupo que consiste em alfafa, maçã, abricó, aspargo, feijão, frutinhas sem caroço, amora-preta, mirtilo, canola, cenoura, couve-flor, aipo, cereja, grão-de-bico, plantas cítricas, algodão, feijão-caupi, uva do monte, pepino, planta cucurbi-tácea, planta da berinjela, árvore frutífera, uva, limão, alface, linhaça, melão, mostarda, árvore contendo amêndoas, quiabo, laranja, ervilha, pêssego, amendoim, pêra, ameixa, batata, soja, abóbora, morango, beterraba, girassol, batata doce, tabaco, tomate, nabo e vegetais, e sendo a referida planta monocotiledônea ainda selecionada do grupo que consiste em milho, trigo, aveia, arroz, sorgo, milo, trigo sarraceno, centeio, gramínea (capim-do-prado, capim-de-rebanho (Phleum pratense), bromo, orquídea, Santo Agostinho, Bermuda, agróstea), e cevada.

11. Cassete de expressão de acordo com a reivindicação 8, caracterizado pelo fato de que a referida célula hospedeira é uma célula vege- tal e o referido cassete de expressão ainda compreende, em ligação operá-vel, um polinucleotídeo selecionado do grupo que consiste em uma sequência intensificadora de expressão, uma sequência líder não traduzida, uma sequência de íntrons, uma sequência que codifica peptídeos alvo do cloro-plasto, e uma sequência de terminação de transcrição e poliadenilação.

12. Vetor, caracterizado pelo fato de que compreende o cassete de expressão, como definido em qualquer uma das reivindicações 8 a 11.

13. Método para controlar a infestação por insetos lepidópteros de uma planta, caracterizado pelo fato de que compreende fornecer na dieta do inseto uma ou mais célula(s) de planta transformada(s) com o cassete de expressão, como definido na reivindicação 8.

14. Cassete de expressão de acordo com a reivindicação 11, caracterizado pelo fato de que compreende um polinucleotídeo selecionado do grupo que consiste em SEQ ID NO:5 e SEQ ID NO:7.

15. Método para proteger uma colheita em um campo de infestação por insetos lepidópteros, caracterizado pelo fato de que compreende: (a) fornecer uma planta de colheita transformada para expressar a proteína inseticida, como definida na reivindicação 6; (b) fornecer a referida planta de colheita na dieta do inseto lepi-dóptero, protegendo assim a planta de colheita da infestação por insetos lepidópteros.

16. Método de acordo com a reivindicação 15, caracterizado pelo fato de que a referida planta de colheita transgênica compreende ainda um agente inseticida adicional tóxico para a mesma espécie de inseto como a referida proteína inseticida e é selecionado do grupo que consiste em uma toxina de Bacillus, uma toxina de Xenorhabdus, uma toxina de Phorhabdus, e um dsRNA para supressão gênica na referida espécie de inseto.

17. Método de acordo com a reivindicação 16, caracterizado pelo fato de que o referido agente inseticida adicional é uma toxina Bacillus selecionada do grupo de proteínas consistindo em uma toxina Cry1, Cry2, Cry5, Cry9, e VIP.