CN102981001B

CN102981001B - 一种评价棉铃虫抗性治理效果的方法

Info

Publication number: CN102981001B
Application number: CN201210480447.4A
Authority: CN
Inventors: 梁革梅; 魏纪珍; 张丽丽; 高珍; 张永军
Original assignee: Institute of Plant Protection of Chinese Academy of Agricultural Sciences
Current assignee: Institute of Plant Protection of Chinese Academy of Agricultural Sciences
Priority date: 2012-11-22
Filing date: 2012-11-22
Publication date: 2014-11-12
Anticipated expiration: 2032-11-22
Also published as: CN102981001A

Abstract

本发明涉及一种评价棉铃虫抗性治理效果的方法。该方法包括以下步骤：1）选择两种用于治理棉铃虫的药物；2）接种敏感或抗性棉铃虫幼虫；3）观察幼虫死亡情况，计算死亡率；4）建立二因素D-饱和方法建立回归方程，评价两种药物的治理效果。本发明方法可操作性强，准确高效，可在Bt蛋白或其他蛋白防治害虫和治理抗性的效果评价中广泛应用。

Description

一种评价棉铃虫抗性治理效果的方法

技术领域

本发明涉及生物检测领域，具体地，涉及一种评价棉铃虫抗性治理效果的方法。

背景技术

棉花是关系国计民生的战略物资，也是仅次于粮食的第二大农作物。棉铃虫是危害棉田的主要害虫之一，上世纪90年代初棉铃虫的大爆发给我国的国民经济造成了巨大的经济损失。为了有效的防治棉铃虫，1996年转基因棉花在美国商业化种植，之后其种植面积在世界范围内快速增长，我国1997年由河北省开始引种美国Bt-Cry1Ac抗虫棉，1999年国产抗虫棉开始商业化种植。2001年以前Bt棉花主要种植于黄河流域棉区，种植面积约50万公顷，到2006年已广泛种植于各个棉区，面积达400万公顷，占全国棉花种植面积的70%，2011年中国的转基因棉花种植比例达到71.5%。

转Bt棉花的广泛种植在带来巨大收益的同时，害虫对Bt的抗药性也成为一个不容忽视的问题。Tabashnik等2008年报道美国的东南部棉铃虫在田间对Bt棉产生了抗性；Tabashnik等2010报道印度从2002年开始使用第一代转基因棉花，到2009年田间的红铃虫已对Cry1Ac产生了抗性。很多国际育种公司先后开发了第二代转基因棉花，如Monsanto公司的BollgardⅡ（表达Cry2Ab和Cry1Ac蛋白），DowAgroSciences公司的WideStrike（表达CrylF和CrylAc蛋白），Syngenta公司的VipCot（表达Vip3A和Cry1Ab蛋白）等。

转双价基因抗虫棉花除扩大杀虫谱外，还可以起到延缓靶标害虫抗性发展的作用。因此，新蛋白的选择基本原则是表达的两种蛋白之间不存在交互抗性，评价新蛋白与抗性棉铃虫的交互抗性及蛋白间的协同作用，对未来转双价基因抗虫棉花的推广具有重要影响。转基因植物的制备过程是一个复杂漫长的过程，受多种因素的影响，转基因植物由于基因突变等影响，其效果具有不确定性，需要进行大量筛选工作。因此，在新基因转入棉花前，在室内对其新型蛋白的效果进行评价可以节省大量的人力、物力、财力。

目前主要是采用多次生物测定的方法分别测定新蛋白对棉铃虫的防治效果、新蛋白对抗性棉铃虫的治理效果、两种蛋白混用对敏感棉铃虫的增效；没有评价两种蛋白混用对抗性棉铃虫的治理效果。

因此迫切需要一种通过一次生物测定，就可以评价两种蛋白混用治理棉铃虫的效果。

发明内容

本发明目的是提供一种评价棉铃虫抗性治理效果的方法，用于简单、快速、高效的全面评价两种蛋白的作用效果。

本发明通过二因素D-饱和最优试验设计、采用表面涂抹法对敏感和抗性棉铃虫初孵幼虫分别进行生物测定，根据回归方程，对两种蛋白的作用效果、主要作用因子、最优的浓度组合进行分析。

