JPH029377A - 化学的に調節可能なｄｎａ配列および遺伝子並びにそれらの用途 - Google Patents

化学的に調節可能なｄｎａ配列および遺伝子並びにそれらの用途

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JPH029377A
JPH029377A JP1055963A JP5596389A JPH029377A JP H029377 A JPH029377 A JP H029377A JP 1055963 A JP1055963 A JP 1055963A JP 5596389 A JP5596389 A JP 5596389A JP H029377 A JPH029377 A JP H029377A
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acid
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ジョン　ライアルズ
Alice Montoya
アリス　モントヤ
Christian Harms
クリスチャン　ハームス
John Duesing
ジョン　デュージング
Christoph Sperisen
クリストフ　スペリセン
Fred Meins
フレッド　マインズ
George Payne
ジョージ　ペイン
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    • C12Q2600/142—Toxicological screening, e.g. expression profiles which identify toxicity

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 本発明は遺伝物質の化学的調節およびそのように調節さ
ｎ得る新規な物質に関する。特Ｋ。
化学調節剤の存在下で、植物内のその他のＤＮＡ配列の
転写を調節する非コードＤＮＡ配列に関する。
〔従来の技術および発明が解決しようとする課題〕植物
形質転換および再生技術における進歩と結びつい次組換
えＤＮＡ技術における進歩は、植物細胞、植物または植
物組織内に新規な遺伝物質を導入することを可能Ｌｕ、
従って植物またに植物組織の価値を高める新規な特徴、
例えば茨現型″ｆｒ：４：入する。遺伝子操作しｆｃ　
’＋ｌｉ物の最近の実証に、病原体に対する耐性（ＥＰ
−Ａ　２４０５５２およびＥＰ−Ａ２２５４５２　）　
７たは昆虫に対する耐性（Ｖａｅｃｋ、　Ｍ、等、　Ｎ
ａｔｕｒｅ　３２８，３５（１９８７）および除草剤許
容性植物の作製（ＤｅＢｌｏｃｋ、　Ｍ。
等、　　ｇＭＢＯＪ、　６．２５１！５（１９８７）で
あり、これらは作物の改良の可能性を強調する。標的作
物は高木および低木ないし観賞用の花および農作物に及
び得る。実際、「作物」がいくつかの天然産物の源とし
てバイオリアクター中で増殖した植物組織の培養体であ
り得ることは明らかである。
ある場合には、植物、植物細胞１几は植物組織内に導入
し九遺伝ｖｌＪ質の発現の時期および／または範囲ケ調
節することが望ましいであろう。
理想的な状態は、農作物、観賞用低木、バイオリアクタ
ーその他に容易に適用きれ得るであろう調節性中間介在
ｑ＊ｒ介して思い通ｆ）Ｋ操作された特徴の発現の調節
であろう。この状態は、中でも特に化学的に調節可能な
キメラ遺伝子発現系に関する本発明により今理解され得
、その発現系は１表現型の特徴の発現が調１剤の制御下
にあるように、例えば調節された遺伝子からの発現が化
学調節剤の存在または不在によシ決定されるように１例
えば表現型の特徴をコード化する遺伝子に結合した化学
的に調節可能な非”　−トＤＮＡ配列からなる。この系
扛１Ｍ物ｌ之蝶Ｍ物組織でのキメラ遺伝子発現の化学的
調節に関する概念の第一の実証である。そのためにこの
系は、トランスジェニック植物ｌ友は植物組織の作製お
よび化学Ａ節剤の機能として発現される特徴の制御を可
能にする。
ん　植物形質転換技術の一般的概観 植物および植物組織の遺伝的形質転換（即ち、植物内へ
の外来１３ＮＡの安定な導入）を遂行する友めに種々の
方法がこの分野で知られている。
これらはアグロバクテリウム（Ａｇｒｏｂａｃｌｅｒｉ
ｕｍ）種による形質転換および直接遺伝子導入による形
質転換を包含する。
アグロバクテリウム　テエメファシエンス（Ａｇｒｏｂ
ａｃｔｅｒｉｕｍ　ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ）　ｎ１ｆ
ｉ物組織の感染部位に腫瘍またはえい瘤の形成音引き起
こす。
双子葉類および裸子植物の広い範囲の疾病であるクラウ
ンゴールの原因である。通常損傷部位で植物に感染する
アグロバクテリウム系Ｔ１〔腫傷誘導性（ｔｕｍｏｒ−
ｉｎｄｕｃｉｎｇ））グラスミドと呼ばれる大きい染色
体外遺伝子を有する。
′１゛ｉグラスミドは腫瘍形成に必要な２つの領域？Ｈ
する。１つの領域は、植物ゲノムυＮＡＫ安定に導入さ
れることが結局見い出されている１、）ＮＡ配列である
’１’−ＤＮＡ（導入さＢる（　ｔｒａｎｓｆｅｒｒｅ
ｄ）−ＤＮＡ）である。腫瘍形成に必要な他方の領域は
、導入＊＋Ｓに関連したｖｒｒ　Ｃ導性（ｖｊｒｕｌｅ
ｎｃｅ月である。ｖｉｒ領域は安定な形質転換には絶対
に必要であるけれども、ｖｉｒｌＪＮＡは感染Ｗｌ物に
実際に導入されない。アグロバクテリウム　チェメ７ア
シエンスでの感染に仲介妊れ之ｆ直物細胞の形質転換お
よびＴ−ＤＮＡのみの引き続く導入は、十分に文献に記
載び扛ている。例えは１３ｅｖａｎ、　Ａ４．Ｗ、およ
びＣｈｉＨｏｎ、　Ｍ−Ｄ、、　■ｎｊ、１（ｅｖ。
（ｊｅｎｅｌ　　１６．　５５７　　（１９８２）　　
参）損。
多くの研究所での数年の精力的な研究の後に、アグロバ
クテリウム系は種々の植物組織の鉾通の形質転換を可能
することが開発さｊした。この方法で形質転換された代
表的な組織は、クパコトマト、ヒマワリ、ワタ、アプラ
六、ジャガイモ、ダイスおよびボグラ金包含する。感染
源としてアグロバクテリウム　チュメファシェンスを用
いるＴｉグラスミド形質転換の之めの宿主範囲は非常に
広いことが知られているが、タバコがその操作の容易さ
ゆえに選択された宿主だりた・ アグロバクテリウム　リゾグネ、ｚ　（Ａｇｒｏｂａｃ
　Ｌｅｔ　ｉｕｍｒｈｉｚｏｇｅｎｅｓ）も１定植物形
質転換の定めのベクターとして部用されてきた。そのバ
クテリアは多くの双子葉植物種に毛状根形成を引き起こ
し、アグロバクテリウム　テユメファシエンスのＴ１グ
ラスミドに類似し元方法で作用するルｉ　〔横形成性（
ｒｏｏｔ−ｉｎｄｕｃｉｎｇ）　）グラスミドと呼ばれ
る大＠な染色体外遺伝子と有する。アグロバクテリウム
　リゾゲネスを用いる形質転換にアグロバクテリウム　
チェメファシエンスのものとｌ１ｌＩｊ様に開発され、
そして例えばアルファルファ、ソラヌム　ニグラＡｈ　
　エル、　　（Ｓｏｌａｎｕｍ　ｎｉｇｒｕｍＬ、）お
よびボグラを形質転換する友めの利用に成功した。
２、　直接遺伝子導入 種々のいわゆる直接遺伝子導入操作は、アグロバクテリ
ウム中間介在物を使用することなしに植物２よび植物組
織全形質転換する几めに開発された。グロトグラストの
直接形質転換においてグロトグラスト内への外因性遺伝
物質の取込みは化学１！削１ｔは電場の使用により高め
らｎ　１４）る。外因性物′Ｒｔ次に核ゲノム内に組込
んでも良い。外来ＤＮＡが偏入され、そして後代植物に
伝達されることが示された双子葉類のタバコで初期の仕
事が行われた。例えばＰａｓｚｋｏｗｓｋｉ。
Ｊ、寺、　ＥＭＨＯＪ、　３．２７１７（１９８４）；
おＬびＰｏＬｒｙｋｕｓ、　Ｌ、等、　Ｍｏ１．　Ｇｅ
ｎ、　Ｇｅｎｅｔ、　１９　ｑ、　１ｂ　９（１９８５
）参照。
単子葉類のグロトグラストもまたこの操作により、例え
ばトリチカム　モツコクカム（Ｔｒｊｔｊｃｕｍ　ｍｏ
ｎｏｃｏｃｃｕｍ）　、　ｏリウム　マルチフローラＡ
　（Ｌｏｌｉｕｍ　ｍｕｌｔｉｆｌｏｒｕｍ）（イタリ
アンライグラス）、トウモロコシおよびブラックメキシ
カンスウィートコーンにおいて形質転換され次。
１之外因性ＤＮＡはマイクロインジェクションにより細
胞またはグロトプラス内に導入され得る。グラスミドＤ
ＮＡの溶ｅ、ニ細く引伸されｔガラス針で細胞内に直接
注入される。この方法でアルファルファグロトグラスト
は撞々のグラスミドにより形質転換された。例えば几ｅ
ｉｃｈ　、Ｔ、　Ｊ。
等、　Ｂｉｏ／ｒｅｃｈｎｏｌｏｇｙ　４．１００１　
（１９８６）参照。
直接遺伝子導入の極く最近開発された方法は。
ＤＮＡ　ｉ有するマイクログロジェクタイル（ｍｉｃｒ
ｏｐｒｏｊｅｃｔｉｌｅｓ）による細胞の打ち込−２Ａ
を含む。Ｋｌｅｉｎ、　Ｔ、Ｍ、等、　　Ｎａｔｕｒｅ
　５２７．７０　（１９８７）参照。この方法で、外因
性ＤＮＡで被覆し次タングステン粒子を標的細胞に向け
て加速させ、報告され文例（タマネギ）では少なくとも
一時の発現を生じ友。
Ｂ、形質転換され次植物組織の再生 植物組織の形質転換のための撞々の方法があるように、
植物組織から植物体の再生方法も様りである。再生の特
定の方法は出発植物組織および再生される特定の植物種
に依存するであろう。近年、植物外植片から誘導され之
カルス組織から多くの撞の植物を再生することが可能と
なった。カルスから再生させ得る植物は単子葉類１例え
ばトウモロコシ、イネ、大麦、小麦およびライ麦、並び
に双子葉類、例えばヒマワＩＪ。
ダイズ、ワタ、アブラナおよびタバコを包含する。
アグロバクテリウム　テエメファシエンスで形質転換さ
れ九組織から植物の再生は、植物の様々な捌で実証され
友。これらはヒマワリ、トマト、ホワイトクローバ−ア
ブラナ、ワタ。
タバコおよびボグラを包含する。アグロバクテリウム　
リゾゲネスで形質転換された組織からアルファルファの
再生も実証さ創１グロトグラストからの植物再生は特に
有用な技術である。
Ｍｖａｎｓ、　Ｄ、ん等によるＨａｎｄｂｏｏｋ　ｏｆ
　Ｐｌａｎｔ　Ｃｅ１ｌＣｕｌ　ｔｕｒｅ、　Ｖｏｌ、
　　１．　ＭａｃＭｉｌｌａｎ　Ｐｕｂｌ、Ｃｏ、、　
１９８５゜ｐ、１２４参照。植物種がプロトゲラストか
ら再生され得る場合、その時遺伝子導入操作が利用でき
、そして形質転換はアグロバクテリウムチェメファシエ
ンスの使用によらない、１０トゲラストから植物の再生
はイネ、タバコ、アブラナ、ジャガイモ、ナス、キエウ
リ、ボグラおよびトウモロコシで実証され友。
植物形質転換および再生技術における技術的進歩に、遺
伝子操作を介する作物改良の可能性を強調する。例えば
タバコモザイクウィルス（ＴＭＶ　）の感染に対して耐
性であり、そして異なる類の除草剤に対して耐性である
遺伝子操作されたタバコおよびトマト植物の報告があっ
た。
昆虫耐性はタバコおよびトマト植ｖＪにおいて操作され
た。
Ｃ８細胞培養 遺伝子操作に対する可能性は農作ＷＫ限定されずに、観
賞用植物、飼料用作物および樹木における改良を含む、
植物バイオテクノロジーの不明瞭な目標は遺伝子操作と
組織培養法の両方を包含し、香辛料、顔料、天然甘味料
、工業的原料、抗菌剤および薬品を包含する莫大な植物
誘導化学物質の高められ定製造である。多くの例の中で
、これらの化合物はかなり広い代謝群に属し、一体とな
って二次産物と示される。植′＄ｌＪは肉食可能な動物
を避け、授粉媒介者をひきつけ、また感染病と戦うよう
な二次産物を産生じ得る。
Ｐｉ物ｉｄＪ胞培養体を非常に多くのｍ物檀から確立す
ることができ、そしてバイオリアクター中で増殖させ得
る。典型的な植物種に、商業的に興味のある二次産物を
産生ずるはとんどのもの全包含する。植物体細胞のｍｔ
ｉａ＊″＃（ツマクローナル変形物）から生ずる安定な
遺伝的変種が誘導そして選択され得ることが、多くの農
業的に１喪な作物植物において明らかに実証さｎ之。
多くの利点は二次化合物の植物組織培＃製造から生ずる
。こ几らは、（り生成し九産物の高められ友純変の可能
性、（２）生体形質転換による高価な最終産物への高価
でない前駆体の変換、および（３）新規な化合物を生み
出すための培養ａＫ基質類似体金供給する可能性を包含
する。
Ｄ、制御され友遺公子発現の利点 植物の遺伝子操作の標的が農作物、観賞用低木、花、樹
木ｌたはバイオリアクターに使用の几めの組織培養体で
あろうと、理解されるべき原理的な利点は、キメラ遺伝
子が適当な時期にだけ、そして適当な盪筐で、そしであ
る状態でに植物の特別な部分において発現されるような
一１＃である。例えば望ましい表現型を得るために、キ
メ２遺伝子と総タンパク質の１１ｉ友はそれ以上のレベ
ルまで発現させることが必要であるかも知れない。これ
はキチナーゼ発現による菌耐性１ｆｃは高められ友グロ
テナーゼ阻害剤発現による昆虫耐性の場合には十分であ
シ得る。
これらの４会には、高レベルの外来タンパク質の産生の
之めに消費されたエネルギーは、植物に対する損害を生
むかもレバないが、遺伝子が所宅する時１例えば槽菌盪
たは昆虫感染が差し迫っている時のみつ邑現きれるなら
ば、二不ルギーの消耗、およびそれ故に収量の減少が除
かれ得る。
１７ｔ、キメラ遺伝子により発現されｆｃ表表現上生艮
の間の適当でない時期に発現されれば、植物に負の効果
全土じ得る。例えば、キメラ遺伝子ｉ鉱物が泗やの離脱
を誘導する植坏勿ホルモンで５）れば、種子の成熟前の
早期の発現は植物体から果実の離脱を起こし、収ｌの減
少ゲ生じるであろう。この場合、さやの離悦が望゛まし
いか。
ｔ７ｔｆｌ少なくとも植物に無害である時にこの表現型
の遺伝子の発現全誘導することが非常に有利で５ｈろ５
゜ 培１１たはバイオリアクター中の組織に対して二次産物
の時期はずれの産生は、産物の収量の減少を生じる培養
体の増殖速度の減少を導くであろう、そｎ故に、培養棒
金二次産物の発現なしに増殖させ１次いで所望の産物の
最適化された発現を行わせる適当な時期にキメラ遺伝子
を誘導させることは有利であろう。
これら並びにその他のものと同様の観点から、産物１友
は植物組峨内のキメラ遺伝子の発現の１々期、範囲Ｐよ
び／または部位の制御は非常に望ましいであろうことは
明らかである。この農地、ＴＭ室またはバイオリアクタ
ーで容易に行わ１１得る制＃Ｊは、特に商業的価値があ
るであろう。
Ｅ、植物における公知のＡ動可能な遺伝子発現系 ｍ物ホルモン金誘導する植々の内部および外部要因、熱
ショック、化学物質、病ふ体、酸素および光の不足によ
り、種々の植物遺伝子が誘導されることは知られている
。こｎらの系を詳細に記載し次ものははとんどないけれ
ども、最高の％徴としてｍＲＮＡの増加したＳ積が特定
の高められｔレベルのタンパク質産生金導くことである
。
植物ホルモンによる遺伝子ａ４節に例えばアブシジン酸
（ＡＢＡ　）はワタの後期胚形成ｍＲＮＡ１豊富に誘導
することが示場れている。　Ｇａ１ａｕ、　Ｇ、Ａ、。
Ｐｌａｎｔ　Ｍｏ１．Ｂｉｏｌ、　７．１５５　（１９
８６）　。その他の例として、ジベレリンｌ１（ＵＡ３
）ｉヒマの実においてマレートシンターゼ転写全、そし
て大麦ｗＩ扮層においてα−アミラーゼイン酵素を誘導
する。ルｏｄｒｉｇｕｅｚ　、　Ｄ、　等、　　ｆ’１
ａｎｌ　Ｍｏ１．　Ｂｉｏｌ、　９゜２２７　（１９８
７）；　ＮｏＪａｎ、　Ｉ：Ｉ、、　Ｃ，等、　　Ｐｌ
ａｎｔ　Ｍｏｌ。
Ｂｉｏｌ、　８．１５　（１９８７）参照。
大豆の熱ショックタンパク質遺伝子の調節は詳細に研究
てれ次。４０℃で種々の時間植物全処理すると、様々な
いわゆる熱ショックタンパクスが沃規に合成される（Ｋ
ｅｙｔ　Ｊ、　等、　　Ｐｒｏｃ。
、ＮａＬｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　ＬＩＳＡ、　７
８，３５２６　（１９８１）　）、。
（１々のそのような遺伝子は単離さｔし、そしてそれら
の調節は詳細に研究された。これら遺伝子の発現は転写
のレベルで主に制＃芒ｎている。
ｈｐｓ　７０遺伝子のブロモ−ターはネオマイシンホス
ホトランスフェラーゼｆｆ　（Ｎｐｔ■）遺伝子に融合
され、セしてキメラ遺伝子はたとえ内因性熱シップク遺
伝子より低レベルでも熱シｇヅクにより誘導されること
が示されｆｔ　（Ｓｐｅｎａ、　Ａ、　号。
ＥＭＢＯＪ、　　４．２７！＋６　（１９８５））。
植物での誘導性遺伝子のもう一つの類に、光調間化遺伝
子、と９わけリブロース１，３−ビスホスフェートカル
ボキシラーゼ（）！、（ＪＢＩＳＣＯ）の小さいサブユ
ニットに対する核のコード化遺伝子を包含する。Ｍｏｒ
ｅｌｌｉ、Ｇ、等、　　（Ｎａｔｕｒｅ　３１５゜２０
０　（１９８５））およびＨｅｒｅｒｒａ−Ｅｓｔｒｅ
ｌｌａ、　Ｌ。
等、　　（Ｎａｔｕｒｅ　５１０．１１５　（１９８４
））ｉＪ、エントウのルＵＤ　Ｉ　Ｓ　ＣＯ遺伝子の５
′配置配列がキメラ様式で付着した時にリポータ−遺伝
子（ｒｅｐｏｒｔｅｒｇｅｎｅ）に光誘導性ヶ付与し得
ることを示し一〇この観察はその他の光誘導性遺伝子例
えばクロロフィルａ　／　ｂ結合タンパク質に広げらｆ
１７’（。
トウモロコシのアルコールデヒドロゲナーゼ（ａｄｈ）
遺伝子は広範囲に研究され念。トウモロコシからのａｄ
ｈｌ−８遺伝子は単離され、そして５′配置ＤＮＡの部
分が、−時的に形質転換される組織が嫌気的条件に晒さ
れた時にキメラリポータ遺伝子（例えばクロラムフェニ
コールアセチルトランスフェラーゼ、　（、’ＡＴ）の
発現全誘導し得ることが示されｆｔ　（）ｔｏｗａｒｄ
、　Ｅ、等、　　Ｐｌａｎｉａ１７０．　５５５　（１
９８７））。
緩和剤として仰られる化学物質の群は、除草剤の有害の
可能性がある施用に対して作物を保護するか、ま几は「
無害にする」ために開発された。そのような化合物の作
用に対する一般的な機構は十分ＫｓＢＡされていないけ
れども、そのような化合物による自然に調節可能な遺伝
子の調節が１つの可能な機構である。より高レベルのグ
ルタチオン−５−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）が緩衝
剤２−クロロ−４−（トリフルオロメチル）−５−メチ
ル−チアゾールカルボ）Ｌ　　Ｃ，等、　　　Ｐｌａｎ
ｔ　　Ｍｏ１．　　　Ｂｉｏｌ、　　　７．　　２３ｓ
　　（１ｑ８ｂ）参照、　ＧＥＴ　ｍＲＮＡのレベルが
緩和剤との処理で＾められるけれども、高めることを導
く機構は報告さｎなかりた。
撞々の病原体に対して過敏に反応する場合。
多くの植物は刺激されて、酸抽出性低分子量病原性関連
（ＰＲ）タンパク質の群を産生する（ＶａｎＬｏｏｎ、
　Ｌ、　Ｃ，、Ｐｌａｎｔ　Ｍｏ１．　Ｂｉｏｌ、　４
．　１１１　（１？８５）。
しかしながら、これらの同じＰＲタンパク質が化学物質
１例えばポリアクリル酸２よびアセチルサリチル酸と処
理した植物内に高レベルで蓄積することは特に興味床イ
（Ｇｉａｎｉｎａｚｚｉ、　Ｓ−等。
Ｊ、　Ｇｅｎ、　Ｖｉｒｏｌ、　２３．　ｉ　（１９７
４）　；　Ｗｈｉｔｅ、　ＬＦ、。
Ｖｉｒｏｌｏｇｙ　９９．４１０　（１９７９））。Ｐ
Ｒ１タンパク質の存在は広題囲の病原体に対して局部的
および全体的の両方の耐性の誘導と関連づけられてきた
。タバコモザイクウィルス（ＴＭＶ）に対して耐性なタ
バコの種間雑種は構造的にＰＲ−タンパク質を発現する
ことがわかり友（Ａｈｌ、Ｐ、等、　　Ｐｌａｎｌ　８
ｃｉ、　ＬｅｔＬ、　２６．１７３　（１９８２）　）
。
さらに、ＴＭＶ感染または化学的に処理したタバコのど
ちらかのｍＲＮＡ　ｉ用いる試験管内での翻訳産生物の
免疫沈降（Ｃｏｒａｅｌｉｓｓｅｎ、　Ｂ、　Ｊ、　Ｃ
，等。
ＥＭＢＯＪ、　５，３７　（１９８６）；Ｃａｒｒ、　
Ｊ、Ｐ、等、　Ｐｒｏｃ。
Ｎａ１１．Ａｃａｄ、８ｃｉ、　ＵＳＡ　８２．７９９
９　（１９８５）　）は。
高められたレベルのＰ）を−タンパク質が肪Ａ蓄項の結
果であることを示し次。それ故に１化学物質１友は病原
体によるＰＲタンパク質遺伝子の誘導は、植物および植
物組織において遺伝子発Ｏｌ倉化学的に調節する問題に
迫る方法を提供する。
〔課題を解決する几めの手段〕
本発明に。
（ａ）　　化学的に調節可能なＤＮＡ配列、好’ｆｆ１
Ｌ＜は純粋な形態にあるもの。
（ｂ）　　前記調節可能な配列が天然に生ずる遺伝子内
で関連するコードＤＮＡ配列の全てでなく１りまたはそ
れ以上の部分と組合せた１種１７ｔはそれ以上の化学的
に０４節可能なＤＮＡ配列。
（ｃｌ　　１１Ｍ１ｆｔはそれ以上の化学的に調節可能
なＤＮＡ配列を含有するキメ２遺伝子。
（ｄ）　　（ａ）、　（ｂ）および／を九ｈ（ｃ）の配
列または遺伝子を含有するベクター （ｅ）　　化学的に調節可能なキメラ遺伝子金含有する
（直物係５種子および植物組織、および（ｆ）　　植物
組織内での化学的に調節可能なキメラ遺伝子の化学的調
節を包含する。本発明はさらにシグナルペプチド、該シ
グナルペグテドをコードするＤＮＡ配列、および檀々の
天然に生ずる化学的に誘導可能な遺伝子の実質的に軸外
な形＊１包含する。
本発明はさらに化学的ＩＣ調節可能なＤＮＡ配列の櫨々
の使用： （ａ）　　バイオリアクターで増殖され友細胞内のキメ
ラ遺伝子の調節。
（ｂ）　　化学調節剤の検定（ａｓｓａｙ）、（Ｃ）　
　植物の生長、Ｊ４節、 （ｄ）　　植物不稔性の調節および （ｅ）　　形質転換された植物内でのキメラおよび／ま
たは非相同遺伝子発現の調節を含む。その他の使用およ
び利点は本発明の以下の詳細な記載から明らかになるで
あろう。
配列の簡単な説明 本発明に係るＤＮＡおよびアミノ酸の配列１〜８につい
て説明する。なお、これらの配列は本明細書の実施例の
次に示している。
配列１はタバコＰＫ−１ａ遺伝子のＸｈｏｊとＢｇｌｌ
Ｊ部位との間の２ｋｂ対のゲノムＤＮＡ配列を開示する
。ヌクレオチド９０３付近の矢印は転写開始部位を示し
、そして２０７および５１５と記入した垂直な矢印は２
つの独立したｃＤＮＡクローンの端部を表わす。遺伝子
のコード部分によりコード化され友ボリベグチド配列も
開示している。
配列２はタバコＰ　Ｉ（−１’遺伝子のゲノムＤＮＡ配
列およびその遺伝子のコード領域によりコードされるボ
リペプチドのアミノ酸配列ケ開示する配列３はキュウリ
ＰＲキチナーゼのｃＤＮＡ配列およびその遺伝子のコー
ド領域によりコードされるボリペプチドのアミノ酸配列
を開示する。
配列４ｔゴタバコＰ　Ｒ−Ｒ遺伝子の主要型のｃ　ＬＪ
ＮＡ配列を開示し、そして配列４（ａ）は配列４とその
遺伝子のコード領域によりコードさｇるボリベグチドの
アミノ酸配列の両方全開示する。
配列５　ｎ　りａ　−ンｐ８８０１ｕｃ　５９．１内に
含１れるタバコ４基性β−１，３−グルカナーゼ遺伝子
のゲノムＤＮＡ配列を開示する。
配列６はりｏ　−ンｐＨ８ＧＩｕｃ３９．３内に含−１
ｎるタバコ塩基性β−１，３−グルカナーゼ遺伝子のゲ
ノムＤＮＡ配列を開示する。
配列７はグラスミドｐｌｊ８ｃｈｔ　１５内に含ｌれる
タバコＰＲーＱｃ１ｃｌＪＮＡ配列を開示する。
配列ａ　ｔａ　ｐＢＳＯＬ　６　ｅ　Ｆ’３に含ｔｎる
単離さｎ、７？：ｃ　ＬＡＮ　Ａ　ｔＤ　ＤＮＡ配列を
開示する。ｃＤＮＡ−はβ−５１゜５−グルカナーゼの
酸性体音開示する。
本発明の詳細な説明 本発明は、その場所の調節が化学１ＳｌｌＩＷＪ剤に依
存している関連［）ＮＡ配列の植物組織での転写全調節
することができるＤＮＡ配列の単離、クローニングおよ
び同定を記載する。これらのＤｉＮＡ配列は、遺伝子の
発現がそのような調節剤により調節され得るキメラ遺伝
子全構築するために利用され得る。化学的方法によるト
ランスジェニック種物におけるキメラ遺伝子の発現を調
節する能力は、植物の増殖および生長に最低の負の影響
でもって表現型の特徴の適当な発現を得るために有用で
ある。この調節は培養ａｔ＊はバ１゛オリアクター中の
植物組織での二次産物１九はその他のクローン化産物の
産生に重要である。
タロー？化され友配列の調節はまたアンチセンス機構（
ａｎｔｉ　−５ｅｎｃｅ　ｍｅｃｈａｎｉｓｍ）による
その他の産物の調節にも重要である。
あらゆる特定の時期での与えられたコード配列の発現は
、典型的には植物組織に施用される化学調節剤の使用に
より調節され得る。明らかな生長移行段階の制御に包含
される遺伝子は１を化学的にＡ節可能なＤＮＡ配列ケ適
白なコードＤＮＡ配列と関連させることにより調節さｎ
得る。
この方法において、化学調節剤のレベルが向上ざＱるか
、または低下されるｌで植物の生長を特定の段階で止め
ることかでさ、またその時に植物の生長を特定の速度に
加速することができり　。
化学的に調節可能なＤＮＡ配タリは１例えば除草剤耐性
１７′ｊは許容性（例えば大豆におけるアトラジン許容
性）を与え、昆虫耐性（ワタにおげルハチラス　スリン
ギエンシス結晶タンパク［）を与えるか、ｌ友は選択的
発現（例えば雄性ｌ友は雌性不稔性）を要求する外来遺
伝子全発現させる定めに利用さｎ得る。化学的に調節可
能なＤＮＡ配列は筐几、アンチセンス機構による二次コ
ード配列の発現を制御するであろうＤＮＡ配列を転写さ
せるために利用され得る。
従って１本発明は多くの対象に迫る： ａ−原則的な対象として、植物内での発現が化学調節剤
により調節されるキメラ遺伝子。
ｂ、化学調節剤に応答して他のｊＪＮＡ配列の植物組織
内で遺伝活性を制御できる実質的に純粋な化学的に調節
可能なＤＮＡ配夕１几 Ｃ１天然に生じる遺伝子内で関連するコードＤＮＡ配列
の全てでなく部分と組合せた化学的に調節可能なＤＮＡ
配列。
ｄ、それらが存在しても良い天然に生じる遺伝子の部分
を有するか、１九は何しない化学的に調節可能なＤＮＡ
配列？含有するベクターｅ８本発明の原則的な対象であ
るキメ２遺伝子を含有するベクター ｆ、これらのベクターにより形質転換された細Ω 胞から誘導されｔ植物組織、植物および種子。
ｇ６　　化学的に調節可能なＤＮＡ配列、例えば表現型
の特徴を調節するものと関連するＤＮＡコード配列の発
現を化学的に調節する方法。
ｈ０本発明の牟メラ遺伝子を用いて新規な化学調節剤を
同定する方法およびそのｗ４節剤を含有する植物組織を
同定する方法。
ｉ、化学的に調節された遺伝子によりコード化されたタ
ンパク質のシグナルペプチド配列。
ｊ、　　＊質的に純粋な病原性関連タンパク質遺伝子。
その他の対象もマ友本発明の以下の記載からｇ識できる
。
定義 発明の詳細な説明および特許請求の範囲、およびこれら
の表現にあてられた範囲の明確な。
そして首尾−貞しｔ理解を確実にする几めに、以下に定
ａを与える： アンテーセンスｍｊｓ：細胞内に翻訳されるｍＲＮＡの
少なくとも一部に相捕的なＲＮＡ分子が存在するために
ｍＲＮＡのタンパク質への翻訳の速度全制御することに
基づい之遺伝子調節の機構。
胞の活性が（りもう１つのＤＮＡ配列の活性を調節する
か、ｌたは（２）もう１つのＤＮＡ配列により調節され
るかのいずれかであるＤＮＡ配列。この定ａは、具体的
には連続的ＤＮＡ鎖に物理的に隣接しているか、または
物理的に分離している配列を含むが、それに限定されな
い。物理的な分離は１例えば同−ＤＮＡ鎖内での分離、
異なるＤＮＡ鎖内での配置、または１本の鎖における不
連続に散在する配列（例えば、調節可能な配列とコード
配列とが交互になっているもの）′ｆ：包含する。
る。
節が化学調節剤に依存している関連ＤＮＡ配列の転写ｔ
−調節することができるＤＮＡ配列、この配列は天然起
源でも合成起源でも良い。
の非コード性の化学的に調節可能なＤＮＡ配列および少
なくとも１つの関連コードＤＮＡ配列を含む遺伝子。こ
の遺伝子は天然、合成ｌたは部分的に天然／部分的に合
成起源のものであって良い。
化学調節剤（化学的に調節可能なＤＮＡ配列の几めのも
の）：化学的ＫＩＪ節可能なＤＮＡ配列と関連する転写
６Ｊ能なＤＮＡ配列の転写を調節するための有効量、所
望する程度まで、そして所望の時期に活性な形で、化学
調節剤が通常見い出されない系内で化学的に調節可能な
ＤＮＡ配列の活性を直接ｌ友は間接作用によジｖＩ４節
する（例えば、開始する。終結する。増加させる。また
は減少させる）元素ま几は分子Ｍ、この術語は。
転写が必要な時に調節剤が全くないか、他くわずかしか
存在しない場合、ｔ７ｔはいくつかの調節剤が存在する
が、しかし所望通りに転写を増加すかもしくば減らすよ
うな高めらｎた４しくは低下し比調節が要求される場合
を含むことを意図している。
従って、化学的に調節可能なＤＮＡ配列を含む系が植物
、例えばトランスジェニック植物である場合、化学調節
剤は、所望の時期に所望の程度まで、化学的調節そして
それ故に関連遺伝子の転写を行うには十分な量で存在す
る。植物内に天然には見い出されない種類である。
「直接作用」により、化学調節作用が化学調節剤とＤＮ
Ａ配列との間の直接相互作用から生ずることヲ弐わす。
「間接作用」Ｋより、調節作用が化学調節剤と系内のい
くつかの他の内因性１比は外因性成分との直接作用から
生じ、その直接相互作用の究極の結果がＤＮＡ配列活性
の活性化１友は抑制化であることを表わす。「活性体」
により、化学調節剤が制御を行うのに必要な形であるこ
とｔａわす。
２つの異型の部分１例えば予め存在する状態と関連しな
い予め存在するＤＮＡ配列から誘導てれ九部分金含む、
１７ｔは合成起源または天然に見い出されない少なくと
も部分を含むＤＮＡ配列。
に細胞のポリペプチドの形成を生じるＤＮＡ配列。
遺伝子：別々の細胞産物に関連する別々の染色体領域。
植物細胞のあらゆる群を包含するが、これに限定きれな
い。上記のまたはこの定義に含ｌｆＬるあらゆる特定の
型の植物組織とともに％１九はその不在下でのこの語の
使用は％植物組織のその他の型を除外することを意図す
るものではない。
特定のコードＤＮＡ配列と関連しｔ場合、細胞のポリペ
プチドの形成音生じるＤＮＡ配列。従って。
例えは、１つのコード配列と関連する場合にコード化し
々い配列は、もう１つのコードまたゆ非コード配列と関
連する場合に実際にコード化するかも矧ｎない。
の特徴。
植物組織：栽培している、１元は培養しているｌ１ＩＩ
物のあらゆる組織。この梧は、全体の植物体、植物細胞
、植物器官、植物種子、グロトプラスト、カルス、細胞
培養体、および構造的および／１７！ｉ：ｒｒ！機能的
単位の形態に組織化されるに対し過敏に反応する植物内
に発現きれるタンパク質。この語は、タバコＰＲー１ａ
、ＰＲ−１ｂ。
ＰＲー１ｃ、　ＰＲ−１’、　ＰＲ−２，ＰＨｔ−Ｎ、
　ＰＲ−〇、Ｐ１％−Ｐ、　ＰＲーＱ、　ＰＲ−８，Ｐ
ＩＬ−凡タンパク質の酸性体および塩基性体、ＰＲ−Ｐ
まｔはＰＲ−Ｑの塩基性対応物であるキチナーゼ、およ
びＰＲ−２，ＰＲーＮｌ之はＰＲー０の塩基性対応物で
あるβ−１，５−グルカナーゼ（グルカンエンド−１，
３−β−グルコシダーゼ、ＥＣ３，２，１，ｌ）および
キュウリからの病原誘導性キチナーゼを包含するが。
これに限定されない。過敏反応は病原体の感染部位およ
び病原体のひき続く位置の回シに即座に局部的な組織の
壊死、によｐＩ＃色づけらｎ。
これが植物全体に病原体が広がる感受性反応との違いで
ある。病原体は例えば、ウィルス１ｔはクイロイド、例
えばタバコ筐たはキエクリモザイク？イルス９輪点ウィ
ルスまたは壊死ウィルス、ベラルゴニウム葉カールウィ
ルス、レットクローバ−斑点ウィルス、トマトブッシー
スタントウイルス、および同様のウィルス、菌類例えば
フィトフンーラ　バラシチカ（ＰｈｙＬｈｏｐｈｌｈｏ
ｒａｐａｒａｓｉｔｉｃａ）筐ｔはベロノスボラ　タバ
チナ（Ｐｅｒｏｎｏｓｐｏｒａ　ｔａｂａｃｉｎａ）バ
クテリア、例えばシュードモナス　シリンガｘ　（Ｐｓ
ｅｕｄｏｍｏｎａｓｓｙｒｉｎｇａｅ）　１友はシュー
ドモナス　メバチ含する。このリストはあらゆる点で限
定されない。
、Ａ節：遺伝子の発現のレベル１九はＤＮＡ配列の転写
のレベルの向上（誘導）１友は低下（抑制）。この定義
はある特定の機構金色むことを意図するものでにない。
実質的に純粋なＤＮＡ配列：天然１７’ｊＨ天然でない
源からの実質的に純粋な形態にある単離され之ＤＮＡ配
列。そのような配列は天然系１例えばバクテリア、ウィ
ルスま几は植物もしくは動物細胞に由来しても、また例
えば合成手段により、もしく１ｃＤＮＡとして供給され
ても良い。
実質的に純粋なＤＮＡ配列は意図され７ｊ　ＪＪＮＡか
らなるベクターの形態で通常単離される。実質的に純粋
とは、意図されｔもの以外のＤＮＡ配列が痕跡ｔ１例え
ば５チ以丁、１チ以下、ｌ之は好ｌしくはＩ１１チ以下
であることを意味する。実質的に純粋なＤＮＡ配列およ
びそれらを含有するベクターは、溶成１例えば緩衝液を
含有する水浴ｇ”！友は通常の培養培地で供給され得、
そして典型的には供給される。
はヌクレオチドまたアミノ醒配列間の近似し次構造関係
を意味する。例えば、実質的に相同なＤＮＡ配列は、８
０％相同、好１しくに９０％ないし９５チ相同であり得
、そして実質的に相同なアミノ酸配列は典型的には５０
％相同またはそれ以上であり得る。相同は１７ｔヌクレ
オチドま友はアミノ酸の１種または種々の部分配列の欠
失している、または付加的なヌクレオチドまたはアミノ
酸を有する部分配列が相互分散されている関係を包含す
る。
人、化学的に調節可能なＤＮＡＡ列 本発明は、化学的調節剤の影響下で、植物１７ｔは植物
