CN102181460B

CN102181460B - 玉米螟谷胱甘肽-S-转移酶基因的RNAi干扰工程菌的构建方法

Info

Publication number: CN102181460B
Application number: CN201110056310A
Authority: CN
Inventors: 杨峰山; 张一桐; 刘春光; 刘丽萍; 陈思学
Original assignee: Heilongjiang University
Current assignee: Heilongjiang University
Priority date: 2011-03-09
Filing date: 2011-03-09
Publication date: 2012-09-19
Anticipated expiration: 2031-03-09
Also published as: CN102181460A

Abstract

玉米螟谷胱甘肽-S-转移酶基因的RNAi干扰工程菌的构建方法，它涉及谷胱甘肽-S-转移酶基因的RNAi干扰工程菌构建方法。构建：一、提取玉米螟总RNA，合成cDNA第一链，设计引物，进行PCR扩增，得Of-GST-RNAi320；二、Of-GST-RNAi320与L4440进行双酶切，回收所需目的片段，连接并构建L4440-Of-GST；三、将L4440-Of-GST转化到大肠杆菌HT115(DE3)中即完成。本发明操作简单、成本低，对玉米螟生长发育起到明显的抑制作用。

Description

玉米螟谷胱甘肽-S-转移酶基因的RNAi干扰工程菌的构建方法

技术领域

本发明涉及谷胱甘肽-S-转移酶基因的RNAi干扰工程菌构建方法。

背景技术

玉米螟(Ostrinia furnacalis)俗称钻心虫，是世界性重大害虫之一，其食性庞杂且分布极广。我国的华北、东北、西北是玉米螟严重危害区，其主要危害玉米、高粱和棉花等，是玉米的专化性害虫，主要以幼虫取食玉米植株和雄穗而造成植株上叶片虫孔、茎杆折断导致减产。据统计，玉米螟危害造成玉米减产高达10％～30％。并且，近年来由于气候变暖、玉米种植密度等因素的改变，玉米螟的危害日益加重。

目前，对玉米螟的防治措施主要包括物理防治、化学防治和生物防治三大技术手段。物理防治主要是利用螟蛾的趋光性，用诱虫灯诱杀玉米螟成虫以达到杀虫的效果。但它必须保证夜间连续供电，且需要大面积统一使用，效果才理想；化学防治主要是通过喷洒一些化学颗粒药剂进行防杀玉米螟，已取得了显著的效果，是目前防治玉米螟主要的技术手段。但其最大的缺点就是对生态环境造成了很大的污染，这与建立环保型生态环境的观念是相背的；生物防治同化学防治相比具有较强的针对性和选择性，生物防治没有不良的副作用，可长期有效地控制危害。生物防治中利用白僵菌和赤眼蜂防治需要充分考虑到不同地区不同的气候和其它可能影响防治效果的因素。而对于目前应用效果较好也较普遍的Bt生物防治手段，其本身也有一定的局限性，它容易被阳光中的紫外线失活，而且害虫会对它产生抗药性，从而使它的应用受到了限制。因此，寻求新的生物防治方法已成为亟待解决的问题。

昆虫谷胱甘肽-S-转移酶(Glutathione-S-transferase，GST)是一类在生物代谢中承担许多重要生理功能的超基因家族，该酶系在生物体对内源性和外源性有毒物质(次生代谢物、杀虫剂等)的降解过程中起着重要作用。其主要功能是催化谷胱甘肽的巯基与一些亲电子类有毒物质进行轭合反应，从而保护一些蛋白质免受损伤，达到解毒目的。迄今为止，已在很多昆虫中克隆到了GST的全长cDNA以及cDNA片段，但尚未有玉米螟谷胱甘肽-S-转移酶基因的相关报道。