具体地，所述方法包括以下步骤：

1）选择两种用于治理棉铃虫的药物；

2）接种敏感或抗性棉铃虫幼虫；

3）观察幼虫死亡情况，计算死亡率；

4）建立二因素D-饱和方法建立回归方程，评价两种药物的治理效果。

其中，所述药物为Cry2Ab蛋白、Cry1Ab蛋白、CrylF蛋白、Vip3A蛋白和Cry1Ac蛋白等中的任意两种。所述药物的浓度为0-4.760μg/cm²。

其中，所述棉铃虫幼虫的接种量为24头以上棉铃虫幼虫/单位体积药物。所述棉铃虫幼虫培养的人工饲料为改进的棉铃虫饲料，饲料组成包括玉米粉、黄豆粉、酵母粉、蔗糖、维生素（具体配方参照《人工饲养棉铃虫技术的改进》中的配方4，植物保护，梁革梅等，1999）；所述棉铃虫幼虫培养的条件为温度27±2℃，湿度75±10%，光照14:10(L:D)h。

对于敏感品系棉铃虫，建立回归方程： x₁代表第一种药物浓度编码值，x₂代表第二种药物浓度编码值、代表理论死亡率，

当回归方程的差异显著性分析达到显著水平时（F>F 0.05），表明实际死亡率与吻合，回归方程能反应实际情况；

当两因素的回归系数差异显著时（t>t 0.05），表明两种药物作用显著；

将两因素的回归系数绝对值大小，绝对值大的为起主要作用的药物；

通过交互效应、最优浓度配比分析，得到两种药物作用的最佳浓度配比。

优选地，所述两种药物为Cry1Ac蛋白和Cry2Ab蛋白时，其治理敏感棉铃虫浓度均为1.75-3.65μg/cm²。

对于BtR品系棉铃虫，建立回归方程：

\hat{y} = 5.383 + 0.473 x 1 + 0.526 x 2 - 0.105 x 12 - 0.474 x 22 - 0.0181 x 1 x 2;

x1代表第一种药物浓度编码值，x2代表第二种药物浓度编码值、代表理论死亡率，

优选地，所述两种药物为Cry1Ac蛋白和Cry2Ab蛋白时，其治理BtR品系Cry1Ac抗性棉铃虫的最佳浓度配比为：Cry1Ac蛋白浓度为2.49-4.23μg/cm²，Cry2Ab蛋白浓度为1.10-4.28μg/cm²。

本发明实施例中还进一步提供以下具体地实施方案：

1）供试棉铃虫

敏感品系和BtR品系Cry1Ac抗性品系棉铃虫的初孵幼虫。

2）两种Bt蛋白的浓度配比

利用二因素D-饱和最优试验设计，针对两种蛋白因素，按下表的浓度设计3次重复的饱和试验，进行生物测定。

表1二因素的编码及浓度设置

3）生物测定方法

本发明采用表面涂抹方法进行生物测定。所述方法如下：先在24孔板中先加入1ml未凝固的人工饲料（饲料组成主要有玉米粉、黄豆粉、酵母粉、蔗糖、维生素等，配方参照梁革梅等（1999）中的配方4），待饲料凝固后，再加入表1中不同浓度的60μl/孔Bt蛋白，加入后轻轻晃动24孔板，使药液均匀的平铺在饲料表面上。每个处理接24头初孵幼虫，设三次重复，第7天检查幼虫死亡率。

4）数据分析

将死亡率转化为几率值，根据结果建立回归方程，对两种蛋白因子的作用效果、主要作用蛋白因子、两蛋白最优的浓度组合进行分析。如果回归方程的差异显著性分析达到显著水平，说明回归方程能够反应实际情况；分析回归方程中两蛋白因素的回归系数，如果差异达到显著水平表明对死亡率的影响显著；而且两蛋白因素的回归系数相比，绝对值越大的对结果的影响越大，如果新蛋白对抗性品系棉铃虫死亡率的影响显著，那么表明新蛋白具有治理抗性的效果；根据交互效应和最优浓度配比分析，可以得到两种蛋白在实际应用中发挥最佳效果的最优配比，可用于两种蛋白合理的共同应用。

本发明的技术效果：

（1）本发明可用于评价新型蛋白治理棉铃虫抗性效果和毒力效果，用于评价新型苏云金芽孢杆菌（Bt）蛋白或其他生物蛋白对治理抗性棉铃虫的效果，及新蛋白与一种已广泛应用蛋白混合使用对棉铃虫的增效作用。