Ｍｉ織内で関連ＤＮＡ配列を調節し得る非コードＤＮＡ
配列に関する。特に本発明はこの調節が化学？Ａ節剤に
依存している植物１Ｆｔｊは植物組織内で関連ＤＮＡ配
列の転写を調節できる非コードＤＮＡ配列七含む。好１
しくはＤＮＡ配列はそｎらが天然物に由来するならばそ
れらが生ずる遺伝子またはゲノムに対して、またはそれ
らが合成混合物で生ずるならばＤＮＡＡ合物に対して実
質的に純粋な形態で存在する。
本発明の非コード性の化学的に調節ＣＵｇなＤＮＡは、
コードＤＮＡ配列と関連する場合に植物組織内のコード
配列の発現を調節するものであり、調節の範囲は化学調
節剤に依存している。
そのような配列は、新規に合成され得るか、または天然
に生じる化学的に調節可能な遺伝子から誘導され得る（
例えば単離ｌたはクローン化）。
本発明の化学的に調節可能なＤＮＡ配列の発生は植物組
織に限定されず、即ち化学的に調節可能なＤＮＡ配列は
種々の天然の源１例えばバクテリア、ウィルスま友は動
物源から誘導さｎても良い。
それは、天然に生じる化学的に調節可能な遺伝子の例え
ば５′配置領域または３′配置領域力・ら単離されても
良い。また、非コ〜ドＤＮＡ配列は、単離された配列に
同一なｃ　ＤＮＡとして化学的に合成されるか、もしく
は酵素的に合成されても良く、単離された配列に実質的
な配列相同性を有しても良い。化学的に調節可能な非コ
ードＤＮＡ配列をクローン化することにより、その配列
を天然に生ずる遺伝子内でそれに隣接するその他の配列
から分離できる。このようにして実質的に純粋なＤＮＡ
配配列金石ことができる。
本発明に関連して、調節は誘導性または抑制性調節剤の
いずれかである化学調節剤を含む。
化学的に抑制可能な遺伝子、即ち抑制性化学物質により
抑制される遺伝子は１例えばトリグト７アンリグレッサ
ーまたはトリブトファンそれ自体の添加がこれら遺伝子
からの発現上抑制するＴｒｐル１友はＡｒｏ）ｉの様な
遺伝子を包含する。
このタイプの最終産物の抑制により調節されるその他の
多くの遺伝子が存在し、そして各場合にその最終産物に
遺伝子の発現を抑制する友めに使用され得る化学調節剤
として作用する。本発明は、そのような遺伝子自体の調
節可能な部分、Ｉたは植物１九は植物組織内の関連ＤＮ
Ａ配列の転写を化学的に調節し得るキメラ構築物の部分
を含む。
化学的に誘導可能な遺伝子、即ち誘導性化学調節剤によ
り誘導される遺伝子は、ＰＲタンパク質遺伝子、特にタ
バコＰＲタンパク質遺伝子、例えばＰＲー１ａ、ＰＲ−
１ｂ、　ＰＦＬ−１ｃ、　ＰＲ−１′。
ＰＲ−Ｑ、ＰＲ−凡およびＰＲーＳ遺伝子、キュウリキ
チナーゼ遺伝子、および４基性および酸性タバコβ−１
，３−グルカナーゼ遺伝子である。特別な面において本
発明は天然に生ずる化学的に調節可能な遺伝子１例えば
単子葉、双子葉′！友は裸子植物からの植物またはｉ物
組織中の天然に生ずる化学的に調節可能な遺伝子の一部
である非コード性の化学的に調節可能なＤＮＡ配列であ
るか、１友はこれに実質的に相同な配列を有する実質的
に純粋なＵＬＮＡ配列からなる。好１しくはそのよ５な
ＤＮＡ配列は関連ＤＮＡ配列がコード配列である植物１
７’Ｃは植物組織内の該関連ＤＮＡ配列の転写を調節す
ることができる。前記ＤＮＡ配列の転写は抑制性化学調
節剤により、Ｉたは誘導性化学調節剤により調節さｎ得
る。特に考慮されるＤＮＡ配列は、化学的に調節可能な
遺伝子がＰＲタンパク質遺伝子１例えば双子葉植物例え
はタバコ１ｆｃにキュウリからのものである配列である
。化学的に調節可能な遺伝子がタバ＝ｚＰＲ−１ａ、Ｐ
Ｒ−１ｂ、ＰＲ−１ｃ、ＰＲ−１′。
ＰＲ−ＱまたはＰＲーＲ遺伝子、キュウリキチナーゼ遺
伝子、または塩基性もしくは酸性β−１，３−グルカナ
ーゼ遺伝子、特にタバコ塩基性１ａおよびＰｌ（−１’
遺伝子、さらにキ、＋７リキチナーゼ遺伝子並びに塩基
性および酸性タバコβ−１，３−グルカナーゼ遺伝子で
あるＤＮＡ配列が最も好ましい。化学的に調節可能な遺
伝子がタバコＰｋＬ−１ａｌｆｃｕ塩基性β−１，５−
ｙｈｈｔ−ゼ遺伝子であるＤＮＡ配列がざらに考慮され
る。
好ましいＰｆ’Ｌの化学的に誘導可能なＤＮＡ配列およ
び本発明の関連遺伝子は、コード配列に隣接する５′配
置領域の非コード配列に明らかに生ずる。代表的な例と
して、コード領域の一部を含有するタバコＰＲー１ａ遺
伝子の約６５００塩基対から単離された配列中の転写開
始部位に自然に隣接する約９００ないし約１２００塩基
対を有する領域が化学的に誘導可能であることがわかり
九。誘導可能性は転写開始部位に自然に隣接する約５０
０ないし約７００塩基対を含有するそれらの折片に保持
さｊしている。そＰＬ故に、前記ＰＲおよび関連遺伝子
の５′配置領域内に位置するＤＮＡ配列１例えば転写開
始部位に隣接する１２００塩基対内に位置するＤＮＡ配
列が最も好ましい。
木兄ＢＡはさらに、調節が化学調節剤に依存している植
物または植物組織内の関連ＤＮＡ配列の転写を調節する
ことができる非コードＤＩＮＡ配列、および該非コード
配列に実質的な相同性を有するＤＮＡ配列の調製方法を
含み、これは天然に生じる遺伝子から実質的に純粋な形
態でＤＮＡ　ｉ単離するか、または化学的もしくは酵素
的Ｋ　ＤＮＡ？合成することをコードする 特に本発明はそのような遺伝子全含有する天然に生ずる
系内の化学的に調節６エ能な遺伝子から実質的に純粋な
化学的に調節可能なＤＮＡ配列の調製方法を含み、これ
は以下の段階二（ａ）　　化学的に調節可能な遺伝子か
ら１４ＮＡの前記系内での発現を活性化し。
（ｂ）　　前記凡ＮＡを単離し、 （Ｃ）　　前記の活性化しｔ系から単離し九ＲＮＡから
生じｙｔ　ＲＮＡ並ひに活性化していない対照系から単
離し−ａ　ＩＬＮＡから生じたＲＮＡ　Ｋ対するゲノム
ライブラリィを別々にスクリーニングし。
［ｄ）　　ゲノムクローンを単離し、 （ｅ）　　前記ゲノムクローンから化学的に調節可能な
遺伝千金サブクローン化し、そして （ｆ）　　所望する化学的に調節可能なＤＮＡ配列を単
離する。から構成される。
さらに本発明は前記系が植物であるような方法も含み、
これは以下の段階： ｆａ）　　化学的に調節可能な遺伝子からのポリＡ＋凡
ＮＡの前記植物内での発現を活性化し、（ｂ）　　前記
ポリＡ　−）　ＩＬＮＡ金単離し。
（Ｃ）　　前記ポリＡ　＋Ｌ（ＮＡがらｃＤＮＡライブ
ラリィ金構築し、 （ｄ）　　前記ｃ　ＤＮＡラリブラリイと活性化してい
ない対照植物内の凡ＮＡから生じ几ＣＤＮＡ、！：を別
々にスクリーニングし。
（ｅ）　　化学的に調節可能であるｃ　ＤＮＡクローン
を単離し。
（ｆ）　　段階（ｅ）のｃＤＮＡクローンをグローブと
して用い前記植物のゲノムライブラリィがらゲノムクロ
ーン全単離し。
（ｇ）　　前記ゲノムクローンから化学的に調節可能な
遺伝子全サブクローン化し、そシテ （ｈ）　　所望する化学的に調節可能なＤＮＡ配列を単
離する、から構成される 前記化学的に調節可能な遺伝子が化学的に誘導可能な遺
伝子、例えばＰＲタンパク質遺伝子例えばタバコＰＲ−
１ａ、　ＰＬ（、−１ｂ、　ＰＲ−１ｃ、　ＰＲ−１′
、ＰＲーＱ、　ＰＲ−几もしくはＰｕ−８遺伝子、キエ
ウリキチナーゼ遺伝子、！７’Ｃはタバコ塩基性もしく
＃：ｃ酸性タバコβ−１．３−グルカナーゼ遺伝子であ
る方法が好ましい。前記Ｐ凡タンパク質遺伝子が化学誘
導剤ｌたは病原体により段階（ａ）で活性化される方法
がさらに好ましい。
本発明はさらに上記方法により製造し之実質的に純粋な
ＤＮＡを含む。
Ｂ、天然に生ずるコード配列の一部を有する化学的に調
節可能なＤＮＡ配列 前項Ａで記載した完全に非コード性の化学的に調節可能
なＤＮＡ配列に加えて１本発明はまた調節可能な配列が
天然に生ずる遺伝子内の関連するコード配列の全てでな
く部分と組合せた天然に生ずる化学的に調節可能なＤＮ
Ａ配列の非コードＤＮＡ配列をも提供する。より詳しく
は、本発明は好筐しくに純粋な形態にある、天然に生ず
る化学的に調節可能な遺伝子の非コード性の化学的に調
節可能なＤＮＡ配列であるか、ｆたはその配列に実質的
な配列相同性を有する第一のＤＮＡ成分配列、この第一
の成分配列はこの調節が化学調節剤に依存する植物ｌ几
は植物組織内の関連ＤＮＡ配列の転写を調節することが
できるものであり、これと天然に生じる化学的に調節可
能な遺伝子内で第一の成分が関連する転写可能なＪＪＮ
Ａ配列の全てでなく部分であるか、またはこれに実質的
な配列相同性會有する第二のＤＮＡ成分配列とからなる
ＤＮＡ配列を含む。天然に生じる化学的に調節可能な遺
伝子は植物起源のもの１例えば単子葉１几は双子葉植物
に生じるものでありて良く、そして抑制性または誘導性
化学調節剤により調節されても良い、第二のＤＮＡ成分
配列は典型的にはフード配列であろう。
本発明の好ましい第二のＤＮＡ配列は天然に生じる化学
的に調節可能な遺伝子により発現されたあらゆるタンパ
ク質のシグナルペプチドをコードする配列である。
特に本発明は非コード性の化学的に調節可能な第一のＤ
ＮＡ配列と、　ＰＲ，タンパク質遺伝子。
例えば双子葉植物、好ｌしくにタバコまたはキュウリか
らのＰＲタンパク質遺伝子１例えばＰＲ−１ａ、ＰＲ−
１ｂ、ＰＲ−ＩＣ，ＰＲＩ−１’、　ＰＲーｑＰＲー几
もしくはｐｇ−ｓ遺伝子、キチナーゼ遺伝子、または塩
基性もしくは酸性タバコβ−１，３−グルカナーゼ遺伝
子からの第二のコードＤＮＡ配列とからなるＤＮＡ配列
を含む。転写が誘導性化学調節剤によシ調節されるＰＲ
タンパク質遺伝子からのＤＮＡ配列が好ましい。特に本
発明は。
第一の非コード性ＤＮＡ配列が上記ＰＲタンパク質遺伝
子の１つの５′配置領域に位置する１例えば前記１’Ｒ
タンパクＩＪｊｔ遺伝子の転写開始部位に隣接する約２
０００塩基対内に位置するＤＮＡ配列管含む。上記の好
ましい第一の非コード配列と上記のシグナルペプチドを
コードする第二のコードＤＮＡ配列とからなるＤＮＡ配
列が最も好ましい。
い。
「配列１」、「配列２」、「配列５」および「配列６」
に示した実質的に純粋なＤＮＡ配列並ｔｌｋ本好ましい
。これらの「配列Ｊは第一の非コード性ＤＮＡ配列と第
二のコードＤＮＡ配列とからなる化学的に調節可能なＤ
ＮＡ配列の例であり。
そしてＰＲタンパク質遺伝子タタバＰＲ−１Φ。
ＰＲ−１’から、塩基性タバコβ−１，３−グルカナー
ゼの２つの形態から、それぞれ誘導される。
「配列１」はタバコからの代表的なＰｌ（、−１ａ遺伝
子の配列を示す。ヌクレオチド１ないし約１１５０［非
コード性５′配置の化学的に誘導可能なＤＮＡ配列およ
びタバコ植物内に天然に生じているＰＲ−１ａコ一ド配
列の一部である。この場合化学的に誘導可能な成分配列
はコード配列に隣接している。Ｎ−の３０個のアミノ酸
をコードするこれらのヌクレオチドは、ＰＲ−１ａタン
パク質のシグナルペプチドのコード配列を構成する。コ
ード配列は前項人に記載のあらゆるコード配列がない非
コード性の化学的に誘導可能なＤＮＡ配列を生成するた
めに非コード配列から除去しても良い。そのような除去
は慣用の技術。
例えば制限酵素消化により行うことができる。
本発明はさらに、天然に生ずる化学的に調節可能な遺伝
子の非コード性の化学的に調節可能なＤＮＡ配列である
か、またはその配列に実質的な配列相同性ｔ−’ｆｆす
る第一のＤＮＡ成分配列、この第一の成分配列はこのＤ
４′ｓが化学調節剤に依存する植物１几は植物組織内の
関連ＤＮＡ配列の転写を調節することができるものであ
ジ、これと天然に生じる化学的に調節可能な遺伝子内で
第一の成分が関連する転写可能なＬ１１’ＪＡ配列の全
てでなく部分であるか、１７’ｉ：はこれに実質的な配
列相同性を有する第二のＤＮＡ成分配列とからなるＤＮ
Ａ配列の調製方法を含み、これは天然に生じる遺伝子か
ら実質的に純粋な形態でＤＮＡ　ｆ単離するか、または
化学的もしくは酵素的にＤＮＡ　２合成することをコー
ドする。前項人に記載した特別な方法およびそれにより
得られ之実質的に純粋なＤＮＡ配列が好ましい。
Ｃ０化学的に調節可能なＤＮＡ配列を含有するキメラ遺
伝子 本発明の別の面は少なくとも１つの化学的に調節可能な
ＤＮＡ配列を含有するキメラＤＮＡ配列（キメラ遺伝子
）である。そのようなキメラ配列の２つのタイプを例と
して示す。より単純な。
’！、？ｆ１２部分型キメラＤＮＡ配列は、そのキメラ
遺伝子が化学的調節の適当な条件下で植物組織内に発現
され得るように、化学的に調節可能なＤＮＡ配列と転写
可能なＤＮＡ配列とからなる。とりわけ１本発明はＡ？
ｔＪが化学調節剤に依存するＭ物または植物組織内の関
連ＤＮＡ配列の転写全調節することができる非コード性
の化学的に調節ｏＴ能な第一のＤＮＡ成分配列および植
物ｌｔは槓ｖＪＭｉ織内で転写さｎ得る第二のＤＮＡ成
分配列からなる化学的に調節可能なキメラＤＮＡ配列を
含む。ＤＮＡ成分配列は天然源から誘導されても。
１友は合成で調製されても良い。
第二のＤＮＡ配列はアンチセンス機構により表現型の特
徴の発現を調節することができるＲＮＡとして転写され
ても良い。１之、キメラＤＮＡ配列内の第二のＤＮＡ配
列は転写および翻訳されても良く、即ち表現型の特徴金
主ずるポリペプチドを産生ずるために植物組織内でコー
ド化さ扛ても良い。キメラ遺伝子は第二のＤＮＡ配列が
適当に、典型的には転写を確実にする化学的に調節可能
なＤＮＡ配列に隣接する配向で結合されるように構築さ
れる。結合は慣用の技術で行われる。
る。
第一の非コードＤＮＡ配列が項Ａに記載の好ましいＤＮ
Ａ配列の１つである化学的に調節ａＪ能な第一のＤＮＡ
成分と第二の転写可能なＪ）ＮＡ酸成分からなるキメ？
　ＤＮＡ配列が好ましい。第一のＤＮＡ成分配列は抑制
性１ｔは誘導性化学調節剤により調節されても良い。本
発明の特定の配列は、第一のＤＮＡ成分配列が植物から
の天然に生じる化学的に調節可能な遺伝子内の化学的に
調節可能なＤＮＡ配列に実質的な配列相同性を有するキ
メラＤＮＡ配列である。
植物からの天然に生じる化学的に調節可能な遺伝子内の
化学的に調節可能なＤＮＡ配列であるか、またはその配
列に実質的な配列相同性を有する第一のＤＮＡ成分配列
と１表現型の特徴を生ずるポリペプチドを産生ずる之め
に転写および翻訳され得るコード配列である第二のＤＮ
Ａ成分配列とからなるキメラＤＮＡ配列が好ましい。好
１しくは、この第二のＤＮＡ成分配列は第一のＤＮＡコ
ード配列に隣接している。第一のＤＮＡ成分配列がＰｌ
ｔタンパク質遺伝子１例えば双子葉植物。
例えばタバコｌｔはキメ９りからのＰＲタンパク質遺伝
子内の化学的に誘導可能なＤＮＡ配列であるか、または
その配列に実質的な配列相同性を有するものであるよ５
なキメラＤＮＡ配列が特に好ましい。それらの例は項Ａ
に記載している。
キメラＤＮＡ配列の第二の例示きれるタイプは、２撞１
九はそれ以上の源に由来する６檀のＬｌＮＡｌＮ間列を
含有する。その最も簡単な実施態様において、このキメ
ラＤＮＡ配列は項Ｂに記載し几２部分ｍ配列と少なくと
も１種の異なる源に由来する第三のｗ位配列とからなる
。もつと詳しく説明すると、天然に生ずる化学的に調節
可能な遺伝子の非コード性の化学的に調節可能なＤＮＡ
配列であるか、１ｔはその配列に実質的な配列相同性を
有する第一のＤＮＡ成分配列、この第一の成分配列はこ
の調節が化学調節剤に依存する植物筐た框植物組織内の
関連ＤＮＡ配列の転写？調節することができるものであ
り、こｆＬと天然に生じる化学的に調節可能な遺伝子内
で第一の成分が関連する転写可能な鳳配列の全てでなく
部分であるか。
ｌｔはこｎに実質的な配列相同性？仔する第二のＬｌＮ
ＡｌＮ間列と、そして植物または植物組織内で転写さＩ
ｆ”Ｌ得る第三のＤＮＡ成分配列とがら々る。
第二および第三のＤＮＡ成分配列は典型的にはコード配
列であろう。第三のＤＮＡ成分は１種以上の天然１九は
合成の源から誘導されても良い。
最初の２つのＤＮＡ成分は典型的には起源が天然であろ
う、起源が植物である場合には、それは単子葉、双子葉
または裸子植物であって良い。
好ましい実施態様において％第二のＤＮＡ配列は、最初
の２つのＤＮＡ配列が生じる化学的に調節可能な遺伝子
のシグナルペプチドをコードするヌクレオチド配列を包
含するであろう。化学的に調節可能なＤＮＡ配列がそれ
を誘導する遺伝子のコード配列の一部と関連している場
合、第三のＤＮＡ配列は適当な配向になければならない
だけでなく、第二のＤＮＡ配列と適当な読み枠内にもな
ければならない、この配向けこの分野では十分に公知の
技術により達成され得る。
第一および第二のＤＮＡ配列成分が前項Ｂにおいて好ま
しいものとして記載したものであるキメラＤＮＡ配列が
好ましい。例えば好ましいキメラＤＮＡ配列は、第一の
ＤＮＡ成分配列が双子葉植物１例えはタバコまたはキュ
ウリからのＰＲタンパク質遺伝子内の化学的に誘導可能
なＤＮＡ配列であるか、またはその配列に実質的な配列
相同性を有するものであるものの１つである。ＰＲタン
パク質遺伝子の例は上記のものである。
上記のキメラ遺伝子は様々な可能な構築物を含む。化学
的に調節可能な非コード配列は、開花または果実熟成遺
伝子、除草剤もしくは多くの種類の有害生物、例えば菌
類、ウィルス、バクテリア、昆虫、線虫もしくはクモ形
類動物に対する許容性もしくは耐性音生ずる遺伝子、酵
素もしくは二次代謝物の産生を制御する遺伝子、雄性も
しくは雌性不稔性、矯性、芳香性、栄養品質等と関連し
得る。本発明を用いてそのような特徴は農夫および庭師
により高めらｎることができ、もはや天然の要因のみに
依存しない。
制御に対して特別の興味がある表現型の特徴は、組織培
養またはバイオリアクター中での代謝物の産生である。
好ましいキメラＤＮＡ配列は、コードＤＮＡ成分配列が
表現型の特徴、例えば除草剤、菌類、ウィルス、バクテ
リア、昆虫、線虫ま之はクモ形類動物に対する許容性ま
たは耐性、二次代謝物の産生、雄性ま几は雌性不稔性お
よび酵素またはその他のリポータ−化合物の産生からな
る群から選択される特徴をコードする２種ま７’ｈｉｊ
５種の成分配列である。コード成分配列が除草剤に対す
る許容性ま友は耐性全コードする、例えば野生型または
除草剤耐性アセトヒドロキシ酸シンターゼ（Ａｔ（Ａｓ
）　　！−コードするか、ま友はコード成分配列が昆虫
に対する耐性をコードする、例えばバチラス　スリンギ
エンシス内毒素（ＢＴ）ｔ−コードする２ｆｌＩま穴は
３種のキメラＤＮＡ配列が特に好ましい。
キメラ配列が化学調節剤の検定として使用される場合、
表現型の特徴は好１しくけ検定可能なマーカーである。
適当なマーカーは、ルシフェラ−セ（ＬＵＸ）　、クロ
ラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（ＣＡＴ
）、ネオマイ・ンンホスホトランス７エラーゼ（ＮＰＴ
）、／バリン７ンターゼ（ＮＯ５）、オクトピンシンタ
ーゼ（ＯＣ５）、β−１，５−グルクロニダーゼ（ＧＵ
Ｓ）、アセトヒドロキシ酸シンターゼ（Ａｆ（ＡＳ）お
よびバチラススリンギエンシス内毒素（ＢＴ）ｔ−包含
するが。
しかしこれに限定されない。
実施例に詳細に記載したそのようなキメラＤＮＡ配列の
代表例は、ＰＲ−１の遺伝子の５′配置非コ一ド配列を
含む２部分キメラＤＮＡ配列である。例示されるマーカ
ーの１つはＧＵＳ遺伝子のコード配列であるが、上記マ
ーカーの全て全使用できる。類似の５部分キメ今配列は
ＰＲ−１の遺伝子のコード配列の一部を含むつこれらの
構築物は、化学的誘導の効果、即ちβ−グルクロニダー
ゼ酵素活性が植物細胞−１友はそれらの抽出物内に容易
に検出可能であるから特に有用である。その他の特別な
実施態様、例えばタバコβ−１，５−グルカナーゼ遺伝
子の１つの非コード配列からなるもの、および野生型も
しくは除草剤耐性アセトヒドロキシ酸シンターゼま友は
バチラス　スリンギエンシス内毒素のコード配列からな
る本のは、項りの実施例に記載している。
好ましいキメラＤＮＡ配列は、２成分または３成分キメ
ラＤＮＡ配列であり、その中で萬−のＤＮＡ成分配列は
タバコＰＲ−１の遺伝子の５′配置領域であり、そして
転写開始部位の隣りの約５００塩基以上、例えば５００
と２０００塩基の間、好１しくに６００と１０００塩基
の間全含むものである。
第二のＤＮＡ成分配列がシグナルペプチドをコードする
、例えば第二のＤＮＡ成分配列がＰＲタンパク質遺伝子
好ましくはｐＲ−１ａ遺伝子からのシグナルペプチドで
あるか、ま几はそれに実質的な配列相同を有するペプチ
ド金コードする３成分からなるキメラＤＮＡ配列がさら
に好ましいう 制限が化学調節剤に依存する植物ま定は植物組織内の関
連ＤＮＡ配列の転写全制御することができる非コード性
の化学的に調節可能な第一のＤＮＡ成分配列および植物
または植物組織内で転写され得る第二のＤＮＡ成分配列
からなる化学的に調節可能なキメラＤＮＡ配列の調製方
法において、前記ＤＮＡ成分配列を連結することをコー
ドする方法を木兄明江さらに含む。同様に本発明は、天
然に生ずる化学的に調節可能な遺伝子の非コード性の化
学的に調節可能なＤＮＡ配列であるか、ま之はその配列
に実質的な配列相同性を有する第一のＤＮＡ成分配列、
この第一の成分配列はこの調節が化学調節剤に依存する
植物ま几は植物組織内の関連ＤＮＡ配列の転写を調節す
ることができるものであり、これと天然に生じる化学的
に調節可能な遺伝子内で第一の成分が関連する転写可能
なＤＮＡ配列の全てでなく部分であるか、またはこｎに
実質的な配列相同性′ｔ−有する第二のＤＮＡ成分配列
と、そしてｍ物まｔは植物組織内で転写さ几得る第三の
ＤＮＡ成分配列とからなるキメラＤＮＡ配列の調製方法
において、前記ＤＮＡ成分配列を同時にまｔは連続的に
連結することをコードする方法を含む。
Ｄ、ベクター 標準技術により産生され、そして項五もしくはＢに記載
し文化学的に調節可能なＤＮＡ配列ま念は項Ｃに記載し
九キメラＤＮＡ配列のいずれかからなるベクターは、本
発明の付加的な態様を示す。ベクターは上記ＤＮＡ配列
のＪＩＬ雌および複製の目的で使用され得、そしてこれ
ら配列で適当な宿主の形質転換のために使用され得る組
換えＤＮＡ配列である。単離および複製用の好ま［７い
ベクターは、適当な宿主微生物、例えば大喝菌内で増殖
し得るプラスミドである。形賀転億用の好ましいベクタ
ーは、植物細胞ま念はアｆロバクチリアの形質転換にＭ
用であるものである。とりわけ、プロトプラスト以外の
植物細＠、全形質転換する場合、その時好ましいベクタ
ーはＴｉ　　プラスミド誘導ベクターである。プロトプ
ラスト内への直接ＤＮ人導入７）九めに、上記ベクター
のあらゆるものが使用できる。出発材料として利用さＴ
ｉ得る適当なベクターはこグ）分野で公知である。形質
転換する植物組織およびプロドブラスト用の適当なベク
ターは、ｄｅＦ　ｒａ＋ｎｏｎｄ、　Ａ、等、　　Ｂｉ
ｏ７’Ｔｅｃｈｎｏｉｏｇｙ　　１，２６３（１９８３
）　：　Ａｎ、　Ｇ、等、　　ＥＭＢＯＪ、　４．２７
７（１９８５）：Ｔ’ｏｔｒｙｋｕｓ、■０等、同上：
　ＲＯｔｈＳｔｅｉｎ、　Ｓ、　Ｊ、等。
Ｇｅｎｅ　５５．１５３（１９８７）　　にｌ己滅され
ている。こｎらに加えて多（のその他のベクターは本発
明ハ出発材料として１吏用に適しているものがこの分野
で記載さｎている。
項Ａｔ７ｔはＢで記載した化学的に調節可能なＤＮＡ配
列だけを含有するベクターは、項ＣＫ記載しｔキメラＤ
ＮＡ配列を含有するベクターの調製の中間体として使用
しても良い。そのような中間体ベクター内への転写可能
である適当な配列の挿入によりその次に所望の植物組織
、プロトプラストまたはその他の宿主を形質転換するｔ
めに使用できる本発明のキメラＤＮＡ配列からなるベク
ターを生ずる。、また、キメラＤＮＡ配列金−＃し、そ
して次いで所望のｍ物組織またはその他の宿主を形質転
換する力めに使用−ｑｎ′ｆｉ）適当なベクター内に挿
入でｎ４る。
ベクターの構築および複！！！は適当な宿主、例えば大
腸菌内で行うことができる。適当な大腸菌株）ＩＢｌｏ
ｌ、　ＪＭ８５．　ＤＨｌ、　Ｄ）（５α、　ＬＥ３９
２等金包含する。本発明のベクター金、例えＩｉ直接遺
伝子導入１７ｊＨマイクロインジエクンヨン技術におい
て便用しても良い。ある場合には使用前にベクター全直
線化することが好ツしい。また、ベクター金アグロバク
テリウム宿主に導入しても良い。この導入は二親又＠　
（５１ｍ０ｎ、　Ｒ−等。
Ｂｉｏ／Ｔｅｃｋｎｏｌｏｇｙ　１．７４（１９８３）
）、三親交雑（Ｄｉｔｔａ、　Ｇ、等、　　ｐｒｏｃ、
　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃ；、　ＵＳＡ７７、７
３４７（１９８０）　）　　または形質転換（Ｈｏｌ　
５ｔｅｒｓ。
Ｍｏ等、　Ｍｏｌ、Ｑｅｎ、　Ｇｅｎｅｔ、　１６３．
１８１（１９７８））を包含する慣用技術により行われ
ても良い。アグロバクテリウムの適当な株は、アゲａバ
クテリウムチェメファゾエンスＬＢ人４４０４．　ＣＩ
Ｆ＄　５４２およびＣ５８Ｚ　７０７　ｔ−包含するが
、これに限定されない。
好ましいベクターは項Ａ、ＢおよびＣＫ記載の好ましい
ＤＮＡ配列からなるものである。嘔らに好ましいベクタ
ーは植物細胞またはアグロバクテリウム内で機能的であ
る１つである。項りの実施例に記載している。
Ｅ、ｍ物組織、植物体および種子 本発明のその他の面は上記のキメラＤＮＡ配列全含有す
る植物組織、植物体またｌｉ種子である。
と記の好ましいとじｔキメラＤＮＡ配列を含有する植物
組織、植物体ま交は種子が好ましい。
植物組織の細胞をこの分野では公知のあらゆる技術（上
記文献に記載のものを含む）および以下の実施例に詳し
く記載した技術により上記のベクターで形質転換する。
これらの技術は直接感染ま友はアグロバクテリウムでの
植物もしくは植物組織の共培養を包含する６′＃に適当
である技術は）（ｏｒｓｈ、　Ｒ，Ｂ、等、　５ｃｌｅ
ｎｃｅ　２２５゜１２２９（１９８５）に記載された葉
ディスク形質転換である。また、ベクターは直接、例え
ば上に十分に記載したように、エレクトロボレーシラン
により、マイクロインジスクシ１ンにより、またはポリ
エチレングリコール（ｆ’ＥＧ）、塩化カルシウムの存
在下もしくは電場内でのプロトプラストの形質転換によ
り形質転換され得る。
形質転換される細胞は単子葉ま友は双子葉植物に由来し
ても良く、そして本発明の化学的に調節可能なキメラ遺
伝子ｂ１ｐＪま念はそれ以上含有していても良い。従っ
て、例えば除草剤および様々な昆虫、ウィルス、バクテ
リア、菌類およびその他の有害生物に対する耐性または
許容性、不稔性、大きさ、開花および果実熟成をコード
する遺伝子は植物組織内に導入され、そしてこれらの細
胞ま友はプロトプラストはこれらの特徴が化学調節剤で
の操作により制御され得る４Ｗ物体に結局再生でれる。
また細胞を組織培養ま念はバイオリアクター中で増殖さ
せ、酵素または二次代謝′＄Ｊを産生ずることができる
。酵素倹定が望′１ｆＬる場合、キメラ遺伝子のコード
部分は、例えば上記のＬＵＸ、　ＣＡＴ、　ＮＰＴ、　
ＮＯ５゜ＯＣ３，ＧＵＳ、ＡＨＡＳまたはＢＴ遺伝子か
らなっていても艮い。ＰＲ遺伝子から化学的に誘導可能
な配列を含有するそのようなキメラ遺伝子に、調節剤の
適用の容易きおよび酵素産物の検出の容易さの定めに本
発明の好ましい実施ｉ２１様である。
形質転換に続き、形質転！され几細胞ま友は植物組ａｔ
慣用の技術により選択するかスクリーニングを行う。所
望により上記の参考文献にｇ２．載のもの、そして単子
葉および双子葉植物の両方を含む実施例に記載のもの金
含む公知の操作により、形質転換された細胞ま友は植物
組織は上記のキメラＤＮＡ配列を含有し、そして次いで
再生される。これらの技術により再生され得る種は、ト
ウモロコシ、ヒマワリ、アブラナ、クローバ−タバコ、
ニンジン、ワタ、アルファルファ、イネ、ジャガイモ、
ナスおよびキュウリを包含するが、こｎに限定されない
。再生さｎ念植物体を標燻法により形質転換に対するス
クリーニングを行う。改良されｆｃ、植物および種子系
列を見つけるｔめに、再生された植物の後代を組込ま几
次ＤＮ人配列の引き続く存在に対して連続的にスクリー
ニングおよび選択する。
古典的な育種、グミドプラスト融合、核移入および染色
体移入を包含する様々な技術によりＤＮＡ配列をその他
の遺伝子系列内に移動させろことができる。
Ｆ、利点および利用 本発明は化学的に調節可能なＤＮＡ配列を含有するキメ
ラ遺伝子のＳ＊ま几は植物組畿内での容易に制御さｆ′
Ｌ友調節可能な発現に基づく数多（の利点および利用を
提供する。アンチセンス機構により作用する遺伝子ま几
はその発現が表現型の特徴の生成を生じる遺伝子の調節
が可能である。遺伝子発現の時期および速度を制御でき
ること並びにこの制御を植物全体に均一にま几は植物の
限られた部分のいずｎかに起こすことの容易さは特に重
要である。
制御を起こすことに、植物＠織ま几は植物体もしくはｉ
物の一部に化学調節剤を、植物細胞、植物組織または種
物体内での発現が望み通りに行われるキメラ遺伝子を調
節するような方法および量で、適用することにより簡単
に行われても艮い。例えば、発現されるべ＠特徴が葉に
だけ発現されるのが好ましい場合、その時葉での発現を
最適化する時期に葉に噴！または散布すると、そして植
物のその他の部分へのあらゆる移動の前に、容易におよ
び効果的に目的を達成し得る。
ま友、土の上方の植物の部分全体への均一な発現は植物
全体への施用により生じ得る（即ち、茎および葉の両面
）、根における発現が望ましい場合、種子もしくは種子
の回りの土まｆＰ：、は根への施用が調節の可能な方法
である。バイオリアクター中での発現は全く容易に、例
えば細胞を接触させる培地への化学調節剤を施用するこ
とにより行われる。
トランスジェニック植物内の新規な表現型の特徴の発現
の時期および／まｆｃは速度を制御する能力は多くの有
用な利点を提供する。例えば、除草剤またはその他の有
害生物防除剤に対する解毒磯傳による許容性が植物内に
導入されろならば、その特徴を化学調節剤の施用の適当
な時期により最大化し得る。従って調節剤は除草剤また
はその他の有害生物防除剤の施用前、施用と一緒に、ま
九は施用後に、方法が最適な許容性を与えるように施用
され得る。
生合成が内因性ま九は外来ＤＮ人により制御される化合
物の産生を調節することも今では可能である。化学的な
誘導に関し、そのような産物の産生を所望の時期に開始
させること本でさる。
誘導されるプロセスは多段階生合成であっても、′１７
ｔは中間代謝物の１段階変換であっても良い。
本発明のもリークの利点は、調節性化学物實の施用によ
り所望の時期で植物の生長プロセスを調節する能力から
生じる。例えば、４１！物生長の同時発生（発芽、ひこ
ばえの発生、若枝の発生、孔形成、開花、果実成熟、乾
燥、離脱その他〕が行われ得る。さらに通常の植物の生
長を抑えることができる。このことは、例えば所望の生
長段階で干渉するであろう毒素遺伝子、アンチセンス機
構を介して生長段階を阻害するであろうＤＮＡ配列、ま
ｔはその発現が新しい生喝段階への移行を阻害し、そし
て生長が進むのを化学的に押粕し得る遺伝子を導入する
ことにより達成さｎ得るう作物の制御された４ｍ形成に
対する雄性ｆｉは雌性不稔性の誘導；１．１つの適当な
効用である。
本発明の付加的な利点は新規な検定操作、好ましくは酵
素検定操作である。例えば新規な化学調節剤の同定は今
ゼ・非常に容易に行うことができる。そのような検定方
法は本発明のキメラＤＮＡ配列を含有する形質転換され
た植物ま几は植物細胞の使用を含む。化学物質は形質転
換された宿主に施用され、そして転写可能なりＮ人配列
の転写は対照に対して測定され、転写は翻訳産物の形態
で、またはそのような産物の効果として通常検出される
。検定μ種々の方法で行わｎても良いが、しかし典型的
には全体の再生され７を植物体を用いるか（ＩＩ！物体
に化学物質を施用することにより、まｔは培養細１泡ま
ｔは組織に対して（細胞または組織に化学物賞金施用す
ることにより）、そして次に酵素活性用の基質を供給す
ることにより行われる。酵素活性の産物を次に標準法、
例えば分光光度測定により検出する。
特に本発明は項Ｃに記載したキメラＤＮＡ配列またにキ
メラＤＮＡ配列を含有するベクターで宿主を形質転換し
、形質転換された宿主に推定？＋）の化学調節剤を施用
し、そして表現型の特徴の発現を測定することからなる
化学Ａ節剤を同定する方法を含む。好ましい方法は形質
転換され几宿主が植物組織ま几は植物細胞であるような
方法である。キメラＤＮＡ配列が好ましいものとして上
記した配列、例えばと記キメラＤＮＡの第一のＤＮＡ成
分配列がＰＲタンパク質遺伝子の化学的に誘導可能な配
列であるか、またにその配列に実質的な配列相同性を有
する化学的に誘導可能な配列であり、セしてキメラＤＮ
Ａによりコードされた表現型の特徴が検定可能な酵素マ
ーカーである様が方法がさらに好ましい。
不発明のもう一つの態様はその他の化学的に調節可能な
ＤＮＡ配列を同定する新規な方法の発見である。推定ｉ
ｎる化学的に調節可能なＤＮＡ配列を含有するベクター
が例えば宿主選択性マーカーおよび選択性ま友は検定性
マーカーから調製嘔れる。、４当な選択性マーカーは抗