发明内容

本发明提供玉米螟谷胱甘肽-S-转移酶基因的cDNA及其RNAi干扰工程菌的构建，目的是对玉米螟生长发育起到明显的抑制作用，从而为农业上防治昆虫提供一条新的途径。

本发明玉米螟谷胱甘肽-S-转移酶基因的cDNA全长为886bp，核苷酸序列如SEQ IDNo.1所示；该基因所编码的氨基酸序列如SEQ ID No.2所示。

玉米螟谷胱甘肽-S-转移酶RNAi干扰工程菌的构建方法按以下步骤进行：一、用Trizol法提取玉米螟三龄幼虫中肠总RNA，利用cDNA反转录试剂盒合成cDNA第一链，根据特定功能的dsRNA片段，设计特异性上游引物Of-GST-RNAi320-P1和下游引物Of-GST-RNAi320-P2，然后以上述得到的cDNA第一链为模板进行PCR扩增，获得目的片段Of-GST-RNAi320；二、目的片段Of-GST-RNAi320与表达载体L4440分别经Pst I和HindIII进行双酶切，回收所需目的片段，连接并构建重组质粒L4440-Of-GST；三、将构建好的重组质粒L4440-Of-GST转化到大肠杆菌HT115(DE3)中，即完成玉米螟谷胱甘肽-S-转移酶RNAi干扰工程菌的构建，命名为htL4440-Of-GST；

其中步骤一中特定功能的dsRNA片段的全长为320bp，核苷酸序列为：CGACGTACTTTTATCCCCAAGTCCTCGCTGGTGCTCCTGCTGACGAAGCCTTGTTGAAGATGCTGGAAGAGGCTCTCAAGTTCCTGGACACCTTCCTCGAAGGTCAGAAGTATGCTGCGGGCTCAGAACTGACCTTGGCTGACCTGTCGCTCGTGGCTACTGTGTCTACTATTGACGCTGCTGGCATATCCATCGAATCCTACCAGAGTGTCAACAAGTGGTTCACGCTGGTCAAATCTACCGCCCCCAAATACGACGAAGCGAACGGCCAAGGCGTAGAAATGTTTAGAGCCTTCGTGGCACAGCTCAAAGCCAAGACG；步骤一中上游引物Of-GST-RNAi320-P1的核苷酸序列为：TCGCTGCAGCGACGTACTTTTATCCCCAA(下划线表示Pst I酶切位点)，下游引物Of-GST-RNAi320-P2的核苷酸序列为：GACAAGCTTCGTCTTGGCTTTGAGCTGTG(下划线表示HindIII酶切位点)。

本发明提供玉米螟谷胱甘肽-S-转移酶基因的cDNA及其RNAi干扰工程菌的构建，对玉米螟生长发育起到明显的抑制作用，为农业上防治昆虫提供一条新的途径，从而拓展该解毒酶在农业上防治昆虫方面的应用。

本发明克隆了玉米螟GST基因cDNA全长，并利用操作简单、成本低且更利于研究昆虫基因功能的自然饲喂法RNAi干扰技术通过沉默GST基因而达到杀虫目的，可以在分子水平上研究玉米螟谷胱甘肽-S-转移酶基因，更好地探讨该基因与玉米螟抗性的关系，以及为进一步采用RNAi干扰技术来沉默玉米螟GST基因以减弱玉米螟对植物次生物质的耐受性，通过此方法有效抑制了玉米螟生长发育，为防治有害昆虫提供了新的途径。

本发明的生物学原理就是首先通过设计简并引物获得目的基因的保守片段，然后利用RACE技术获得全长序列，进而通过沉默昆虫谷胱甘肽-S-转移酶基因的mRNA，抑制此解毒酶的活性，使昆虫丧失解毒功能或解毒能力下降，从而来达到调控昆虫生长发育的目的。

本发明中RNAi干扰工程菌对玉米螟生长发育方面的研究做出了重大的铺垫，目前，在昆虫中现在用RNAi研究基因功能的方法主要是注射法，虽然注射法在昆虫基因功能的研究方面取得了很大的研究成果，但它具有很多缺点，如对实验操作人员有较高的技术要求且劳动强度大，实验成本高等。近几年来，人们开始尝试通过昆虫饲喂取食dsRNA来降低靶基因的表达，可以消除注射法所带来的大部分缺点。但从某种程度上来讲这仍旧只是另一种意义上的注射，操作复杂，工作量大，无法大规模进行基因功能研究。在本发明的基础上采用一种通过自然饲喂含有特定基因dsRNA饲料来有效抑制昆虫靶基因mRNA表达，以抑制昆虫的正常生长发育，该方法不仅操作简单，且不需要对特定dsRNA高度纯化，研究应用成本低，可以广泛应用于农业中。