（2）本发明方法可操作性强，准确高效，可在Bt蛋白或其他蛋白防治害虫和治理抗性的效果评价中广泛应用。

附图说明

图1为Cry1Ac和Cry2Ab对于敏感品系棉铃虫的作用效果图；其中Ⅰ-Ⅶ分别表示Cry1Ac浓度0μg/cm²、0.02μg/cm²、0.06μg/cm²、0.18μg/cm²、0.53μg/cm²、1.59μg/cm²、4.76μg/cm²，图中数据为平均值±标准误。

图2Cry1Ac和Cry2Ab对于BtR品系Cry1Ac抗性棉铃虫的作用效果图；其中Ⅰ-Ⅶ分别表示Cry1Ac浓度0μg/cm²、0.02μg/cm²、0.06μg/cm²、0.18μg/cm²、0.53μg/cm²、1.59μg/cm²、4.76μg/cm²，图中数据为平均值±标准误。

具体实施方式

以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。在不背离本发明精神和实质的情况下，对本发明方法、步骤或条件所作的修改或替换，均属于本发明的范围。

若为特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。

实施例1棉铃虫抗性治理效果的评价方法

1.1供试棉铃虫

敏感品系和抗性品系棉铃虫的初孵幼虫。

1.2Cry1Ac、Cry2Ab蛋白的浓度配比

利用二因素D-饱和最优试验设计，针对两种蛋白因素，按上述表1的浓度设计3次重复的饱和试验，进行生物测定。

1.3生物测定方法

本发明采用表面涂抹方法进行生物测定。所述方法如下：先在24孔板中先加入1ml未凝固的人工饲料（人工饲料为本实验室配制，饲料组成主要有玉米粉、黄豆粉、酵母粉、蔗糖、维生素等，配方参照梁革梅等（1999）中配方4），待饲料凝固后，再加入表1中不同浓度的60μl/孔Bt蛋白，加入后轻轻晃动24孔板，使药液均匀的平铺在饲料表面上。每个处理接24头初孵幼虫，设三次重复，第7天检查幼虫死亡率。棉铃虫幼虫培养的条件为温度27℃，湿度75%，光照14:10(L:D)h。

1.4数据分析

实施例2Cry2Ab、Cry1Ac对治理敏感品系棉铃虫的效果评价

(一)对于敏感品系棉铃虫，矩阵结构和结果如表2。我们用公式F1得到每项的和B0、B1、B2、B21、B22和B12。根据表2的矩阵结构和公式F2，可以得到回归值b0、b1、b2、b21、b22和b12。然后可以得到回归方程：

\hat{y} = 9.04 + 1.83 x 1 + 0.31 x 2 - 1.89 x 12 - 0.80 x 22 - 0.808 x 1 x 2

(B_{ij}) = (\begin{matrix} B_{0} \\ B_{1} \\ . \\ . \\ . \\ B_{K} \end{matrix}) = (\begin{matrix} Σy \\ Σ x_{1} y \\ . \\ . \\ . \\ Σ x_{i} x_{j} \end{matrix})

F_{2} : (\begin{matrix} b_{0} \\ b_{1} \\ \cdot \\ \cdot \\ \cdot \\ b_{(p - 1), p} \end{matrix}) = (\begin{matrix} B_{0} \\ B_{1} \\ \cdot \\ \cdot \\ \cdot \\ B_{K} \end{matrix}) (\begin{matrix} C_{00} C_{01} & \cdot \cdot \cdot & C_{0 k} \\ C_{10} C_{11} & \cdot \cdot \cdot & C_{1 K} \\ \cdot & \cdot \\ \cdot & \cdot \\ \cdot & \cdot \\ C_{k 0} C_{k 1} & \cdot \cdot \cdot & C_{kk} \end{matrix})

F3:F回=Q回*f误/f回*Q误

F4:Se=(Qerr/ferr)1/2

F5:tbj=bjj/(Se＊Cjj1/2)

表2 96S品系的试验矩阵结构和结果

1、回归方程的显著性分析

因为在这个试验中我们做了三次重复，所以用有重复的情况下验证回归方程的显著性，如公式F3，得到F回=1434.25。查F表，f1=5，f2＝10时，F0.05=3.33，F0.01＝5.64。因F回﹥F0.01,故差异极显著，说明此回归方程关系显著，能够反应实际情况。

2、回归系数的显著性分析

用F4和F5进行回归系数的显著性测定，得到：t0=89.47；t1=33.82；t2=5.69；t11=16.92；t22=7.15；t12=13.27。查t表，当f＝10时,t0.01＝3.17，比较得出都大于3.17，则Cry1Ac和Cry2Ab单用和混用对于敏感品系（96S）死亡率的影响都极显著。