生物質耐性遺伝子および除草剤耐性遺伝子を包含する。
代表的な抗生物質耐性遺伝子は、・・イグロマイシン、
カナマイシン、クロラムフェニコール、ブレオマイシン
、ビエーロマイシン、リンコマイシン、Ｇ４１Ｂおよび
メトトレキセイトのものを包含する。ハイグロマイシン
に対する耐性の特ニ適当な遺伝子はアミ／グリコシドホ
スホトランスフェラーゼ■である。ハイグロマイシン耐
性遺伝子を含有する植物の形質転換用の適当なベクター
は、Ｒｏｔｈｓｔｅｉｎ、　Ｓ、　Ｊ、等、　　Ｑｅｎ
ｅ５３、１５３（１９８７）に記載さ几ている。除草剤
耐性遺伝子の例に、例えばスルホニル尿素、グリホセー
ト、ホスフィノドリチンおよびアトラジンに対する耐性
をコード化する。
適当な検定可能なマーカーは酵素、抗原、免疫グミプリ
ｙ等の遺伝子、並びに抗生物質耐性遺伝子を包含する。
適当な酵素マーカーはＬＵＸ。
ＣＡＴ、ＮＰＴ、ＮＯ５，ＯＣ５，ＧＵＳ、　ＡＨＡｓ
およびＢＴを包含する６特に適当な酵素は酵素検定の容
易１故にβ−１，５−グルクロニダーゼ（ＧＵＳ）　　
である、検定可能なマーカーをコードするＤＮＡ配列を
慣用の技術を用いてベクター内に挿入することができる
。
検定可能なマーカーの発現が推定きれるＤＮＡ配列の制
御下にあるように１推定はれる調節可能なＤＮＡ配列は
典型的には検定可能なマーカー遺伝子に隣接しで挿入さ
れる。ベクターは次に植物組織またはもう一つの適当な
宿主を形質転換するために使用される。形質転換され友
ｉ物組ｌ＆ま几は宿主は植物選択性マーカー、典型的に
は抗生物質耐性に基づいて選択される。形質転換でれ九
組織の選択ま之は再生に峡いて、次に化学調節剤を植物
組織ま友はその他の宿主に施用する。化学調節剤の施用
に続（検定可能なマーカーの誘導ま九は抑初は、Ａ節が
化学調節剤に依存する隣りのＤＮＡ配列の転写を調節す
ることができるものの様な推定式ｎるＤＮＡ配列を同定
する。例えば、化学調節剤を葉またはその他の植物組織
に対して施用し、そして検定可能なマーカーの発現を測
定することＫより、検定は全体の再生されたま友は形質
転−１ｆ！てれた植物体に関して行うことができる。ま
几、推定される化学調節剤をカルスまたはその他の培養
体に施用し、そして検定可能なマーカーの発現を測定す
ることにより、検定は形質転換ぢ九ｔカルス組ａまたは
細胞培譬体中のその他の宿主に関して行うことができる
。
特に本発明は以下の段階： ｌａｌ　　推定される化学的に調節可能なＤＮＡ配列ま
たは該ＤＮＡを含有するベクター　宿主選択性遺伝子マ
ーカーである第二のＤＮＡ配列および表現型の特徴をコ
ードする第三のＤＮＡ配列で宿主を形質転換し、 １１）Ｉ　　この形質転換され定宿主に化学調節剤を施
用し、そして ＋Ｃ＋　　前記第三のＤＮＡ配列によりコードされ１表
現型の特徴の発現を測定するか、またはその発現におけ
る変化を選択する、ことからなる化学的に調節可能なＤ
ＮＡ配列を同定する方法を含む。
前記第三のＤＮＡ配列が宿主選択性ｉたは検定性遺伝子
マーカーである方法および第二もしくけ第三のＤＮＡ配
列が除草剤耐性または抗生物質耐性、例えばハイグロマ
イシン、カナマイシン、クロラムフェニコール、ブレオ
マイシン、ビューロマイシン、リンコマイシンおよびメ
トトレキセイト耐性遺伝子から選択でｎろ、例えばアミ
ノグリコシドホスホトランスフェラーゼ■ハイグロマイ
シン耐性遺伝子である方法のような方法が好ましい。
推定烙れる化学的Ｋｖ！４節可能なＤＮＡ配列が第三の
ＤＮＡ配列と績合し、そして好ましくはそれに隣接して
いるような方法もま几好ましい。
第三のＤＮＡ配列がルシフェラーゼ（ＬＵＸ）、クロラ
ムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（ＣＡＴ）
、ネオマイシンホスホトランスフェラーゼ（ＮＰＴ）、
ツバリンシンターゼ（ＮＯ５）、オクトピンシンターゼ
（ＯＣＳ）、β−１，５−グルクロニダーゼ（ＧＵＳ）
、アセトヒドロキシ酸シンターゼ（Ａｔ（Ａｓ　）およ
びバチラス　スリンギエンシスｆｆ１ｌ＊（ＢＴ）から
なる群から選択さ九る倹定可能々酵素マーカーをコード
するような方法がさらに好ましい。
本発明の別の面は上記方法により同定され九実質的に純
粋な化学的だ調節可能な遺伝子配列である。
本発明は１定形質転換され次植物材料を選択する方法も
樟供する。化学調節剤が知ら几ている化学的に調節可能
なＤＮＡ配列および表現型の待舐が調節剤で処理きれる
第二のＤＮＡ配列を含む外因性ＤＮＡ配列に植物材料を
晒（〜、そして表現型の特徴の発現を捜した。特徴の観
察は、推定−＋　Ｑ、）駁質転得体の形質転換が実＠に
起こりｔことを確信する。この方法の几めの典型的な表
現型の特徴は上記の宿主選択性マーカーおよび検定性マ
ーカーを包含する。
所に本発明は、ｆａｌ公知の化学調節剤で１む東３形質
転換体を処理し、そして１ｔ）ｌ第二のＤＮＡ配列によ
りコードきれ九表現型の特徴の発現による形質転換体を
選択することからなる、公知の化学調節剤により化学的
に′ｆＩ４節可能である第一のＤＮＡＪｔ分配列および
表現型マーカーをコードする関連する第二のＤＮＡ配列
からなる形質転換性ＤＮＡに晒嘔ｎ念形質転換され九植
物細胞まｔは組織を選択する方法を含む。上記表現型の
特徴が抗生物質耐性例えば、ハイグロマイシン、カナマ
イシン、クロラムフェニコール、ブレオマイシン、ビュ
ーロマイシン、リンコマイシン、６４１Ｂおよびメト＋
−レキセイトに対する耐性、了たに検定可能な酵素マー
カー　例えば、ルシフェ５−セ（ＬＵＸ）、クロラムフ
ェニコールアセチルトランスフェラーゼ（ＣＡＴ　）　
、ネオマイシンホスホトランスフェラーゼ（ＮＰＴ）、
ツバリンシンターゼ（ＮＯ５）、オクトピンシンターゼ
（ＯＣＳ）、β−１，５−グルクロニダーゼ（ＧＵＳ）
、アセトヒドロキシ酸シンターゼ（ＡＨＡＳ　）および
バチラススリンギエンシス内毒素（ＢＴ）からなる群か
ら選択されるものであるような方法が好ましい方法であ
る。
Ｇ、シグナルペプチド シグナルベブチド−またはシグナル配列は、小泡体に入
るタンパク質における特別なＮ末端アミノ酸配列である
。真核細胞内のそのような配列は典型的には、その多（
が疎水性である約１５ないし４０１固のアミノ酸残基を
含む。その配列は最終的には成熟タンパク質から切断ざ
ｎる。
本発明に関し、化学的に調節可能な遺伝子のシグナルペ
プチドは、上記の３部分キメラ構築物の構築に有用であ
る。そのようなキメラ構築物は化学的に調節可能な第一
の配列、タンパク質内でシグナルペプチドをコードする
４二のＤＮＡ配列、および表現型の特ａをコードする第
三の配列を含有する。表現型の特徴は例えば検定操作で
容易に検出てれろものが好ましい。シグナルペプチドを
コードするＤＮＡ配列のキメラ構築物内への包含は、宿
主細胞の小胞、体から離れてその最終的な部位に向けら
れる第三のＤＮＡ配列により発現された産物を許す。
それ故に本発明の付加的な態様はタバコＰＲ−ミ／酸配
列を有するタンパク質である。このペプチドのアミノ酸
配列は以下の通りである：ＭｅｔＱ１ｙｐｈｅＶａｌＩ
、ｅｕｐｈｅ５ｅｒＧｌｎＩ、ｅｕＰｒｏＳｅｒＰｈｅ
Ｌｍｔ−ＬｅｕＶａｌＳｅｒＴｈｒＬｅｕＬｅｕＬｅｕ
ＰｈｅＬｅｕＶａｌ　Ｉ　ｌｅ　−５ｅｒｆ（ｉ　３Ｓ
ｅｒＣｙｓＡｒｇｘｌａ。
本発明はま九このペプチドをコードするＤＮＡに、本発
明はまた（１）シグナルペプチドをコードする配列と共
に化学的に調節可能な配列を含有するＤＮＡおよび（２
）化学的に調節可能な成分、シグナルペプチドのコード
部分および転写、好運しくけ翻訳されるＤＮＡ配列を含
有する３部分キメラＤＮ人配列を含む。
Ｈ０新規なＰＲ遺伝子 本発明はま友、新次に単離し、そして同定しｆＰＲゲノ
ムＤＮＡおよびタバコからのＰＲ−１３゜ＰＲ−１’お
よびＰＲ−Ｒと記載される遺伝子からのｃＤＮＡ　ｓキ
ュウリからの病原体誘導性キチナーゼ、タバコからのＰ
Ｒ−Ｑ　、タバコからの塩基性β−１，３−グルカナー
ゼ５９．１および３９５、タバコからの酸性β−１，３
−グルカナーゼ、およびこれらの遺伝子に実質的な配列
相同性を有するＤＮＡ配列を含む。これらの遺伝子のＤ
ＮＡ配列は配列１ないし８に示されている。配列１．２
゜５および６（それぞれＰＲ−１３，ＰＲ−１’、　　
並びにβ−１，３−グルカナーゼ３９．１および３９３
）の新規な遺伝子はま友上記の本発明の非コード性の化
学的に調節可能なＤＮＡ配列の特別な実施嗜様を表わす
。新規な配列５，４．７および８は、ＰＲタンパク質キ
ュウリキチナーゼ、タバコＰＲ−Ｒ、タバコＰＲ−Ｑお
よびタバコβ−１，３−グルカナーゼの酸性体をコード
する。遺伝子の単離および特徴づけの詳細は実施例に示
す。
■、化学調節剤 化学調節剤は、用語の定義に示したようにある環境下で
化学的に調節可能なＤＮＡ配列を介して遺伝子の発現を
調節する物質として定義される。溶媒和またはその他の
錯化分子またはアニオンを含むか、または含まないイオ
ン化または中性の形態にある物質は、調節が望まれる時
期に化学的に調節可能な遺伝子を含有する系に対して通
常外因性であろう。外因性化学的調節剤が系内の調節剤
の童を制御するのが容易で便利であるため好ましい、し
かしながら、本発明はまた内因性調節剤、例えば系内の
活性またはレベルが系内のその他の成分によシ、または
系で作用することｋよシ人為的に制御される化学物質の
使用を包含する。
化学調節剤は植物またはそれらの密接な誘導体内におい
てＰＲタンパク質用の誘導剤であることが知られて偽る
化学物質を包含する。これらは安息香酸ＳｔＶチル酸、
ポリアクリル酸およびそれらの置換誘導体を包含し、適
当な置換基は低級アルキル基、低級アルコキシ基、低級
アルキルチオ基訃よびハロゲン原子を包含する。
植物組織、典型的には全体の植物の葉に施用する場合、
ｍＲＮＡおよびＰＲタンパク質のレベルの増加が植物組
織内で明らかである。
本発明の化学的に調節可能なＤＮＡ配列およびキメラ遺
伝子用の調節剤の付加的な群は、ベンゾ−１，２，３−
チアジアゾール構造に基づいており、そして以下のタイ
プの化合物：ベンゾ−１，２，！５−チアジアゾールカ
ルボンハ、ベンゾ−１，２，３−チアジアゾールチオカ
ルボン酸、シアノベンゾ−１，２，３−チアジアゾール
、ベンゾ−１，２，３−チアジアゾールカルボン酸アミ
ド、ベンゾ−１，２，３−チアジアゾールカルボン酸ヒ
ドラジド、およびそれらの誘導体を包含するが、これに
限定されない。
調節剤の好ましい群は、ベンゾ−１，２，！Ｓ−チアジ
アゾールー７−カルボン酸、ベンゾ−１゜２．３−チア
ジアゾール−７−チオカルボン酸、７−ジアノベンゾ−
１，２，３−チアジアゾール、ベンゾ−１，２，３−チ
アジアゾール−７−カルボン酸アミド、ベンゾ−１，２
，３−チアジアゾール−７−カルボン酸ヒドラジド、お
よびそれらの誘導体を包含するが、これに限定されなり
。
適当な誘導体はベンゾ−１，２，３−チアジアゾール部
分が非置換または農薬の芳香環系において通常用いられ
る小さな置換基、例えば低級アルキル基、低級アルコキ
シ基、低級ハロアルキル基、低級ハロアルコキシ基、低
級アルキルチオ基、シアノ基、ニトロ基およびハロゲン
原子により置換されたタイプの化合物の代表種を含むが
、これに限定されない。適当な誘導体はさらに、”言カ
ルボン酸、チオカルボン酸、カルボン酸アミドまたはカ
ルボン酸ヒドラジド官能基のいずれかが非置換または脂
肪族、芳香脂肪族または芳香族残基により置換されたベ
ンゾ−１，２，５−チアジアゾール化合物の代表種を含
むが、こ九に限定されない、適当な残基は、アルキルｆ
ｉ　（特に低級アルキル基）、アルコキシ基（特に低級
アルコキシ基）、低級アルコキシアルキル基、アルコキ
シアルコキシアルキル基、シクロアルキル基、シクロア
ルキルアルキル基、フェニルアルキル基（特にベンジル
基）、ナフチルアルキル基、フェノキ７アルキル基、ア
ルケニル基、およびアルキニル基を含むが、これに限定
されず、この中で置換基のアルキル部分は非置換である
か、またはヒドロキシ基、ハロゲン原子、シアノ基また
はニトロ基により置換されており、そして置換基の芳香
族部分は非置換であるか、または農薬における芳香環系
に通常用いられる小さい置換基、例えば低級アルキル基
、低級アルコキシ基、低級ハロアルキル基、低級ハロア
ルコキシ基、低級アルキルチオ基、シアノ基、ニトロ基
およびハロゲン原子によシ置換されている。
ベンゾ−１，２，５−チアジアゾール構造に基づいた調
節剤は調節剤として実際に作用する分子を離脱すること
のできる全ての分子系を含む。
ベンゾ−１，２，３−チアジアゾール構造に基づいた調
節剤の好ましい群は、ベンゾ−１，２゜３−チアジアゾ
ールカルボン酸、アルキルベンゾ−１，２，３−チアジ
アゾールカルボキシレート（アルキル基は１ないし６個
の炭素原子を有する）、およびこれらの化合物の置換さ
れた誘導体を包含する。適当な置換基は低級アルキル基
、低級アルコキシ基、低級アルキルチオ基およびハロゲ
ン原子を包含する。＃に、ベンゾ−１，２，３−チアジ
アゾール−７−カルボン酸およびそのアルキルエステル
、例えばメチルベンゾ−１，２，３−チアジアゾール−
７−カルボキシレートは、ＰＲタンパク實遺云子から単
離された化学的に調節可能なＤＮＡ配列からなるキメラ
ＤＮＡ配列用の好ましい誘導剤である。記載した化学調
節剤の合成および殺生物剤としてのそれらの利用は莢国
特許第１１７６７９番号およびＫｉｒｂｙ、　Ｐｌ等、
Ｊ、　Ｃｈｅｍ、　Ｓｏｃ、　０２２５０（１９７０）
Ｋ明記されている。
さらに本発明による調節剤として使用され得るベンゾ−
１，２，５−チアジアゾールの誘導体は、１９８８年８
月１８日出願の米国特許出Ｈ第２３４．２４１号明細書
に記載されており、これを参照により体間Ｉ１８に編入
する。
ベンゾ−１，２，！ｌ−チアジアゾール構造に基づいた
好ましい種の中で、例えばベンゾ−１゜２．３−チアジ
アゾール−７−カルボン酸、メチルベンゾ−１，２，３
−チアジアゾール−７−カルボキシレート、ｎ−プロピ
ルベンゾ−１，２゜３−チアジアゾール−７−カルボキ
シレート、ベンジルベンゾ−１，２，３−チアジアゾー
ル−７−カルボキシレート、ベンゾ−１，２，５−チア
ジアゾール−７−カルボン酸第二ブチルヒドラジド等が
言及し得る。
本発明の化学的に調節可能なＤＮＡ配列のための調節剤
の付加的な群はピリジンカルボン酸構造、例えばインニ
コチン酸構造そして好ましくはハロインニコチン酸構造
に基づく。ジクロロインニコチン酸およびそれらの誘導
体、例えば低級アルキルエステルが好ましい。化合物の
この類の適当な調節剤、例えば２，６−ジクロロイソニ
コチン酸、およびそれらの低級アルキルエステル、特に
メチルエステルである。
本発明のその他の面はそれ故に、化学的に調節可能な遺
伝子の転写を調節する方法であシ、この方法はそのよう
な化学調節剤を項Ａ、ＢまたはＣに記載の化学的に調節
可能なＤＮＡ配列含有の植物ｍ織、植物体または種子に
施用することからなる。植物組織、植物体または種子が
上記の好ましｂ化学的に調節可能なＤＮＡ配列を含有す
るような方法が好ましい。
化学調節剤は純粋な形態で、溶液または懸濁液で、粉末
または微粉末として、またはＱ、桑に使用されるその他
の慣用の配合剤で、またはバイオリアクター工程で施用
され得る。そのような配合剤は固体または液体担体、即
ち植物イ）、組織、細胞または組織培養またはその他へ
の施用を促進するために、または貯蔵、取扱いまたは輸
送特性を改善するために調節剤が組合せられる材料を包
含し得る。適当な担体の例は珪酸塩、粘土、炭素、硫黄
、樹脂、アルコール、ケトン、芳香族炭化水素等を包含
する。慣用の水利粉末または水性エマルジョンとして配
合される場合、ｖ！４？ｆＪ剤配合剤は剤種合剤はそれ
以上の慣用の界面活性剤、イオン性または非イオン性の
いずれかの、例えば水利剤、乳剤または分散剤を包含し
得る。
調節剤はまた植物にある利益を付与するのに望ましいも
う一つの薬剤と組合せて植物に施用しても良く、前記利
益は調節剤によシ調節されるあらゆるキメラ遺伝子によ
シ制御される特徴に関連するか、または関連しない利益
である。
例えば、調節剤は肥料と混ぜ、そして肥沃化に関連しな
いトランスジェニフクな特徴の発現が望まれる直前に施
用され得る。また、それは除草剤と組合せられ、そして
除草剤の効果がＳもなければ最大に達するであろう時に
そのような効果を減するために施用され得る。
液体配合剤のよりに、調節剤は植物の葉、茎または枝に
、蒔く前に種子に、または土もしくは植物を支持するそ
の他の住良培地にスプレーとして施用しても良す、調節
剤はバイオリアクター系内で使用され得、調節は反応培
地に調節剤配合剤の単独添加によるか、または予め決め
られた期間にわたり連続的な添加により行われる。
調節剤は所望のｉ！Ｊ４節を行うのに十分な盆で、そし
て十分な期間にわたり施用される。好ましい調節剤は施
用量で施用される植物、植物組織または植物細胞に植物
毒性またはその他の男性効果を示さないか、最低のもの
とするものである。
項ＡまたはＢに記載した中で好ましいＤＮＡ配列および
項Ｃに記載した中で好まし込キメラＤＮ人配列は、特に
その中で転写が上記の化学調節剤により調節されるもの
であシ、その化学調節剤は例えば、安息香酸、サリチル
酸、アセチルサリチル酸、ポリアクリル酸およびそれら
の置換誘導体からなる群から選択されるか、またはベン
ゾ−１，２，Ｓ−チアジアゾールカルボン酸、ベンゾ−
１，２，３−チア・ジアゾールチオカルボン酸、シアノ
ベンゾ−１，２，Ｓ−チアジアゾール、ペアシー１．２
．３−チアジアゾールカルボンルアミド、ベンゾ−１，
２，５−チアジアゾールカルボン酸ヒドラジド、および
それらの誘導体からなる群から選択されるか、またはシ
クロインニコチン酸もしくはそれらの誘導体である。上
記の好まし層化学、ｖ１節剤、例えばベンゾ−１゜２．
３−チアジアゾール−７−カルボン酸、メチルベンゾ−
１，２，３−チアジアゾール−７−カルボキシレート、
ｎ−プロピルベンゾ−１，２゜３−チアジアゾール−７
−カルボキシレート、ベンジルベンゾ−１，２，３−チ
アジアゾール−７−カルボキシレート、ベンゾ−１，２
，５−チアジアゾール−７−カルボン酸第二ブチルヒド
ラジド、２，６−ジクロロイソニコチン酸、またはメチ
ル２．６−シクロロインニコチ　ネート、特にメチルベ
ンゾ−１，２，５−チアジアゾール−７−カルボキシレ
ートにより転写が調節されるＤＮＡ配列が最も好ましい
。
Ｊ、　ＡＴＣＣへの寄託 以下のバクテリア、グラスミドおよび懸濁培壓体をアメ
１３カン　タイプ　カル帝ヤー　コレクンヨンに寄託し
た。
大腸ｆ５　ＨＥ　１０１　／　＋ＩＴＪ　Ｓ　７５−Ｋ
ｍ、　ＡＴＣＣ番号６７６２８％寄託日１９８８年２月
１２日、プラスオ）”　ｐＢＳ−ＰＲｌｏ　１５　Ｃ’
ｌａ　、　ＡＴＣＣ’４号４０４２６　、寄託日１９８
８年２月１２日、プラスミドｐＢＳ−ＰＲ１０１９、Ａ
ＴＣ’Ｃ番号４０４２７　、寄託日１９８８年２月１２
日、トウモロコシＭｉ％、培養体６−２７１７−ＧＣ，
ＡＴＣＣ番号４ｒＪ５２６、寄託日１９８７年５月２０
日、プラスミドｐＢＳ−Ｇｌｕｅ　３９．１　、　ＡＴ
ＣＣＢ号４０５２６、寄託日１９８８年１２月２９日、
プラスミドｐＢＳ−Ｇｌｕｃ　３９．３　、　ＡＴＣＣ
番号４０５２７　、寄託日１９８８年１２月２９日、プ
ラスミドｐＢＳ　ｃｕｃｃｈｉ　／キチナーゼ、ＡＴＣ
Ｃ本発明のキメラ遺伝子は天然またに合成のあらゆる・
才からの化学的に調節可能なＬｌ〜Ａ配列を、転写可能
なＤＮＡ配列１擺またはそれ以上と組合せて含有し、通
常、転写可能な配列の少なくとも一部は表現型の特徴に
翻訳されるであろうが、本発明はまたアンチセンス機構
を介して操作されるキメラ遺伝子を含む、以下の記載お
よび多くの実施例は植物ゲノムの天然に児い出された化
学的に調節可能なＤＮＡ配列に関しているが、本発明は
その他の天然系例えばバクテリア系、ウィルス系、およ
び動物系に生じるような配列罠も同様に当てはまる。こ
れはそれらの天然系からの配列を単離する技術が公知で
あるからである。さらに、合成またはその他の非天然系
から誘導された配列も同様に含まれる。
化学的Ｋｖ１４節可能なＤＮＡ配列が天然に存在するか
または合成により存在する源から単離され、そして必要
ならば慣用の方法により特徴づけられる。ＤＮＡ配列が
天然に生じる遺伝子から単離される場合、この遺伝子は
適当な調節剤によ′す、遺伝子に対する化学調節剤また
はその他の公知の調節剤のいずれかにより活性化される
。活性化を生じるＲＮＡが単離され、そしてｃ　ＤＮＡ
ライブラリィを構築するために使用される。このライブ
ラリィは、（１）　　活性化された系から単離されたＲ
ＮＡおよび（２）調節剤により活性化されなかった第二
の系から単離され九ＲＮＡの両方から生成された放射標
識ｃ　ＤＮＡ　を用いる分画スクリーニングに使用され
る。この分画スクリーニングは上記のように本発明の特
別な一面である。化学的に調節されたｃＤＮＡを含有す
るクローンを次に単離し、そして好ましくはここで配列
決定を行う。ｃ　ＤＮＡクローンを次にゲノムクローン
が化学的に調節可能なＤＮＡ配列からなるゲノムライブ
ラリィからのゲノムクローンの同定および単離のために
使用する。
この遺伝子を好ましくは配列決定し、そして化学的に調
節可能なＤＮＡ配列の地図作成を、この遺伝子断片のサ
ブクローニング、それらのす′ポーター遺伝子への結合
およびトランジェニック植物材料または一時的な植物発
現系内でのそれらの活性の評価により行う。
タバコのＰＲタンパク質遺遺伝のために、　ラムダゲノ
ムライブラリィを標準技術を用いて構築し、そして化学
的に調節可能なＤＮＡ配列からなるクローンを同定およ
び精製する。これらのクローンの１つを特徴づける。化
学的に調節可能なＤＮＡ配列を有する制限断片を同定す
るＰＲ−１ａ遺伝子に対して、これらの遺伝子断片は約
２　ＱＯ００塩基対のＣ１ａＩ断片、６５０Ｄｊ％１５
対Ｈｉｎｄ■断片および３６００塩基対ＥｃｏＲＩ　　
断片を包含する。Ｈｉｎｄｌ断片はコード性の約５００
塩基対および非コード性の約６０００塩基対を転写開始
部位に隣接する５′配置領域内に含有する。これらの断
片のいくつかをプラスミド内にサブクローン化し、他の
サブクローニングおよび全体の特徴づけ、即ち、制限地
図作成、ＤＮＡ配列決定および遺伝子の転写開始部位の
同定のだめのＤＮＡの源として使用する。
ＰＲ−１ａ遺伝子のために、３６００塩基対Ｅｃｏ几■
断片をラムダゲノムクローンから直接サブクローン化し
、そして次Ｋ　Ｘｈｏ　ＩおよびＰｓｔｌ　部位が両側
に結合している約１２００塩基罰の最終りローンにサブ
クローン化する。このクローンはＰＲ−１ａ遣云子から
の化学的に誘導可能なＤＮＡ配列およびその遺伝子の隣
接コード領域の一部を含有し、この一部はＰＲ−１３タ
ンパク質遺伝子のシグナルペプチドのコード配列を包含
する。
同様にβ−１，３−グルカナーゼの塩基性体をコードす
るゲノムクローンを単離する。　３９１および５９．３
と命名した２種のクローンを特徴づけ、そして化学的に
調節可能なＤＮＡ配列からなる制限断片を同定する。
本発明のベクターを周ると、次にこれらのクローンを上
記の様に３部分からなるキメラ遺伝子の調製のために使
用できる。これらのキメラＤＮＡ配列は化学的に調節可
能な配列、転写可能なＤＮＡの一部および外来源からの
第三のＤＮＡ配列を含む。　また、このクローンを例え
ば部位関連突然変異によシさらに操作し、上記の２部分
キメラ遺伝子を調製するための外来源からのコード配列
への付着の前に親遺伝子からあるコード断片の全てまた
はほとんどを除去し得る。好ましい実施態様において、
化学的に調節可能な配列でないキメラ遺伝子の一部は容
易に観察されるか、または検出される表現型の特徴のた
めのリポータ−遺伝子を構築する。以下の実施例はβ−
１，３−グルクロニダーゼ、野生型および除草剤耐性ア
セトヒドロキシ酸シンターゼ並びにバチラス　スリンギ
エンシス内毒素の遺伝子を説明するが、しかしその他の
種々のリポータ−遺伝子を上記のように想定することも
できる。その他の好ましい実施態様において、キメラ遺
伝子のコード成分ＤＮＡ配列は除草剤に対する許容性も
しくは耐性または昆虫に対する耐性をコードする。この
実施態様はアセトヒドロキシ酸シンターゼおよびバチラ
ス　スリンギエンシス内毒素の記載した遺伝子の例を示
している。
これらの遺伝子を含有するキメラ遺伝子およびベクター
は、形質転換された細胞１組織および植物もしくはバイ
オリアクターで有用な細胞接養体を生じる様々な技術に
より植物細胞内に導入され得る。種々の技術は続〈実施
例に双子葉類および単子葉類に関して詳細に記載されて
いる。目的を達成するためＫここに含められるこれらの
方法のいくつかはその他の特許出願、特に１９８７年５
月２９日出願の米国特許出願第５６５Ｇ６号および１９
８８年３月８日出願の米国特許出願第１６５６６５号明
細書の主題である。
形質転換された植物材料を次に化学調節剤で処理し、表
現型リポータ−遺伝子の発現を観察および／または測定
することができる。この種の系は特定の化学物質の調筋
活性を同定するための容易なスクリーニング装置を提供
する。本発明はまた非常に多くの試料のスクリーニング
を高い正確さおよび短期間で行えるβ−１，３−グルク
ロニダーゼ（ＧＵ８）酵素活性の改良された検定にも関
する。特にこの検定は１，３ないし５　ｍＭ　４−７’
チルウムベリフエリルグルクロニドを含有するα５ｄ以
下の試料中の植物組織抽出物を約５７℃で１ないし５時
間反応させ、そして遊離された螢光指示剤のａ度を測定
することからなる。
几ＮＡの定常状態のレベルの定量的測定は遺伝子発現の
分析における必須段階である。それを目的として、プラ
イマー延長検定が開発された。
本発明のこの方法は、遺伝子特有のオリゴヌクレオチド
を高り比放射能まで標識し、オリゴヌクレオチドをＲＮ
Ａ試料とハイプリーノド形成させ、そしてこのハイブリ
ッドを逆転写酵素で延長することを含む。延長物を変性
アクリルアミドゲル上で分離し、そしてオートラジオグ
ラフィーにより視覚化する。この方法が従来のものよシ
優れている点は、プローブ作製の容易性、検定グロトコ
ールの単純さ、および検定に要する時間の短縮を包含す
る。このプライマー延長検定はＳ１マツピングと同程度
に高感度で定量的である。
実施例で後記する特定の反応条件下で適用されるような
プライマー延長検定は、ＴＭＶ感染タバコ葉から抽出し
た総ＲＮＡ中のＰＲ−１ｍ几ＮＡのレベルの決定に対し
て最適化されている。プライマー延長データの定量的分
析およびこのｉ）　Ｎ　Ａから誘導されたｃｌ）ＮＡ　
ライブラリィ中のＣＤＮＡクローンの頻度に基づいてこ
れらの葉中のｍＲＮＡの１チをＰＲ−１ｍＲＮＡとして
示す。
上記の方法に対する本発明の方法の改良点は、オリゴヌ
クレオチドの高い比活性までの標識、検定で用いられる
プローブの減少され九モル量（典型的には約α０１ない
しａ　０５　ｐｍｏ＋　）、最適化したハイブリッド形
成および延長時間、並びニ最適化したヌクレオチド三リ
ン酸濃度からなる。
それ故に本発明は、 （ａ）　　長さが１２と１８の間のヌクレオチドの几Ｎ
Ａの特定のプライマーオリゴヌクレオチドを高い比放射
能まで標識し、 （ｂ）　　ＲＮＡと［ｌＬｌと２ｏｎＭの間の濃度の標
識オリゴヌクレオチドとを２分と２４時間の間、約３７
℃の温度でハイブリッド形成させ、（Ｃ）　　α００５
と１　ｍＭの間の濃度のヌクレオチド三リン酸の存在下
、１と１２０分間の間、プライマーオリゴヌクレオチド
を逆転写酵素で延長し、そして （ｄ）　　延長物をオートラジオグラフィーで分、；１
１しそして睨宛化することからなるＲ　Ｎ　Ａ溶訃中の
特定のＲＮＡ１を決定する方法を含む。
Ｌ、実施例 下記の実施例により本発明をさらに詳細に説明する。こ
れらは、特許請求の範囲及びその意味を限定すると理解
されるべきではない。
酵素反応は、別に記載しない限り製造者の勧める方法に
従って行われる０本発明のキメラ遺伝子及びベクターは
、当該技術分野で良く知られた技術を用いて製造される
。適当な技術はＭａｎｉａｔｉｓ、Ｔ、ｅｔ　ａｌ、、
Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ、　ＣｏｌｄＳｐ
ｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、　Ｎ
ｅｓ　Ｙｏｒｋ　（１９８２）　　；Ｍｅｔｈｏｄｓ　
ｉｎ　Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ＋　Ｖｏｌｕｍｅｓ　６８
＋　１００＋　１０１支び１１８　（１９７９，１９８
３，１９８３及び１９８６）　　；並びにＤＮＡ　ＣＩ
ｏｎｉｎｇ＋　Ｇｌｏｖｅｒ、　Ｄ、Ｍ、、Ｅｄ　ＩＲ
Ｌ　Ｐｒｅｓｓ。
０ｘｆｏｒｄ　（１９８５）に記載されている。培養液
組成物はＭｉｌｌｑｒ、　　Ｊ、ｔｌ、、　　Ｅｘｐｅ
ｒｉｍｅｎｔｓ　　ｉｎ　　Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒＧｅｎ
ｅｔｆｃｓ、　Ｃｏ１ｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　１ｌａｒｂｏ
ｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ。
Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ　（１９７２）、並びに前記に示した
文献に記載されている。
略語の意味 ＡＴＰ　　：アデノシン三リン酸 ｂｐ：塩基対 ＣＢＴＡＢ　　Ｆヘキサデシルトリメチルアンモニウム
ブロマイド ２．４−Ｄ　　：２．４−ジクロロフェノキシ酢酸ＤＴ
Ｔ　　：　　ジチオスレイトール ｄｉｃａｍｂａ　　：　３＋６−ジクロロ−２−メトキ
シ安息香酸 ＥＤＴＡ　：エチンジアミンーＮ、Ｎ、Ｎ　’　、Ｎ　
’−四酢酸ｋｂ：キロベース対 ＭＥＳ：２〜（Ｎ−モルホリノ）エタンスルホン酸ＭＵ
　：　４−メチルウンベリフェリルグルクロナイド ＰＥＧ　　：ポリエチレングリコール ｐｉｃｌｏｒａｍ　：　４−アミノ−３，５，６−）リ
クロロビコリン酸 ＳＤＳ　　ニドデシル硫酸ナトリウム ＴＦＡ　　：　トリフルオロ酢酸 ＴＭＶ　　：タバコモザイクウイルス Ｔｒｉｓ−ＨＣＩ　；　トリス　（ヒドロキシメチル）
メチルアミン塩酸塩 培地 ５ｌｌ−０１”Ｌ　：５ｃｈｅｎｋの培地＋Ｒ，Ｕ、ｅ
ｔ　ａｌ、＋ｃａｎ、Ｊ。
Ｂｏｔ、、５０　（１９７２）　１９９　２０４　　；
ホルモン未含有。
５１１培地は液体であってもよく、または０．８％の寒
天または０，３％のＧｅ１Ｒｉｔｅ　”で固化されてい
てもよい。培地は通常、オートクレーブ中、２３０〜２
５０　’　Ｆの温度で１５〜２０分間加熱することによ
り殺菌される。
５ｌｌ−３Ｏｆ”ｆ　三３０μｍのＤｉｃａｍｂａを含
有する５Ｈ−０培地。
５ｌｌ−４５Ｐｔ　　：　４５μｍのＤｉｃａｍｂａを
含有するＳｌ＋−０培地。
］Ｙ　ａ　ｍ　ａ　ｄ　個の培地１ｙ、ｅｔ　ａｌ、、
　ＰｌａｎｔＣｅｌｌ　Ｒｅｐｏｒｔｓ、　５．８５−
８８　（１９８６）。
ｐＭｕｒａｓｈｉｇｅ　、　Ｔ、及びＳｋｏｏｇ＋　Ｆ
ｌＰｈｙｓｉｏｌｏｇｉａ　Ｐｌａｎｔａｒｕｍ　９＋
　４７３　（１９６８）の培地。
培地は０．８％の寒天もしくはアガロース、または０，
３％のＧｅ１Ｒ４ｔｅ　”で固化されうる。
第１表 使用した培地組成物 １廼：　　　　　　　　　　　　ＬＪＬＬ””’　　エ
マクロエレメント１．ミクロエレメント１及びＦｅ　−
ＥＤＴＡは文献に記載されている：　Ｋａｏ、に、Ｎ、
等。
Ｐｌａｎｔａ　１２６．１０５　１１０　（１９６５）
によるＫＭ培地；Ｃｈｕ等、　５ｃｉｅｎｔｉａ　５ｉ
ｎｃｉａ　１８．６５８　（１９７５）によるＮ６培地
。
有機物及びビタミン”（ｍｇ／ｆｆ１）：ビオチン　　
　　　　　　　０．０１ ピリドキシン−ＩＣ＋　　　　　１．００　　　０，３
チアミン−ｈｃｌ　　　　　　　１０．００　　　０．
１ニコチンアミド　　　　　　１．００ ニコチン酸　　　　　　　０．１０　　　０，３葉酸　
　　　　　　　　　０．４０ Ｄ　−Ｃａ−パントチネート　１．００ｐ−アミノ安息
香酸　　　０．０２ コリンクロライド　　　　　１．００ リボフラビン　　　　　　　０．２０ ビタミン８１２　　　　　　０．０２ グリシン 糖及び糖アルコール スクロース グルコース マンニトール ソルビトール セロビオース フルクトース マンノース ラムノース リボース キシロース ミオ−イノシトール 最終ｐＨ 消毒 脚注 ０．１０ ２．０ Ｃｇ／ｌ］　： ０．２５　　　　３０．０ ６Ｂ、４６ ０．２５ ０．２５ ０．２５ ０．２５ ０．２５ ０．２５ ０．２５ ０．２５ ０．１０ ５．８　　　　　　５．６ 濾紙　オートフレ ーブ マクロエレメントは通常１０倍に濃縮された原液として
調製され、ミクロエレメントは通常１０００倍に濃縮さ
れた原液として調製される。