附图说明

图1为具体实施方式二中构建重组质粒L4440-Of-GST进行双酶切鉴定的凝胶电泳图，其中M1泳道为DL5000 Marker，M2泳道为DL1000 Marker，1泳道为重组质粒L4440-Of-GST；图2为具体实施方式二中所构建的玉米螟谷胱甘肽-S-转移酶基因RNAi干扰工程菌htL4440-Of-GST对玉米螟幼虫进行干扰检测的对比结果图。

具体实施方式

本发明技术方案不局限于以下所列举具体实施方式，还包括各具体实施方式间的任意组合。

具体实施方式一：本实施方式玉米螟谷胱甘肽-S-转移酶基因的cDNA全长为886bp，核苷酸序列为：

TCGCGGATCCACAGCCTACTGATGATCAGTCGATGGA A A AGTCTTACTGTGGAGTTCTGAAGCGGTGCACGCGAGTTTCAAAGCTACA

TCGATCGACCTTTACTACACGGCCGGGTCAGCGCCCTGTCGCCTGGTGTTACTGGTGGCTGCCGCTCTGAACCTCGAACTCAACCTTAAGCCTCTAGACTTAAGGGCTGGAGAACAGCTCACACCAGAATTTTTACAGCTGAACCCACAACACACAGTTCCCACGATCATAGACGACGGCTTTTCGCTAAATCCTCCACACACAGTTCCCACGATCGTAGACGACGGCTTTTCGCTATGGGAATCGCGCGCCATCAGCCGATACCTGGTCAACAAGTACGGAGGGGCAGCCCTGTACCCTGAGGACCCGAAGGCGAGGGCTTTGGTGGACCAGAGACTGGACTTCGACTTGGGTACACTGTACCCCAGATTTGCGACGTACTTTTATCCCCAAGTCCTCGCTGGTGCTCCTGCTGACGAAGCCTTGTTGAAGATGCTGGAAGAGGCTCTCAAGTTCCTGGACACCTTCCTCGAAGGTCAGAAGTATGCTGCGGGCTCAGAACTGACCTTGGCTGACCTGTCGCTCGTGGCTACTGTGTCTACTATTGACGCTGCTGGCATATCCATCGAATCCTACCAGAGTGTCAACAAGTGGTTCACGCTGGTCAAATCTACCGCCCCCAAATACGACGAAGCGAACGGCCAAGGCGTAGAAATGTTTAGAGCCTTCGTGGCACAGCTCAAAGCCAAGACGGAGCTG

TCGTGAGACTGGTATAGTGCATAGTTTTGTATTAAGTAAATGTTTGATACATAAGTGAATT

TTGAAATTTAAAAGTAAAAAAAAAAAA；该基因所编码的氨基酸序列为：MetSerIleAspLeuTyrTyrThrAlaGlySerAlaProCysArgLeuValLeuLeuValAlaAlaAlaLeuAsnLeuGluLeuAsnLeuLysProLeuAspLeuArgAlaGlyGluGlnLeuThrProGluPheLeuGlnLeuAsnProGlnHisThrValProThrIleIleAspAspGlyPheSerLeuAsnProProHisThrValProThrIleValAspAspGlyPheSerLeuTrpGluSerArgAlaIleSerArgTyrLeuValAsnLysTyrGlyGlyAlaAlaLeuTyrProGluAspProLysAlaArgAlaLeuValAspGlnArgLeuAspPheAspLeuGlyThrLeuTyrProArgPheAlaThrTyrPheTyrProGlnValLeuAlaGlyAlaProAlaAspGluAlaLeuLeuLysMetLeuGluGluAlaLeuLysPheLeuAspThrPheLeuGluGlyGlnLysTyrAlaAlaGlySerGluLeuThrLeuAlaAspLeuSerLeuValAlaThrValSerThrIleAspAlaAlaGlyIleSerIleGluSerTyrGlnSerValAsnLysTrpPheThrLeuValLysSerThrAlaProLysTyrAspGluAlaAsnGlyGlnGlyValGluMetPheArgAlaPheValAlaGlnLeuLysAlaLysThrGluLeu。