3、因子主次分析

偏回归系数绝对值的大小反映了因素的主次，符号的正负反应了因素水平的取值方向。｜1.83｜>｜0.31｜，则b1>b2；表明一定范围内Cry1Ac对敏感品系（96S）死亡率的影响是主要因素。

4、交互效应分析

将4个编码值分别代入回归方程式的x1和x2中求出x1x2的交互效应值，见表3。由表3可知，当Cry1Ac浓度编码值取0.3945水平时,Cry2Ab浓度的编码值取-0.1315时,交互效应最高，理论死亡率几率值为9.50，即死亡率为100%。

5、最优浓度配比

用4个编码值，每两两组合，共组成4*4=16个全因子试验，分别代入回归方程式中的x1和x2中，即可模拟出16个试验结果表3，其中包括已经实施的6个试验在内。根据实际的需要，将杀死一半以上害虫为最优组合，则从16个组合中选出满足约束条件的15个组合（见表3中画√者）。

对入选的15个组合进行综合分析，确定最优浓度组合，列出最优组合的频数分布表进行分析（表4）。对入选的15个最优组合进行平均数、标准差、标准误、95%的置信限以及最优浓度范围的计算，最后得出在防治该品系棉铃虫时Cry1Ac和Cry2Ab的浓度都在1.75到3.65μg/cm²范围内效果最佳。

表3模拟实验结果

表4最优组合频数分布

df＝15;t_0.05=2.131

实施例3Cry2Ab、Cry1Ac对治理Cry1Ac抗性棉铃虫的效果评价

对于抗Cry1Ac的BtR品系，其矩阵结构和结果见表5，如上同样的分析得到回归方程：

\hat{y} = 5.383 + 0.473 x 1 + 0.526 x 2 - 0.105 x 12 - 0.474 x 22 - 0.0181 x 1 x 2

1、回归方程的显著性分析

F回=11.60﹥F0.01=5.64，故差异极显著，说明此回归方程关系显著，能反映实际情况。

2、回归系数的显著性分析

通过计算得到：t1=2.42>t0.05=2.23；t2=2.69>t0.05=2.23，说明Cry1Ac和Cry2Ab对于死亡率的作用都比较显著。

3、因子主次分析

｜0.53｜>0.47｜，则b2>b1,表明一定范围内Cry2Ab对抗Cry1Ac品系棉铃虫死亡率的影响是主要因素。

表5 BtR品系的试验矩阵结构和结果

4、交互效应分析

将4个编码值分别代入回归方程式的x1和x2中求出x1x2的交互效应值，见表6。由表6可知，当Cry1Ac浓度编码值取1水平时,Cry2Ab浓度的编码值取1时,交互效应最高，理论死亡率几率值为5.78，即死亡率为78.30%。

5、最优浓度配比

用4个编码值，每两两组合，共组成4*4=16个全因子试验，分别代入回归方程式中的x1和x2中，即可模拟出16个试验结果表6，其中包括已经实施的6个试验在内。根据实际的需要，将杀死一半以上害虫为最优组合，则从16个组合中选出满足约束条件的9个组合（见表6中画√者）。

对入选的9个组合进行综合分析，确定最优浓度组合，列出最优组合的频数分布表（表7）进行分析。对入选的9个最优组合进行平均数、标准差、标准误、95%的置信限以及最优浓度范围的计算，最后得出在防治该品系棉铃虫时Cry1Ac在2.49-4.23μg/cm²和Cry2Ab的浓度1.10-4.28μg/cm²范围内效果最佳。

表6模拟实验结果

表7最优组合频数分布

df＝9;t_0.05=2.262

实施例4Cry1Ac和Cry2Ab混用的增效作用

分别以0.02，0.06，0.18，0.53，1.59和4.76μg/cm²的浓度测定Cry1Ac（A₁-A₆）和Cry2Ab（B₁-B₆）蛋白单用时对敏感和抗性棉铃虫幼虫的死亡率，再将两种蛋白各浓度交叉组合，测定36种浓度处理下对抗、感棉铃虫的毒杀效果（表8）。将死亡率进行反正弦转化后，进行ANOVA数据分析，用Tukey法进行多重比较。