ｂ　クエン酸、フマル酸及びリンゴ酸（各々４０ｍｇ／
　１の最終濃度）及びピルビン酸ナトリウム（２０ｍｇ
／　１の最終濃度）を１００倍濃度の株溶液として製造
し、ＮＨ４ＯＨでｐＨを６，３に合わせ、この培地に添
加する。
Ｃアデニン（０，１ｍｇ／　１の最終濃度）、及びグア
ニン、チミジン、ウラシル、ヒポキサチン及びシトシン
（各々０．０３ｔａｇ／　Ｉｔの最終濃度）を１０００
倍に濃縮された原液として製造し、ＮＨ，ＯＨでｐＨを
６，３に合わせ、この培地に添加する。
ｄ　下記のアミノ酸を１０倍の原液（ＮＩｌ、ＯＩＩで
ｐｏｅ、ｓに合わせた）を用いてこの培地に添加して、
下記の最終濃度を得る；グルタミン（５，６ｍｇ／２）
、アラニン、グルタミン酸（各々０．６ｍｇ／ｊり、シ
スティン（０，２ｍｇ／　１　）　、アスパラギン、ア
スパラギン酸、シスチン、ヒスチジン、イソロイシン、
ロイシン、リジン、メチオニン、フェニルアラニン、プ
ロリン、セリン、スレオニン、トリプトファン、チロシ
ン及びバリン（各々０．１ｍｇ／Ｉ！、）　。
ｅ　ビタミン原液は通常１００倍に濃縮して製造される
。
材料 アガロース：アガロースの製造及び精製は、Ｇｕｉｓｅ
ｌｅｙ及びＲｅｎｎ、”Ｔｈｅ　Ａｇａｒｏｓｅ　Ｍｏ
ｎｏｇｒａｐｈ″。
Ｍａｒｉｎｅ　Ｃｏ１１ｏｉｄｓ　Ｄｉｖｉｓｉｏｎ　
ＦＭＣＣｏｒｐ、＋　１９７５に記載されている。アガ
ロースは寒天の成分の一つである。市販品として得られ
る寒天は通常、大量の側鎖を有する天然アガロースとイ
オン性アガロペクチンとの混合物からなる。通常、側鎖
の一定の数はそのまま残っており、アガロースの物理化
学的性質、例えばゲル化温度及び融点を決定する。低融
点アガロース、特に５ｅａＰｌａｑｕｅ　”アガロース
は好ましい固化剤である。
カゼイン　　　　（Ｃａｓｅｉｎ　ｈ　ｄｒｏｌ　５ａ
ｔｅ）：カゼイン水解物−ウシ胎児ミルクから得られる
酵素的氷解物、Ｔｙｐｅ　１．　Ｓｉｇｍａ　Ｃｏ、、
ＰＯ，ＢＯＸ　１４５０８，５ＩＬｏｕｉｓ　　ＭＯ６
３７１８，ｔｌｓＡＣｅｌｌｕｌａｓｅ　Ｒ５：セルラ
ーゼＲ５，Ｙａｋｕｌｔ　Ｈｏｎ５ｈａＣｏ、　Ｌｔｄ
、＋　１．１．１９＋　Ｈ４ｇａｓｈｉ−ｓｈｉｎｂａ
ｓｈｉ、Ｍｉｎａｔ。
ｋｕ、　　Ｔｏｋｙｏ、　　１０５　ＪａｐａｎＧｅｌ
Ｒｉｔｅ　″ニゲルライト　ゲルマン　ガム。
５ｃｏｔｔ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ　Ｉｎｃ、、　
Ｆｉｓｋｅｒｖｉｌｌｅ、　Ｒ，Ｉ。
０２８１２３、　ｔｌｓＡ ＧｅｎｅＳｃｒｅｅｎ　Ｐｌｕｓ　”　　：　　Ｃａｔ
、　Ｎｏ、　ＮＥＦ　９７６＋　ＮＥＮＲｅｓｅａｒｃ
ｈ　Ｐｒｏｄｕｃｔｓ＋　５４９　Ａｌｂａｎｙ　Ｓｔ
、、　Ｂｏｓｔｏｎ。
ＭＡ　０２１１８．　ＵＳＡ ＩＢＩ　　Ｒａｎｄｏｍ　　　ｒｉＩＴｌｅｒ　　ｋｉ
ｔ　　：　　’　　Ｐｒｉｍｅ　　Ｔｉｍｅ　　　　ｒ
ａｎｄｏｓ　ｐｒｉｍｅｒ　ｋｉｔ、　Ｉｎｔｅｒｎａ
ｔｉｏｎａｌ　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｓｓ　Ｉｎ
ｃ、、ＰＯ，Ｂｏｘ　１５６５＋　Ｎｅｗ　Ｒａｖｅｎ
、　ＣＴ　０７６０６＋５Ａ Ｎａｌ　ｅｎｅ　”　ｆｉｌｔｅｒ　：　Ｎａｌｇｅ　
Ｃｏ、、Ｄｉｖｊｓｉｏｎ　ｏｆ　５ｙｂｒｏｎ　Ｃｏ
ｒｐ、　Ｒｏｃｈｅｓｔｅｒ、　Ｎ、Ｙ、　１４６０２
＋　ＵＳＡＰｅｃｔｏｌ　ａｓｅ　Ｙ−２３”　　：　
５ｅｉｓｈｉｎ　ＰｈｒａｍｃｅｕｔｉｃａＩ　Ｃｏ　
Ｌｔｄ、＋４−１３　Ｋｏａｍｉ−ｃｈｏ、　Ｎ１ｈｏ
ｎｂａｓｈｉ、　Ｔ。
ｋｙｏ＋　Ｊａｐａｎ Ｐａｒａ目Ｉｓ　”　　：　Ｐａｒａｆｉｌｍ　”　１
ａｂｏｒａｔｏｒｙ　ｆｉｌｍ　−Ａｍｅｒｉｃａｎ　
　Ｃａｎ　　Ｃｏ、Ｇｒｅｅｎｗｉｃｈ、ＣＴ　　０６
８３０．ＵＳ＾ＳＳＣ：　１，３４　ｍＭ　ＮａＣｌ、
　０．１５４　ｍＭ　　クエン酸ナトリウム Ｓ　ｉｎ　ｃｏｌｕｍｎ　　：　５ｅｐｈａｄｅｘ　”
　Ｇ２５　　が予め詰められたカラム、Ｃａｔ、Ｎｏ、
１００４０２＋　Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ　Ｍａｎｎｈｅ
ｉｍ　Ｂｉｏｃｈｅｎ＋１ｃａｌｓ＋　Ｐｉｓｃａｔａ
ｗａｙ、　ＮＪ、　ＵＳＡＴＡＥ　ｂｕｆｆｅｒ　　び
ＴＢＥ　ｂｕｆｆｅｒ　：各々電気泳動において一般的
な緩衝液であるトリス−アセテート緩衝液及びトリスボ
レート緩衝液、　Ｍａｎｉａｔｉｓａｔ　ａｌ、、　５
ｕｐｒａ参照 １、一般的な技術 この実施例の群は、下記の詳細な例を実施するために使
用される一般的な操作を記載する。
実施例１　：アガロースの連結 プラスミドＤＮへの制限消化及び低融点ＴＡＢゲル上で
の断片の電気泳動的分離に続いて、適当な断片を含有す
るバンドを正確に取り出し、６５°Ｃに加熱してアガロ
ースを溶融する。２〜５μｆを水１５μ２に添加し、該
溶液を６５°Ｃで１０分間放置する。この溶液を３７°
Ｃに冷却し、５分間放置して温度を平衡させる。１０倍
のりガーゼ緩衝液（２００ａＭのトリス、ｐ！（８，０
，１００ｍＭのＭｇＣｈ＋　１００ｍＭのＤＴＴ　、１
００ｍＭのＡＴＰ）　２μｌをＴ４　　ＤＮＡ　リガー
ゼ（Ｎｅｗ　Ｅｎｇｌａｎｄ　ＢｉｏＬａｂｓ）　Ｉ　
Ｂ　ｅと共に添加し、その後、該溶液を固化させ、１５
゛Ｃで一晩インキエベートする。
実施例２：アガロースからの形質転換 適当なＤＮＡを含有するアガロースを、６５°Ｃで１０
分間インキエベートすることにより溶融する。
この溶液１０ｕｌをＴＥＩ衝液（１００ＩＭのＴｒｉｓ
　ｐＨ７，５１ｍＨのＥＤＴＡ）３０　ｔｌ　（２に添
加し、混合し、その後、室温に放置する。凍ったコンピ
テント細胞（Ｌｃｏｌｉ　　菌［ＩＨ５α）を湿った氷
上に置き、溶けさせる。希釈したＤＮＡ溶液を、２００
　μｌの細胞に添加し、その後氷上に２０分間放置する
。その後、ＤＮＡを含有する細胞を、４１°Ｃで９０秒
間の熱ショックをかける。その後、細胞を室温に１０分
間放置する。０．８ｍｌのＳＯＣ培地（Ｈａｎａｈａｎ
、　Ｄ、、Ｊ、Ｍ。
］　Ｂｉｏ１．１６６、５５７　５８０（１９８３））
を添加し、培養液を３７°Ｃで一時間インキユベートす
る。ｌＯＯμｌの培養液を、１００μＢ７ｍｌのアンピ
シリン（Ｌ−ａｍｐ）を含有するＬＢ板（Ｍ　ｉ　ｌ　
ｌｅｒ　、且肛ａ）上に置き、そして板を３７°Ｃで一
晩インキユベートする。陽性のコロニーを取り出し、第
二のＬ−ａｍｐ板にリストリーク（ｒｅｓｔｒｅａｋ）
　Ｌ／、その後、板を３７°Ｃで一晩インキユベートす
る。
実施例３　サザーンブロッティング タバコＤＮＡ　３μｇを供給者により提案された条件下
で、種々の制限酵素により消化する。該ＤＮＡをフェノ
ールで抽出し、エタノールで沈澱させ、その後、ゲルロ
ーディング緩衝液（フィコール１５％、ブロモフェノー
ルブルー０．０２５％、ＥＤＴＡ　ｌｏｍＭ　、　ｐＨ
８）中に再懸濁する。サンプルを載せ、０，３％のアガ
ロースゲル上、５Ｖ／ｃｍでブロモフェノールブルー染
料がゲルの最後に到達するまで電気泳動にかける。　該
ｏＮＡは、供給者により記載されたようなアルカリ性ト
ランファー法を用いてシーンスクリーンプラス（Ｇｅｎ
ｅ−３ｃｒｅｅｎ　Ｐｌｕｓ）　（ＤｕＦｏｎｔ）に移
される。プレハイブリダイゼーション、ハイブリダイゼ
ーション及び洗浄は、製造者の提案に従う。ハイブリダ
イゼーションはオートラジオグラフィーにより検出され
る。
実施例４　分子アダプター 典型的な分子アダプターは、ＰｓｔＩ部位のＢａｍＨ１
部位への添加のための下記； ５　”　−ＧＧＧＡＴＣＣＣＴＧＣＡ−３’で表わされ
る配列である。この分子はＢ−シアノエチルホスファ−
アミダイト化学を用いてアプライド　バイオシステム　
シンセサイザー（Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍ
ｓ　５ｙｎｔｈｅｓｉｚｅｒ）上で合成され、逆相ＨＰ
　Ｌ　Ｃにより精製される。このオリゴヌクレオチド約
２ｕｇをＭａｎｉａｔｉｓ　ｅｔ　ａｌ、、５ｕｐｒａ
。
ｐ、　１２５によりキナーゼする。オリゴヌクレオチド
溶液を水浴中で６５℃に加熱し、約３０分かけて室温に
冷却する。この強化アダプターの約１０倍のモル量を、
消化されたＤＮＡに、１０倍のりガーゼ緩衝液、Ｔ４　
ＤＮＡリガーゼ、及び適当な量の水と共に添加する。典
型的な反応を下記に示す： 結合されるべきＤＮＡ　　：　　１〜２ｕｌ　（〜１ｐ
ＩＩｏりアダプター　：　　　　　ｌ　ｕ　ｌ　　（〜
１０ｐｍｏｌ）１０倍のりガーゼ緩衝液：１ａｌ Ｔ４　　ＤＮＡ　リガーゼ：　　　ｌｕｌ水＝　　　　
　　　５〜６μ２ この溶液を１２〜１５°Ｃで３０分間インキュベートし
、その後、６５℃に３０分間加熱し、リガーゼを不活性
化する。その塩の濃度及び容量は、適当な制限消化に合
わせられ、結合されたＤＮＡを消化して、結合された“
５ｔｉｃｋｙ　ｅｎｄ”を露呈する。
非インク−ボレーテッドアダプターを、アガロース上で
の電気泳動または続いて起こるイソプロパツール沈澱に
より除去する。
実施例５　プライマー　エクステンションマツピング Ａ　ブライマーエクステンシランのためのブライマーの
合成及び５°末端標識 下記のプライマーオリゴマーはアプライドバイオシステ
ムシンセサイザー及びβ−シアノエチルホスファ−アミ
ダイト化学を用いて合成される。
ＰＲ−１：５’　　−＾ＴＡＧＴＣＴＴＧＴＴＧＡＧＡ
ＧＴＴ−３”ＧＵＳ：　　　５’−↑ＣＡＣＧＧＧＴＴ
ＧＧＧＧＴＴＴＣＴＡＣ−３’ＡＨＡＳ：　　　５　　
’　　−ＡＧＧＡＧＡＴＧＧＴＴＴＧＧＴＧＧＡ−３’
ＢＴ：５’−＾ＴＡＣＧＴＴＣＴＡＣＴＡＴＣＡＴＡＧ
Ｔ−３’オリゴヌクレオチドは逆相高圧液体クロマトグ
ラフィ（ＩＩＰＬｃ）により精製される。各々のオリゴ
５　ｐｍｏｌを”Ｐ　−ＡＴＰ（６０００Ｃｉ／ｍｍｏ
ｌ、１０　ｇｃＩ／ｕｎ）２０００Ｃを用いてキナーゼ
化する（Ｍａｎｉａｔｉｓ、　Ｔ、　ｅｔ　ａｌ、、　
幻」ＬＬ−ａｔ　ｐ、Ｉ２５）、　３７°Ｃで３０分間
インキュベーションした後、反応物を１００μｌに希釈
し、フェノール／クロロホルムで抽出し、その後、５０
ｕｇの担体ＲＮＡで３回沈澱させる。最終的な沈澱物を
１倍の逆転写酵素緩衝液（５０ｍＭ　　）リス−〇ＣＩ
、ｐＨ７，５，４０ｍＭのＫＣＩ　、　３ｍＭのＭｇＣ
１□）　中に２ｎＭの濃度で再懸濁する。標識されたオ
リゴヌクレオチドの比活性は、約３×１０’　Ｃｖｃｐ
ｍ／ｐｍｏｌと測定される。
Ｂ、　トータル（ｔｏｔａｌ）ＲＮＡの製造方法トータ
ルｌ？ＮＡは、実質的にＬａｇｒｉｍｉｎｉ、Ｌ、Ｍ、
　ｅｔ　ａｌ、、Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃ
ｉ、ＵＳＡ　８４．７５４２（１，９８７）に記載され
ているように製造される。組織はモーター及び杵中、液
体窒素の下で磨り潰される。謬り潰された組織は、＆ｉ
ｌ織の重ｆｆｉ（ｇ）当たり２，３ｍｆｔでグリンディ
ング緩衝液（Ｌａｇｒｉｍｉｎｉ、Ｌ、Ｍ、　ｅｔ　ａ
ｌ、　…肛旦　　に添加される。その後、等量のフェノ
ールを添加し、乳濁液をプリンクマンポリトロン中でホ
モジナイズする。１゜５倍容量のクロロホルムを添加し
、乳濁液を穏やかに１５分間混合する。遠心分離により
相を分離し、水相を除去する。ＲＮＡは、０．３Ｍの酢
酸す及び２，３容量のエタノールを添加することにより
沈澱する。沈澱物は遠心分離により集められ、２　ｍｌ
の殺菌水に再懸濁される。塩化リチウムを３Ｍの最終濃
度になるように添加し、４°Ｃで一晩放置する。沈澱物
を遠心分離により集め、ペレットを氷冷した８０％エタ
ノールで洗浄する。
該ペレットを乾燥し、５００μ２の殺菌水中に再懸濁す
る。このトータルＲＮＡの沈澱物の濃度を分光側光法に
より調べる。さもなければ、ＲＮＡを、カルス組織から
一辺約３胴の立方体に切り出し、ポリトロン工程の前に
、液体窒素中での摩砕のための予め冷却されたモーター
及び杵に添加すること以外は上記のようにしてＲＮＡを
カルスから抽出する。
Ｃ，フライマーエクステンション トータルＲＮＡ　５０μｇを５００　μでのエンペンド
ルフチェープの中で凍結乾燥する。該ＲＮＡを３０μｌ
の放射性標識プローブ溶液中に再懸濁し、１０分間７０
°Ｃに加熱する。該チューブをゆっくり３７°Ｃに冷却
し、−晩インキユベートする。チューブを３７°Ｃの水
浴から取り除かずに、２μｌの１０倍の逆転写酵素緩衝
液（５００ｍＭ　　Ｔｒｉｓ−１１Ｃ１，ｐＨ？、５．
４０Ｏｎ＋Ｍ（７）ＭＣＩ　、３０ｍＭ（７）ＭｇＣＩ
ｚ）、５ｔｇ／１ｔｒｌＯ）ウシ胎児血清アルブミン１
μ尼、１００ｍＭのジチオスレイトール５ｕｌ、１０倍
のｄＮＴＰｓ　（各ｄＮＴＰは）ＩｚＯ中１０ｍＭ）　
　５　ｕ　１．　、３　ｕ　ＥのＨｚＯ，２ｕ　１（Ｄ
ＲＮａｓｉｎ　（８０単位）、及び２ｕｅの逆転写酵素
（４００単位ンを添加し、反応物を３７°Ｃで３０分間
インキュベートする。反応を止めるために、５μｌの３
Ｍの酢酸ナトリウム（ｐＨ５）及び１５０μｌの無水エ
タノールを添加する。チューブを一２０°Ｃに３０分間
放置し、沈澱物を遠心分離により集め、８０％エタノー
ルで洗浄し、風乾する。該沈澱物をローディングダイ（
９０％ホルムアミド、０．０５％ブロモフェノールブル
ー、０．０５％キシレンシアツール、１ｍＭ　ＥＤＴＡ
）１０〜２０μｌ中に再懸濁し、エクステンション生成
物を６％のシーケンシングゲル（Ｍａｎｉａｔｉｓ、　
Ｔ、　ｅｔ　ａｌ、＋　且肛廷上で分離する。エクステ
ンション生成物はオートラジオグラフィーにより可視化
される。
実施例６　ＳｌヌクレアーゼマツピングプラスミドｐＢ
Ｓ−ＰＲ１０１３Ｃ１ａは５４ａＮＩ　で消化され、コ
ウジ腸ホスファターゼで脱リン酸化され、そして”Ｐ−
ＡＴＰでキナーゼされる。フェノール抽出及びエタノー
ル沈澱に続いて、ＤＮＡをＢｓｔＥｆｆで消化し、その
後、第１図の７５０ないし１０３５からの３００ｂｐ断
片を低ゲル温度アガロースゲル上での電気泳動の後に単
離する。プローブをホルムアミドハイブリダイゼーショ
ン緩衝液（Ｂｅｒｋ、Ａ、Ｊ、　ｅｔ　ａｌ、、　Ｃｅ
１１１２．７２１　（１９７７））中に、約２ｎＭの濃
度で再懸濁する。プローブの比活性は約５　Ｘ　１０Ｃ
ｖｃｐｍ／ｐｍｏｌである。
凍結乾燥した後、トータルＲＮＡ　（５０μｇ）を３０
μ！のプローブ溶液中に溶解し、その後、４８゛Ｃで一
晩ハイブリッド形成する。Ｓｌ　　ヌクレアーゼ処理及
びゲル電気泳動は実質的に上記と同様に、４００単位／
ｄのＳｌ濃度、３０’Ｃのインキュベーション温度を用
いて行われる。適当なＳｌヌクレアーゼ濃度はパイロッ
ト実験により調べられる。
実施例７　転写開始部位のマツピング ＰＲ−１ａ遺伝子の転写開始部位は、Ｓ１ヌクレアーゼ
マツピング及びブライマーエクステンシゴン分析の組み
合わせにより決定される。ＴＭＶ　−感染した葉から単
離されたＲＮＡ　、またはテンプレートとしてのＸｈｏ
ｌ−Ｐｓｔｌ断片の１１ｐ１９サブクローン、及び特定
プライマーとしてのＰＲ−１ａ配列の１０２５ないし１
０４２位を補足する１７塩基オリゴヌクレオチドを用い
てのブライマーエクステンション実験のオートラジオダ
ラムが調べられる。
ブライマーそれ自体は、５１ホスフエ）で標識され、従
って、エクステンション生成物のサイズがシーケンシン
グレーンにおける対応するバンドのサイズと同一になる
であろう。ゲノムクローンの９０２及び９０３位に対応
する二つの強いバンド、並びに部位９０までの弱いバン
ドの出現は、これらの部位のいずれかで転写が開始する
ことを示唆する。しかしながら、ブライマーエクステン
ション分析は単独ではｍＲＮＡの５′末端を同定するの
には使用できない０例えばｎ＋ＲＮ八が上流側の１から
スプライスされる５′末端を含んでいることもありうる
。
結論として５′末端を決定するためには、高い解明度の
ＳＬヌクレアーゼマツピングが使用される。５ｆａＮＩ
断片は５°末端で標識され、Ｂｓ　ｔＥ　Ｉ　Ｉで消化
され、部位７５９ないし１０４０からエクステンディン
グするストランドの特異なブローブガ得られる。このプ
ローブは、Ｔ？ＩＣ−感染タバコの葉から単離されたＲ
ＮＡ中のＰＲ−１ａ転写物の５°末端をマツピングする
のに使用される。
１３７±２塩基の主なバンドはゲノムクローンの部位９
０１ないし９０５に相当することが見出された。高い解
明度の３１実験において、消化生成物がプローブ上で実
施されたシーケンシング反応のサイズスタンダードと共
に電気泳動され、三つのバンドが部位９０１．９０２及
び９０３に対応して可視化される。これらの結果は、ブ
ライマーエクステンション分析を確認し、ＰＲ−１ｍＲ
ＮＡの５°末端を９０１．９０２または９０３位のいず
れかに位置づける。転写の開始に関して、これらの結果
の一つの可能な類推は、ＲＮＡポリメラーゼが各塩基９
０１．９０２または９０３において、多かれ少なかれ等
しい可能性で転写を開始することである。しかしながら
、真核転写はａｎ　Ａでの開始を好むので、見かけ上多
様な５“末端のもっとも可能性の高い説明は、ＰＲｌａ
　ｄＮＡが９０３（ａｎ　Ａ）位で開始し、ＰＲ−１ｂ
及び−１ｃ　ｍＲＮＡがそれらの対応する遺伝子上の他
の部位の１箇所で開始することである。
２、タンパク質の同定及び特徴づけ これらの実施例に関連するＰＲタンパク質は、ある場合
においては始めて、他の場合においては文献に記載され
た方法に従って、究極的にそれらの化学的に誘導しうる
遺伝子の同定を確認する目的のために単離され、精製さ
れ、そして配列される。
実施例８ＰＲ−１ａタンパク質及びＰＲ−１ｂタンパク
質の精製 Ｎ１ｃｏｔｉａｎａ　ｔａｂａｃｃｕｍ　ｃｖ、χａｎ
ｔｈｉの植物をガラスハウス内で育て、８週齢になった
とき、葉をびりの一般的な菌種（旧）の懸濁液（０，５
μｇ／戚）と穏やかに摩擦することにより感染させる。
感染から７週間後に葉を収穫し、細胞内液（ＴＣＰ）で
葉を洗い流し、Ｐａｒｅｎｔ、　Ｊ、Ｇ、　ｅｔ　ａｌ
、、Ｃａｎ。
Ｊ、　Ｂｏｔ、　６２，３６４　（１９８４）に従って
集める。ＩＣＦ２５０１１ｄｌを凍結乾燥により５０ｍ
１まで濃縮し、ｐｌ＋８．０のＴｒｉｓ−１１ｃＩ及び
１ｍＭのＥＤＴＡで平衡にしたＵｌｔｒａｇｅｌ　ＡＣ
Ａ５４カラムにかける。溶離液は電気泳動により、１０
％のポリアクリルアミドゲル上で分析する。ＰＲ−１タ
ンパク質を含むフラクションを集め、凍結乾燥し、３　
ａｌｌの水に再懸濁し、その後、水で一晩透析する。こ
の製剤をさらにＨＰＬＣアニオン交換クロマトグラフィ
ーにより、ＴＳＫ−ＤＥＡＥ　５ＰＮカラム上でさらに
精製した。カラムは５０ｍＭのＴｒｉｓ−ｆｌｃｌ、ｐ
Ｈ８，０及び１ｍＭのＥＤＴＡ中の０〜０．６Ｍ　Ｎａ
Ｃ１成分で溶離する。フラクションはポリアクリルアミ
ドゲル電気泳動（ＰＡＧＥ）により分析される。最初に
、ＰＲ−１ｂがカラムから０．１８ＭのＮａＣまで溶離
し、そしてＰＲ−１ａが０．２８ＨのＮａＣまで溶離す
る。各タンパク質を含むフラクションを集め、水で透析
し、凍結乾燥する。
ＰＲ−１ａ及びＰＲ−１ｂタンパク質標本の純度を、ア
クアボール（Ａｑｕａｐｏｒｅ）フェニルカラム（２，
ｌＸ１００ｍｍ、Ｂｒｏｗｎｌｅｅ）を用いて逆相ＨＰ
ＬＣにより確認し、０．１％ＴＦＡ中の線状アセトニト
リル／イソプロパツール（に１）グラジェント（５−８
０％）で？８離することにより確認する。
実施例９　タンパク質配列決定 精製され、凍結乾燥されたＰＲ−１ａタンパク質を、Ｉ
Ｍ　Ｔｒｉｓ−１１ｃＩ　、ｐＨ８，６，１Ｏｎ＋Ｍの
ＥＤＴＡを含有する６門グアニジン−ＨＣＩに溶解する
。ジチオスレイトールを２０ＩＩＭになるように添加し
、４−ビニルピリジンを最終濃度５０ｍＭになるように
添加する。その後、サンプルを窒素雰囲気下、１，３時
間インキュベートする。ピリジルエチル化物質をアクア
ボールフェニルカラム（２−Ｉ　Ｘ　１０ｃ＋ｎ　。
Ｂｒｏｗｎｌｅｅ）を用いてＨＰＬＣで脱塩化する。カ
ラムを、０．１％のトリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）中、ア
セトニトリル／イソプロパツール（１；１）の綿状、５
〜８０％グラジェントを用いて溶離する。
自動化されたＥｄｍａｎデグラジエーションをＡｐｐｌ
ｉｅｄ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ　４７０Ａガス相シーケ
ンサ−で行う。フェニルチオヒダントイン（ＰＴＨ）ア
ミノ酸を、＾ｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅ−ｍｓ　
１２０＾ＰＴＨアナライザーで同定する。
臭化シアン分解を、Ｓｉｍｐｓｏｎ、Ｒ，Ｊ、ｅｔ　ａ
ｌ、＋Ｂｉｏｃｈｅｍ、　Ｉｎｔ！、　８．７８７　（
１９８４）によりその場で行う。ＰＲ−１のピログルタ
メートアミノペプチダーゼ（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ　Ｍ
ａｎｎｈｅｉｍ）による消化を、＾１１ｅｎ、　　Ｇ、
、Ｐｌａｎｔ　　Ｓｅｉ、　　Ｌｅｔｔ、　　２６．　
１７３　　（１９８２）に従って行う。
ＰＲ−１ａを、０．ＩＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣＩ、ｐＨ８，
５中、室温で２４時間、Ｌｙｓ−Ｃ（Ｂｏｅｈｒｉｎｇ
ｅｒ　Ｍａｎｎｈｅｉｍ）で、１；１０の酵素−基質比
で消化する。ペプチドを、アクアポールＣ−８カラム（
Ｉ　Ｘ２２ｃｍ、Ｂｒｏｗｎｌｅｅ）を用いて、０゜１
％ＴＦ＾中の線状アセトニトリル／イソプロパツール（
１：１の比）グラデイエンド（０ないし６０％）により
、ＨＰＬＣにより単離する。
Ｎ−末端Ｌｙｓ−Ｃペプチドのトリプシン（Ｃｏｏｐｅ
ｒ）による消化を、０６１Ｍの塩化カルシウムを含有す
る０、１Ｍの炭酸水素アンモニウム、ｐＨＱ、２中で、
酵素−基質比１：１００で、３７°Ｃで５時間行う。得
られた二つのペプチドをＬｙｓ−Ｃペプチドと同様の条
件を用いて、ＨＰＬＣ上で分離する。
、実施例１０　　ＰＲ−１ａペプチドのタンパク質配列
３個のｃＤＮＡクローンのＤＮＡ配列とＰＲ−１ａ、−
１ｂ及びＩＣタンパク質との相互関係は、もともとはＣ
ｏｒｎｅｌｉｓｓｅｎ、Ｂ、Ｊ、Ｃ，ｅｔ　ａｌ、＋　
Ｐ技工モーにより、出版されたＰＲ−１ａ　（Ｌｕｃａ
ｓ＋　Ｊ、　ｅｔ　ａｌ、、　ＥＭＢＯＪ、４ｔ２７４
５　（１９８５））から誘導される三つのペプチドのタ
ンパク質配列データの比較並びにｃＤＮ＾ＤＮＡクロー
ン論されるタンパク質の一次構造に基づいて作られる。
しかしながら、ＰＲ−１ａとして決められたｃ　ＤＮＡ
クローンは、５′末端で切断され、３個のペプチドのう
ち２個のみにちあして、残りの１個の不適合と比較され
うる。上記で製造し分析したようなｃ　ＤＮＡから推定
されるコード化されたアミノ酸配列及びＰｆｉｔｚｎｅ
ｒ、Ｕ、Ｍ。
ｅｔ　ａｌ、＋　且肛ムからのＰＲ４ａ　ｃ　ＤＮＡ配
列は出版されたタンパク質配列に、報告されたようなト
リプトファン残基において合わないだけでなく、アミノ
末端タンパク賞配列の他の三つの位置においても合わな
い、この異例は、この問題となっているＰＲ−１ａ　と
してのクローンの同定を位置づける。従って、ＰＲ−１
ａ遺伝子としてのｔｏｂｃｈｒＰＲＩＯ１３クローンの
同定は、精製されたＰＲ−１ａ　タンパク質の一次構造
の多くの部分をアミノ酸配列により決定することにより
証明される。
ＰＲ−１ａタンパク質のためのアミノ酸配列データは、
ＰＲ−１ａ　、−１ｂ及び−１０のためのｃ　ＤＮＡク
ローンから推定されるアミノ酸配列と比べられる０分析
で使用されたｃ　ＤＮＡ配列データは、上記で単離され
たｃ　ＤＮＡクローンからの、及び全ての部位で適合す
るＰｆｉｔ、ｚｎｅｒ、　ＩＪ、Ｍ、　ｅｔ　ａｔ、。
２からの配列である。完全なＰＲ−１ａタンパク質配列
の８０％以上が決定され、この配列はｔｏｂｃｈｒＰＲ
１０１３のための推定されたＰＲ−１ａタンパク質配列
に合っている。推定のＰＲ−１ｂ及びＰＲ−１ｃｃＤＮ
＾クローン（ＣｏｒｎｅｌｉｓｓｅｎＪ、Ｊ、Ｃ，ｅｔ
　ａｌ、、１１劇）から誘導された推定されたアミノ酸
配列に比べて、各々７個及び６個の不適合がある。従っ
て、証１処は明らかにｔｏｂｃｈｒＰＲ１０１３が実際
にＰＲ−１ａ遺伝子のクローンであることを示している
。
３、クローンの製造 この群の実施例は遺伝子の単離及び化学的に調整可能な
配列及びそれらの配列を含むキメラ遺伝子の遺伝子単離
及び同定の結果として生産されたクローンを記載する。
実施例１１　　ｔｏｂｃｈｒＰＲ１０１３の製造核は、
Ｎ１ｃｏｔｉａｎａ　ｔａｂａｃｃｕｍの葉から、最初
に該組織３５ｇを液体窒素中で凍結し、そしてモーター
とペラスルで微細な粉末になるまで摩砕することにより
単離する。該粉末を摩砕緩衝液（０，３Ｍのスクロース
、　５０ｍＭのＴｒｉｓ＋　ｐＨ８，５ｍＭの塩化マグ
ネシウム、５ｍＭの硫酸水素ナトリウム、０，３％のＮ
Ｐ４０）　２５０ｄに添加し、その後、氷上で１０分間
撹拌する。この混合物を６層のチーズ布を通して濾過し
、その後、液体を遠心分離ボトルに移し、７００　Ｘｇ
で１０分間の遠心分離にかける。該ペレットを摩砕緩衝
液中で再懸濁し、再遠心分離にかける。該ペレットを再
び摩砕緩衝液中に再懸濁し、再遠心分離にかける。該ペ
レットを再び摩砕緩衝液中に再懸濁し、そしてこの懸濁
液を１０ｍＭのＴｒｉｓ、ｐＨ８，１，５ｍＭの塩化マ
グネシウム、１４０ｍＭの塩化ナトリウム、２４％のス
クロース、１％のＮＰ４０を含有する２０ｄの冷たいス
クロースクツション上に積層する。これらの管は１７．
０００　Ｘ　ｇで１０分間遠心分離にかけられる。この
段階でのペレットは主に各及びデンプン顆粒を含む、高
分子量のＤＮＡは核から、実質的にＭａｎｉａｔｉｓ、
　Ｔ、ｅｔ、ａｌ、ｄ屁■に従って単離される。ＤＮＡ
は部分的にＭｂｏｌで消化され、ＥＭＢＬ３クローニン
グベクターのＢａｍＨＩ部位に連結される。約３００，
０００のプラークが標識ＰＲ−１ｂ　　ｃＤＮＡプロー
ブでスクリーニングされる。５０の陽性クローンが単離
され特定される。陽性のプラークは精製され、制限分析
により特徴づけられる。
これらのクローンは制限マツピングにより８つの厳密な
群に類別される。該クローンの一つは、ｔｏｂｃｈｒＰ
Ｒ１０１３として同定される。　ｔｏｂｃｈｒＰＲ１０
１３の部分的な制限マツプを第１図に示す、　ＤＮＡの
単離及びＯＮへの操作は実質的にＭａｎｉａｔｉｓ。
Ｔ、ｅｔ　ａｌ、、赳肛ムのように行われる。
実施例１２　　ｐＢＳ−ＰＲ１０１３Ｃｌａの製造クロ
ーンｔｏｂｃｈｒＰＲ１０１３からのＣ１ａｌ断片をＢ
ｌｕｅｓｃｒｉｐｔ　　プラスミド（Ｓｔｒａｔａｇｅ
ｎｅ　ＣｌｏｎｉｎｇＳｙｓｔｅＭｓ）へ継代培養して
、ｐＢＳ−ＰＲ１０１３Ｃ１ａ（第２図参照）を得る。
　ｐＢＳ−ＰＲ１０１３Ｃ１ａからの２ｋｂのＸｈｏＩ
−Ｂｇｌｌｌ断片を配列し、９１３ないし１７１１位（
配列ｌ）がＰｆｉｔｚｎｅｒ、Ｕ、Ｍ、ｅｔ　ａｌ、、
且肛虹により単離されたＰＲ−１個のためのｃ　ＤＮ＾
クローンの配列に完全に合うことが見出された。クロー
ニング方法の間にタバコＤＮＡの可能な再配列が、ゲノ
ムＤＮＡからの予想された制限フラグメントを分析する
ことにより見出された。ｐＢＳ−ＰＲ１０１３Ｃ１個の
配列情報及び制限マツプに基づいて、ゲノムのタバコＤ
ＮＡのＥｃｏＲＩ　、　Ｈｉｎｄｎｌ、Ｘｈｏｌ＋Ｂｇ
１　■、または旧ｎｄＩ［［＋Ｐｓｔ　Ｉによる消化が
、各々ＰＲ−１ａ遺伝子を含む３．２ｋｂ　、６．７ｋ
ｂ　、　２．０ｋｂまたは６．４ｋｂの断片を発生すべ
きである。この予想を試験するために、タバコ染色体Ｄ
ＮＡ　３μｇを適当な酵素で消化し、０．７％のアガロ
ースゲル上で電気泳動にかける。ＤＮＡをナイロン膜に
移し、そしてＰＲ−１ａ遺伝子から得られる標識したＸ
ｈｏｌ−ＢｓｔＥ　ＩＩ制限断片でプローブする。対照
用として、ｐＢＳ−ＰＲ１０１３Ｃ１ａ　ＤＮＡを消化
し、同じゲル上で電気泳動にかける。予想したように、
ＥｃｏＲＩ　、旧ｎｄｎｌ、ＸｈｏｌｈＢｇｌ　Ｉｆ、
及び旧ｎｄＩＩ［＋Ｐｓｔ　Ｉの消化物は対照用バンド
でコミグレートする予想された分子量のバンド産生する
。従って、ｔｏｂｃｈｒＰＲ１０１３クローンに含有さ
れたＤＮＡはタバコゲノムにＤＮＡの連続片を表わす。
実施例１３　ｐＢＳ−ＰＲ１０１３Ｅｃｏの製造プラス
ミドｐＢＳ−ＰＲ１０１３Ｅｃｏは、ＰＲ−１ａ遺伝子
を含有する３、６ｋｂのＥｃｏＲＩ断片を、ｔｏｂｃｈ
ｒＰＲ１０１３（実施例９）から、ブルースクリプトプ
ラスミドのユニークなＥｃｏＲＩ部位に継代培養するこ
とにより形成される。ブルースクリプトプラスミド（ｃ
ａｔａｌｏｇ　ｎｏ、　２１２０３）　はＳｔｒａｔａ
ｇｅｎｅＣｌｏｎｉｎｇ　５ｙｓｔｅｒｎｓ、　Ｌａ　
Ｊｏｌｌａ、　Ｃａ１ｉｆｏｒｎｉａから得られる。　
ｐＢＳ−ＰＲ１０１３Ｅｃｏの構造は両方の制限マツピ
ング及びＤＮＡ配列の両方により確認される。このプラ
スミドの構成を第３図に示す。
Ｂ、　さもなければ、プラスミドｐＢＳ−ＰＲＩＯ１３
ＣｌａはＥｃｏＲＩにより消化され、ＰＲ−１ａ　ｉｆ
ｆ伝子を含有する３、６ｋｂの断片が単離される。ｐＢ
ｌｕｅｓｃｒｉｐｔはＥｃｏＲＩで消化され、前もって
単離された３、６ｋｂのＥｃｏＲＩ断片と混合され、連
結される。このプラスミドの構成を第４図に示す。
実施例１４１）ＢＳ−ＰＩ１１０１３ＥｃｏΔＰｓｔの
製造プラスミドｐＢＳ−ＰＲ１０１３ＥｃｏをＰｓｔｌ
で消化し、ＤＮＡ断片を２，５％の低ゲル温度アガロー
スゲル上で分離する。ブルースクリプトベクターを含有
する大きな断片及びタバコＤＮＡの３．０ｋｂ正確に取
り出し、アガロースを溶融するために６５°Ｃに加熱す
る。２μｌを１５μ２の水に添加し、ＤＮＡを実施例１
に記載したようにアガロース中で連結する。
■、　−晩インキユベートした後、ＤＮＡを含有するア
ガロースを６５゛Ｃで１０分間インキュベートすること
により溶融し、その後アガロースから実質的に実施例２
に記載したのと同様の方法により転換する。
２、　各々６個の推定される陽性構造物からのバクテリ
ア培養液の一部を、１００μｇ７ｍｆｔのアンピシリン
を含有するＬＢ培地（Ｍｉｌｌｅｒ、ｓｕ肛蛙５　ｍｌ
ｌに接種し、そしてこの培養液を３７°Ｃで一晩インキ
エベートする。細胞をクリニカル遠心分離で、１０分間
、フルスピードでの遠心分離により採取する。上清液を
除去し、細胞を５０ｍＭグルコース１００　ｕ　Ｑ　、
　２５ｍＭのＴｒｉｓ、ｐＨ７，５，１０ｍＭ　ＥＤＴ
Ａ中に再、Ｑ濁し、懸濁液を１，３ｕｅのエッペンドル
フ遠心分離管に移す。新しく調製した１０ｏｉｇ／　ｍ
ｌのリゾチーム溶液を添加し、懸濁液を氷上に１０分間
放置する。その後、０．２Ｎの水酸化ナトリウム２００
μ℃、１％のドデシル硫酸ナトリウムを添加し、懸濁液
を混合し、氷上に２分間放置する。
２Ｍの酢酸ナトリウム２００　μｌ　（ｐＨ４，８）を
添加し、溶液を氷上に１５分間放置する。得られた溶液
をエッペンドルフ遠心分離器中、フルスピードで１０分
間の遠心分離にかける。上清液を新しい遠心分離管に移
し、４００μｒのフェノール／クロロホルム（１：１）
で抽出する。水相を新しい管に移し、４００μ尼のクロ
ロホルムで抽出する。
この抽出液からの水相を新しい管に移し、２倍容量のエ
タノールを添加することによりＤＮＡを沈澱させ、−２
０℃で３０分間貯蔵する。沈澱したＤＮＡをエッペンド
ルフミクロフユージ中、フルスピードで１５分間の遠心
分離にかけることにより集める。エタノールを除去し、
ベレットを８０％のエタノールで洗浄する。エタノール
を再び除去し、ペレットを風乾する。ＤＮＡをＴＥ緩衝
液中に再懸濁する。構造はＰｓｔｌで消化することによ
り証明だれる。親のプラスミドρＢＳ−ＰＲ１０１３２
ｃＯは６ｋｌび６５０　ｂ　ｐ以下のバンドを生じさせ
、新しい構成においては小さい方が欠けている。
これらのプラスミドの一つはプラスミドｐＢＳ−ＰＲ１
０１３ＥｃｏΔＰｓｔとして選択される。このサブクロ
ーンの構成は次の分析により証明される。このプラスミ
ドの構成を第５図に示す。
実施例１５　　ｐＢＳ−ＰＲＩ０１３ＥｃｏΔＰｓｔΔ
Ｘｈｏの製造ｐＢＳ−ＰＲ１０１３Ｅｃｏの仮の制限マ
ツプを確立する。
ＸｈｏＩ制限部位は、Ｐｓｔｒ部位から蒸溜側１２００
ｂρ以下に位置する。プラスミドｐＢＳ−ＰＲ１０１３
ＥｃｏΔＰｓｔはＸｈｏｌで消化され、断片は０．９％
の低ゲル温度アガロースゲル上で分離される。二つの断
片は３．９ｋｂ及び１．７ｋｂのサイズで可視化される
。
３．９ｋｂの断片を含有するバンドは注意深くゲルから
取り出され、実質的に上記と同様の方法によりアガロー
ス中で連結される。アガロースは溶融し、ＤＮＡはコン
ピテントＢｃｏＲＩ菌１１ＢＩＯＩに上記のように形質
転換される。細胞を１、Ｂ　−ａｍｐ板上に延べ、上記
のようにインキュベートする。
一方の推定された陽性のコロニーはＬＢ−ａｍｐ培地に
接種され、ＤＮＡは実質的に上記と同様に単離される。
この新規なサブクローンｐｕｓ−ＰＲ１０１３ＥｃＯΔ
ＰｓｔΔＸｈｏの構造は、制限分析及びＤＮＡ配列によ