本实施方式中ATG为翻译起始密码子；TAA为翻译终止密码子。

本实施方式中玉米螟谷胱甘肽-S-转移酶基因的全长序列是按照以下方法得到的：一、采用Trizol法提取玉米螟三龄幼虫中肠总RNA，利用反转录试剂盒合成cDNA；二、通过PCR技术扩增出目的基因的保守片段：根据NCBI数据库已报道的棉铃虫、大蜡螟、家蚕和云杉色卷蛾的GST氨基酸序列，通过DNAMAN生物软件比对后找到各物种GST基因的高度保守区，设计简并引物，即

Of-GST-JB-P1：5’-CC(C/T)CA(A/G)CACACAGT(C/G)CC(C/T)AC-3’；

Of-GST-JB-P2：5’-TA(T/C)TTCTG(G/A)CC(C/T)TCNAGGAA-3’；以上一步获得的cDNA为模板，通过PCR(94℃ 3min，94℃ 30s，55℃ 30s，72℃ 1min，35 cycles，72℃10min，4℃∝)扩增出目的基因的保守片段，扩增出的片段送上海英俊生物技术公司测序；三、利用RACE技术获得目的基因的cDNA全长：根据测序正确的保守片段分别设计5’RACE和3’RACE特异性引物GSP1和GSP2，参考TaKaRa公司的RACE试剂盒说明书进行从而获得GSTs全长序列。

具体实施方式二：本实施方式玉米螟谷胱甘肽-S-转移酶基因RNAi干扰工程菌的构建按以下步骤进行：一、用Trizol法提取玉米螟三龄幼虫中肠总RNA，利用cDNA反转录试剂盒合成cDNA第一链，根据特定功能的dsRNA片段，设计特异性上游引物Of-GST-RNAi320-P1和下游引物Of-GST-RNAi320-P2，然后以上述得到的cDNA第一链为模板进行PCR扩增，获得目的片段Of-GST-RNAi320；二、目的片段Of-GST-RNAi320与表达载体L4440分别经Pst I和HindIII进行双酶切，回收所需目的片段，连接并构建重组质粒L4440-Of-GST；三、将构建好的重组质粒L4440-Of-GST转化到大肠杆菌HT115(DE3)中，即完成玉米螟谷胱甘肽-S-转移酶RNAi干扰工程菌的构建，命名为htL4440-Of-GST；

本实施方式中表达载体L4440质粒与大肠杆菌HT115(DE3)源自中国农业科学院植保所。

本实施方式步骤一中获得目的片段Of-GST-RNAi320，是需要经过胶回收纯化所得的。

本实施方式步骤二中连接并构建重组质粒L4440-Of-GST的验证过程为：构建重组质粒L4440-Of-GST和空载体L4440分别用HindIII单酶切，用Apal I进行双酶切鉴定以验证是否成功构建，结果如图1所示，重组质粒L4440-Of-GST构建成功。