表8浓度配比分布表

A₁B₁	A₁B₂	A₁B₃	A₁B₄	A₁B₅	A₁B₆
						A₂B₁	A₂B₂	A₂B₃	A₂B₄	A₂B₅	A₂B₆
A₃B₁	A₃B₂	A₃B₃	A₃B₄	A₃B₅	A₃B₆
						A₄B₁	A₄B₂	A₄B₃	A₄B₄	A₄B₅	A₄B₆
A₅B₁	A₅B₂	A₅B₃	A₅B₄	A₅B₅	A₅B₆
						A₆B₁	A₆B₂	A₆B₃	A₆B₄	A₆B₅	A₆B₆

Cry1Ac对敏感种群的致死中浓度是0.025μg/cm²；Cry2Ab对敏感种群的致死中浓度是0.43μg/cm²，Cry1Ac的杀虫活性比Cry2Ab高17.44倍（图1）。从图中结果可以看出，当Cry1Ac和Cry2Ab浓度都是1.59-4.76μg/cm²时，棉铃虫的死亡率大于98%，防治效果非常好。与用本发明测定结果基本一致。

BtR品系棉铃虫对Cry1Ac的抗性倍数是2194.15倍，Cry2Ab对BtR棉铃虫品系的抗性倍数为4.86倍（图2）。Cry1Ac对BtR抗性品系棉铃虫的毒杀效果明显降低，能杀死95.83%敏感棉铃虫的1.59μg/cm²Cry1Ac只能使19.44%抗性品系棉铃虫死亡。此时，只有Cry1Ac浓度大于1.59μg/cm²、Cry2Ab浓度大于0.53μg/cm²时，抗性棉铃虫死亡率才能达到95%以上，取得最优防治效果。与用本发明测定结果基本一致。

由此可知，本发明可以评价两种蛋白不同配比混用治理棉铃虫的效果，不仅可以评价新蛋白对棉铃虫的防治效果，还可以评价新蛋白对抗性棉铃虫的治理效果，同时还可以评价两种蛋白间的交互作用及混用的增效，并筛选到蛋白的最优浓度组合。

虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

Claims

1.一种评价棉铃虫抗性治理效果的方法，包括以下步骤：

1)选择两种用于治理棉铃虫的药物，所述棉铃虫为敏感品系棉铃虫，药物为Cry1Ac蛋白和Cry2Ab蛋白；

2)接种敏感棉铃虫幼虫，Cry1Ac蛋白和Cry2Ab蛋白治理敏感品系棉铃虫的浓度均为1.75-3.65μg/cm²，所述棉铃虫幼虫的培养条件为温度27±2℃，湿度75±10％，光照14:10h；

3)观察幼虫死亡情况，计算死亡率；

4)利用二因素D-饱和方法建立回归方程，评价两种药物的治理效果，对于敏感品系棉铃虫，建立回归方程：

\hat{y} = 9.04 + 1.83 x_{1} + 0.31 x_{2} - 1.89 {x_{1}}^{2} - 0.80 {x_{2}}^{2} - 0.808 x_{1} x_{2},

x₁代表第一种药物浓度编码值，x₂代表第二种药物浓度编码值、代表理论死亡率；

当回归方程的差异显著性分析达到显著水平时，表明实际死亡率与吻合，回归方程能反应实际情况；

当两因素的回归系数差异显著时，表明两种药物作用显著；

将两因素的回归系数绝对值大小相比，绝对值大的为起主要作用的药物；

2.一种评价棉铃虫抗性治理效果的方法，包括以下步骤：

1)选择两种用于治理棉铃虫的药物，所述棉铃虫为BtR品系Cry1Ac抗性棉铃虫，药物为Cry1Ac蛋白和Cry2Ab；

2)接种抗性棉铃虫幼虫，所述棉铃虫幼虫的培养条件为温度27±2℃，湿度75±10％，光照14:10h，其治理BtR品系Cry1Ac抗性棉铃虫的浓度为Cry1Ac蛋白：2.49-4.23μg/cm²，Cry2Ab蛋白：1.10-4.28μg/cm²；

3)观察幼虫死亡情况，计算死亡率；

4)利用二因素D-饱和方法建立回归方程，评价两种药物的治理效果，对于BtR品系Cry1Ac抗性棉铃虫，建立回归方程：

\hat{y} = 5.383 + 0.473 x_{1} + 0.526 x_{2} - 0.105 {x_{1}}^{2} - 0.474 {x_{2}}^{2} - 0.0181 x_{1} x_{2};

当两因素的回归系数差异显著时，表明两种药物作用显著；