り証明される。第６図はこのプラスミドの構成を示す。
実施例１６　ｐｃＩＢ２７０の製造 プラスミドｐＢＪ１０１．３　（カタログＮｏ、６０２
４．１）がＣ１ｏｎｅｔｅｅｈ　Ｌａｂｓ、Ｐａ１ｏ　
Ａｌｔｏ、　Ｃａ１ｉｆｏｒｎｉａから得られる。この
プラスミドを最初にＢａｍ）ｆ　Ｉ　で消化し、その後
５ａｌｌで消化する。プラスミドｐＢＳ−ＰＲ１０１３
ＥｃｏΔＰｓｔΔＸｈｏがＰｓｔＴで消化される。次式
： ５　’　−ＧＧＧＡＴＣＣＣＴＧＣＡ−３’で表わされ
る配列を有するＰｓｔｌ／Ｒａｍ旧アダプターが上記実
施例４に記載されるように製造され、Ｐｓｔｌ−消化ｐ
ＢＳ−ＰＲＩＯ１３ＥｃｏΔＰｓｔΔＸｈｏに連結され
る。得られた材料を最初にＢａｍＨＩで消化し、その後
Ｘｈｏｌで消化する。ＢａｍＨＩ／ＸｈｏＩ断片を単離
し、消化されたｐＢｌｌｏｌ、３と混合して連結させ、
形質転換させる。推定された陽性のｐｃＴＢ２７０のク
ローンを単離し、制限及びＤＮＡ配列分析により証明す
る。このプラスミドの沈澱を第７図に示す。
実施例１７　Ｍ１３罹ｐ１８−または＋１１１）１９−
ＰＲ１０１３ＥｃｏΔＰｓｔΔＸｈｏの製造 プラスミドｐＢＳ−ＰＲ１０１３Ｅｃｏ　ΔＰｓｔΔＸ
ｈｏをＰｓ（Ｉ及びＡｓｐ７１Ｂで消化する。１％のＴ
ＡＢ低温ゲル化アガロースゲル上で電気泳動にかけた後
、１゜ＩｋｂのＡｓｐ７１８／Ｐｓｔｌ断片を単離する
。ｃｏｌｉファージＭ１３ｍｐ１８またはＭ１３ｍｐ１
９の複製型分子（ＲＦ）を、Ｍｅｓｓｉｎｇ、Ｊ、＋Ｍ
ｅｔｈ、Ｅｎｚｙｍｏ１．１０１＋２０　（１９８３）
により製造する。さもなければ、これらのベクターはＢ
ｅｔｈｅｓｄａ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ　Ｌａｂｓ、＋Ｇａ
ｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ。
Ｍａｒｙｌａｎｄから得られうる。各々のベクターは最
初にＡｓｐ７１８で消化され、その後、Ｐｓｔｌで消化
される。０．７％のＴＡＢ低ゲル化アガロース上で電気
泳動によりポリリンカーピースを除去した後、得られた
ベクターＲＦを混合し、上記で製造された１、１ｋｂの
断片とアガロース中で混合し、連結する。ＤＮＡを形質
転換し、推定される陽性のプラークを単離し、その後そ
れらの構造をＲＰ　ＤＮＡの分析により証明する。Ｍ１
３ｍｐ１８−及び＋１２１９−ＰＩ？１０１３ＥｃｏΔ
ＰｓｔΔＸｈｏの構成を第８図に示す。
実施例１８　Ｍ１３ｍｐ１８−またはｍｐ１９−ＰＲ１
０１３ＢｃｏΔＰｓｔΔＸｈｏ、Ｎｃｏ及びｐＣＩＢ　
２６Ｂ　　の製造−重鎖のＭ１３ｍｐ１８−ＰＲ１０１
３ＢｃｏΔＰｓｔΔＸｈｏファー’；　ＤＮＡをＭｅｓ
ｓｉｎｇ＋且肛ムにより単離する。
次式： ％式％ で表わされる配列の１８　ｂｐオリゴヌクレオチドプラ
イマーを上記のように合成する。ブライマーはＴ４ポリ
ヌクレオチドキナーゼ（Ｍａｎｉａｔｉｓ、Ｔ。
ｅｔ　ａｌ、−肚ｎ　　第１２５頁）で、未標識ＡＴＰ
を用いてホスホリル化する。３７°Ｃで６０分間インキ
ュベートした後、反応物を６８°Ｃに１５分間加熱し、
その後氷上に置く、このプライマー及びＭ２Ｓ−４０フ
ォワードシーケンシングプライマー（ＮｅｗＥｎｇｌａ
ｎｄ　Ｂｉｏｌａｂｓ　＃１２１２）を、−重鎖Ｍ１３
ｍｐｌＢＰＲＩＯ１３ＥｃｏΔＰｓｔΔＸｈｏ　ＤＮＡ
に、１：１：１のモル比で混合した後、６８゛Ｃに１０
分間加熱した後にゆっくり冷却することにより強化する
。強化された混合物を氷の上に置き、１／１０容盪の１
０倍のエロンゲーシゴン緩衝液（２０ｍＭ　Ｔｒｉｓ　
ｌｌ衝液ｐＨ７，５，６ｍＭ　ＭｇＣＩｔ　、　１ｍＭ
のＤＤＴ　、　１ｍＭのｄＡＴＰ、　１ｍ門のｄＣＴＰ
、１ｍＭのｄＧＴＰ及び１ｍＭのｄＴＴＰ）を添加する
。ＤＮＡポリメラーゼ■の大きな断片１０単位（Ｋｌｅ
ｎｏｗ　　ｆｒａｇｎ＋ｅｎｔ、Ｎｅｗ　　Ｅｎｇｌａ
ｎｄ　　Ｂｉｏｌａｂｓ＃２１０）及びＴ４　　ＤＮＡ
　リガーゼ（Ｎｆ！Ｂ　＃２０２）０．１単位を添加し
、その後、反応を１５°Ｃで１４時間進行させる。その
時間に、各酵素の付加的なアリコートを添加し、反応を
さらに２５°Ｃで２時間、混合物がコンビテン）ＪＭＩ
ＯＩ　Ｅ、ｃｏｌｉを形質転換するのに使用される前に
行う。−船釣なこの操作の流れ図を第９図に示す。
変異したファージを同定するために、プラークを遺伝子
スクリーンプラス（Ｇｅｎｅ　５ｃｒｅｅｎ　ＰｌｕＳ
）　（［１１１ｒ’ｏｎｔ）に載せ、製造者の提案に従
って加工する。該フィルターを４時間のプレハイブリダ
イゼーションを行い、そして４２℃で一晩、０．９Ｍの
ＮａＣ１を含有する製造者のハイブリダイゼーション溶
液中でハイブリダイゼーションを行う。
その後、続いて該フィルターを０．９Ｍの濃度のＮａＣ
まで洗浄し、各段階において洗浄温度を５°Ｃずつ増加
させながらオートラジオグラフィーでモニターする。変
異を受けたハイブリダイゼーションにより同定されたフ
ァージは、塩基の変化を確認するために配列される。
そのような候補の複製型（Ｍ１３ｍｐ１Ｂ−ＰＲ１０１
３Ｅｃ。
ΔＰｓｔΔＸｈｏ、　Ｎｃｏ）を単離し、ＰｓｔＩ及び
ＢｓｔＥｒＩで消化して、第１０図に説明するように、
ｐＢＳ−ＰＲＩＯ１３ＥｃｏΔＰｓｔΔＸｈｏ中の対応
する非変￥４３９４　ｂｐ断片−〇置き換えている３９
４　ｂｐ　　断片を産生ずる。
これは、２１７ｂｐ　０）ＰＲ−１ａ遺伝子のためのコ
ード配列がＩｉ’ｔ＜９３０位にＮｃｏＩ部位を有する
ｐｃＩＢ２６８を製造する結果となる。このプラスミド
の構造は配列分析により確認される。
実施例１９　ＧＵＳ及びＰＲプロモーター配列の種々の
長さを含むキメラ遺伝子の製造 Ａ、　ｐｃＩＢ２６９の構成 ９３０ｂｐの断片を、１．０％の低ゲル温度アガロース
ＴＡＢゲル上でＸｈｏ　Ｉ及びＮｃｏｌで消化されたｐ
Ｃ１８２６８を電気泳動にかけた後、単離する。その後
、この断片が、Ｘｈｏｌ及びＮｃｏｌで消化されたｐＢ
Ｓ−ＧＵＳｌ、２　（実施例１９　Ｂ参照）に連結され
る。形質転換体を単離し、制限分析及びＤＮＡ配列によ
り分析する。一つの陽性なプラスミドを選択し、そして
ｐｃＩＢ２６９と命名する。このプラスミドの構成を第
１１図に示す。
Ｂ、　ｐｕｓ−ＧｔｉＳｌ、２の構成 ｐＢＳ−Ｇ［ＪＳｌ、２を、ｐＲＡＪ２６５　　（Ｊｅ
ｆｆｅｒｓｏｎ、Ｒ，八、ｅｔａｌ、、ＥＭＢＯＪ、　
６．３０９１−３９０７　（１９８７）及びＧ［ＪＳ　
Ｕｓｅｒ　Ｍａｎｕａｌ＋　　Ｃ１ｏｎｅｔｅｃｈ　Ｌ
ａｂｓ、、Ｐａ１ｏ　Ａｌｔｏ、　　Ｃａ、）からの３
９１　ｂｐ　５ａＩＩ／５ｎａｂｌ　断片とｐＢ１２２
１　（Ｊｅｆ　ｆｅｒｓｏｎ、Ｒ，Ａ、ｅｔ　ａｌ−＋
ＥＭＢＯＪ」肚ユ）及び５ａｉｌ及び１１１ｐ１９−Ｐ
Ｒ１０１３ＥｃｏΔＰｓｔΔＸｈｏで消化されたｐＢＳ
からの１７０７　ｂ：　５ｎａｂｌ／ＥｃｏＲＩ断片と
の３個の連結部位により製造する　（第１２図参照）。
形質転換体を単離し、制限消化及びＤＮＡ配列により分
析する。一つの変化したクローンはｐＢＳ−ＧＵＳｌ、
　２と命名される。
Ｃ，ｐｃＩＢ２００の構成 最初に、ＴＪＳ７５ＫａｎをｐＴＪＳ７５　（Ｓｃｈｍ
ｉｄｈａｕｓｅｒ及びＨｅ１ｉｎｓｋｉ、　Ｊ、Ｂａｃ
ｔｅｒｉｏｌ、　１６４．４４６−４５５（１９８５）
）のＮａｒｌによる消化により製造して、テトラサイク
リン遺伝子を取り出し、続いてＮｐｔＩ遺伝子を有する
ｐＵｃ４Ｋ　（Ｍｅｓｓｉｎｇ＋　Ｊ、　ａｎｄ　Ｖｉ
ｅｒｒａ、Ｊ、。
Ｇｅｎｅ　１９．２５９−２６８（１９８２））からの
ＡｃｃＴ断片の挿入を行う。その後、ｐｃＩＢ　２００
を、ｐｃＩＢ７　（Ｔ−ＤＮＡボーダーの左及び右を含
み、植物選択性ｎｏｓ／ｎｐ（［■キメラ遺伝子及びρ
［ＪＣポリリンカー、Ｒｏｔｈｓｔｅｉｎ、Ｓ、Ｊ、等
、　Ｇｅｎｅ　５３，１５３〜１６１　　（１９Ｂ？）
）のＥｃｏＲＶ断片にＸｈｏＩリンカ−を連結すること
により製造し、そしてＸｈｏｌで消化された断片を５ａ
ｌｌ消化ＴＪＳ７５Ｋａｎにクローン化する。
Ｄ、ρＣｌ８２７１の構成 プラスミドｐＣＩＢ２６９（実施例１９Ａ）をＸｈｏｌ
及びＥｃｏＲ［で消化し、ｎｏｓ３’ををするＧＵＳ　
ｇｅｎｅ　　に連結されたＰＲ−１ａプロモーターを有
する３０２３　ｂｐ断片を単離し、続いて１．０％の低
ゲルアガロースＴＡＥゲル上で電気泳動する。その後、
この断片を、５ａｉｌ及びＥｃｏＲＩで消化されたブロ
ードホスト範囲ベクターｐｃＩＢ２００に連結する。形
質転換体を単離し、制限分析により分析する。一つの変
形されたクローンをｐｃＩＢ２７１　と命名する。
このクローンの構造を第１３図に示す。
Ｅ、　ｐｃＩＢ２７２の構成 ｐｃＩＢ２６Ｂ（実施例１８）をＡｌｕｌ及びＮｃｏｌ
で消化し、Ｉ　ＸＴＡＥ　Ｏ，７％のアガロースゲル上
で電気泳動にかけた後、８３３　ｂｐ断片を単離する。
この断片をβ−グルクロニダーゼ遺伝子にｐＢＳ−ＧＵ
Ｓｌ、２＜実施例１９Ｂ）中のｎｏｓ　３°末端を連結
する。その後、プロモーター及びＣＵＳを、へ５ｐ７１
８１／Ｂａｍ１ｌｌ断片としてのｐＣＩＢ２８２と命名
されるこのプラスミドから取り出し、Ｅ、ｃｏｌｉ菌Ｄ
Ｈ５αへの形質転換の前に、Ａｓｐ１１８１及びＢａｒ
ｇＨＩで消化されたｐＣＩＢ２００に連結する。形質転
換体を単離し、制限分析により分析する。一つの変形ク
ローンをｐＣＩＢ２７２と命名する。
Ｆ、　ｐｃＩＢ２７３の構成 ｐｃＩＢ２６８を、ＨａｅｌＴＩ　＋　Ｎｃｏ［で消化
し、６０３ｂρ　断片を、ｌ　ＸＴＡＥ　０．７％のア
ガロースゲル上で′心気泳動にかけた後単離する。この
断片を、ｐＢＳ−ＧＵＳｌ、２中、ｎｏｓ　３　’末端
を有するβ−グルクロニダーゼ遺伝子の前に置く。その
徨、プロモーター及びＧＵＳを、Ａｓｐ７１８Ｉ／Ｂａ
ｍＨＩ断片としてのｐｃＩＢ２Ｂ２と命名されるこのプ
ラスミドから取り出し、Ｅ、ｃｏｌｉ菌ＤＨ５αへの形
質転換の前に、Ａｓｐ７１８１及びＢａｍＨ［で消化さ
れたｐｃｒＢ２００に連結する。形質転換体を単離し、
制限分析により分析する。一つの変形クローンをｐｃＩ
Ｂ２７３と命名する。
実施例２０　　ヒグロマイシン（ＨｙｇｒｏｌＩｌｙｃ
ｉｎ）ベクター中のキメラ遺伝子の製造 ｐＣＩＢ２６９を、Ｘｈｏｌ及びＥｃｏＲＩで消化し、
１６０％の低ゲルアガロースＴＡＢゲル上での電気泳動
に続いて、ｎｏｓ３”末端を有するＧＵＳ　ｇｅｎｅ　
　に連結されたＰＲ−１ａプロモーターを有する３０２
３　ｂｐ断片を単離する。。その後、この断片を、配列
： ５　’　−ＡＡＴＴＣＧＴＣＧＡＣＧ−３’を有するＥ
ｃｏＲＩ／５ａｌＩアダプターとの連結により、Ｘｈｏ
［／５ａｉｌ断片に転化する。このＸｈｏｌ／５ａｌｌ
断片を５ａｌｌで消化されたｐｃＩＢ７１２（Ｒｏｔｈ
ｓｔｅｉｎ、Ｓ、Ｊ。
ｅ　Ｌ　ａ　Ｉ　、　、　」川■）に連結して、ｐｃＩ
Ｂ２１９を製造する（第１４図参照）。
実施例２１　ｐｃＩＢ２００／ＰＲＩ−ＢＴの製造Ａ、
　ｐｃＩＢ２００との連結 プラスミドｐｃＩＢ１００４　（下記参照）をｓｐｈ　
Ｉで消化し、フェノール抽出し、エタノール沈澱し、再
懸濁する。配列： ５　　’　　−ＣＣＧＧＴＡＣＣＧＧＣＡＴＧ−３’を
有するオリゴヌクレオチドが合成され、生成され、キナ
ーゼ化され、そして５ｐｈｌ消化プラスミドｐｃＩＢ１
００４に連結される。連結後、リガーゼを不活性化し、
ＤＮＡをＫｐｎ　Ｉで消化する。このＤＮＡを０．８％
の低ゲル温度アガロースゲル上を走らせる。プラスミド
ｐｃＩＢ２００（実施例１９Ｃ）をＫｐｎ　ｒで消化し
、ウシ騙アルカリホスファターゼで処理し、０．８％低
ゲル温度アガロースゲル上を走らせる。ｐｃｒＢ２００
ベクターを含有するバンド及びＰＲ−１５’フランキン
グ配列／ＢＴフュージョンを含有するバンドを混合し、
ＤＮＡ連結してプラスミドｐｃＩＢ２００／ＰＲＩ−Ｂ
Ｔを形成する。
Ｂ、　ｐｃＩＢ１００４の製造 プラスミドｐｃＩＢ１０／３５ＢＴ（６０７）をＮｃｏ
　Ｉ及びＢａｍＨｌで消化し、０．８％低ゲル温度アガ
ロースゲル上を走らせる。プラスミドＩ）ＣＩＢ２６９
　（実施例１９Ａ）をＮｃｏＩ及びＸｈｏＩで消化し、
０．８％低ゲル温度アガロールゲル上を走らせる。プラ
スミドｐＣＩＢ７１０　（ロートスティン＋Ｓ、Ｊ、ｅ
ｔ　ａｌ、、５ｕｐｒａ）を５ａＩＩ及びＢａｍ旧で消
化し、０．８％低ゲル温度アガロールゲル上を走らせる
。　ＣａＭＶ　３５ｓ　　プロモーター３°末端を含有
する５ａｉｌ及びＢａｍ１ｌｌで消化したベクターを有
するバンドがｐＵｃ１９にクローン化し、ＢＴ遺伝子を
含有するバンド及びＰｌ？−１５１フランキング領域を
含むバンドを取り出し、混合し、ＤＮＡ連結してプラス
ミドｐｃＩＢ１００４を形成する。
ｃ、　ｐｃｉＢｌｏ／３５Ｂｔ（６０７）の製造ｐｃｒ
Ｂ１０／３５Ｂｔ（６０７）、約６０７個のアミノ酸の
配列コードを含有する欠損プロトキシン遺伝子を、Ｂａ
ｃｉｌｌｕｓ　ｔｈｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓエンドトキシ
ンからの該プロトキシン遺伝子を含有するプラスミドで
あるプラスミドｐｃＩＢ１０／３５ｓｂｔから製造する
。
Ｅ、ｃｏｌｉ　ＭＣｌ０６１含有ｐｃｒＢ１０／３５Ｓ
ｂｔはアメリカンタイプカルチャーコレクション＾ＴＣ
ＣＮｏ、　６７３２９、１９８７年２月２７日に寄託さ
れている。デリートされたプロトキシン遺伝子はＢａｍ
ＨＩ開裂部位（ＧＧＡＴＣＣ）、続いてヌクレオチド１
９７６をＢＴ遺伝子配列内に導入することにより製造さ
れる。これは、ｐｃＩＢ１０／３５Ｓｂｔからのプロト
キシン配列を含有するＢａ−旧断片のクローン化により
、標準的なオリゴヌクレオチド　突然変異誘発法を用い
て行うことができる。突然変異誘発の後、二重標準複製
型分子ＤＮＡを、？１１３クローンから製造し、その後
、これをＢａｍＨＩで消化する。欠損プロトキシン遺伝
子を含有する約１．９ｋｂの断片をＢａｌ１旧−開裂ｐ
ｃＩＢ１０／７１０に挿入する。得られたプラスミドは
カナマイシンのために選択される。製造のための詳細な
説明は、１９８７年１１月１８日に提出されたアメリカ
合衆国特許出願筒１２２．１０番号に記載されており、
これは参考文献として導入される。
実施例２２　ｐｃＩＢ１２３３　（ｐｃＴＢ２００／Ｐ
ＲＩ−ＡＨＡＳ）の製造 ａ、　　ｐｃＩＢ２００の連結 プラスミドｐｃＩＢ２００をＫｐｎ　ｒ及びＸｂａｌで
消化し、０．８％低ゲル温度アガロースゲル上を走らせ
る。
プラスミドｐｃＩＢ１２１６をＫｐｎＩ及びＸｂａ　Ｉ
で消化し、０．８％低ゲル温度アガロースゲル上を走ら
せる。
Ａ　１１　Ａ　Ｓコード配列及びバンド含有ｐｃｉＢ２
００ヘクターに融合されたＰＲ−１５°フランキング配
列を含有する４、３ｋｂ以下のバンドを取り出し、混合
し、そしてＤＮＡ連結してｐｃＩＢ１２１３を形成する
。
Ｂ、　　ｐｃＩＢ１２１６の製造 プラスミドｐｃｒＢ２６９（実施例１９Ａ）をＸｂａ　
Ｉ及びＮｃｏｌで消化し、０．８％低ゲル温度アガロー
スゲル上を走らせる。プラスミドｐｃＩＢ１２０７　（
下記参照）をＸｂａ　［及びＮｃｏ　Ｉで消化し、０．
８％低ゲル温度アガロースゲル上を走らせる。ブルース
クリプトベクターをＰＲ−１５’フランキング配列を含
有するバンド及びＡ）！ＡＳコード配列を含有する３゜
３ｋｂのバンドを取り出し、混合し、そしてＤＮＡ連結
してｐｃＩＢ１２１６を形成する。
Ｃ，Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ　ＡＨＡＳ　　遺伝子を含
有するプラスミドｐｃＩＢ１２０７の製造 総プラントＤＮＡを５週齢のＡｒａｂｉｄｏｐＳｉｓ　
ｔｈａｌｉａｎａ　ｅｃｏｔｙｐｅ　Ｃｏｌｕｍｂｉａ
から単離する。このＤＮＡ２５０μｇを制限酵素χｂａ
ｒ４０００単位で４時間消化する。消化は、０．８％の
アガロースゲル上の電気泳動により行われる。６，３ｋ
ｂと４．３６ｋｂＯ間のＤＮＡ断片（ＩＩｉｎｄＩ［Ｉ
−消化ラムダＤＮＡサイズマーカー）をＮ＾−４５ＤＥ
ＡＥメンプラン（Ｓｃｈｌｅｔｃｈｅｒａｎｄ　５ｃｈ
ｕｅｌｌ、Ｋｅｅｎｅ、ＮＨ，ｌｌ５Ａ）を用いて、製
造者の提案する方法に従ってゲルから単離する。Ｘｂａ
ｌ消化及びホスファターゼ処理されたラムダｏｎｇＣ（
ＩｏｎｇＣ）アーム製造は、Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ　Ｃ
ｌｏｎｉｎｇＳｙｓｔｅＩＩ＋ｓ　（Ｌａ　Ｊｏｌｌａ
＋　ＣＡ＋ＵＳＡ）から得られる。
アラビドブシスＸｂａｌ挿入ＤＮＡはＳ　ｔｒａ　ｔａ
ｇｅｎｅにより推薦されている方法に従って１．０　μ
２のｌｏｎｇＣアームに連結される。２，３μ２の連結
反応物を、製造者より提案される方法に従って、ギガバ
ックプラスキット（Ｇｉｇａｐａｃｋ　Ｐｌｕｓ　ｋｔ
ｔ）を用いてラムダファージヘッドに詰める。ライブラ
リーの活性はＥ、ｃｏｌｉ　ＶＣＳ２５７上で調べられ
る（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ　Ｃｌｏｎｉｎｇ　Ｓｙｓｔ
ｅｍｓ）。
ｐｆｉ１６／８−ｃ４プラスミドＤＮＡ　（Ｊ、Ｐｏ１
ａｉｎａ、　Ｃａｒｌｓｂｅｒｇ　Ｒｅｓ、　Ｃｏ１５
．４９＋５７７−５８４）５０μｇをＥｃｏＲ■で消化
し、消化した生成物を０．８％のアガロースゲルに溶解
する。イース）ＡＨＡＳ　　遺伝子のためのコード配列
を含む２ｋｂのＥｃｏＲＴ断片をＮ＾４５０ＥＡＥメン
プランを用いて、製造者により提案されている方法に従
ってゲルから単離する。
２ｋｂのフラグメントに対する放射線で標識されたプロ
ーブを、ハイブリダイゼーションはんおうの日に、プラ
イムタイムキット（Ｐｒｉｍｅ　ＴｉｍｅＫｉｔ）（Ｉ
ｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇ
ｉｅｓ　Ｉｎｃ、＋Ｎｅｗ　Ｈａｖｅｎ＋　ＣＴ＋υＳ
Ａ）を用いて、ランダムブライミング反応で、製造者に
より提案された方法に従って合成する。
ＶＣ５２５７上に２５０．０００の組換えファージを置
く。
ファージプラークを持ち上げる二重の膜は、コロニー／
プラークスクリーン膜（ＮＥＮ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈＰｒ
ｏｄｕｔｓ、　ｎｕ　ｐｏｎｔ、　Ｂｏｓｔｏｎ、　Ｍ
＾、　ＵＳＡ）を用いて、製造者により提案された方法
に従って製造される。該メンプランは、上記と同様に製
造された０、２５μｇの３２Ｐ−標識イーストＡＨＡＳ
遺伝子プローブを含有する新鮮なＬＳハイブリダイゼー
ション緩衝液１５０戚に移される。液膜は４２゛Ｃで穏
やかに震盪しながら１６時間インキエベートし、室温で
、２ＸＳＳＣで二重、１回あたり１５分間洗浄し、ＬＳ
ウォッシュ緩衝液中（２５％ホルムアミド、５ＸＳＳＣ
１１％５ＯＳ）中、４２°Ｃで３回、１回あたり２時間
洗浄し、その後、リンス緩衝液（０，ｌＸ５ＳＣ，Ｏ。
１％５ＤＳ）中、２回、１回あたり３０分間洗浄する。
膜を固定し、Ｃｒｏｎｅｘ　Ｌｉｇｈｔｅｎｉｎｇ　Ｐ
ｌｕｓ　５ｃｒｅｅｎｓ（ＤｕＰｏｎｔ、　Ｉｌｉｌｍ
ｉｎｇｔｏｎ、　ＤＢ、　ＵＳＡ）及びＭＡＲ−５フイ
ルム（コダック）で螢光測定する。両方のメンプランリ
フトに陽性のフィルムシグナルを与えるプレートの開城
からのプラークを引き上げ、１５０　ｍのプレート当た
り低密度の３００プラークに置き換え、スクリーニング
方法はシングルハイブリダイゼーシゴンブラークが単離
されるまで繰り返される。
ブラークー生成ファージからのファージＤＮＡのミニブ
レツブをＬａｍｂｄａＳｏｒｂ　Ｐｈａｇｅ　Ａｄｓｏ
ｒｂｅｎｔｋｉｔ　（Ｐｒｏｍｅｇａ、Ｍａｄｉｓｏｎ
、　Ｗｌ、ＬＩＳＡ）を伴う方法に従って行う。ファー
ジＤＮＡを制限酵素Ｘｂａ　Ｉで切断し、５．８ｋｂの
挿入断片をｐｕｓ（−）プラスミド（Ｄ　Ｘｂａ　１部
位にクローン化する（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ　Ｃ１ｏｎ
４ｎｇ　Ｓｙｓｔｅｍｓ”）。クローン化された断片の
アラビドシスＡＩＩＡＳ遺伝子を含むＸｂａｌ断片によ
る同定は、その制限マツプ及びＤＮＡ配列を、該遺伝子
のためにｌｌａｕｇｈｎ　ｅｔ　ａｌ、、Ｍｏ１．　Ｇ
ｅｎ、　Ｇｅｎｅｔ、　２１１＋　２６６（１９８８）
　、及びｎａｚｕｒ　ｅｔ　ａｌ、、Ｐｌａｎｔ　Ｐｈ
ｙｓ＋ｏ１．８５゜１１１０　（１９８７）により出版
されたものと比較することにより証明される。このプラ
スミドはｐｃＩＢ１２０７と定められる。
実施例２３　　ｐｃＩＢ１２３２の製造（ｐｃＴＢ２０
０／ＰＲＩ−ＡＨＡＳ−５ｕＲ） 八、　ｐｃＩＢ２００　　との連結 プラスミドｐｃＩＢ２００　（実施例１９Ｃ）はＫｐｎ
Ｉ及びＸｂａ　Ｉで消化され、０．８％低ゲル温度アガ
ロースゲル上を走らせる。プラスミドｐｃＢ１１２３０
をＫｐｎＩ及びＸｂａ　Ｉで消化し、０．８％低ゲル温
度アガロールゲル上を走らせる。ＡＨＡＳ−５ｕＲコ一
ド配列に融合したＰＲ−１５’フランキング配列を有す
る４゜３ｋｂ以下のバンド及びｐｃＩＢ２００ベクター
を含有するバンドを取り出し、混合し、ＤＮＡ連結して
プラスミドｐｃｒＢ１２３２を形成する。
Ｂ、　　ｐｃＩＢ１２３０の製造 プラスミドＩ）ＣＩ８１２０８　（下記参照）をＸｂａ
　Ｉ及びＮｃｏｌで消化し、断片をＩ　ＸＴＡＥ　０．
８％低ゲル温度アガロースゲル上での電気泳動により分
離する。プラスミドｐｃＩ８２６９　（実施例１９Ａ）
をＮｃｏ　Ｉ及びＸｂａｌで消化し、ｌ　ＸＴＡｆ！　
０．８％低ゲル温度アガロースゲル上を走らせる。ブル
ースクリプトベクター及びＰＲ−１プロモーターを含む
ｐｃＩＢ２６９断片及び突然変異したＡ）！Ａｓ遺伝子
を含む３．３ｋｂ断片（クロスホモロジー及び制限断片
分析によりＭａｚｕｒ　ｅｔ　ａｌ、、　Ｐｌａｎｔ　
Ｐｈｙｓｉｏｌ、　８５＋１１１０−１１１７　（１９
８７）に記載された遺伝子で分析）を、取り出し、溶融
し、−緒に連結して、ｐｃ４Ｂ１２３０と定義されるク
ローンを製造する。
ｃ、　ｐｃ１８１２０８の製造 ゲノムＤＮＡライブラリーを実施例２２Ｃに記載したよ
うに、Ｈａｕｇｈｎ　ａｎｄ　Ｓｏｎ＋ｅｒｖｉｌｌｅ
、　Ｍｏ１．　Ｇｅｎ、　Ｇｅｎａｔ、　２０４’、　
４３０−４３４（１９８６）により記載されたようにス
ルホニル尿素系除草剤に対する抵抗性のために選択され
たアラビドシス植物から単離したＤＮＡを用いて、形成
する。遺伝子コード化アセトヒドロキシ酸シンターゼ（
ＡＨＡＳ）をイーストアセトヒドロキシ酸シンターゼ遺
伝子プローブ（実施例２２Ｇ参照）とのクロスハイブリ
ダイゼーションにより同定する。組換えＤＮＡをｐｃＩ
Ｂ１２０８として定義されたクローンを生産するブルー
スクリプト（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）にサブクローン化
する。このプラスミドは、スルホニル尿素系除草剤によ
る抑制に抵抗性の突然変異したアセトヒドロキシ酸シン
ターゼをコード化した遺伝子を含む。
実施例２４　　ニコチアナ　タバクム（Ｎｉｃｏｔｉａ
ｎａＴａｂａｃｕｍ）からのβ−１，３−グルカナーゼ
（グルカン　エンド−１，３−β−グルコシダーゼ）の
塩基型をコード化するゲノムクローンの単離ＣＥＴＡＢ
法（Ｍｕｒｒａｙ　ａｎｄ　Ｔｈｏｍｐｓｏｎ、　Ｎｕ
ｃｌｅｉｃ　Ａｃ１ｄ　Ｒｅｓ、　８．４３２１　（１
９８０））によるニコチアナタバクムｃｖ、　ｌ１ａｖ
ａｎａ　４２５　　の葉から高分子１ＤＩＪＡを製造す
る。１００μｇのＤＮＡを５ａｃｌで完全に消化する。
このＤＮＡを０．８％のアガロースゲル上の電気泳動に
より分離する。３ないし７ｋｂの分子量範囲に相当する
ゲルの領域を６個の等しいサイズのストリップに切断し
、ＤＮＡをこれらのストリップから電気溶離（ｅｌｅｃ
ｔｒｏｅｌｕｔｅ）　Ｌ／、分離したフラクションとし
て沈澱させる。ＤＮＡは再懸濁され、各フラクションか
らのアリコートはアガロースゲル上で電気泳動させ、サ
ザーンプロッティングにより分析する。β−１，３−グ
ルカナーゼｃＤＮ＾プローブにハイブリダイズするＤＮ
Ａを含むフラクション（Ｓｈｉｎｓｈｉ、１１．　ｅｔ
　ａｔ。
＋Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　＾ｃａｄ、　Ｓｃｉ、　Ｕ
ＳＡ　８５，３５４１−５５４５（１９８８））を集め
、ライブラリーの形成に使用する。
ストラタゲン　コーポレーションから買うことのできる
クローニングベクターラムダＯｎｇＣを５ａｃＩで消化
される。このＤＮへの１μｇを、５ａｃｌで消化された
ｔｏｂａｃｃｏ　ＤＮＡ　Ｏ，１μｇと混合し、そして
ＤＮＡを製造者の提案によるＴ４　　ＤＮＡ　リガーゼ
と連結する。その後、連結されたＤＮＡをストラタケ゛
ンによる１ｎｖｉｔｒｏパツケージ法を用いてファージ
粒子に詰める。ファージをラムダマニュアルに提案され
たようにバクテリアに延べる。杓７５．０００個のプラ
ークを３２−Ｐで標識されたβ−１，３−グルカナーゼ
ｃＤＮＡプローブを用いてスクリーニングする。１】の
陽性プラークを同定する。これらのプラークは続いての
ラウンドのブレーティング及びスクリーニングにより生
成される。
ＤＮＡを生成されたクローンから単離し、クローンを旧
ｎｄ［、ＥｃｏＲ［、及びＳａｃ　Ｉを用いての制限消
化により分析する。クローンは二つのタイプ、即ら、ク
ローン３９．１に代表されるクローンと、クローン３９
．３に代表されるクローンとからなる。クローン３９．
１及び３９．３における４、５及び４．７ｋｂ挿入物は
、各々５ａｃｌで消化されるサブクローン化され、サブ
クローンｐＢＳＧＩｕｃ３９．１　　（ラムダクローン
３９．１から誘導されるＳａｃ　ｒ断片）及びサブクロ
ーンｐＢＳＧＩｕｃ３９．３　　（ラムダクローン３９
．３から誘導される５ａｃｌ＠片）が単離される。
サブクローンｐＢＳ−ＧＩｕｃ３９．１及びｐＢＳ−Ｇ
ｌａｃ３９．３内に含まれる５ａｃｌ断片内のＤＮＡ配
列は、ＤＮＡ配列により調べられ、配列５及び配列６内
に各々見られる。コード配列が見出され、インターヴエ
ニング配列がコード配列の５′末端の近くに位置する。
実施例２５　　β−１，３−グルカナーゼ遺伝子のため
の転写開始位置の同定 Ａ、　ブライマーエクステンションマツピング塩基２３
９９ないし２４１６と補足的であり、実施例５に記載さ
れたようなプライマーエフテンション実験に使用される
合成ＤＮＡブライマーを合成する。これらの実験のため
のＲＮＡをフィトフトラバラシチ力種のニコチアナ（Ｐ
ｈｙｔｏｐｈｔｈｏｒａ　ｐａｒａｓｉｔｉｃａ　ｖａ
ｒ、　ｎ１ｃｏｔｉａｎａ）ｉ染タバコから単離する。
プライマーエクステンション法は標識されたプライマー
をテンプレートとして使用されるサブクローンｐＢＳ−
Ｇｌｕｃ３９．１とのジデオキシＤＮＡ配列反応中で用
いる分子１１準に対して行われる。エクステンション生
成物は、実施例５に記載したようなゲル電気泳動及びオ
ートラジオグラフィーの後、β−１，３−グルカナーゼ
３９．１配列、配列５の１４３２位、１４４６位及び１
４４７位に相当することが（１１！Ｌｖされる。ｐＢＳ
−Ｇ１ｕｃ３９．１配列の１５５４位と２３４５位との
間には大きなイントロンが存在するので、分子量ラダー
はエクステンション生成物の正確な分子量を反映しない
かもしれない。従って、第二のブライマーエクステンシ
ョンマツピング実験は１５３０位ないし１５４７位に補
足的なプライマーを用いて行われる。このブライマーを
用いて、３個のグルカナーゼｍＲＮＡの５１末端をＡ残
基の１４３４．１４４８及び１４４９位にマフピングす
る。
Ｂ、　Ｓｌヌクレアーゼ　マンピング １４１５位ないし１５０４位に補足的な合成オリゴヌク
レオチドはＳ１ヌクレアーゼマツピングにおいてプロー
ブとしての用途に合成される。オリゴヌクレオチドは５
′末端で３２Ｐ−ＡＴＰ及びＴ４ポリヌクレオチドキナ
ーゼを用いて、５ｕｌ）Ｉ）Ｉｉｅｒの提案に従ってキ
ナーゼ化される。フェノール抽出及びエタノール沈澱に
続いて、標識されたオリゴヌクレオチドをホルムアミド
ハイブリダイゼーション緩衝液（実施例６参照）に、約
２ｎＭの濃度で再懸濁する。これらの実験において使用
されるＲＮＡはフィトフトラパラスチ力感染タバコから
前記実施例のように単離される。Ｓｌマッピングはこの
実施例６に記載されたような標識されたオリゴヌクレオ
チドを用いたＲＮＡ上で行われる。ゲル電気泳動の３個
のバンドがｐＢＳ−Ｇｌｕｃ３９．ＩＤＮ＾配列の１４
３４位、１４４８位及び１４４９位に対応することが検
出される。
Ｃ０転写開始部位の決定 プライマー・エクステンシヨン及びＳ１ヌクレアーゼマ
ツピング法の両方が１４３４位、１４４８位及び１４４
９位のｌ１ｌＲＮＡの５゛末端を位置づける。従って、
全てのアデニン残基であるこれらの部位はβ−１，３−
グルカナーゼ遺伝子の転写開始部位に対応する。
実施例２６　　ｐＢＳ−Ｇ１ｕｃ３９．１／ＧＵＳの製
法配列： Ａ）　　　　５’−ＧＴＴＴＡＴＧＴＧＡＧＧＴＡＧＣ
ＣＡＴＧＧＴＧＧＧＡＡＧＡＣＴＴＧＴＴＧＧＧ−３’ Ｂ）　　５”−ＧＡＴＣＧＣＧＧＴＡＣＣＧＡＧＣＴＣ
ＣＴＣＴＡＧＧＧＧＧＣＣＡ＾ＧＧ−３’ のオリゴヌクレオチドが合成され、精製され、そして５
ｕｐｐｌｉｅｒ’ｓ　ｄｉｒｅｃｔｉｏｎｓ　（パーキ
ン　エルマー　セタス（＋’ｅｒｋｉｎ　Ｅｌｍｅｒ　
Ｃｅｔｕｓ）ＤＮＡ　Ｔｈｅｍａｌ　ｃｙｃｌｅｒ　　
；及びパーキン　エルマー　セタス、ＧｅｎｅＡｍｐ　
Ｒｅａｇｅｎｔ　Ｋｉｔ）に従って、ポリメラーゼ触媒
反応（ＰＣＲ）で使用され、ｐＢＳ−Ｇｌｕｃ３９．１
からのＤＮ＾の１４９４　ｂｐ断片を拡大する。オリゴ
はＫｐｎ１部位を３９．１グル力ナーゼ配列の塩基対ま
で直ちに５°ないしＳａｃ１部位に付加し、その後、新
しい塩基対１４６２で新しいＮｅｏ　１部位を発生させ
るように決められている。ＰＣＲアンプリフィケーショ
ン法から誘導されたＤＮＡは、フェノール／クロロホル
ムで抽出され、エタノールで沈澱される。ＤＮ＾は再懸
濁され、Ｎｃｏ　Ｉ及びにｐｎｌの両方で消化され、０
．８％の低ゲル温度アガロースゲルで電気泳動にかける
。　１４６２　ｂｐバンドを取り出し、下記の連結に使
用する。プラスミドｐＢＳ−ＧＵＳ１．２　（実施例１
９Ｂ）をＮｃｏｌ及びＫｐｎ　Ｉで消化し、０．８％の
低ゲル温度アガロースゲルで電気泳動にかけ、ベクター
を含むバンドを取り出す、　ＰＣＲ反応からのｐＢＳ−
Ｇｕｓ　１．２ベクター及び１４６２　ｂｐバンドを連
結し、Ｅ、ｃｏｌｉ　　に転換するために使用する。陽
性のコロニーを取り出し、１４６２　ｂｐ挿入物を含む
もののためにスクリーニングする。挿入物を含むプラス
ミドはｐｕｓ−Ｇｌｕｅ３９、１／Ｇｏｓのピューテー
ティブなりローンであるが、この方法における突然変異
誘発率は比較的高い（〜１／１０００塩基）、いくつか
のクローンは１４６２　ｂ、、断片を通して配列される
べきである。
予想された配列を有する一つのクローンは、クローンｐ
ＢＳ−Ｇｌｕｃ３９．１／Ｇ［ｌＳとして選択される。
実施例２７　　ｐＢＳ−ＧＩｕｃ３９．３／ＧＵＳの製
造配列： Ａ）　　　　５’−ＧＴＴＴＡＴＣＴＧＡＧＧＴＡＧＣ
ＣＡＴＧＧＴＧＡＧ八＾ＧＡＣＴＴＧＴＴＧＧ八−３Ｂ
）　　５　’　へＧＡＴＣＧＣＧＧＴＡＣへＧＡＧＣＴ
ＣＣＣＴＴＧＧＧＧＧＧＣＡＡＧ−３’のオリゴヌクレ
オチドが合成され、精製され、そしてＩ’ＣＩ？反応に
使用して、ｐＢＳ−ＧＩｕｃ３９，３から１６７７　ｂ
ｐ断片をアンプリファイする。オリゴヌクレオチドは新
しいＫｐｎＩ部位をグルカナーゼ３９゜３の１位のＳａ
ｃ　Ｉ部位及び１６４６位の新しいＮｃｏ　Ｉ部位に極
めて隣接して導入するように決められている。Ｉ’ＣＲ
アンブリソイケーションからのＤＮＡはフェノール／ク
ロロホルムで抽出され、エタノールで沈澱され、再懸濁
され、Ｎｃｏ　Ｉ及びＫｐｎ　１の両方で消化され、０
．８％の低ゲル温度アガロースゲルで電気泳動にかける
。　１６４６　ｂｐでのバンドを取り出し、下記の連結
に使用する。ρＢＳ−Ｇｕｓ、１．２はＮｃｏ　Ｉ及び
Ｋｐｎ　Ｉで消化され、０．８％の低ゲル温度アガロー
スゲルで電気泳動にかけられる。ベクターを含むバンド
を取り出し、ＰＣＲはんおうからの１６４６　ｂｐバン
ドと混合し、連結して、プラスミドｐＢＳ−Ｇ１ｕｃ３
９．３／ＧＵＳを形成する。
前記のように、いくつかのピューテーティブプラスミド
を単離し、配列し、望まれた配列を有するものをプラス
ミドｐＢＳ−Ｇ１ｕｃ３９．３／ＧＵＳとして取り出す
。
実施例２８　　ｐｃＩＢ２００／Ｇｌｕｃ　３９．１−
ＧＵＳ及びｐｃＩＢ２００／Ｇｌｕｃ　３９．３の製造 ｐｃＩＢ２００（実施例１９Ｃ）をＫｐｎ　Ｉ及びＸｂ
ａ　Ｉで消化し、０．８％の低ゲル温度アガロースゲル
で電気泳動する。プラスミドｐｕｓ−ＧＩｕｃ３９．　
Ｉ／ＧＩＪＳ（実施例２６）をＫｐｎｌ及Ｕｘｂａｌテ
消化し、断ハをＯ，８ン６の低ゲル温度ゲルで分離する
。ｐｃＩＢ２００ベクターを含有するハンド及びＣＵＳ
遺伝子に融合されるグルカナーゼ３９．１遺伝子の５°