本实施方式所构建的玉米螟谷胱甘肽-S-转移酶基因RNAi干扰工程菌htL4440-Of-GST，在室温条件下12000rpm离心2min富集菌体，按照200∶1的体积比用ddH₂O溶解富集的菌体，并充分混匀；将人工饲料(周大荣开发的玉米螟专业饲料，可通过购买得到)切成碎片或颗粒，将上述离心富集的新鲜菌液按浓度为1mL/mg(菌液/饲料)加到人工饲料中进行玉米螟饲喂取食，经观察计算后，结果如图2所示，ddH₂O空白组玉米螟幼虫的死亡率为0％，表达载体L4440对照组玉米螟幼虫的死亡率为3.33％，丁布〔D：是指DIMBOA，它是禾本科植物体内一种特有的防御性化合物，它对害虫有拒食、毒杀等作用，可以增强植物抵御害虫攻击的能力(Sicker et al.，2000)〕对照组玉米螟幼虫的死亡率为13.37％，丁布+表达载体L4440(D+L)对照组玉米螟幼虫的死亡率为18％，丁布+htL4440-Of-GST(D+RL)组玉米螟幼虫的死亡率为52％，由此可见本实施方式所构建的玉米螟谷胱甘肽-S-转移酶基因RNAi干扰工程菌对玉米螟生长发育起到了明显的抑制作用。

具体实施方式三：本实施方式与具体实施方式二不同的是步骤二中Of-GST-RNAi320双酶切的体系如下：

其它步骤及参数与具体实施方式二相同。

具体实施方式四：本实施方式与具体实施方式二不同的是步骤二中表达载体L4440质粒双酶切的体系如下：

其它步骤及参数与具体实施方式二相同。

具体实施方式五：本实施方式与具体实施方式二不同的是步骤二中连接的体系如下：

其它步骤及参数与具体实施方式二相同。

Claims

1.玉米螟谷胱甘肽-S-转移酶基因的RNAi干扰工程菌的构建方法，其特征在于它按以下步骤进行：一、用Trizol法提取玉米螟三龄幼虫中肠总RNA，利用cDNA反转录试剂盒合成cDNA第一链，根据特定功能的dsRNA片段，设计特异性上游引物Of-GST-RNAi320-P1和下游引物Of-GST-RNAi320-P2，然后以上述得到的cDNA第一链为模板进行PCR扩增，获得目的片段Of-GST-RNAi320；二、目的片段Of-GST-RNAi320与表达载体L4440分别经Pst I和HindIII进行双酶切，回收所需目的片段，连接并构建重组质粒L4440-Of-GST；三、将构建好的重组质粒L4440-Of-GST转化到大肠杆菌HT115(DE3)中，即完成玉米螟谷胱甘肽-S-转移酶RNAi干扰工程菌的构建，命名为htL4440-Of-GST；

其中步骤一中特定功能的dsRNA片段的全长为320bp，核苷酸序列为：CGACGTACTTTTATCCCCAAGTCCTCGCTGGTGCTCCTGCTGACGAAGCCTTGTTGAAGATGCTGGAAGAGGCTCTCAAGTTCCTGGACACCTTCCTCGAAGGTCAGAAGTATGCTGCGGGCTCAGAACTGACCTTGGCTGACCTGTCGCTCGTGGCTACTGTGTCTACTATTGACGCTGCTGGCATATCCATCGAATCCTACCAGAGTGTCAACAAGTGGTTCACGCTGGTCAAATCTACCGCCCCCAAATACGACGAAGCGAACGGCCAAGGCGTAGAAATGTTTAGAGCCTTCGTGGCACAGCTCAAAGCCAAGACG ；步骤一中上游引物Of-GST-RNAi320-P1的核苷酸序列为：TCGCTGCAGCGACGTACTTTTATCCCCAA，下游引物Of-GST-RNAi320-P2的核苷酸序列为：GACAAGCTTCGTCTTGGCTTTGAGCTGTG。

2.根据权利要求1所述的玉米螟谷胱甘肽-S-转移酶基因RNAi干扰工程菌的构建方法，其特征在于步骤二中Of-GST-RNAi320双酶切的体系如下：

3.根据权利要求1所述的玉米螟谷胱甘肽-S-转移酶基因RNAi干扰工程菌的构建方法，其特征在于步骤二中表达载体L4440质粒双酶切的体系如下：

4.根据权利要求1所述的玉米螟谷胱甘肽-S-转移酶基因RNAi干扰工程菌的构建方法，其特征在于步骤二中连接的体系如下：