フランキング配列を含有するＫｐｎｌ−Ｘｂａｌ　バン
ドを耳マリ社し、ＤＮＡ連結してプラスミドｐｃＩＢ２
００／ＧＩｕｃ３９．１−ＧＵＳを形成する。
Ｂ、　同様にプラスミドｐＢＳ−Ｇｌｕｃ３９．３／Ｇ
ＵＳ（実施例２７）を消化し、消化されたｐｃｉＢ２０
０に連結してプラスミドｐｃＩＢ２００／Ｇｌｕｃ３９
．３−ＧＩＩＳを形成する。
実施例２９　ｐｃｒＢ２００／Ｇｌｕｃ３９．１−ＢＴ
　　及びｐｃｒＢ２００／Ｇｌｕｃ３９．３−ＢＴの製
造 ＾、　　ｐＣＩＢ２００／Ｇ１ｕｃ３９．１−ＢＴプラ
スミドｐＢＳ−Ｇｌｕｃ３９．ｌ／ＧＵＳをにｐｎｌ及
びＮｃｏ　まで消化し、０．８％低ゲル温度アガロース
ゲルで電気泳動にかける。プラスミドｐｃＩＢ１００４
（実施例２１Ｂ）をＫｐｎ　Ｉ及びＮｃｏ　Ｉで消化し
、０．８％低ゲル温度アガロースゲルで電気泳動する。
プラスミドｐｃ１８２００（実施例１９Ｃ）をＫｐｎ　
Ｉで消化し、ウシ腸アルカリホスファターゼを用いて脱
リン酸化０．８％低ゲル温度アガロースゲルで電気泳動
にかける。ｐｃＩＢ２００ベクターを含有するバンド、
グルカナーゼ５′フランキング領域を含有するバンド、
及びＢＴ遺伝子を含有するバンドを取り出し、−緒に混
合し、連結してプラスミドｐｃＩＢ２００／Ｇｌｕｃ３
９．１−ＢＴを形成する。
Ｂ、　　ｐｃＩＢ２００／Ｇ１ｕｃ３９．３−ＢＴ同様
にプラスミドｐＢＳ−ＧＩｕｃ３９．３／ＧＵＳを消化
されたｐ（ｊＢ１００４及び消化されたｐｃＩＢ２００
で消化し、連結してプラスミドｐｃｌＢ２００／Ｇｌｕ
３９．３−ＢＴを形成する。
実施例３０　　ｐｃＩＢ２００／ＧＩｕ３９．１−ＡＨ
ＡＳ及びｐｃＩＢ２００／Ｇｌｕ３９．３−ＡＩＩＡＳ
の製造 Ａ、　　Ｉ）ＣＩＢ２００の連結 プラスミドｐＢＳ−Ｇ１ｕｃ３９．１／ＡＨＡＳをＫｐ
ｎ　Ｉ及びＮｃｏｆで消化し、０．８％低ゲル温度アガ
ロースゲルで電気泳動にかける。プラスミドｐｃＩＢ２
００（実施例１９Ｃ）をにｐｎＩ及びＸｂａ　Ｉで消化
し、０．８％低ゲル温度アガロースゲルで電気泳動する
。グルカナーゼ／　Ａ　１１　Ａ　Ｓフュージョンを含
有するバンド及びｐｃｉＢ２００発現ベクターを含有す
るバンドを取り出し、混合し、ＤＮＡ連結してプラスミ
ドｐｃＩＢ２００／ＧＩｕｃ３９．１−Ａｌ１＾Ｓを形
成する。
同様に、プラスミドｐＢＳ−Ｇｌｕｃ３９．３／ＡＨＡ
Ｓを消化されたｐｃＩＢ２００で消化し、連結して、プ
ラスミドｐｃＩＢ２００／Ｇｌｕ３９．３−ＡＨＡＳを
形成する。
Ｂ、　プラスミドｐＢＳ−Ｇｌｕｃ３９．１／ＡＨＡＳ
及びｐＢＳ−Ｇｌｕｃ３９．３／ＡＩＩＡＳの製造 プラスミドｐＢＳ−Ｇ１ｕｃ３９．１／ＧＵＳ（実施例
２６）をＫｐｎｌ及びＸｂａｌで消化し、０．８％低ゲ
ル温度アガロースゲルで電気泳動にかける。プラスミド
ｐＣ［８１２０７（実施例２２Ｃ）をＮｃｏ　Ｉ及びＸ
ｂａ　Ｉで消化し、０．８％低ゲル温度アガロースゲル
で電気泳動する。グルカナーゼ５°フランキング配列及
びベクター含有するハンド及びＡＨＡＳコード化配列化
合列するバンドを取り出し、混合し、ＤＮＡ連結してプ
ラスミドｐＢＳ−Ｇｌｕｃ３９．１／ＡＨＡＳを形成す
る。
同様に、プラスミドｐＢＳ−Ｇｌｕｃ３９．３／ＧＵＳ
　（実施例２７）を消化し、消化されたｐｃＩＢ１２０
７と連結してプラスミドｐＢＳ−Ｇｌｕｃ３９．３／Ａ
ＨＡＳを形成する。
実施例３１　　ｐｃＩＢ２００／Ｇｌｕ３９．１−ＡＨ
ＡＳ−５ｕＲ及びｐＣＩＢ２００／Ｇｌｕ３９．３−＾
ＨＡＳ−５ｕＲの製造Ａ、ｐｃＩＢ２００との連結 プラスミドｐＢＳ−Ｇ］ｕｃ３９．１／ＡＨＡＳ−３ｕ
ＲをＫｐｎ　Ｉ及びＸｂａ　Ｉで消化し、０．８％低ゲ
ル温度アガロースゲルで電気泳動にかける。プラスミド
ｐｃＩＢ２００（実施例１９Ｃ）をＫｐｎｌ及びＸｂａ
　Ｉで消化し、０．８％低ゲル温度アガロースゲルで電
気泳動する。グルカナーゼ／ＡＨＡＳ−ＳｕＲフュージ
ョンを含有するバンド及びｐｃＩＢ２００発現ベクター
を含有するバンドを取り出し、混合し、そしてＤＮＡ連
結してプラスミドｐｃＩＢ２００／Ｇ１ｕｃ３９．１−
＾ＨＡＳ−Ｓｕｒを形成する。
同様にプラスミドｐＢＳ−Ｇｌｕｃ３９．３−ＡＨＡＳ
−３ｕｒを消化し、消化されたｐｃＩＢ２００と連結し
、プラスミドｐｃＴＢ２００／Ｇｌｕｃ３９．１−ＡＨ
ＡＳ−５ｕＲを形成する。
Ｂ、プラスミドｐＢＳ−Ｇｌｕｃ３９．１／ＡＨＡＳ−
ＳｕＲ及びｐｕｓＧｌｕｃ３９．３／八ＨＡＳ−ＳｕＲ
の製造プラスミドｐＢＳ−ＧＩｕｃ３９．１／ＧＵＳ　
（実施例２６）及びｐＢＳ−Ｇ１ｕｃ３９．３／ＧＵＳ
　（実施例２７）をＮｃｏ　Ｉ及びｘｂａ！で消化し、
そして制限断片を０．８％の低ゲル温度アガロースゲル
で分離する。　ｐｃＩ８１２０８（実施例２３Ｃ）をχ
ｂａｒ及びＮｃｏ　Ｉで消化し、突然変異したＡＩＩＡ
Ｓ遺伝子（スルホニル尿素除草剤抵抗性、５ｕＲ）をア
ガロースゲル電気泳動で単離する。グルクロニダーゼプ
ロモーター及びｐＢＳベクターを含有する断片を取り出
し、溶融し、ＡＩＩＡＳ　　断片と結合して消化された
ｐＢＳ−ＧＩｕｃ３９．１／ＡＨＡＳ−５ｕＲ及びｐＢ
Ｓ−ＧＩｕｃ３９．３／ＡＨＡＳ−ＳｕＲを各々製造す
る。
４、新規な遺伝子の同定 下記の例は、本発明の残る新規なＰＲタンパク質遺伝子
の単離及び特定を示す。
実施例３２　　他のゲノム及びｃＤＮＡのクローンの単
離 Ａ、　　ＰＲ−１’をコード化するゲノムクローンの単
離 実施例１１に記載したように、ゲノムライブラリーを形
成し、ＰＲ−１ｃＤＮＡプローブでスクリーニングする
。クローンを単離し、消化されたＩａｌＩｌｄａ　ｔｏ
ｂｃｈｒＰＲ１０１９を消化する。プレリミナリーな制
限マツプを確立する。Ｃ１ａｌ断片をブルースクリプト
にサブクローン化し、その後、プラスミド、ｐＢＳ−Ｐ
Ｒ１０１９Ｃ１個の制限マツプを製造する。
大きなＸｈｏ　Ｉ断片をｐＢＳ−ＰＲ１０１９Ｃ１ａか
ら除去し、プラスミドｐＢＳ−ＰＲ１０１９Ｃ１ａ　Ｘ
ｈｏを製造する。このプラスミドは、ＰＲ−１０１９遺
伝子を含有する約２．７ｋｂのタバコＤＮＡを含有する
。欠損はこのプラスミド中で行われ、欠損のセットはＤ
Ｎ＾配列に使用される。
この遺伝子の約２１００ｂｐのＤＮＡ配列を配列２に示
す。ＰＲ−１０１９中でコード化したタンパク質はＰＲ
−１ａ　、　ＰＲ−１ｂまたはＰＲ−１ｃに対して約６
５％同等であることが見出される。従って、この新しい
遺伝子はＰＲ−１’と命名される。
Ｂ、　キュウリキチナーゼをコード化するｃＤＮＡクロ
ーンの単離 病原体誘導キチナーゼタンパク質を、感染した胡瓜の葉
から、Ｍｅｔｒａｕｘ、Ｊ、Ｐ、ｅｔ　ａｌ、＋Ｐｈｙ
ｓｉｏｌｏｇｉｃａｌ　ａｎｄ　Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　
Ｐｌａｎｔ　Ｐａｔｈｏｌｏｇｙ、　３３＋１−９　（
１９８８））に記載されているように単離する。
ペプチドはこの同族のタンパク質製造物から従来技術に
記載されたのと実質的に同様に、且つ実施例９及び１０
に記載されたように製造される。
タンパク質の二つの領域を選択し、その後、ペプチドを
コード化しうるメツセンジャーＲＮＡの全ての可能な組
み合わせに完全に対応するオリゴヌクレオチドプローブ
を合成する。プローブの配列を下記に示す： ＧＴ　　　　　　　Ａ クローン゛１　：　５　’　−ＣＣＡＴＴＣＴＧＮＣＣ
ＣＣＡＧＴＡ　−３’ＧＧＧＣ プローブ２　：　５　’　−ＧＧＡＴＴＡＴＴＡＴＡＡ
＾＾ＴＴＧＮＡＣＣＣＡ　−３キユウリの葉をタバコネ
クロシス（Ｎｅｃｒｏｓｉｓ）ウィルス（ＴＮＶ）で感
染させ、ＲＮＡを実施例５に記載したように感染した後
、５日間単離する。
ポリＡ　＋ＲＮＡを標準技術により単離し、ｃ　ＤＮＡ
ライブラリーを、実質的に（Ｇｕｂｌｅｒ＋Ｕ、ａｎｄ
　ｌｌｏｆｆｍａｎ、Ｂ、Ｊ、、Ｇｅｎｅ　２５，２６
３（１９８３））に記載したように、ラムダＺａｐクロ
ーニングベクター（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）内に製造す
る。　３００．０００プラークを延べ、そして二重のプ
ラークリフト３ｔＰ標識オリゴヌクレオチド混合物ｌ　
（プローブ１）または混合物２　（プローブ２）の両方
でプローブする。各々のプローブでスクリーニングした
ときに陽性の結果を示すプラークを単離する。ファージ
の単離及び自動的な取り出しは、Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ
　Ｌａｌ１ｂｄａ　Ｚａｐミルラボラトリニュアルに記
載されたように実施される。
ブルースクリプトプラスミド内で、−度、キチナーゼｃ
ＤＮ＾クローンが単離されると、それらはジデオキシシ
ーケンシングにより配列される。
キチナーゼ遺伝子の配列は配列３に提供される。
Ｃ９ＰＲ−Ｒのメジャーフオームをコード化するｃＤＮ
Ａクローンの単離 ニコチアナ　タバクム（Ｎｉｃｏｔｉａｎａ　ｔａｂａ
ｃｃｕｍ）、例えばＸａｎｔｈｉ−ｎｃ　ｇをタバコモ
ザイクウィルスに感染させ、感染後、５日間収穫する。
総ＲＮＡを実施例５に記載したように製造し、ポリＡ十
ＲＮＡを標準技術を用いて単離する。ｃＤＮＡ　　ライ
ブラリーを、このポリＡ　＋ＲＮＡを用いて、ラムダｏ
ｎｇＣクローニングベクター（Ｓ　ｔｒａｄａｇｅｎｅ
）内に製造する。約３００．０００のプラークを次式＝
５　’　−ＧＡＡＣＴＴＣＣＴＡＡＡＡＧＣＴＴＣＣＣ
ＣＴＴＴＴＡＴＧＣＣ−３’で表わされる配列のオリゴ
ヌクレオチドプローブでスクリーニングする。
陽性のプラークを標準技術により精製し、ＤＮＡをファ
ージから製造する。　ｃＤＮＡを含む組換えファージの
断片をブルースクリプトプラスミドにサブクローン化す
る。ｃ　ＤＮＡのＤＮＡ配列をＤＮＡシーケンシングに
より決定する。　ＰＲ−Ｒの主な型をコード化する一つ
のクローンの配列（Ｐｉｅｒｐｏｉｎｔ＋　Ｈ，Ｓ、　
ｅｔ　ａｌ、＋Ｐｈｙｓｉｏ１．　Ｐｌａｎｔ　Ｐａｔ
ｈｏｌ。
３１．２９１（１９８７））は、配列４に存在する。こ
のコード化されたタンパク質は、トウモロコシから単離
される公知のトリプシン／α−アミラーゼ抑制剤（Ｒｉ
ｃｈａｒｄｓｏｎ、Ｍ、ｅｔ　ａｌ、＋Ｎａｔｕｒｅ　
３２７＋　４３２（１９８７））に対して非常に強い相
同を示す。クローン化されたＰＲ−Ｒは各々のプロテア
ーゼまたはα−アミラーゼの抑制剤であってよく、上記
のように、遺伝子の導入により発現されたとき、植物に
対する殺虫作用、殺ウイルス作用または殺菌作用を与え
る。
Ｄ、　ＰＲ−Ｑをコード化するｃＤＮＡの単離Ｎ１ｃｏ
ｔｉａｎａ　ｔａｂａｃｕｍ　ｃｖ、　Ｘａｎｔｈｉ　
　−ｎｃ葉に、タバコモザイクウィルスを感染させ、感
染から５日間収穫する。総１２ＮＡを実施例５に記載し
たように製造し、ポリＡ＋ＲＮＡを標準技術を用いて単
離する。ラムダＯｎｇＣクローニングベクター（Ｓ　ｔ
ｒａ　ｔａｇｅｎｅ）中のこのポリＡ　＋ＲＮＡを用い
てＣＤＮＡ　ライブラリーを製造する。約３００，００
０個のプラークを標識されたｃＤＮＡプローブでコード
化したタバコ塩基性キチナーゼ遺伝子（Ｓｈｉｎｓｈｉ
　ｅｔ　ａｌ、、Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、
　Ｓｃｉ、　ＵＳＡ　８４．８９−９３（１９８７））
を用いてスクリーニングし、フィルターを０．１２５ｍ
ＭのＮａＣ１，１％　ＳＤＳ　、　４０ｍＭのリン酸ナ
トリウム（ｐＨ７，２）、１ｍＭのＥＤＴＡ中、５０°
Ｃで洗浄する。、２４の陽性プラークを精製し、一つの
クローンが命名したｐＢＳｃｈｔ１５のＤＮＡ配列を調
べる。この配列を配列７に提供する。
実施例８に記載したように、ＴＭＶ感染タバコの葉の細
胞内液からＰＲ−Ｑタンパク質を部分的に精製する。ウ
ルトラゲルＡＣＡ５４　クロマトグラフィーからのＰＲ
−０，ＰＲ−Ｐ、　ＰＲ−Ｑ及びＰＲ−Ｉｆを含′有す
るフラクションを集め、凍結乾燥により濃縮する。タン
パク質を、ポリアクリルアミドゲル電気泳動によりさら
に精製する。ＰＩ？−Ｑを含むタンパク質質バンドを取
り出し、タンパク質を、Ａｐｐｌｉｅｄ　１３ｉｏｓｙ
ｓｔｅｍｓ　Ｕｓｅｒ　Ｂｕｌｌｅｔｉｎ　Ｎｏ、　３
６＋　１９８８年３月２１日に従って？８離する。タン
パク質を、ピログルタメートアミノペプチダーゼで処理
し、実♂缶例９に記載されたように自動化されたエドマ
ンデグラデーション（Ｅｄｍａｎ　ｄｅｇｒａｄａｔｉ
ｏｎ）により配列する。ＰＲ−Ｑタンパク質のアミノ末
端の配列は、下記のとおりであることが調べられるＣＸ
ｘ×は確定的でない）： Ｇ　ｌ　ｎＧ　ｌ　ｙ　［ＩｅＧ　１ｙＳｅｒ　Ｔ　１
ｅＶａ　ｌＴｈ　ｒＸｘｘＡｓ　ｐＬｅｕＰｈｅＡｓ　
ｎＧ　ｌｕＭｅ　ｔＬｅｕ配列７内のクローンにコード
化されたタナクｎは： ｌ）塩基性タバコキチナーゼに対する制限された構造的
相同、及び ２）　タンパク質配列により決定されるＰＲ−Ｑのアミ
ノ末端タンパク質配列に対する同定 をベースとする病原体関連タンパク質Ｑであることが調
べられる。
Ｅ、　ｃＤＮ＾でコード化するβ−１，３−グルカナー
ゼの酸型の単離 実施例３２Ｄ（上記）に記載されたｃＤＮＡライブラリ
ーの約３００．０００のプラークを、標識されたｃＤＮ
Ａプローブでコード化したβ−１，３−グルカナーゼの
塩基性型を用いてスクリーニングしく５ｈｉｎｓｈｉ＋
　Ｈ，ｅｔ　ａｌ、、　５ｕｐｒａ）　、０．１２５Ｍ
のＮａＣ１，１％のＳＯ５、４０ｍＭのリン酸ナトリウ
ム（ｐｆ（７，２）、１ｍＭのＥＤＴＡ中、５０°Ｃで
、フィルターを洗浄する。
１５の陽性のプラークを単離し、インサートをブルース
クリプトプラスミド中にサブクローン化する。部分的な
ＤＮＡ配列は、クローン５おぼい６でコード化された、
公知のＤＮＡ配列に対して約５５％の相同を有する同一
のｃＤＮＡ　　を表わす。
クローン５及び６中のｃ　ＤＮＡの配列を調べ、配列８
に示す。このｃＤＮＡは制限されたアミノ酸配列相同及
びさらにコード化されたイソエレクトリックポイントを
ベースとするβ−１，３−グルカナーゼの酸型をコード
化することが結論づけられる。
Ｆ、　キュウリキチナーゼ遺伝子をコード化するゲノム
のクローンの単離 ＮｕｃｌｅｉをＣｕｃｕａ＋ｉｓ　５ａｔｉｖｕｓ　ｃ
ｖ、　Ｉ、ｏｎｇ　Ｍａｒｋｅｔｅｒから単離し、ＤＮ
Ａを実施例１１に記載したように単離する。このＤＮＡ
の３ａｇをＥ！ｃｏＲＶ　、　ＥｃｏＲｌ、口ａｍｌｌ
ｌまたは旧ｎＤｆｆｌで消化し、断片を０，３％アカロ
ースリ゛ル上ζう３；凍する。二トユ・シリニトチナー
ゼｃ　ＤＮＡ　（配列３）の標識されたプローブを用い
てのサザーンプロット分析は、ＥｃｏＲＩ消化において
、約１２ｋｂでシングルバンドを表わす。
従って、総ＥｃｏＲＩ消化及びラムダ置換型クローニン
グベクターへの結合を用いたキュウリキチナーゼ遺伝子
を単離することが決定される。
上記で単離されたＤＮＡ　１０μｇをＥｃｏＲＩを用い
てのχ全に消化する。その後、このＤＮＡをフェノール
で抽出し、エタノールで沈澱させ、ＥＭＢＬ４のＥｃｏ
ＲＩ部位に結合する。約ｔｏｏ、ｏｏｏプラークをキュ
ウリキチナーゼ、配列３の標識されたｃＤＮＡプローブ
でスクリーニングする。１０の陽性なプラークを取り上
げ、精製し、ＤＮＡ挿入物を予備的な制限消化マンピン
グにより分析する。
全てのクローンが同じ結果を与える。従って、他の分析
のために一つを取り出す、その後、このクローン中の１
２ｋｂの挿入物をブルースクリプトにサブクローン化し
てプラスミドｐＢＳｃｕｃｃｈｔ／ｒ、ｈｉｔｉｎｎＳ
ｐを′テえる。このクローン化ｎＮ＾のために制限マツ
プを確立し、断片をサブクローン化し、ＤＮＡ配列を決
定する。
Ｇ、　酸性β−１，３−グルカナーゼのゲノムのクロー
ンの単離 ゲノムのライブラリーを実施例１１に記載されたように
製造し、酸性β−１，３−グルカナーゼ。
実施例３２Ｈのためにｃ　ＤＮＡでスクリーニングする
。ラムダクローンを単離し、このラムダクローンのＩｋ
ｂのＥ！ｃｏＲ１＠片を、上記の実施例３２Ａに記載さ
れたようにＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔにサブクワ−７化する
。ブルースクリプトクローンはｐＢＳＧＬ６ｅと命名さ
れる。
５、植物の安定な形質転換及び発生 植物組織を上記のように、当該技術分野で公知のあらゆ
る技術によりベクターで形質転換する。　ＤＮＡの植物
細胞への転換に使用されるそのような方法、例えば、植
物体、植物組織または植物細胞の、＾、ｔｕｍｅｆａｃ
ｉｅｎｓ（Ｉ（ｏｒｓｃｈ、Ｒ，Ｂ、ｅＬ　ａｌ。
、５ｃｉｅｎｃｅ　２２５＋１２２９（１９８５）　；
　Ｍａｒｔｏｎ、Ｌ、、Ｃｅ１ｌＣｕｌＬｕｒｅ　ａｎ
ｄ　Ｓｏ＋ｗａｔｉｃ　Ｃｅ１ｌ　（＋ｅｎｅｔｉｃｓ
　ｏｆ　Ｐｌａｎｔｓ、Ｖｏｌ、　１，３１４〜５２１
．１９８４）による直接の感染またはコカルチベーショ
ンによる感染は、下記の文献に記載されたような方法に
よる外因性ＤＮＡでのプロトプラストの処理を含む：　
Ｐａｓｚｋｏｗｓｋｉ、Ｊ、ｅｔ、ａｌ、、ＥＭＢＱ　
Ｊ、　３．２７１７（１９８４）　　：　ＩＩ！Ｐ−Ａ
　０１６４５７５　；　５ｈｉｌｌｉｔｏ、Ｒ，Ｄ、　
ｅｔ　ａｌ、、Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ　３＋　
１０９９　（１９８５）　；　Ｐｏｔｒｙｋｕｓ、１．
ｅｔ　ａｌ、＋５ｕｐｒａ；Ｌｏｅｒｚ、１１．ｅｔ　
ａｌ、、Ｍｏ１．Ｇｅｎ、Ｇｅｎｅｔ、　１９９＋　１
７８（１９８５）　　ＨＦｒｏｎｕ＋＋、Ｍ、　ｅｔ　
ａｌ、、　　５ｕｐｒａ　　；ＧＢ　２＋１４０８２２
　　；及びＮｅｇｒｕｔｉｕ、１．ｅｔ　ａｌ、、　Ｐ
ｌａｎｔ　Ｍｏｌ。
Ｂｉｏｌ、　８．３６３　（１９８７）　　ｉポリエチ
レングリコール（ＰＥＧ）によるインキュベーシヨン（
Ｎｅｇｒｕｔｉｕ。
１、　ｅＬ、ａｓ、＋５ｕｐｒａ）　；マイクロインジ
ェクション（Ｒｅｉｃｈ、Ｔ、Ｊ、ｅｔ　ａｌ、、Ｂｉ
ｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ　４，１００Ｉ−１００４（
１９８６）　　；　Ｒｅ１ｃｈ、Ｔｊ、ｅｔ　ａｌ、、
Ｃａｎ、　Ｊ、Ｒｏｔ。
６４．１２５９−１２６７（１９８６））、マイクロプ
ロジエクチル　ボンバードメント（ＫＩｅｉｎ＋　Ｔ、
Ｍ、ｅｔ　ａｌ、、Ｎａｔｕｒｅ　３２７．７０．　（
１９８７））。
実施例３３八ｇｒｏｂａｃｔｅｒｔｕｍ　　の形質転換
ｐｃＩＢ２７０（実施例１６）　、ｐｃＩＢ２７１　、
ｐｃＩＢ２７２及びｐｃＩＢ２７３　（実施例１９０　
、　Ｅ及びＦ）プラスミドＤＮＡを塩化セシウムエチジ
ウムブロマイドグラディエント上で精製し、ヘルパープ
ラスミドｐＣＩＢ５４２を含有する形質転換体＾、　ｔ
ｕａ＋ｅｆａｃｉｅｎｓ菌Ａ１３６に、Ｈｏ１ｓｔｅｒ
ｓ＋Ｍ、　ｅｔ　ａｌ、＋Ｍｏ１．　Ｇｅｎ、　Ｇｅｎ
ｅｔ。
１６３、１８１−１８７（１９８７）に使用して、菌Ｃ
ｌＢ２７０、ＣｌＢ２７１、ＣｌＢ２７２及びＣｌＢ２
７３を得る。
同じ方法を用いて、プラスミドｐｃＩＢ２７１　、ｐＣ
ＩＢ２７２及びｐｃＩＢ２７３をｖｉｒｕｌｅｎｔ　Ａ
、ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ菌１５９５５．Ａ２０８．Ａ
２８１及びＡ、　ｒｈｉｚｏｇｅｎｅｓ　５ｔｒａｉｎ
Ａ４に形質転換し、ｐｃＩＢ２７１　Ｘ　１５９５５　
、ｐｃＩＢ２７ＩＸ　　Ａ２０８、　ｐｃＩＢ２７１　
　Ｘ　　Ａ２８１、　ｐｃＩＢ２７１　　Ｘ　　Ａ４、
　ｐＣＩＢ２７２　　Ｘ　　１５９５５　　、　ｐｃＩ
Ｂ２７２　　Ｘ　　八２０８、　ｐｃＩＢ２７２　　Ｘ
　　八２８１、ｐｃＩＢ２７２　Ｘ　Ａ４、ｐｃＩＢ２
７３　Ｘ　１５９５５　、ｐｃ［Ｂ２７３　Ｘ　Ａ２０
Ｂ、ｐＣＩＢ２７３　Ｘ　Ａ２８１及びｐｃＩＢ２７３
　Ｘ　Ａ４を製造する。
八ｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ　５ｔｒａｉｎ　ＣｌＢ５
４２は、プラスミドのカナマイシンマーカーがＴｎ７の
スペクチノマイシン／ストレプトマイシン部位に置き換
わっている菌ＥＩＩＡＩＯＩ（Ｈｏｏｄ　ｅｔ　ａｌ、
、Ｊ、Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ、１６８．１２９１−１３０
１　（１９８６））である。
実施例３４　　タバコの葉の円板形質転換ｉ奏アグロバ
クテリウム菌ＣｌＢ２７０、ＣｌＢ２７１、ＣｌＢ２７
２及びＣｌＢ２７３を、ｐｕｓ、６に合わせられたグル
タミン酸塩培地中で、１８〜２４時間生育させ、それら
の抗生物質を含まない同じ培地中での００．。。
が０．２となるように希釈される前に、０．１５％マン
ニトール、５０　ｕ　ｇ／ｖｐｌカナマイシン、５０　
ｕ　ｇ／　ｒｕｎスベクリノマイシン及び１■／ｍｌス
トレプトマイシンを追加する。その後、バクテリアを、
Ｈｏｒｓｃｈ、Ｒ，ｅｔ　　ａｌ、、５ｃｔｅｎｃｅ　
　２２７，１２２９−１２３２（１９８５）の方法の変
法に従って、ＧＡ７コンテナー中で無菌で生育させたＮ
１ｃｏｔｉａｎａ　ｔａｂａｃｕｍ　ｃｖ、　ｘａｎｔ
ｈｉの葉から打ち抜いた５〜７鴫の円板のイノキュレー
ションのために、ＯＤ、。。が０．２〜０．４の希釈に
なる前に３ないし５時間生育させる。
葉の円板を、Ｍｕｒａｓｈｉｇｅ及びＳｋｏｏｇｓメジ
ャー及びマイナー塩（ＭＳ）、ｌｌｌ１ｇ／ｌのベンジ
ルアデニン及び１■／　ｍｌのα−ナフタレン酢酸を含
む０．７％寒天上に、５０μｇ／ｍ１のカナマイシン、
１００　ｐｇ　／ｒａ１のカルベニシリン及び１００　
ｐｇ／！ＩＩｌのメツオキシンを含む同じ培地に移す前
に、２日間維持する０円板上に生じる吸技を取り出し、
吸技チップの、ＧＡ７コンテナー中の５０μｇ／ｕｄｌ
カナマイシンを含有するＭＳ培地上でのサブカルチャリ
ングにより６本の苗木が得られるまで増殖させる。
苗木を、ホルモンを含まず、５０　ａ　ｇ／ｄのカナマ
イシンを含む培地上に根づかせ、土壌に移し、フィトト
ロン中で硬化した後、化学的な調節器を備えた導入処理
のための温室に移す。開花期に、花を自家受粉させる。
種子は花が成熟したら収穫する。
導入実験及びその結果を実施例６３．６６及び第Ｈ表に
記載する。
実施例３５　　遺伝子導入タバコカルス及び植物体の製
造 アグロバクテリウムａ、ｃｒＢ２ｒｏ及び２７１を葉の
円板から生じるカルスの形質転換に使用する（実施例３
４）、カナマイシン含有ＭＳＢＮ選択培地上で生じるカ
ルスを、ＭＳメジャー、マイナー塩及びＦｅ−ＥＤＴＡ
（Ｇｉｂｃｏ　＃５００〜１１１７　；　４．３ｇ／　
ｌ＞、正ビタミン、１００■／ｌのミオイノシトール、
２０ｇ／　ｌのスクロース、２■／ｌのナフタレン酢酸
及び０．３■／ｌのキネチンからなるカルス成長培地上
で維持する。
カルスは、カルス片をＭＳＢＮ培地に移すこと及び続い
て実施例３４に記載された方法により、遺伝子導入植物
を発生させるために使用されうる。
カルスは、遺伝子の導入の測定及びそれに続く誘導化学
物質の施用に、並びに遺伝子誘導化学物質のためのスク
リーニングにも使用される。
実施例３６　　ニンジンの形質転換 菌ＣｌＢ２７０、ＣｌＢ２７１．　ＣｌＢ２７２、Ｃｌ
８２７３、ｐｃＩＢ２７１　Ｘ　１５９５５　、ｐｃＩ
Ｂ２７１　Ｘ　Ａ２０８、ｐｃＩＢ２７１　Ｘ　Ａ２８
１、ｐｃＩＢ２７１　Ｘ　Ａ４、ｐｃＩＢ２７２　Ｘ　
１５９５５　、ｐｃＩＢ２７２　ＸＡ２０Ｂ、ｐｃＩＢ
２７２　Ｘ　Ａ２８１、ｐＣＩＢ２７２　Ｘ＾４、ｐｃ
ｌＢ２７３　Ｘ　１５９５５　、ｐＣＩＢ２７３　Ｘ　
Ａ２０８、ｐＣＩＢ２７３　Ｘ　Ａ２８１及びｐｃＩＢ
２７３　Ｘ　Ａ４を実施例３４に記載されたように成長
させる。その後、００＆。。が０．２〜０．４になるま
で希釈したバクテリアを、表面を殺菌したニンジンから
の円板カットの接種に使用する。
ニンジンの表面殺菌をするために、皮を剥き、１０％の
クロロックス（ｃｈｌｏｒｏｘ）溶液中に２０分間浸漬
する。ニンジンを蒸溜水ですすいだ後、５薗の片にスラ
イスし、水寒天上に基底のサイドを上げて置く、その後
、バクテリア２０〜５０μｌを円板の上面に通用する。
７日後、円板をＭＳ塩、３％のスクロース、０．１ｒａ
ｇ／　Ｚの２．４−Ｄ　、　５０＆ｇ／ｒｄのカナマイ
シン、１００μｇ／ｍ１のカルベニシリン及び１００μ
ｇ／ＩＩｄｌのメツオキシンを含む０．７％の寒天に移
す、キャンビアル環（ｃａｍｂｉａｌ　ｒｉｎｇ）の回
りに形成したカルスを取り出し、３％のスクロース、０
．１ｍｇ＃！の２，４−Ｄ　、　５０＆ｇ／ｍＮのカナ
マイシン、１００μｇ／ｒａｆｔのカルベニシリン及び
１００　ｐｇ／ｍｌのメツオキシンを含む０．７％のＭ
Ｓ寒天に移す、カルスが成長した後、小さな片に切断し
、同じ培地の４つのプレート上に無作為に置く。このカ
ルスがプレートを満たしたら、３つのプレートに水、５
０ｍＭのサリチル酸ナトリウム、ｐＨ５，６、または２
５０μｇ／ｌのメチルベンゾ−１，２，３−チアジアゾ
ール−７−カルボキシレートを噴霧し、キメラＰＲ−１
ａ／ＧＵＳ遺伝子の発現を誘導する。
誘導実験及び結果を実施例６３及び６６に記載する。
実施例３７　　ヒマワリの形質転換 アグロバクテリウム菌ＣｌＢ２７０．　ＣｌＢ２７１．
　ＣｌＢ２７２、ＣｌＢ２７３、ｐｃＩＢ２７１　Ｘ　
１５９５５　、ｐｃＩＢ２７１　Ｘ　Ａ２０８、ｐｃＩ
Ｂ２７１　ＸＡ２８１、ｐｃＩＢ２７１　Ｘ　Ａ４、ｐ
ｃＩＢ２７２Ｘ　１５９５５　、ｐｃＩＢ２７２　Ｘ　
Ａ２０Ｂ、ｐＣＩＢ２７２　Ｘ　Ａ２８１゜ｐＣＩＢ２
７２　Ｘ　Ａ４、ｐｃＩＢ２７３　Ｘ　１５９５５　、
ｐｃｉＢ２７３　ＸＡ２０８、ｐＣＩＢ２７３　ＸＡ２
８１及び９ＣＩＢ２１３　Ｘ　Ａ４を実施例３４に記載
されたように成長させる。その後、００、。。が０．２
〜０．４になるまで希釈したバクテリアを、下記のよう
に製造されたヒマワリ植物の茎への接種に使用する。
ヒマワリの種子を１０％のカプタンに１０分間、続いて
１０％のクロロックスに１０分間浸漬した後、蒸溜水で
すすぐ。種子被膜を除去し、種子を０゜７％の水寒天上
で、３日間暗くして発芽させ、その後、２３°Ｃのラブ
リンインキュベーターセット中に置き、１２時間で昼と
夜を交代する。苗木は１週間で育ち、その後、切断した
茎の表面にバクテリアのデキャピテーシゴン及び接種を
行つ。
１週間後、ＣｌＢ２７０．　ＣｌＢ２７１．　ＣｌＢ２
７２またはＣｌＢ２７３を接種した茎を切断し、ＭＳ塩
、３％のスクロース、２　ｍｇ　／　ｍｌのα−ナフタ
レン酢酸、１ｍｇ／ｍｌの６−ベンジルアミノプリン、
１００　ｐｇ／ｍ２のカルベニシリン、１００　μｇ／
ｍｌのメツオキシン及び５０＆ｇ／ｍのカナマイシンを
含む０．７％寒寒天上直置、　ｐｃＩＢ２７１　Ｘ　１
５９５５　、ｐｃＩＢ２７１　Ｘ　Ａ２０８、ｐｃＩＢ
２７１　Ｘ　Ａ２８１、ｐｃＩＢ２７１　Ｘ　Ａ４、ｐ
ＣＩＢ２７２Ｘ　１５９５５　、ｐＣＩＢ２７２　Ｘ　
Ａ２０Ｂ、ｐｃＩＢ２７２　Ｘ　Ａ２８１、ｐｃＩＢ２
７２　Ｘ　Ａ４、ｐｃＩＢ２７３　Ｘ　１５９５５　、
ｐｃＩＢ２７３　ＸＡ２０８、ｐｃＩＢ２７３　Ｘ　Ａ
２８１及びｐｃＩＢ２７３　Ｘ　Ａ４を接種した茎を切
断し、ＭＳ塩、３％のスクロース、１００μｇ／Ｉｄの
カルベニシリン及び１００μｇ／−のメツオキシンを含
む０．７％寒天上に置く。カルスを新鮮な培地に、２週
間毎に充分な量が４個の板に得られるまで移す。ピルレ
ントアグロバタテリウム菌から生長したカルスの半分を
、ホルモンを含まず、５０μｇ／ｍのカナマイシンを含
む培地に移す。カナマイシンの存在下または不存在下で
生長した充分なカルスが得られた後、形質転換したニン
ジンのカルスのために、上記の方法のように、誘導のた
めの処理を行う。
実施例３８トマトの形質転換 アグロバクテリウム菌ＣｌＢ２７０、ＣｌＢ２７１、Ｃ
ｌＢ２７２、ＣｒＢ２７３、ｐｃＩＢ２７１　Ｘ　１５
９５５　、ｐｃＩ８２７１　Ｘ　Ａ２０８、ｐｃＩＢ２
７１　Ｘ　Ａ２８１、ｐｃＩＢ２７１　Ｘ　Ａ４、ｐＣ
ＩＢ２７２Ｘ　１５９５５　、ｐｃＩＢ２７２　Ｘ　Ａ
２０８、ｐｃＩＢ２７２　Ｘ　Ａ２８１、ｐｃＩＢ２７
２　Ｘ　Ａ４、ｐｃｉＢ２７３　Ｘ　１５９５５　、ｐ
ｃＩＢ２７３　ＸＡ２０８、ｐ（ｊＢ２７３　Ｘ　Ａ２
８１及びｐｃＩＢ２７３　Ｘ　Ａ４を実施例３４に記載
されたように成長させる。その後、０口、ｌ）。が０．
２〜０．４になるまで希釈したバクテリアを、下記のよ
うに製造されたトマトの苗木の茎への接種に使用する。
トマトの種子を１０％のクロロックスに１０分間浸漬し
た後、蒸溜水ですすぐ。種子を、０．７％の水寒天上で
、３日間暗くして発芽させ、その後、２３゛Ｃのラブリ
ンインキュベーターセット中に置き、１２時間で昼と夜
を交代する。苗木は１週間で育ち、その後、切断した茎
の表面にバクテリアのデキャピテーション及び接種を行
う。
１週間後、ＣｌＢ２７０、ＣｌＢ２７１、ＣｌＢ２７２
またはＣｌＢ２７３を接種した茎を切断し、ＭＳ塩、３
％のスクロース、２■／ｄのα−ナフタレン酢酸、１ｍ
ｇ／滅の６−ベンジルアミノプリン、１００　μｇ７ｍ
ｌのカルベニシリン、１００μｇ／ｄのメツオキシン及
び５０μｇ７ｍｌのカナマイシンを含む０．７％寒天上
に置く。ｐｃＩＢ２７１　Ｘ　１５９５５　、ｐｃＩＢ
２７１　Ｘ　Ａ２０８、ｐｃＴｒ＋２７１　Ｘ＾２８Ｌ
　ｐｃＩＢ２７１　Ｘ　Ａ４、ｐｃＩＢ２７２Ｘ　　１
５９５５　　、　ｐＣＩＢ２７２　　Ｘ　　Ａ２０８、
　ｐｃＩＢ２７２　　Ｘ　　Ａ２８１、ｐｃＩＢ２７２
　Ｘ　Ａ４、ｐｃＩＢ２７３　Ｘ　１５９５５　、ｐｃ
ＩＢ２７３　ＸＡ２０８、ｐＣＩＢ２７３　Ｘ　Ａ２８
１及びｐｃＩＢ２７３　Ｘ　Ａ４を接種した茎を切断し
、正塩、３％のスクロース、１００μｓ／ｄのカルベニ
シリン及び１００μｇ／ｍｌｌのメツオキシンを含む０
．７％寒天上に置く。カルスを新鮮な培地に、２週間毎
に充分な量が４個の板に得られるまで移す。ピルレント
アグロバクテリウム菌から生長したカルスの半分を、ホ
ルモンを含まず、５０μｇａｔｅρのカナマイシンを含
む培地に移す。カナマイシンの存在下または不存在下で
生長した充分なカルスが得られた後、形質転換したニン
ジンのカルスのための上記の方法のように、誘導のため
の処理を行う。
実施例３９　　ワタの形質転換 アグロバタテリウム菌ＣｌＢ２７０、ＣｌＢ２７１、Ｃ
ｌＢ２７２、ＣｌＢ２７３、ｐｃＩＢ２７１　Ｘ　１５
９５５　、ｐｃＩＢ２７１　Ｘ　Ａ２０８、　ｐｃｌＩ
Ｉ２７１　　Ｘ　　Ａ２８１、　ｐｃＩＢ２７１　　Ｘ
　　Ａ４、　ｐｃＩＢ２７２Ｘ　　１５９５５　、ｐｃ
ＩＢ２７２　Ｘ　Ａ２０８、ｐｃ［Ｂ２７２　Ｘ　Ａ２
８１、ｐｃＩＢ２７２　Ｘ　Ａ４、ｐＣＩＢ２７３　Ｘ
　　１５９５５　、ｐｃＩＢ２７３　ＸＡ２０８、ｐｃ
ｉ８２７３　Ｘ　Ａ２８１及びｐｃｉＢ２７３　Ｘ　Ａ
４を実施例３４に記載されたように成長させる。その後
、ＯＤｌ、。。が０．２〜０．４になるまで希釈したバ
クテリアを、下記のように製造されたワタの使用への接
種に使用する。
ワタの種子を１０％のりＯｒ：ｊックスに２０分間浸漬
した後、蒸溜水ですすぐ。種子を、０．７％の７に寒天
上で、暗所にて発芽させる。苗木は１週間で育ら、その
後、子葉の表面にバクテリアの接種を行う。
接種された子葉からカルスを形成させ、切断し５た後、
ＭＳ塩、３％のスクロース、１００　ｕｇ／ｍｌのカル
ベニシリン及び１００　μｇ／戚のメツオキシンを含む
０．７％寒天上に置く。カルスを新鮮な培地に、３週間
毎に充分な量が４個の板に得られるまで移す。ピルレン
トアグロバクテリウム菌から生長したカルスの半分を、
ホルモンを含まず、５０μｇ／ｍｌのカナマイシンを含
む培地に移す。カナマイシンの存在下または不存在下で
生長した充分なカルスが得られた後、形質転換したニン
ジンのカルスのための上記の方法のように、誘導のため
の処理を行う。
実施例４０トウモロコシ（Ｚｅａ　Ｍａｙｓ）、エライ
トインブレッド　ライン　フンク（Ｅｌｉｔｅ　Ｉｎｂ
ｒｅｄｌｉｎｅ　Ｆｕｎｋ）２７１７の、特別なタイプ
のカルスの製造 インブレッド　ライン　フンク２７１７のトウモロコシ
植物を生長させて、温室内で開花させ、自家受粉させる
。約２〜２，３１の長さの胚を含むインメーチャーイア
ー（Ｉｍｍａｔｕｒｅ　ｅａｒｓ）を、Ｍ物体から除去
し、１０％のり００ソクス溶液中で２０分間消毒する。
胚を無菌で仁から除去し、胚軸の下方でＯ，１ｍｇ／　
１の２．４−Ｄ　、６％（ｗ／ν）スクロース及び２５
Ｉｌ１Ｍのし一プロリンを含み、０．２４％輛／ν）の
Ｇｅ１ｒｉｔｅ　”で固化された０ＭＳ培地（初期培地
）上に置く。２７℃で、暗所にて２週間の培養の後、小
鱗片上で発達するカルスを胚から除去し、０，３ｍｇ／
　１の２．４−Ｄを含み、０．２４％の（ｗ／ｖ）のＧ
ｅ１ｒｉＬｅ　”で固化されたＢ５培地上に置＜　（Ｇ
ａｍｂｏｒｇ、Ｏ，Ｌ、　ｅｔ　ａｌ、、Ｅｘｐｅｒｉ
ｍｅｎｔａｌ　Ｃｅ１ｌ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ　５０．１
５１〜１５８　（１９６８））　、カルスを２週間毎に
新しい培地で継代培養する。胚を初期培地に置いてから
合計８週間後、特別なタイプのカルスが特徴的な形態に
より確認される。このカルスは、さらに同じ培地上で継
代培養する。
さらに２力月後、カルスを、２ｍｇ／ｌの２．４−〇を
含有し、Ｇｅ１ｒｉｔｅ　”で固化されたＮ６培地上で
連続して継代培養する。
実施４Ａ４１トウモロコシ（Ｚｅａ　Ｍａｙｓ）、エラ
イトインブレッド　ライン　フンク（Ｅｌｉｔｅ　Ｉｎ
ｂｒｅｄｌｉｎｅ　Ｆｕｎｋ）２７１７の懸濁培養液の
製造実施例４０に記載されたカルスを少なくとも合計６
力月継代培養する。継代培養に選択されたカルスの型は
、比較的非粘質で、顆粒状で、そして非常に脆く、小さ
な個々の細胞凝集体に分離され、液体培地上に置かれる
。大きく、細胞の広がった凝集体を含有する培養体は保
持されない。トウモロコシ　エライト　インブレッドフ
ンク２７１７の特別なカルスのアリコート約５００■を
、１２５７ｄのプロング（Ｄｅｌｏｎｇ）フラスコ中の
２ｒＲｇ／Ｎの２．４−Ｄを含有するＮ６培地３０ｄに
置く。ジャイレトリー　シェーカー（１３０ｒｐｍ、　
２゜５　ａｍ　ｔｈｒｏｗ）上で暗所にて２６°Ｃで１
週間培養した後、培地を新しい培地に置き換える。この
方法で、懸濁液をさらに１週間継代培養する。その時間
に培養体が調べられ、そこには大量の広がって細胞は保
持されていない。大きな広がった細胞を伴う凝集体を含
む懸濁培養液は捨てられる。好ましい組織は、普通のタ
イプの細胞凝集体よりも特別に滑らかな表面を有する、
細胞凝集体を分割する密度の高い細胞質からなる。
保持された培養体は、これらの小さな凝集体内に代表さ
れる少なくとも５０％の細胞を有する。
これは望ましい形態である。これらの懸濁液も、１週間
よりも少ない倍増時間の急速な生長率を有する。懸濁培
養は０，３　ｄのＰＣＶ　（詰められた細胞容量：ピペ
ット中に保持された細胞容りを新しい培地２５１ｄ！に
移すことにより、週毎に継代培養される。この方法での
４ないし６週間の継代培養の後、培養体は、週毎の継代
培養当たり２ないし３倍に増加した。７５％より多い細
胞が望ましい形態である培養液がさらに継代培養のため
に保持される。ラインは常時、内容物が最も良い形態を
示すフラスコを継代培養に選択することにより維持され
る。各々の場合、２週間毎に、孔径６３０μｍのステン
レン鋼性篩を通しての定期的な篩過を用いると、培養液
の分散が増加するが、これは必要ではない。
実施例４２　Ｚｅａ　Ｍａｙｓの懸濁培養液からのプロ
トプラストの製造 実施例４１のように製造された懸濁培養細胞のＰＣＶ　
ｌ〜１，３　ｄを、４％（ｗ／ｖ）　セＪＬｔラーゼＲ
Ｓを含み、ＭＭＣ（８，６５ｇ／　１のＫＣＬ　、　１
６．４７ｇ／　ｊ！のＭｇＣｈ　　−６Ｈ２０及び１２
，３ｇ／　ｌのＣａＣ１ｇ　　・２ｔｌｚＯ１５ｇ／ｌ
　ＭＥＳ、ｐＨ５，６）塩の溶液中の１％（Ｗ／ｖ）の
ロジム（Ｒｈｏｚｙｍｅ）を有するフィルター−殺菌混
合物１０〜１５１１Ｉｉ中でインキュベートする。消化
は、ゆっくり揺れるテーブル上、３０°Ｃで３〜４時間
実施される。標本は、逆にされた顕微鏡の下で、プロト
プラストの放出についてモニターされる。
放出されるプロトプラストは下記のように集められる：
標本は、１００μｍメツシュの篩、続いて５０μｍの篩
を通して篩遇される。プロトプラストを篩を通して、も
との酵素溶液の容量に等しいＫＭＣ塩溶液の量で洗浄−
る。１ＯＲ１のプロトプラスト標本を各々のいくつかの
棄却可能のプラスチックの遠心分離管内に入れ、１，３
〜２−の０．６Ｍスクロース溶液（０，１％（ｗ／ｖ）
モルホリノエタンスルホン酸（？ＩＥＳ及びＫＯＪｌ）
で緩衝したもの）を下方の層とする。管を６６０−１Ｏ
０Ｘ　　で１０分間遠心分離にかけ、界面のプロトプラ
ストバンディングをピペットを用いて集め、新しい管に
入れる。プロトプラスト標本を新しいＫＭＣ塩溶液１０
ｄに再懸濁し、６６０−１Ｏ０ｘで５分間遠心分離にか
ける。上清液を除去して棄却し、そしてプロトプラスト
をドロップリメイニングに穏やかに再懸濁し、その後、
１３／１４強さのＫＭＣＩＭの溶液を徐々に添加する。
再び５分間遠心分離にかけた後、上清液を再び除去し、
プロトプラストを６／７強さのＫＭＣ溶液中に再懸濁す
る。アリコートを計数のために取り出し、そしてプロト
プラストを再び遠心分離により沈澱させる。プロトプラ
ストを、ＫＭ−８９媒体（第１表）中、または６ｍＭの
ＭｇＣ１ｇを含む０，３Ｍのマンニトール中、まただ下
記の実施例に記載されるような形質転換に使用される他
の適当な媒体中で、１ｍｌあたり１０’　（１千万）で
再懸濁する。
このプロトプラスト懸濁液を形質転換のために使用し、
実施例４３及び４４に記載されたように培養する。
実施例４３　　エレクトロポレーションによるＺｅａＭ
ａｙｓ　Ｐｒｏｔｏｐｌａｓｔｓの形質転換Ａ、熱衝撃
以外の全ての工程は、室温（２２〜２８’Ｃ）で実施さ
れる。実施例４２の最後の工程で、プロトプラストは０
．１％（ｗ／ｖ）ＭＢＳ　　及び６ｍＭのＭｇＣ１，を
含有する０、５門のマンニトール中に再懸濁される。こ
の懸濁液の抵抗はＤｉａｌｏｇ　Ｅｌｅｃｔｒ。
ｐｏｒａｔｏｒ　（ＤＩＡ−ＬＯＧ　Ｇ、ｍ、ｂ、Ｈ，
、ドイツ連邦共和国。
Ｄ−４０００デユツセルドルフ１３）のチェンバー内で
測定され、３００ｍＭのＭｇＣＩｇ溶液を用いて１〜１
．２ｋＯｈｍに合わせられる。プロトプラストは、サン
プルを含有する管を４５°Ｃの水浴に５分間浸漬するこ
とにより熱衝撃を受け、その復水により室温に冷却され
る。Ｒｏｔｈｓｔｅｉｎ＋Ｓ、Ｊ、　ｅｔ　ａｌ、＋５
ｌｕｐｒａ　　に記載されたような植物選択性ヒグロマ
イシン抵抗性遺伝子及び実施例１９ないし３１に記載さ
れたようなキメラ遺伝子構造を含有する線状化プラスミ
ド４μｇ、並びにウシ胸腺キャリヤーＤＮＡを、この懸
濁液０．２５ｍｆｆ１のアリコートに添加する。３０Ｉ
ｌ１ＭのＭｇＣ１ｇを含有する０、５Ｍのマンニトール
中の２４％（Ｗ／Ｖ）のポリエチレングリコール（ＰＥ
Ｇ）溶液（Ｍ賀８０００）　０．１２５ｄをプロトプラ
ストに添加する。混合物を充分に、しかし穏やかに混合
し、１０分間インキュベートする。サンプルをエレクト
ロボレーターのチェンバーに移し、サンプルの初期電圧
１５００．１８００．２３００または２８００Ｖｃｎ＋
−’で、そして１０ｇ秒の指数崩壊時間で、ｌＯ秒間隔
で３回パルスを与える。
下記のようにプロトプラストを培養する。サンプルを６
ｃｍのベトリ血中に室温で延べる。さらに５〜１５分後
、５ｅａＰｌａｑｕｅアガロースを１．２％（ｗ／ｖ）
及び２．４−Ｄを１■／２含有するＫＭ−８１３培地３
ｄ（第１表、　５ｕｐｒａ）を添加する。アガロース及
びプロトプラストを充分に混合し、培地をゲル化させる
。
Ｂ、実施例４３Ａを下記の変法の１個またはそれ以上を
用いて繰り返す。
（１））プロトプラスト標本の抵抗を０，３〜０．７ｋ
Ｏｈｍに合わせる。
（２）使用するＰＥＧが、分子量４０００のＰＥＧであ
る。
（３）　　ＰＥＧを使用しないか、または１２％の１，
３倍容量のＰＥＧを添加する。
（４）パルスを３秒間隔で適用する。
（５）　　エレクトロポレーションの後、プロトプラス
トを温度１６゛Ｃに冷却したプレート上に置いた皿に延
べる。
（６）　　プロトプラストをエレクトロボレーション工
程の後、管内に置き、６／７の強さのＫＭＣ溶液１０ｄ
またはＷ５溶液（ＫＣＩ　３８０ｍｇ／　ｌ、　ＣａＣ
１ｚ　　、２Ｈｚ０１Ｂ、　３７５ｇ／　ｌ５ＮａＣ１
９ｇ／　ｌ、グルコース９ｇ／　ｌ、ｐＨ６，０）で洗
浄し、その後、６０ｇで１０分間の遠心分離により集め
、０．３　ｄのＫＭ培地中に再懸濁し、Ａに記載したよ
うに延べる。
（７）　　ウシ胸腺担体ＯＮへを添加しない。
実施例４４　　ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）での
処理によるＺｅａ　Ｍａｙｓプロトプラストの形質転換
実施例４２の最後の工程で、プロトプラストを０．１％
（ｗ／ｖ）ＭＥＳ　　及び６ｍＭのＭｇＣ１，を含有す
る０、５Ｍのマンニトール中に再懸濁する。実施例４３
に記載したように、４５°Ｃで５分間の熱衝撃を与える
。プロトプラストを遠心分離管中で形質転換のためのア
リコートに分散し、管１個あたり０．３ｍｌの懸濁され
たプロトプラストが存在する。
次の１０分間の間に、下記のもの：ＤＮＡ（実施例４３
）及びポリエチレングリコール（ＰＥＧ）溶液（ＭＷ６
０００．４０％（ｗ／ｖ）　　；　０．　ＬＭのＣａ　
（ＮＯ３）　ｚ及び０．４Ｍのマンニトール含有、　Ｋ
ＯＩ（でｐ］１８〜９に調製）を添加し、最終濃度２０
％のＰＥＧを与える。アリコートを時々震盪しながら３
０分間インキュベートし、その後、プロトプラストをペ
トリ皿（直径６ｃｍの皿あたり０．３ｍｌのオリジナル
プロトプラスト懸濁液）に置き、実施例４３に記載した
ように培養する。
Ｂ、　実施例４４　Ａ　　を繰り返し、実施例４４Ａの
ＰＥＧ溶液中で３０分間インキュベートした後、０．３
−〇−５溶液を２ないし３分間隔で５回添加することに
より、プロトプラストを洗浄する。プロトプラスト懸濁
液を遠心分離にかけ、上清液を除去し、その後プロトプ
ラストを実施例４３Ａのように培養する。
Ｃ，ＰＥＧの最終濃度を１３％（ｗ／ｖ）と２５％（ｗ
／ｖ）との間とする変法で、実施例４４＾及び４４Ｂを
繰り返す。
実施例４５　１０ドブラストからのカルスの再生アガロ
ース中にプロトプラストを含有するプレートを２６°Ｃ
で暗所に置り、１４日後、コロニーがプロトプラストか
ら発生する。コロニーを含有するアガロースを、２ｍｇ
／ｌの２．４−Ｄを含み、０．２４％（ｗ／ｖ）のＧｅ
１ｒｉｔｅ　’で固化されたＮ６培地（第１表、５ｕｐ
ｒａ）３０　ｍｌを含有する直径９ｃｍのペトリ皿の表
面に移す、この培地を、２Ｎ６として示す。カルスをさ
らに２６°Ｃで暗所にて培養し、カルス片を、２週間毎
に新しい固体の２Ｎ６培地に継代培養する。
実施例４６　Ｚｅａ　Ｍａｙｓの形質転換されたカルス
の選択 形質転換された細胞を選択するために、１００ｍｇｅｌ
または２００ｍｇ／　１のヒグロマイシンＢを２Ｎ６培
地に添加する変法を用いて、実施例４５を繰り返す。
実施例４７　　コーン植物の再生 ＾、　カルスを２Ｎ６培地上及び０Ｎ６（２，４−Ｄを
含まないＮ６培地）上並びに８６１培地（０，２５ｍｇ
／　ｌの２゜４−ロ及び１０ｍｇ／　１のキネチンを含
むＮ６培地からなる）上に保存のために置き、再生を開
始するＯＮ６上で生長するカルス及びＮ６１培地は明所
中で生長する（白色螢光燈からの１０〜１００μＥｉｎ
ｓｔｅｉｎｓ／ｍ”秒の光を１６時間／日照射する）　
、　Ｎ６１培地上での長い時間は有害であるので、２週
間後、Ｎ６１培地上で生長しているカルスをＯＮ６培地
上に移す。カルスを、例えカルスが同じ培地配合物上に
再び移されるべきであっても、２週間毎に継代培養する
。植物体は、約４ないし８週間で現れる。植物体が少な
くとも２ＣＩの高さになったら、それらをＧＡＴ中のＯ
Ｎ６培地に移す。
２ないし４週間で根が生じ、根が生長を支えるのに充分
に形成されたように見えたら、植物体を、最初の４ない
し７日間光のシェードの下で、ビートポット中の土に移
す。ハードニングオフをアシストするために２ないし３
日間移植した植物の上から明るいプラスチックのカップ
を被せることは、しばしば有用である。−度植物体が確
立されたら、それらは通常のコーン植物と同様に処理さ
れ、温室内で成熟した状態まで生長する。子孫を得るた
めに、植物は自家受粉するか、または野性種と交配する
。
Ｂ、実施例４７Ａを１１００Ｉｌ１／ｆまたは２００　
ｍｇ／　ｊ２のヒグロマイシンＢをカルスを維持するた
めに使用される培地に添加させる変法で繰り返す。
実施例４８　　ダクチリス　グロメラタ　エル。
（Ｄａｃｔｙｌｉｓ　Ｇ１ｏ＊ｅｒａｔａ　Ｌ、　）（
カモガヤ）の組織からの胚形成懸濁液の製造 胚形成カルスは、温室内で育ったカモガヤ植物（ダクチ
リス　グラメラタ　エル、）の最も若い葉の基底部分か
ら、Ｈａｎｎｉｎｇ、　Ｇ、Ｅ、ｅｔ　ａｌ、＋Ｔｈｅ
ｏｒ、　Ａｐｐｌ、　Ｇｅｎｅｔ、、　６３．１５５−
１５９　（１９８２）に記載されたように開始する。葉
を、１：１０の希釈率のクロロックス溶液（次亜塩素酸
ナトリウム５．２５％（＆４／い　；クロロックスカン
パニー、オークランド、カリフォルニア）中に約１０分
間浸漬することにより表面消毒し、その後直径または長
さが１ないし５ｍｍである小さな片に無菌で切断する。
これらの片を、ゲル過剤として０．８％（ｗ／ｖ）のア
ガロースを含有する無菌のＳｌ＋−３０培地上に置く。
約２５゛Ｃで培地上に植えつけてから２ないし６週間以
内にカルス及び／または胚形成構造物が現れる。胚形成
カルスを２ないし４週間毎に新しいＳＨ−３０培地に継
代培養し、暗所にて２５°Ｃで培養することにより維持
する。
Ｂ、　胚形成懸濁培養を約０，３ｇ　　の新しい重量の
胚形成カルスをＧｒａｙ、Ｄ、Ｊ、ｅｔ　ａｌ、、Ｐｌ
ａｎｔ　Ｃｅ１ｌ　Ｔｉ５ｓｕｅ　Ｏｒｇａｎ　Ｃｕ１
ｔ、、　４＋　１２３−１３３　（１９８５）に記載さ
れた、４５μ門のｄｉｃａｍｂａ及び４ｇ／ｉ！、のカ
ゼインヒドロリセートを含有する液体培地５０ｍ２に置
くことにより開始する。懸濁培養液を２７°Ｃで、１６
時間明所（４０μＥ／ｌ１１２秒）及び８時間暗所の光
同期で、ジャイラトリーシェーカー上で、約１３０ｒｐ
Ｉ１まで、金属キャップ及びパラフィルム（ｐａｒａｆ
ｉＩｌｌ）　”で封した１２５ｍＮのプロングフラスコ
中で生長させる。約４週間後、大きな塊を約３０秒間放
置し、小さな細胞崩壊物を含有する上清液の１０−のア
リコートを除去し、５０ｍＲの新しい培地に移す、この
方法を、より小さなりランプサイズ及び小さな細胞質を
ベースとしてより良好な品質の点で最も成功した培地を
用いて３ないし４週間毎に繰り返す。５ないし８回の移
しかえの後、懸濁液は非胚形成細胞を実質的に含まず、
胚形成細胞クラスターの大多数きわめて小さい（１５０
ないし２０００μｍ）。
実施例４９　　ダクチリス　グロメラタ　エル（Ｄａｃ
ｔｙｌｉｓ　Ｇｌｏｍｅｒａｔａ　Ｌ、）プロトプラス
トの単離及び精製 実施例４８の胚形成懸濁培養液から、細胞をＮａｌｇｅ
ｎｅ　”　０．２μｍフィルターユニットで無菌的に濾
過し、その後、０，３ｇ　　のフレッシュウェイト細胞
をペトリ皿中の各々１２，３ｄのプロトプラスト酵素混
合物に添加することにより、製造する。酵素混合物は、
２％（ｗ／ｖ）セルラーゼＲＳ、７ｍＭのＣａＣＩｚ　
ｘＨｚＯ，０，７１１ＩＭのＮａＨｚＰＯａ　ＸＨｚＯ
１３ＩＩＩＭの阿ε５（ｐＨ５，６）　、グルコース（
ＰＨ５，６の５５０ｍＯｓＺｋｇ　ＨｚＯ）からなり、
フィルター殺菌されている。該混合物をオービタルシェ
ーカー中、約５０ｒｐｍでほの暗い光（＜　５　μＥ／
ｍ”秒）中で、約４ないし５時間渦巻かせる。その後、
消化物をステンレス鋼篩（１００μｍメツシュサイズ）
を通して篩遇し、そして約６０ないし１００ｇ　　で約
５分間の遠心分離にかける。その後、沈澱を含むプロト
プラストをグルコースで５５０ｍＯｓ／ｋｇ　ＨｚＯに
合わせたプロトプラストカルチ十−培地ＫＭ−８ｐで３
回洗浄する。この点で、浮上工程はプロトプラストの他
の精製のために含まれうる。この場合において、洗浄さ
れたプロトプラストを、スクロースで７００＋＋＋Ｏｓ
／ｋｇ　ＩＩｚＯに合わせたＫＭ−８ｐ培地１ＯＩＩｉ
ノ最上層に積層する。６０−１００　Ｘ　ｇで約１０分
間の遠心分離の後、界面のプロトプラストバンディング
をファインピペットを用いて集める。最後に、プロトプ
ラストを１ないし２燻のＫＭ−８ｐ培養培地１〜２　ｍ
ｆｌ中に再懸濁し、ステンレスメツシュスクリーン（２
０μｍメツシュサイズ）を通して篩過する。放出された
プロトプラストを集め、洗浄し、その後、培養のための
ＫＭ−８ｐ培地、または実施例５１ないし５３による形
質転換に適する浸透圧的に合わせた培地中に再懸濁する
。
実施例５０　　ダクチリス　グロメラタ　エル、プロト
プラスト培養液及びカルスの生長 Ａ、　精製したプロトプラストを、１．３％（ｗ／ｖ）
の５ｅａＰＩａｑｕｅ　”　　アガロース（ＦＭＣＣｏ
ｒｐ、＋　Ｍａｒｆｎｅ　Ｃｏ１１ｏｉｄｓ　Ｄｉｖｉ
ｓｉｏｎ、　Ｒｏｃｋｌａｎｄ＊　Ｍａｊｎｅ＋　ＵＳ
Ａ）及び３０ないし４０％（ｔｎ／ｖ）の調製した培地
を含むＫＭ−８９培養培地中、１−当たり約５ＸＩＱ’
のプロトプラストの密度で置く。その後、暗所中に２８
°Ｃの定温でプレートを置く（３ないし４週齢のダクチ
リス　グロメラタ　エル、胚形成懸濁培養液から、無菌
のＮａｌｇｅｎｅ　”　０．２　ａｍフィルターを通し
て培地を濾過し、該培地をグルコースの添加により５５
０ｍＯｓｍ／ｋｇ　ＨｚＯとし、その後再びフィルター
殺菌することにより得られる）。１０ないし１４日後、
アガロースをくさび形にカットし、３　ｍｌのオリジナ
ルアガロースを埋め込んだ培養液当たり３％（ｗ／ｖ）
のスクロースを有する５Ｈ−４５懸濁培養培地２０ｍ１
を用いて、５ｈｉ１１ｉｔｏ、Ｒ，Ｄ、ｅｅ、ａｌ、、
Ｐｌａｎｔ　　Ｃｅｔｌ　　Ｒｅｐｏｒｔｓ、　　２＋
　　２４４−２４７（１９８３）により記載されたｂｅ
ａｄ　ｃｕｌｔｕｒｅ’内に置く。プレートをプラット
フォームシェーカーに置き、約５Ｏｒｐｍで８μＥ／１
ＩＩｚ秒の明所中で撹拌する。新しい懸濁培養液が生じ
、コロニーがアガロースから生長し、細胞を液体培地内
に放出する。得られた懸濁培養細胞を寒天固化５Ｈ−３
０壇地上に置き、暗所中、２５°Ｃでカルスが生じるま
で置く。
Ｂ、　プロトプラストを、培養培地が調製された培地を
含まないこと以外は上記実施例５０＾に記載されたよう
に培養する。
実施例５１　　エレクトロポレーションを用いたダクチ
リス　グロメラタ　エル、プロトプラストの形質転換 Ａ、　プロトプラストを精製した後、直ちに５ｈｉ１１
ｉｔｏ、　Ｒ，Ｄ、　ｅｔ　ａｌ、、　Ｂｉｏ／Ｔｅｃ
ｈｎｏｌｏｇｙ　３＋　１０９９−１１０３　（１９８
５）により、実施例２０に記載したような線状化プラス
ミドを用いてエレクトロボレーシランを行う、最後の洗
浄の後、プロトプラストを、エレクトロポレーション緩
衝液（０，４Ｍのマンニトール＋　６ｍＭのＭｇＣ１，
）中に、ｌｄ当たり約７ＸｌＯ”のプロトプラストの密
度で再懸濁する。プロトプラストを１０ｄのプラスチッ
クの遠心分濯管中の０．７　ｄのアリコート中に置く。
各々１０μｇ７ｍＡ及び５０μｇ／ｍｆｌの最終濃度を
与える、実施例２０のプラスミドＤＮＡ及び音波処理し
たコウシ胸腺ＤＮＡ　（σ）を、管に添加する。
その後、０．３８ｍｆｆ１のポリエチレングリコール（
ＰＥＧ）溶液（０，４Ｍのマンニトール、３０ａ＋Ｍの
ＭｇＣ１゜、０．１％（ｗ／ｖ）のＭＥＳ（ｐＨ５，６
）中の２４％（ｗ／ｖ）ＰＥＧ６０００　）を添加し、
溶液を穏やかに混合する。
プロトプラスト懸濁液をＤｉａｌｏｇ”エレクトロボレ
ーター中に移し、３２５０　Ｖ／ｃｍ初期電圧で及び１
０μ秒の指数崩壊定数で、３０秒間隔でパルスを１０回
適用する。サンプルをチェンバーから除去し、直径１０
ｃａ＋のペトリ皿中に置く。１．２％（−／ｖ）Ｓｅａ
Ｐｌａｑｕｅ”アガロースを含有するＫＭ−８ｐ培地１
ＯＩｄを添加し、プロトプラストを培地を通して偶然分
散し、そしてアガロースをゲル化させる。
Ｂ、　使用する初期電圧が３５００　Ｖ／　ｃｍ、　４
０００Ｖ／ａｍ、５０００Ｖ／ｃｍ、３０００Ｖ／ｃｍ
または２５００Ｖ／ｃｍであること以外は実施例５１４
を繰り返す。
Ｃ，ＭＷ４０００のＰＥＧまたはＭＷ８０００のＰＥＧ
を用いること以外は、実施例５１Ａ及びＢを繰り返す。
Ｄ、　　ｌ終ＰＥＧ　Ｎａ度が１０％と３０％（ｗ／ｖ
）の間であること以外は実施例５１＾ないしＣを繰り返
す。
実施例５２　　ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）での
処理によるダクチリス　グロメアタ　エル、プロトプラ
ストの形質転換 Ａ、　Ｐｆ！Ｇメディエートダイレクト遺伝子トランス
ファーをＮｅｇｒｕｔｉｕ、　１．　ｅｔ　ａｌ、、　
５ｕｐｒａ、により実施する。使用したＤＮＡは、実施
例２０に記載した線状化プラスミドである。
最後の洗浄に続いて、プロトプラストを、１５■ＨのＭ
ｇＣｈ　ヲ含有する０、５Ｍのマンニトール中に、１　
ｔｔｒｌあたり約２ＸｌＯ’の濃度で懸濁する。プロト
プラスト懸濁液を１ｌＩｉのアリコートとして１０ｍｇ
のプラスチックの遠心分離管に分散する。ＯＮＡを上記
の実施例５１に記載したように添加し、その後、ＰＥＧ
溶液０，３−を添加する（０．４Ｍマンニトール、０．
１ＭＣａ（ＮＯ３）ｚ、　ｐｉ（７，０中の４０％（−
／ｖ）　ＰＥＧ　４０００）　、溶液を穏やかに混合し
、時々震盪させながら３０分間室温（約２４°Ｃ）でイ
ンキュベートする。その後、洗浄溶液１．４−を添加し
、管の成分を穏やかに混合する。洗浄溶液は、８７ｍＭ
のマンニトール、１１５ｍＭのＣａＣ１ｚ　、２７ｍＭ
のＭｇＣｈ　、３９■ＨのＫＣＩ　、　７ｍＭのトリス
−ＨＣｌ及び１．７ｇ／　ｌのミオ−イノシトール、ｐ
ｉＥ９．０からなる。
４つの１．４　ｄの洗浄溶液のアリコートを、各々の添
加の後に混合しながら４分間隔で添加する。
その後、管を約６０×ｇで約ｌＯ分間遠心分離にかけ、
上清液を捨てる。沈澱したプロトプラストを１　ｍｌの
ＫＭ−８ｐ培養培地中で処理し、その後１０ｃｍのペト
リ皿に置＜、１．２％（ｗ／ｖ）ＳｅａＰＩａｑｕｅ　
”アガロースを含むＫＭ−８ｐ培地１０戚を添加する。
プロトプラストが培地中に適当に分散され、アガロース
がゲル化する。
Ｂ、実施例５２Ａを下記の１個もしくはそれ以上の変法
を用いて繰り返す。
（１）　　洗浄溶液のｐｌ＋を５．６または７．０に合
わせる。
（２）使用するＰＥＧがＭＷ　６０００のＰＥＧ　、　
ＭＷ　２０００のＰＥＧまたは酔８０００のＰＥＧであ
る。
（３）　　１５４ｍＭのＮａＣ１，１２５１のＣａＣ１
ｚ　、５ｍＭのグルコースからなり、ｐＨをに０１まで
６．０とした洗浄培地、０．２ＭのＣａＣ１ｚ　、０．
１％（ｗ／ｖ）のＭＥＳからなり、ｐＨをＫＯＨで６．
０にした洗浄培地、または０．２ＦのＣａＣ１ｚ　、７
ｍＭのトリス／）ＩＣＩからなり、ｐＨをＫＯＨにより
９．０とした洗浄培地。
実施例５３　　エレクトロポレーシヨンまたはＰＥＧ処
理によるダクチリス　グロメラタ　エル。
プロトプラストの形質転換 形質転換を、アリコートを形質転換のための管に分散す
る前、またはアリコートを分散した後、ＰＥＧを添加す
る前にプロトプラストを４５°Ｃで約５分間処理するこ
と以外は、実施例５１または５２に記載したように実施
する。
実施例５４　　形質転換したコロニーの選択Ａ、実施例
５１ないし５３からのプロトプラストを含有する培養プ
レート　（ペトリ皿）を、暗所で、約２５°Ｃで１０日
間インキュベートし、その後、ｂｅａｄ　ｃｕｌｔｕｒ
ｅｓ’（Ｓｈｉｌｌｉｔｏ、　Ｒ，Ｄ、　ｅｔ　ａｌ、
、　ＰｌａｎｔＣｅｌｌ　Ｒｅｐｏｒｔｓ　２．２４４
〜２４７（１９８３））のための５個の等しい片に切断
する。４個のスライスを各々４ｇ／　４２のカゼインヒ
ドロリセート及び２０μｇ／　ｍｌ　（７）ヒグロマイ
シンＢを有する５Ｈ−４５培養埼地２０ｄ中に置く。５
番目のスライスを、非選択対照群としてのヒグロマイシ
ンＢを含まないこと以外は上記と同じ培地２０ＷＮに入
れる。４ないし５週間後、ヒグロマイシンＢ内で生長す
る推定の形質転換したプロトプラスト誘導細胞コロニー
をアガロースから切り出し、その後、ヒグロマイシンＢ
を２０μｇ／ｐｉｔ含有する液体５１１−４５培地２−
を有する１９ｍｍのペトリ皿に置き、オーとタルシェー
カー上で、約５Ｏｒｐｍで撹拌する。さらに４ないし５
週間後、生長して新しい懸濁液を作る全てのコロニーを
１２５　ｄのエーレンマイヤーフラスコに移し、培地中
に２０μｇ／ｄのヒグロマイシンＢが含まれること以外
は親の懸濁培養液と同様の方法で生長させる。
新しい懸濁液を、４ｇ／ｌのカゼインヒドロリセート及
び２０μｇ／ｄのヒグロマイシンＢを含有する５１１−
４５培地を用いて、工ないし３週間毎に継代培養する。
これらのｇ濁液からの細胞も、２０μｇ／ｒｔｒｌｌの
ヒグロマイシンＢを含有する固化したＳｌ＋−３０培地
に置き、約２５°Ｃで暗所でインキュベートする。プレ
ート化した細胞から生長するＣａ　Ｉ　ｌ　ｉを、２週
間毎に新しい培地上に継代培養する。ヒグロマイシンＢ
の存在下で生長する細胞が形質転換体であると推定され
る。
Ｂ、　ヒグロマイシンロ含仔培地内で生長するプロトプ
ラストから誘導された細胞コロニーを２０μｇ７ｍｌの
ヒグロマイシンＢを含有する５ｉ１−：３ｏ　培地の庚
天板で置くこと以外は実施例５４八に記載さ（１，たよ
うに選択を実施し、暗所で、約２５°Ｃでイン′キュベ
ートする。
実施例５５　　形質転換されたダクチリス　グロメラタ
　エル、植物の再生 Ａ、　プロトプラストから誘導されるダクチリスグロメ
ラタ　エル、カルス　（実施例５４に記載されたように
得られる）を固化されたＳ　Ｈ−３０培地上で生長させ
、２週間毎に継代培養する。
生じる胚の全てを除去し、発芽培地（Ｓｌ！−０）上に
延べ、明所（４５ないし５５μＥ／ｍ”秒）に置く、こ
れらの胚の発芽は１ないし４週で生じ、得られた植物体
は、明所のＳｌ＋−０培地上に置かれ、根のシステムを
形成する。これらを６ないし１２葉期に温室内に移し、
その後徐々に硬化させる。
ｎ、　プロトプラストから誘導されたカルス（実施例５
４に記載したように得られる）を、０．２４％（ｗ／ｖ
）　Ｇｅ１ｒｉｔｅ　”で固化された５ｌｌ−０培地上
、明所（４５ないし５５　ｕ　Ｅ／ｍ”秒）で、２週間
毎ニ継代培養する。得られた植物体を、０．１２％（ｗ
／ｖ）のゲルライト８及び０．４％（−／ν）の寒天の
組み合わせで固化した５ｌｌ−０及び０ＭＳ培地の１：
ｌの混合物上、明所に置き、根のシステムを生じさせる
。それらを６ないし１２葉期で温室に移し、徐々に硬化
させる。
Ｃ０上記の実施例４４Ａ及び４４Ｂに記載されたように
小さな植物体が得られ、０．８％（ｗ／ｖ）の寒天で固
化された０ＭＳ培地上、明所に置いて、根のシステムを
生じさせる。それらを６ないし１２葉期で温室に移し、
徐々に硬化させる。
Ｄ、　上記の実施例４４Ａに記載されたように小さな植
物体が得られ、０．１２％（ｗ／ｖ）のゲルライト員及
び０．４％（ｗ／ｖ）の寒天の組み合わせで固化したＳ
ｌ＋−０及び０ＭＳ培地のにｌの混合物上、０゜１２％
（ｗ／ｖ）の寒天で固化された０ＭＳ培地上、明所に置
いて、根のシステムを生じさせる。それらを６ないし１
２葉期で温室に移し、徐々に硬化させる。
６、トランジェント遺伝子発現 下記の実施例は、キメラ遺伝子が、植物のゲノムに、遺
伝子が安定に導入される必要なしに、どのように導入さ
れ、使用されるかを記載している。
実施例５６　　ＰＥＧでの処理によるＤＮＡのＮ、Ｔａ
ｂａｃｕｍのプロトプラストへの導入 Ａ、　　ＩＪ、ｔａｂａｃｕｍのプロトプラストの製造
は、下記の文献：　Ｐａ５ｚｋｏｈｓｋｉ＋Ｊ、ｅｔ　
ａｌ、、ＥＭＢＯＪ、３＋　２７１７（１９８４）　；
英国特許出願第２１５９１７３号、ヨーロッパ特許出１
１ｉＥＰ　０１２９６６８号；　５ｈｉｌｌｉｔｏ、Ｒ
，Ｄ、及びＰｏｔｒｙｋｕｓ＋　１．　Ｉｎ　　：Ｍｅ
ｔｈｏｄｓ　ｉｎ　Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ。
ｅｄｓ、　Ｗｕ、　Ｒ，及びＧｒｏｓｓｔａａｎ、　Ｌ
、、Ａｃａｄｅｍｉｃ　Ｐｒｅｓｓ。
０ｒｌａｎｄｏ、Ｆｌｏｒｉｄａ、　Ｖｏｌ、１５３．
３１３〜３０６．　（１９８７）に記載された方法に従
って、または当該技術分野で公知の他の方法により行う
ことができる。これらの文献は参考文献として導入され
る。
Ｂ、　　Ｎｅｇｒｕｔｉｕ、　１．　ｅｔ　ａｌ、、Ｐ
ｌａｎｔ　Ｍｏ１．　Ｂｉｏｌ、　８゜３６３　（１９
８７）の方法の変法により、ＤＮ＾をプロトプラストに
導入する。最後の洗浄工程に続いて、実施例５６Ａに記
載されたように製造されたプロトプラストを、０，４月
マンニトール、１５〜３０１ＩＩＭのＣａＣＩｚ　、０
−１％（ｗ／ｖ）のＭＥＳからなる溶液中に、ｌ　ｔｕ
ｌ当たり１．６〜２ＸＩＯ’の密度で再懸濁する。
プロトプラスト懸濁液を０，３ｍｌのアリコートとして
１０ｄのプラスチックの遠心分離、管に分散する。実施
例１９ないし３１のＤＮＡを１０μ２の殺菌蒸溜水に添
加し、Ｐａ５ｚｋｏｈｓｋｉ、Ｊ、ｅｔ　ｓｌ、ＥＭＢ
ＯＪ。
３、２７１７　（１９８４）により記載されたように殺
菌し、その後、０，３戚のＰＥＧ溶液（０，４Ｍのマン
ニトール、Ｏ，ＬＭのＣａ（ＮＯｉ）ｚ　　ｐ）Ｉ　７
．０中の４０％（ｗ／ｖ）　ＰＥＧ　Ｈ８０００）を添
加する。溶液を穏やかに混合し、場合によって震盪しな
がら室温（約２４℃）で３０分間インキエベートする。
その後、洗浄溶液Ｉ−を添加し、管の中身を穏やかに混
合する。
１５４ｍＭのＮａＣ１，１２５ｍＭのＣａＣ１，，５ｍ
ＭのＭＣＩ、５ｍＭのグルコースからなり、ｐＨがＫＯ
Ｈにより６゜０に調整されている。さらに、洗浄溶液２
ｄ、３Ｉｄ及び４ｍのアリコートを連続して５分の間隔
で、各回の添加後に混合しながら添加する。
その後、管を約１０〜１００　ｘｇで、約１０分間の遠
心分離にかけ、上清液を捨てる。ペレット化したプロト
プラストを、等張化剤としての０．３Ｍのグルコースを
有し、スクロースを含まない充分なに３培地中で処理し
、ｌ　ｍＭ当たりｉｏｏ、ｏｏｏの最終密度を達成し、
１０ｃＩ１１のペトリ皿中で培養する。
Ｃ８実施例５６Ｂを１個もしくはそれ以上の下記の変法
を用いて繰り返す。
（１）　　洗浄溶液のｐ＋＋を５．６または７．０に合
わせる。
（２）使用したＰＥＧは分子層４０００のＰＥＧである
。
（３）洗浄培地は０．２ＭのＣａＣＩｇ　、　０．１％
（ｗ／ｖ）　ＭＥＳからなり、ＫＯＨによりｐｉｆ６．
０に合わせたもの、または０．２　ｍＭのＣａＣ１ｇ　
、７ｍＭのトリス／　ＨＣＩ　がらなり、ＫＯＨにより
ｐＨ９，０に合わせらたものである。
（４）　　２５μ２の殺菌水中の剪断したコウシ胸腺Ｄ
Ｎ＾５０μｇをプラスミドＤＮＡと一緒に添加する。
（５）プラスミドＤＮＡを処理により使用する前に適当
な制限酵素（例えばＢａｍＨＩ）で線状化する。
実施例５７　　ＤＮＡのエレクトロポレーションによる
Ｎ、　Ｔａｂａｃｕｍのプロトプラストへの導入＾、　
　ＤＮＡのＮ、　Ｔａｂａｃｕｍのプロトプラストへの
導入は、プロトプラストを適当なＤＮＡの存在下、Ｆｒ
ｏｍｍ、Ｍ、Ｅ、　Ｉｎ　　：　Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｉｎ
　Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ＋ｅｄｓ。
Ｗｕ、Ｒ，ａｎｄ　Ｇｒｏｓｓｎ＋ａｎ＋Ｌ、＋Ａｃａ
ｄｅｏ＋ｉｃ　Ｐｒｅｓｓ＋　０ｒｌａｎｄｏ、　Ｆｌ
ｏｒｉｄａ、　Ｖｏｌ、　１５３．３０７．　（１９８
７）　；及び５ｈｊｌｌｊｔｏ　Ｒ，Ｄ及びＰｏｔｒｙ
ｋｕｓ　１．．１ｂｉｄ、、ｐ、２８３〜３０６に記載
された方法の変法により、電気パルスで処理することに
より行われる。
プロトプラストは実施例５６Ａに記載されたように単離
される。最傍の洗浄の後、プロトプラストを下記の溶液
７０．２Ｍのマンニトール、０．１％（ｉｙ／ｖ）　の
ＭＥＳ　７７２ｍＭのＮａＣ１，７０ｍＭのＣａＣ１，
。
２，３ＴＩＩＭのＫＣＩ　、２，３ｍＭのグルコースか
らなり、ｐｌｌがＫＯＩＩで５．８に調整されている溶
液中に、１ｍ１当たり１．６〜２　ＸＩＯ’の密度で再
懸濁する。
プロトプラスト懸濁液をプラスチックの棄却可能のキュ
ベツトにｌ　ｒｎｌのアリコートとして分散し、１０μ
ｇのＤＮＡを実施例５６Ｂ及びＣに記載されたように添
加する。この点での溶液の抵抗値は、下記のエレクトロ
ポレーション装置の４７ｉの電極セットの電極の間で測
定され、６オームの範囲内にある。
実施例１９ないし３１のＤＮＡをＬＯｕｅの殺菌蒸溜水
内に添加し、Ｐａｓｋｏｗｓｋｉ、Ｊ、ｅｔ　ａｌ、、
ＥＭＢＯＪ、３＋２７１７（１９８４）に記載されたよ
うに殺菌される。溶液は穏やかに混合され、その後、室
温（２４〜２８”Ｃ）で、１０ｍｓの指数崩壊定数で、
４７１の電極アセンブリーを用いたＢＴＸ　−）ラスフ
エクター３００のエレクトロポレーション装置から４０
０Ｖ／　ｃＩｌのパルスに課す。プロトプラストを５分
間のアンデイスクープに放置し、その後、ベトリ皿に置
き、実施例５６Ａに記載されたようなに３培地を添加し
て、プロドブストの密度を１００，０００／ｄにする。
８、　１個もしくはそれ以上の下記の変法を用いて、実
施例５７Ａを操り返す： （１）　　使用する電圧が２００Ｖ／　ｃｍ、または１
００Ｖ／　ｃｍと８００ν／　ｃｍとの間である。
（２）指数崩壊定数が５ｍｓ、１５ｍ５または２０ｍ５
である。
（３）　　２５μ２の殺菌水中の剪断したコウシ胸腺Ｄ
Ｎ４５０μｇを、プラスミドＤＮＡ　と共に添加する。
（４）プラスミドＤＮＡを、使用前に適当な制限酵素（
例えばＢａｍ旧）での処理により線状化する。
実１藁例５８　Ｚｅａ　Ｍａｙｓ　Ｌｉｎｅ　２７１７
のプロトプラストへのＤＮＡの導入 メイズ　インブレッド　ライン　フンク２７１７のプロ
トプラストを上記の実施例４０ないし４７に記載したよ
うに製造し、上記の実施例５６及び５７のＮ、　Ｌａｂ
ａｃｕＩｌ　　フ″ロトブラストの再９．　ＱＱのため
に記載した／８液のいずれかに、ＬＯ’／ｍｌの濃度で
再愁眉する。実質的に実施例５６及び５７に記載したの
と同様に形質転換を行う。形質転換に続いて、プロトプ
ラストを２Ｘ１０’／−の濃度で、固化剤が添加されず
、１　ｍｇ／　ｌの２．４−Ｄを含有するＫＭ−８ｐ培
地中で培養する。
実施例５９　　ＤＮＡのＳｏｒｇｈｕｍ　Ｂｉｃｏｌｏ
ｒのプロトプラストへの導入 モロコシ（ｓｏｒｇｈｕｍ）のプロトプラストの懸濁液
ＰＳ　５６２を、実質的に上記実施例４０のＺｅａ　ｗ
ａｙｓに記載されたように製造し、実施例５６及び５７
のＮ、　ｔａｂａｃｕｍプロトプラストの再懸濁のため
に記載された溶液のいずれかに、１０　’　／　ｍｌの
濃度で再懸濁する。形質転換は実質的に実施例５８に記
載したのと同様に行う。形質転換に続いて、プロトプラ
ストを２ＸＩＯ６／ＩＪｌの濃度で、固化剤が添加され
ないＫＭ−８ｐ培地中で培養する。
実施例６０　Ｎ１ｃｏｔｉａｎａ　Ｐｌｕｍｂａｇｉｎ
ｉｆｏｌｉａ、　Ｐｅｔｕｎｉａ　Ｈｙｂｒｉｄａ及び
Ｌｏｌｉｕｍ　Ｍｕｌｔｉｆｌｏｒｕｍのプロトプラス
トへのＤＮＡの導入 Ｎ、ｐｌｕｍｂａｇｉｎｉｆｏｌｉａ、　Ｐ、ｈｙｂｒ
ｉｄａまたはし、ｍｕｌｔｉｆｌｏｒｕ＋ｙのプロトプ
ラストを５ｈｉｌｌｉｔｏ　ａｎｄ　Ｐｏｔｒｙｋｕｓ
＋　５ｕｐｒａにより記載されたように製造し、実施例
５６及び５７に記載されたように処理する。
それらを５ｈｉｌｌｉｔｏ　ａｎｄ　Ｐｏｔｒｙｋｕｓ
、　５ｕｐｒａにより記載された培地中で、アガロース
または他のいずれのゲル化剤も添加せずに培養する。
実施例６１　　ＤＮＡのＧｌｙｃｉｎｅ　Ｍａｘのプロ
トプラストへの導入 Ｇｌｙｃｉｎｅ　ｍａｘのプロトプラストをＴｒｉｃｏ
ｌｉ。
Ｄ、Ｍ、　ｅｔ　ａｌ、、　Ｐｌａｎｔ　Ｃｅ１ｌ　Ｒ
ｅｐｏｒｔｓ＋　５＋　３３４−３３７（１９８６）　
　またはＣｈｏｗｈｕｒｙ、　Ｖ、に、　ａｎｄ　Ｗｉ
ｄｈｏｌｍ　。
Ｊ、Ｍ、、Ｐｌａｎｔ　Ｃｅ１ｌ　Ｒｅｐｏｒｔｓ　４
．２８９〜２９２　（１９８５）。
ｏｒ　Ｋｌｅｉｎ、Ａ、Ｓ、　ａｔ　ａｌ、、　Ｐｌａ
ｎｔａ　１５２．１０５−１１４（１９８１）により記
載されたような方法により製造する。ＤＮＡをこれらの
プロトプラストに、実質的に実施例５６及び５７に記載
されたように導入する。プロトプラストはＫｌｅｉｎ、
＾、Ｓ、ｅｔ　ａｌ、、５ｕｐｒａ、　Ｃｈｏｗｈｕｒ
ｙ　Ｖ、に、及び−ｉｄｈｏｌｍ、　Ｊ、Ｍ、５ｕｐｒ
ａ＋またはＴｒｉｃｏｌｉ、　Ｄ、Ｍ、ｅｔ　ａｌ、、
５ｕｐｒａに記載されたように、アルギン酸塩を培地の
固化のために添加することなしに培養する。
７、トランスジェニック植物組織の化学的調節下記の実
施例に、代表的なトランスジェニック植物組織の化学的
に調節されうる遺伝子の化学的調節のための方法を記載
する。下記の実施例は、直接誘導に関するが、同様な方
法は抑制によるシステムオペレーティングのためにも適
用しうるであろう。
種々の技術がトランスジェニック細胞のケミカルレギュ
レーターによる処理のために適用可能である。例えば、
細胞はレギュレーターを含む液体培地に懸濁しうる。カ
ルスは、該培地上で生長させても、レギュレーターを含
有する培地に移しても良く、またレギュレーターを殺菌
した塗料ブラシまたはプラントミスタ−を用いてカルス
に施用しても良い。同様に、植物または植物の部分も塗
料ブラシまたは好ましくはプラントミスタ−を用いてレ
ギュレーターの溶液または懸濁液で処理することができ
る。
化学的に調節可能なキメラ遺伝子を含有する表現型の特
徴の発現は、植物または植物組織に施用されるレギュレ
ーターの量に比例する。
実施例６２トランスジエニツクカルス培養における化学
的誘導 八、　前記の方法により得られるカルスは、殺菌した塗
料ブラシまたはプラントミスタ−で、フィルター殺菌さ
れた、Ｎａ０１１の添加によりｐＨが６゜０と８．０と
の間に合わせられた０、１ないし５０ｍＭのサリチル酸
の溶液を塗布することにより、化学的誘導について分析
される。
誘導後、カルスは２日間インキュベートされ、その後収
穫され、液体窒素中で凍結され、それらが実施例６５及
び／または実施例６６に記載された遺伝子誘導について
分析されるまで、−８０°Ｃで貯蔵される。
Ｂ、　さもなければ、下記の溶液が誘導に使用される。
（１）　　ｐＨをＮａＯＨの添加により６．０と８．０
の間に合わせた０、１ないし５０ｍＭの安息香酸（２）
　　ｐＨをＮａＯＨの添加により６．０と８．０の間に
合わせた０、１ないし５０ｍＭのポリアクリル酸（３）
メチル　ベンゾ−１，２，３−チアジアゾール−７−カ
ルボキシレート 溶液を、化学物質を含む水和剤を殺菌した水に１ｍｇ／
ｍｌの濃度で数分間再懸濁することにより製造する。不
溶性の固体をフィルター殺菌による溶液から除去する。
（４）　　ｐＨが６．０と８．０との間である０、１な
いし５０ｍＭのベンゾ−１，２，３−チアジアゾール−
７−カルボン酸 化合物を最小限の量のジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ
）に溶解し、その後、殺菌した水で所望の濃度に希釈す
る。得られた懸濁液を濾過することなく適用する。
（５）　　０．１ないし５０ｍＭのｎ−プロピルベンゾ
−１゜２．３−チアジアゾール−７−カルボキシレート
（４）のように製造する。
（６）　　０．１ないし５０１ＩＩＭのベンジル　ベン
ゾ−１，２゜３−チアジアゾール−７−カルボキシレー
ト（４）のように製造する。
（力　０．１ないし５０ｍＭΦヘンソ゛−１，２，３−
チアジアゾール−７−カルボン酸Ｎ−第二ブチルヒドラ
ジド （４）のように製造する。
（８）　　ｐｌｌが６．０と８．０との間である０、１
ないし５０ｍＭの２，６−ジクロロイソニコチン酸（４
）のように製造する。
（９）　　０．１ないし５０ｍＭのメチル２，６−ジク
ロロイソニコチネート （４）のように製造する。
実施例６３　　）ランスジェニック植物における化学的
誘導 Ａ、　前記の方法により得られた植物に、ｐＨがＮａ０
１１により６，０と８．０との間に合わせられた０、１
ないし５０ｍＭのサリチル酸の微細な噴霧液を、プラン
トミスタ−を用いて葉に施用する。
三日間植物を生長させ続け、その後収穫し、液体窒素中
で凍結し、それらが実施例６５及び／または６６に記載
されたように使用されるまで一８０°Ｃで貯蔵する。
Ｂ、　さもなければ、下記の溶液を誘導のために使用す
る。
（１）　　ｐＨをＮａＯＨの添加により６．０と８．０
の間に合わせた０、１ないし５ｈＭの安息香酸 （２）　　ｐｔｌをＮ　ａ　０１１の添加により６．０
と８．０の間に合わせた０、１ないし５０ｍＭのポリア
クリル酸（３）メチル　ベンゾ−１，２，３−チアジア
ゾール−７−カルボキシレート 溶液を、化学物質を含む水和剤を殺菌した水に１　ｍｇ
／−の濃度で数分間再懸濁することにより製造する。不
溶性の固体をフィルター殺菌により溶液から除去する。
（４）　　ｐＨが６．０と８．０との間である０、１な
いし５０５Ｍのベンゾ−１，２，３−チアジアゾール−
７−カルボン酸 化合物を最小限の量のジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ
）に溶解し、その後、殺菌した水で所望の濃度に希釈す
る。得られた懸濁液を濾過することなく適用する。
（５）　　０．１ないし５０ｍＭのロープロピルベンゾ
−Ｌ２．３−チアジアゾール−７−カルボキシレート（
４）のように製造する。
（６）　　０．１ないし５０ｍＭのベンジル　ベンゾ−
１，２゜３−チアジアゾール−７−カルボキシレート（
４）のように製造する。
（７）　　０．１ないし５０ｎ＋Ｍのベンゾ−１，２，
３−チアジアゾール−７−カルボン酸Ｎ−第二ブチルヒ
ドラジド （４）のよ・うに製造する。
（８）　　ｐｌｌが６．０と８．０との間である０、１
ないし５０ｍＭの２．６−ジクロロイソニコチン酸（４
）のように製造する。
（９）　　０．１ないし５０１のメチル２．６−シクロ
ロイソニコチアネート （４）のように製造する。
実施例６４　Ｎ、　Ｔａｂａｃｕｍ、　Ｚｅａ　Ｍａｙ
ｓ、　Ｎ、Ｐｌｕｍｂａｇｉｎｉｆｏｌｉａ、　Ｐ、　
Ｈｙｂｒｉｄａ、　Ｌ、Ｍｕｌｔｉｆｌｏｒｔ＋ｍ　ａ
ｎｄ　ＳｏｒｇｈｕｌＩ　Ｂｉｃｏｌｏｒ 上記の実施例５６ないし６１に記載したように処理され
たプロトプラストを２６℃で、暗所で、２日間培養する
。この時間後、中和溶液として０゜１と５０ｍＭとの間
の濃度でｐＨが６．０と８．０とおの間であるサリチル
酸を添加する。プロトプラストをさらに２日間培養し、
遠心分離により収穫し、急速に凍結し、下記の実施例の
ように処理する。
Ｂ、　さもなければ、下記の化合物の中和溶液または懸
濁液をプロトプラストに添加し、最終濃度を０．１　と
５０ｍＭの間にする。
（１）　　安息香酸 （２）ポリアクリル酸 （３）メチル　ベンゾ−１，２，３−チアジアゾール−
７−カルボキシレート （４）ベンゾ−Ｌ２，３−チアジアゾール−７−カルボ
ン酸 （５）ｎ−プロピルベンゾ−１，２，３−チアジアゾー
ル−７−カルボキシレート （６ン　ベンツ゛−１，２，３−チアジアソ゛−ル−７
−カルボキシレート （７）ベンゾ−１，２，３−チアジアゾール−７−カル
ボン酸Ｎ−第二ブチルヒドラジド （８）　　２．６−ジクロロイソニコチン酸（９）メチ
ル２．６−シクロロイソニコチアネートＣ１さもなけれ
ば、誘導を、プロトプラストを誘導前に１日、３日また
は５日間培養すること以外は実施例６４Ａ及び６４Ｂに
記載したように実施する。
Ｄ、　誘導を、プロトプラストを誘導後、収穫前に１日
、３日または５日間培養すること以外は実施例６４Ａ　
、６４Ｂまたは６４Ｃに記載したように実施する。
実施例６５　　化学的に誘導されうるＤＮＡ配列：ｒ＊
ＲＮＡの製造 実施例６２ないし６４のように誘導され、収穫された植
物材料を、ＲＮ＾の単離によるｎ＋ＲＮＡ片の誘導、及
び実施例５に記載したようなブライマーエクステンショ
ンアッセーに関して分析する。
化学的に調節可能なＧＵＳ　、　ＡＩＩＡＳまたはＢＴ
のためのキメラ遺伝子コードを含有するトランスジェニ
ック植物から誘導され、サリチル酸、メチルベンゾ−１
，２，３−ベンゾチアジアゾール−７−カルボキシレー
ト、ベンゾ−１，２，３−チアジアゾール−７−カルボ
ン酸、ロープロピルベンゾ−１，２，３−チアジアゾー
ル−７−カルボキシレート、ベンジルベンゾ−１，２，
３−チアジアゾール−７−カルボキシレート、ベンゾ−
１，２，３＝チアジアゾール−７−カルボン酸Ｎ−第二
ブチルヒドラジド、２，６−ジクロロイソニコチン酸、
メチル２．６−ジクロロイソニコチネートまたはＴＭＶ
で誘導されたカルスまたは再生植物材料は、ブライマー
エクステンションアッセーにおいて各々ＧｔｌＳ　、　
ＡＩＩＡＳまたはＢＴブライマーでの分析でｍＲＮＡの
高められた値を示す。
実施例６６　　化学的に誘導されるＤＮＡ配列のための
分析：β−グルクロニダーゼ酵素活性Ａ、　エリザアッ
セー 凍結した葉の組織を、液体窒素の存在下、モーター内で
杵で摩砕して微細な粉末を生産する。
葉の抽出物を、Ｊｅｆｆｅｒｓｏｎ、Ｒ，Ａ、ｅｔ　ａ
ｌ、、Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ。Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、ＵＳ
Ａ　８３．８４４７−８４５１　（１９８６）により記
載されたように、与えられた重量軸）で、等！　（ｄ）
のＧＵＳ抽出緩衝液（５０ｎ＋Ｍのリン酸ナトリウム緩
衝液、ｐＨ７，０，０，１％のＴｒｉｔｏｎ−Ｘ　１０
０，０゜１％のサルコシル、１０ｗＭのβ−メルカプト
エタノール）と混合することにより製造する。
反応をＥＬｌＳＡ板のウェル中で、５〜２５μ２の抽出
物を、４−メチルウンベリフヱリルグルクロニド（門Ｕ
）を総容量１２５μ！中２ｍＭの最終濃度で含有する１
２０〜１００μｉのＧｔｌＳアッセー緩衝液（５０１の
リン酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ７，０，Ｏ１１％Ｔｒｉ
Ｌｏｎ　Ｘ−１００，ｌｏｍＭのβ−メルカプトエタノ
ール）と混合することにより行う。該プレートを３７°
Ｃで１〜５時間インキュベートし、反応を３ＭのＮａｚ
ＣＯ：＋　１５０μｌの添加により止める。
放出された螢光指示薬の濃度を、Ｆｌｏｗ　　Ｌａｂｓ
Ｆｌｕｏｒｏｓｋａｎ　ＩＩ　ＥＬＩＳＡ板リーダーす
でプレートを読むことにより調べる。
脚注 ａＨｌ−９は、菌ＣｌＢ２７１により葉の円板を形質転
換することにより得られるタバコ植物である。
Ａｌｕ　１−１３は、菌ＣｌＢ２７２により葉の円板を
形質転換することにより得られるタバコ植物である。
１１ａｅ　１−１６は、菌ＣｌＢ２７３により葉の円板
を形質転換することにより得られるタバコ植物である。
ｂ　＾水 Ｂサリチル酸 Ｃメチルベンゾ−１，２，３−チアジアゾール−７−カ
ルボキシレート Ｄ緩衝液 　ＴＭＶ 形質転換されたタバコカルス（実施例２３）：下記のＧ
ＵＳ−活性は、処理後２１時間に収穫された形質転換さ
れたカルスのサンプルから得られる。
ＣｌＢ２７１により形質転換されたちの：Ｈ２０噴霧：
１．８ｎＫａｔ　ＭＵ／ｍｇタンパク質：５０ＩＩＩＭ
サリチル酸ナトリウム噴霧：　３．８ｎＫａｔ　ＭＵ／
ｍｇのタンパク質。
ＣｌＢ２７１により形質転換されたもの（異なる実験）
：Ｈ２０噴’Ｍ　：　２．８ｎＫａｔ　ＭＵ／ｍｇタン
パク質；２５０μｇｅｌのメチルベンゾ−１，２，３−
チアジアゾール−７−カルボキシレート噴ｆｉｉ　：　
１３．７ｎＫａｔＭＵ／ｍｇタンパク質。
ＣｌＢ２７３により形質転換されたもの：ＨｚＯ噴霧：
０．４６ｎＫａｔ　ＭＬＩ／ｍｇタンパク質；　５０ｍ
Ｍサリチル酸ナトリウム噴ｎ　：　１．８ｎＫａｔ　Ｍ
［Ｉ／ｍｇタンパク質；２５０μｇ／ρメチルベンゾー
１，２．３−チアジアゾール−７−カルボキシレート噴
霧：　３１．２　ｎＫａｔＭＩＪ／＋ｇ　タンパク質。
形質転換されたニンジン（実施例３６）：下記のＧ［Ｉ
Ｓ活性は、ｐｃＩＢ２７１により形質転換された、処理
後２１時間に収穫されたカルスのサンプルから得られる
。１１．０噴ｆｉ　：　５．２ｐＫａｔ　ＭＩＪ／Ｂタ
ンパク質。５０ＩＩＩＭサリチル酸ナトリウム噴ｍ　：
　１１．６ｐＫａｔ　ＭＵ／ｍｇタンパク質。２５０　
ｕｇ／ｆｆｉメチルベンシー１．２．３−チアジアゾー
ル−７−カルボキシレート噴霧液：　２２．１　ｐＫａ
ｔ　ＭＵ／ｍｇ　タンパク質。
形質転換されたトマト（実施例３８）：下記のＧＵＳ活
性は、形質転換された、処理後２１時間に収穫されたカ
ルスのサンプルから得られる。
Ｃｌ８２７１により形質転換された：１ＩｔＯ噴霧：１
７．２ｐＫａｔ　ＭＵ／ｍｇタンパク質、　２５０　ｕ
ｇ／ｌ−メチルベンゾ−１，２，３−チアジアゾール−
７−カルボキシレート噴霧：　５６．１　ｐＫａｔ　Ｍ
Ｕ／ｎａｇタンパク質。
ｃ＋Ｂ２７３ＸＡ４により形質転換：Ｈ，０噴霧：４．
６ｐＫａ　＋　ＭＵ／ｎｇタンパク質；２５０μｇｅｌ
メチルベンゾー１，２．３−チアジアゾール−７−カル
ボキシレート噴ｎ　：　２２．１　ｐＫａｔ　ＭＵ／ｍ
ｇタンパク質。
ｐｃＩ８２６９で処理されたタバコプロトプラスト（実
施例５６）のトランジェント発現：　Ｈ２Ｏ：３０．６
±１３ｐＫａｔ　ＭＵ／ｍｇタンパク質；メチルヘンシ
ー１゜２．３−チアジアゾール−７−カルホキシレー）
：６６．６±２０ｐＫａｔ　ＭＵ／ｓｇタンパク質。
実施例６７　　内在遺伝子の化学誘導のためのアッセー 対照方法として、実施例６２ないし６４に記載されたよ
うにサリチル酸、メチル　ベンゾ−１，２゜３−チアジ
アゾール−７−カルボキシレート及びＴＭＶにより誘導
されたタバコ植物材料を、実施例５に記載された方法に
よる内在ｐＰＲ−１ａ遺伝子からのｍＲＮへの転写につ
いて分析する。ｍＲＮＡの高められたレベルが、全ての
３個のインデューサーによる誘導の後に検出される。
実施例６８　　化学的に誘導されうるＤＮＡ配列のため
のアッセー：アセトヒドロキシ酸シンターゼ（ＡＩＩＡ
Ｓ）酵素活性 Ａ、　ＡＨＡＳアッセーのためのサンプル製造分析すべ
き葉及び／または根の組織材料の重量を調べ、組織を液
体窒素中に置き、微細な粉末にする０組織の重量の２倍
に等しい量の冷たいホモジネート緩衝液（５０ａ＋Ｍの
Ｎａ１ｌｔＰＯａ緩衝液ｐＨ７，０，０，５ｍＭのＥＤ
ＴＡ　ｐＲ７，０，０，５＋ｗＭのＭｇＣ１，。
１ｍＭのナトリウムピルベートｐＨ７，０，１（１ｍＭ
のフラビン　アデニン　ジヌクレオチド、、１ｍＭのフ
ェニルメチルスルホニルフルオライド、１０％のグリセ
ロール）を添加し、該混合物をフレンチプレッシャーセ
ルに移す、全ての次工程を物質を低温（約４°Ｃ）に保
持して行う、細胞を１６．０００ｐｓｉで崩壊し、細胞
滲出物を氷上の容器に集める。さもなければ、フレンチ
プレッシャーセル処理の代わりにモーター及びペラスル
中で組織をホモジネート緩衝液とともに摩砕する。滲出
液は１０．　ＯＯＯｒｐｍで５分間の遠心分離にかけ、
透明な細胞破壊片とする。上清液の体積を測定し、酵素
グレード硫酸アンモニウムを２５％の飽和度（１４４１
１８（ＮＨ４）　ｚｓＯａＩ上清液のｄ）になるように
添加する。混合物を氷上で１５分間撹拌し、その後、１
０．００Ｏｒｐｍで５分間遠心分離にかける。ペレッ［
・を捨で、上清液を硫酸マグネシウムで５０％の飽和度
（１５８ａ＋ｇ　（ＮＨ４）ｚｓＯｎ／上清液の１１１
）に合わせる。氷上で１５分間撹拌した後、ペレットを
１０゜０００ｒｐ＋ｍで５分間の遠心分離により集める
。得られたペレットを各々２ｇの葉または５ｇの板材料
に対してカラム緩衝液ｌ−に溶解する。抽出物は、カラ
ム緩衝液（５０ｍＭのＮａＨｚＰＯｎ緩衝液＋）Ｈ７，
０，０，１ｇＭ　ＥＤＴＡ、０，３ｅＩＭ　ＭｇＣｈ、
　１０＃　Ｍのフラビンアデニンジヌクレオチド、１ｍ
Ｍのフェニルメチルスルホニルフルオライド、１０％の
グリセロール）で等長比された５ｅｐｈａｄｅｘ　Ｇ５
０　　カラムにかけることにより脱塩化する。サンプル
を、カラム緩衝液で溶離し、カラムにかけられたサンプ
ル体積（ｍｌ）あたり、サンプルの２ＰＩｒｌが集めら
れる。
Ｂ、　管アッセー 実施例６８Ａにより製造された抽出物５〜５０μｌを総
容１０，３　ｄの反応混合物（２ｈＭのＮａＨ，ＰＯ。
緩衝液ｐＨ７，０，２０ｍＭのピルビン酸ナトリウム、
０，３ｍＭのチアミンピロホスフェート、５ｍＭのＭｇ
Ｃ１，，１０ｍＭのフラビンアデニンジヌクレオチド）
中に溶解する。混合物を３７°Ｃで３０分間インキュベ
ートする。反応は６Ｎのｎｚｐｏ４を５０μｌ添加する
ことにより止められる。混合物を６０℃で１５分間イン
キュベートし、その後、α−ナフトール試薬（２，５Ｍ
のＮａＯＨ中の５％α−ナフトール５００　μ！並びに
２５ｍｇ／ｍ　Ｉのクレアチン１２５μりで処理し、６
０゛Ｃでさらに１５分間インキュベートする。
沈澱が生じたら、これをスピンアウトし、吸収を５２０
僧μで測定する。生じたｐＭｏｌｅｓアセトインを、０
．４　μｇないし１０μｇのアセトインを用いて出来た
標準曲線から計算する。比活性をｐＫａ　ｔ／ｍｇタン
パク質として表わす。
Ｃ１エリザ板アッセー サンプル１〜２０μ℃をエリザ板ウェル中に、反応混合
物の総体積がＯ，１５ｄとなるように置（。
混合物を３７°Ｃで３０分間反応させる。反応を１％の
クレアチンを含有する２、４Ｍ　　の１１□ＳＯ４５０
μ尼を添加することにより止める。得られた混合物を６
０°Ｃで３０分間インキュベートする。いずれの沈澱の
存在も遠心分離により分離される。アツセー混合物１５
０μｆを新しいエリザ仮に移し、５ＭのＮａＯＨ中、１
０％のα−ナフトール１００ｔＩｆで処理し、さらに２
０分間６０°Ｃでインキユベートする。吸収を５２０ｍ
Ｍで測定し、比活性を実施例６８Ｂのように表現する。
実施例６９　　化学的に誘導可能なＤＮＡ配列：　Ｂａ
ｃｉｌｌｕ、ｓ　　Ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ　　Ｅ
ｎｄｏｔｏｘｉｎＡ、　植物抽出方法 約１００ｍｇの植物組織を０．１ｍ１ｌの抽出緩衝液（
５０ｍＭのＮａｚＣＯ：＋　　ｐＨ９，５、１０ｍＭの
ＥＤＴＡ、　０．０５％のＴｒｉｔｏｎ　Ｘ−１ｏｏ、
　０．０５％のＴｗｅｅｎ＋　１００ｍＭのＮａＣｌ。
１ｍＭのフェニルメチルスルホニルフルオライド（使用
のすぐ前に添加）、及び１ｍＭのロイペプチン（使用の
すぐ前に添加））中にホモジナイズする。抽出後、２Ｈ
のＴｒｉｓ　ｐＨ７，ｏを添加してｐＨを８．０〜８，
３に合わせる。その後、抽出物をＢｅｃｋｍａｎ　ｍｉ
ｃｒｏｆｕｇｅ中、１０分間の遠心分離にかけ、上清液
をエリザ分析に使用する。
Ｂ、　エリザ エリザ板をエタノールで前処理する。ホウ酸塩緩衝塩（
１００ｍＭのホウ酸、　２５ｍＭのホウ酸ナトリウム、
１５ｍＭのＮａＣ１，ｐ１１８．４〜８，３）中の３Ｈ
ｇ／ｍｌの濃度のアフィニティ精製したウサギの抗−Ｂ
ｔ血清（５０μｌ）を、板に添加し、これを４°Ｃで一
晩インキユベートする。抗血清は、ウサギを、ドデシル
硫酸ナトリウムで可溶化した勾配精製ＢＬ（Ｂａｃｉｌ
ｌｕｓ　ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ　ｅｎｄｏｔｏｘ
ｉｎ）結晶（Ａｎｇ、Ｂ、Ｊ、　　＆　Ｎ１ｃｋｅｒｓ
ｏｎ、　　Ｋ、Ｗ、＋　　Ａｐｐｌ、　　Ｅ＊ｃｉｒ。
ｎ、　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ、　３６．６２５−６２６　
（１９７８））で免疫化することにより製造される。こ
の板を洗浄緩衝液（１０ｍＭのＴｒｉｓ−１１ＣＩ　ｐ
Ｈ８，０，０，０５％Ｔｗｅｅｎ　２０゜０．０２％の
アジ化ナトリウム）で洗浄し、その後、ブロッキング緩
衝液（１０ａ＋Ｍのｐｌ＋７．４のリン酸ナトリウム緩
衝液、１４０ｍＭの闘ａｃＩ、１％のコウシ血清アルブ
ミン、０．０２％のアジ化ナトリウム）で室温で１時間
処理し、再び洗浄する。植物抽出物を添加して合計５０
μｇのタンパク質（典型的には約５μｉの抽出物；　Ｂ
ｉｏ−Ｒａｄから市販品として得られるキットを用いて
Ｂｒａｄｆｏｒｄ、Ｍ、、＾ｎａ１．Ｂｉｏｃｈｅｍ、
７２．　２４８　（１９７６）の方法により決定する）
をＥｃｏＲｌ　、その後４°Ｃで一晩インキユベートス
る。洗浄後、５０ｕＱのアフィニティー精製ヤギ抗Ｂｔ
抗血清を３μｇ／ｄのタンパク質の濃度でＥＬＩＳＡ希
釈物（１０ｍＭのリン酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ７，４
，１４０ｎ＋Ｍ　ＮａＣ１，０，０５％Ｔｗｅｅｎ　２
０＋　１％のコウジ血清アルブミン、０，０２％アジ化
ナトリウム）に添加し、その後、これを３７℃で１時間
インキュベートする。洗浄後、エリザ希釈液中でｔ：ｓ
ｏｏに希釈されたアルカリホスファターゼ（Ｓｉｇｍａ
　ＣｈｅｍｒｃａＩｓ、　Ｓｔ、　Ｌｏｕｉｓ、　　Ｍ
ｏ、、ＵＳＡ）に結合した５０μ２のウサギ抗−ヤギ抗
体を添加し、３７°Ｃで１時間インキュベートさせる。
洗浄後、５０μｉの基剤（０，６ｍｇ／　ｙｄｌのｐ〜
ニトロフェニルホスフェート、　０．０５ｍｇ／ｍｌの
−ＣＩ□１０％のジェタノールアミン、　ＩＩｃＩ　で
ｐＨ９，８に合わせる）を添加し、室温で３０分間イン
キュベートする。反応は３列のＮａ０１１５０　μ２を
添加することにより完結される。変形エリザリーダー（
ｔｌｅｗｌｅｔｔ　Ｐａｃｋａｒ＋Ｌ　５ｔａｎｆｏｒ
ｄ、　Ｃａ、、　ＵＳＡ）中で４０５ｎｍでの吸収を読
む。
次に、上記の「配列の簡単な説明」の欄で説明した「配
列１ないし８」を示す。
■ 配 列 配 列 ｌ　（３） 明細書の浄書（内容に変更なし゛ ■５５０ ！８１０ ！８９０ ｉ１０ １Ｇ ７Ｇ ０７Ｇ １５Ｇ ２１Ｇ １３！Ｏ ３７Ｇ 配 列 ｌ　（２） 配 列 廁ＩＬ１ ＡＩＯ ｌ４フ０ ｌ４９０ １５ｌ０ ｌ５３０ ｌ５７０ ｌ５９０ ８タ０ ｌ６１０ ｌ６５０ ｌ０１０ ｌ０３０ ｌ６９０ １フ１０ ＋７３０ ｌ０７０ ｌ０９０ ｌ７９０ １ｇ１０ １ｌ５０ ｌ１９０ ｌ８５０ ｌ６９０ １９５ロ ｌ９７０ １２１Ｇ ｌ２７０ ２０ｌ０ ｌ２９０ １３１Ｇ ｌ３３０ 人ＡＴＧＡＧＡＡＴＡ ｌ３フＧ １３９Ｇ 配 列 配 列 フＯ ６７Ｇ 賛＾＾ＨＫＩＴＴＴＬＳＩＦＦＬＬＳＳＩＦＲＰＣＭＦ
ＡＤＮ　　＾　ＤＮＬＬＳＳＷＮＱＷＴＡＦＰＴＳＫＬ
Ｙ１５Ｇ ７９ｆｌ ＳＳ ＤＡＡＧ ■ Ａ ＩＹＷＧＱＮＧＮＥＧＳＬＡＳＴＣＡＴＭＧＬＰＡＡＲ
ＥＡＡＰＳＧＧＦＩＰＡＤＶＩＩＳＯ’／ＬＰ１フ０ １９Ｇ ２１Ｇ ８１Ｇ ＮＹＥＦＶＮ ■ ＡＦＬＳＳＦＧＳＧＱＡＰＶＬＩＩＬＡＧＩＩ■ ■ κ　ＡＳＳＮＹＧＧＶＭＬＷＳＫＡＦＤＮＧＹＳＤＳ■ ＣＮＰＤＮＮＧＣＡＦＬＳＤＥＩＮＳＣＫＳＱＮＶＫＶ
ＬＬＫＧＳＩＧ傘 ３１Ｇ １Ｇ１０ ｌ０３０ Ｓ ■ ＧＧＧＡＧＳＹＳＬＳＳＡＤＤＡＫＱＶＡＮＦＩＩＮ ｌ０７０ ｌ０９０ Ｓ Ｙｌ．ＧＧＱＳＤＳＲＰＬＧＡＡＶＬ［ＩＧＶＤＦＤｆ
ＥｓＧ 配 列 ＳＧＱＦＷＤＶＬＡＱＥＬＫＮＦＧＱＶ　　ＩＬＳＡＡ
　Ｐ　ＱＣＰ配 列 入＾ＡＡ＾Ｃへ＾＾＾　入人へ人入＾ＴＯＡＡ　　Ｃ丁
テＣＣＴＣ入ＡＡ　　ＡＧＣττＣＣＣＣＴ　　ＴＴＴ
ＴＴＧＣＣＴＴｌｏ Ｄ １Ｇ 丁ＣＣＣＣＡＴＧＧＡ　　ＡｆｆＣＡＧＣＣＣＧ　　Ａ
ＣＣ＾ＡＴＧＧＡＧ　　ＧＡ？ＧＴＣＧＴ入＾　丁ＣＴ
ＣＡＧＡＴＧＣ９Ｇ １Ｇ 配列４ ポリペ丁チドのアミノ醒Ｉｒ：デ１ １Ｇ ＧＡＯＣ？ｅｅ？ｅ？　　ｋＧＧＧＧＧｃｃｋｋ　　Ｇ
ＧＣＪＪＩＡｃＣテテ　’ＰＴＴＧＣＴｋＡＴＧ　　Ｇ
（−＾入入Ａ＾＾Ａ丁９Ｑ ε１０ Ａ丁ＣＴＧＣＴＡＡＡＴｒＡＴｒＡＡＡＴＧ配列４（ａ
） （２）：配列４と遺伝子のコードＳ１域によりコード化
されたポリへ゛１チドのアミノ酸配列 １ユ５１ ＧＴＡＡＣＧｋＴＧＡ　　デ丁ＡＡＧＣＡＯＧＡ　　Ａ
Ｔ丁ＣＣＴＣ丁ＧＯ丁ＴＧＴＧＣＡＧＧｋ　　ＴＧＡＡ
ＡＧ入ＡＡＣ配列５０） ＋　１−１−ｍ　ｍ　ｍ　ｍ　１．−Ｉ　Ｆ４　＋−１
Ｍ　ｍ　Ｆ４　ｄＣｈ　Ｉ／ｌ　（）　ｌ／ｌ　Ｃ）　
ψＯＩ／ｌ口Ｌｎ　Ｏｕ’ｌ。ψＮ　　Ｎ　　Ｍ　　Ｍ
　　啼＃　　ｔ／１　１／ｌ　　ｔｏ　　＃　　ｌ”　
　ｌ’−％　　ｇｌＮ　Ｎ　Ｎ　ＩＮ　Ｎ　Ｎ　ＩＮ　
ＩＮ　１１１Ｎ　Ｎ　ＩＮ　ＩＮ　ＳＦ４　Ｆ４　％１
１−１１−１１−１１−１−ＰＩ　−％Ｉ　Ｆ４　＋ｎ
　Ｐ４Ｑ　ｔｌ’ｌ　０　ａｔ’ｌ　６　Ｉ／１０１７
％　６　＆ｌ’Ｉ　Ｃ）　ｉｎ　Ｏｌ７１ｒ＋ｒ＋ｍΦ
Ｃ偽Ｏロー−ｉへｉ− 一一一一一一一一 ＡＴＧＣＡＡＣＧＡＡ　　ＣＡＡＡＣＡＣＧＧＣＴＴＴ
ＧＣＣＡＣＴＧ　　Ｃτ丁ＧτＧ＾丁ＡＧ　　ＧＴＡＡ
ＡＡＧＡＡＡ１５１−Ｚｏ。
２５↓−３００ Ｓｏｌ−５５０ ０ＩＪＳＯ ９ＳＬ−０ 入へ入＾＾Ｃ＾丁＾＾　ＧＡＡＡＧＴＡＣｋＧ　　ＡＧ
Ｇ入Ａ＾＾丁ＧＧ　　へ〇ＴＴ〒〒Ｃ丁ＧＧへ↑ＣＡＣ
Ｃ入ＡＴＧ　　ＧＣＡ？？ＧｆｆＴテ　Ｇ”〒Ｇ丁Ｇ丁
Ｇ７丁　？？丁ＣＣ丁Ｇ丁丁Ｃ丁丁入へＣ＾ＧＧＧ＾Ｇ
ＣＴＴＧＧＣｋＣＡ　　ＡＧＧＣＡＴ？ＣＧテ　丁Ｃ丁
Ａ丁丁ＧＴＡＡ　　ＣＧＡＧＴＧＡＣ丁丁　ＧＴｉＣＡ
ＡＣＧＡＧＡ丁ＧＣ丁ＧＡＡＧＡ　　ＡＴＡＧＧ入＾Ｃ
ＧＡ　　ＣＧＧＴＡＧｋ丁Ｇ？　　ＣＣＴＧＣＣ入Ａ丁
ＧＧＣ〒丁Ｃ丁ＡＣＡＣττＡＴＯＡ？ＧＣＡ　　？？
Ｃ八テへＧＣ？Ｇ　　ＣＴＧＣＣ入Ａ丁丁ＣＣｔ＝丁Ｃ
Ｃ？ＧＯτ　丁丁丁ＧＧＡＡＣ丁入ＣＴＧＧＴＧＡＴＧ
ｋ　　？ＡＣ？ＧＣＣＣＯ？　　ＡＧＧＡＪＩＡＧＡＡ
Ａ　　ＴＴＧＣＴＧＣＣＴＴ　　ＴＴＴＣＧＧＴＣｋ人
ＡＣＴＴＣＴＣＡＣＧ　　ｋｋｋｃ’ｒｋｃＴＧＧ　　
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ＧＡ　　丁へ丁丁ＡτＧＧ丁ＡＧＡＧＧＡＣＣＣＡＴ　
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ＣＴｋ丁入丁ＣＡ　　丁テ（ＪＡ＾ＡＣＡＧ　　Ｃ？Ａ
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Ｇ’！’？Ａ？ＣＡＴＣＧ　　ＧＴＣＧＴＴＯＧＡＣＴ
ＣＣＧＴＣＴＱＣＣａＣａコ入ＴＣＡＧＧ　　ＣＧＧＣ
ＧｋｋＴＣＧ　　ＡＧ丁ＡＣＣＡＧＧ丁　’ｒＡＣＧＧ
ＴＧ丁人Ａ　τ丁＾ＣＣＡＡＣＡτＣＡ？ＴＡＡＣＧＧ
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入入丁ＴＧＧ　　＾丁入＋ｊＡＣＡＧＧ　　ＡＧＧ？Ａ
丁ＴＧＴＧ　　ＧＴｋＴＧ’：’ＴｋＡＡ　　ＴＧ丁丁
ＧＣＴＣＣＧＧＧＧＧｋｋＡＡＣテ　？ＧＯＡＣ？Ｃ丁
丁人　ＣｋＡＣＣＪＬＡＡＧＧ　　ＡＡＣ？〒ＣＧＧＣ
ＣＡＧＧＧＣＴＡＧＧＣτ丁ＣＧ丁丁＾Ｃ八丁　入Ｇ入
ＡＴＧＣへＧへ　τＣ入τＣ丁丁人丁Ｇ　τＡ丁入口八
へＧ？丁　＾丁入τ丁丁Ｓ丁人τ丁へへＴτ入Ａ丁ＧＡ
　　入丁＾入ＧＧＧＧへテ　丁ＧＴＧＴＡＴＣＣＡ　　
Ｔ丁入＾Ｇ入Ａ丁丁Ａ　　ＧＧＴＧ入人Ａ丁人丁↑丁Ｃ
丁ＧＴＴＡＴ？　　ＴＧＴＣ丁τＣ？ＴＧ　　ＧＧＡＡ
Ｇ入ＡＣＣＡ　　人τ入Ｇ口丁ＣＣ丁＾　τＡ丁入ＴＧ
ＡＧＧＣＧＣＴＴＴ丁Ａ人ＧＴ　　ＧＡ？０ＡＧＯＣ丁
入　ＣＴＧＣＡ丁丁Ｇ八τ　Ｇへ＾入入ＣＧ入入＾　τ
τ丁ＣＴ＾ＴＣＣ＾Ｃ入入＾τ入入入＾Ｃ丁丁ＣＣ丁丁
ＧＴＣ丁配列７ 配列６　（，１） ５１−Ｚｏ。
６５１−フＯＯ フロ１−フ５０ フ５ｌ−８００ ｓａｌ−ａｓ。
１１０１−１ｏフ ＣＡＧＧＴＧＣＴＣＡ　　ｋＱｃＡＧＱｋ（ａＴＴ　　
ＴＧＴＴＡＴＧＧＡＡ　　ＧＧＣ入入（ａＧＧ入＾　Ｔ
ＧＧＡ？？ＡＣＣＡＴＣＴＣＣＡＧＣｋＱ　　Ａ？Ｇ？
？ＧＴＧ丁ＣＧＣ？ＡＴＧｅＡＡＣＣＧＡＡＡＣＡＡＣ
Ａ　　’ｌ’？ｃｏ？ＡＣＯＡ？ＧＡＧＡＡτＡＴＡ？
　　ＧＡ？ＣＣ？ｅＡＣＣＡＧＣＣＡＡＣ？Ｃ？　　Ｃ
ＧＡＡＧＣＧＣＴτ　ＡＧＡＧＧＣ？ＣＣＡ＾ＣＡ丁τ
ＧＡＧＣ？　　ＣＡＴＧＣテ＾ＧＧ？　　Ｇ？ＣＣＣｍ
？ＣＣＧＧＡＣｅＴ？ＧＡ　　ＧＡＡｒＱ’ＦＴＧＣＴ
ＧＣＴＡＧＣＣＡＡＧ　　ＣＣＡＡＴＭＣＡＧ＾　τ＾
ＣＴＴＧＧＧＴＣＣＡＡＡＡ（：入ｋＴｏ　　？？ＡＯ
ＯＡＡＣ？ＡＴＧＧＴＡＡＴＧＴＣＡＡＧＴＴＣＡＧＧ
？　Ａ？Ａ？ＡＧＣＡＧ？　　ＴＧＧＡＡＡＴＧｋＡ　
　ＧＴＴＡＧＴＣＣＣＴＴ人ＪｕＴＧ人＾＾Ａ　　ＣＴ
ＣＴＡＡＧＴＡＴ　ＧＴＡＣＣＴＩ；ＴＣＣ丁丁Ｃ丁ζ
＾ＡＣＣＣＣＡＴＧＣＧ＾＾八ＣＡ？？ＣＭへぐＴＧ　
　ＣＣＡＴＡＴＣＴＧＧ　　ＴＯＣＴＧＧＴＣ″ＰＴ　
ＱＧ入＾＾ＣＣＡＧＡ　テＧＡ＾ＡＧテＣテＣＣＡＣＡ
ＧＣＴＡＴＴ　　ＧＡＡＡＣＴＧＧＡＣＴ丁＾Ｃ丁ＡＣ
八ＣＡ　Ｃ＾ＣτテＣテＣＣテ　ＣＣＡＴＣ八＾Ａ丁へ
ＧＯＡＯＡＴＴＣ入Ａ　　ＡＧＡＴＱＡＴＧＴ丁　ＣＧ
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Ｇ＾ＣＣＣテＧ入＾＾　ｉ↑Ｇ＾ａｙａｃｈ丁丁〒丁０
ＧＡＣ？ＡＴｉτ〒ＣＡＧＣＡＡＡＣＡ？ＧＣＡＡＣＣ
ＡＭＧ丁＾ＣＣ＾Ｇ＾τＣＡＧτ丁Ｔ丁入ＡＣＴＡＣ？
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　　ＡＧＧＡＡ？ＡＡＧＧ　　ＡＣ？ＷＣＣテ〒テ（ｉ
ｉＡ’ｌ’ｃ＾＾ＧＡＧ　　ｋｋｋＧＴｋＧＴｃｃ　　
Ａ？１ＧＧＣＡＣテ＾　丁Ｇ丁ＡＣテＧＡＡ＾　Ｃ丁Ａ
丁Ａτ入τＣＡ丁ＧＣＴＣＡτＡＡＡ　　ＧＡＡＡＧ（
ＡＣ？ｒ　　Ａ？？ＡＣＡＡ？ＡＡ　　ＴＧＡＡＡｃＡ
ｃ’ｒ？　　ＡＣＡＡＧＡＡＡＡＧｃｃｘ’ｒｃλＡ 配列８ ４図面の簡単な説明 第１図はラムダｔｏｂｃｈｒ　ＰＲ１０１５（Ｄ部分的
な制限エンドヌクレアーゼ地図を表わす。ａｔｋｂ組換
えファージゲノムが示されたラムダの右側および左側ア
ームと共ＫＭかれている。１９ｋｂタバコ挿入物をラム
ダ地図の下に拡大して示す。
ＰＲ−ｄａ遺伝子の位置（網目状のハツチ）と転写の方
向（矢印）を示す、　Ｐ＝Ｐｓｔ　、　Ｈ＝Ｈｊｎｄ　
ｌ。
Ｃ＝Ｃ１ａ　Ｉ　、　Ｒ＝ＥｃｏＲＩ。
第２図はラムダｔｏｂｃｈｒＰＲｉ　（１１５がらｐＢ
Ｓ−ＰＲ１０１！ＩＣ１個の構築を表わす説明図である
。
２つのＣｌａＩ部位の間）１９　ｋｌ）　ＤＮＡ　断片
をブルースクリプトプラスミド内にサブクローン化しｆ
ｅ、Ｃ＝Ｃ１ａ　Ｉ　、　ＬＧＴアガロース＝ゲル化温
度の低−アガロース。
第３図はラムダｔｏｂｃｈｒＰＲ１０１５からｐＢＳ−
ＰＲ１０１３Ｅｃｏ　の構築を表わす説明図である。
うＡ　タｔｏｂｃｈｒ　ＰＲｌ　０１３がらのＰＲ−１
人遺伝子を含有する五６　ｋｂ　ＥｃｏＲＩ断片をブル
ースクリプト内にサブクローン化する。　Ｒ＝ＥＣＯＲ
Ｉ　、　ＬＧＴ　７ガロ一ス＝ゲル化温度の低いアガロ
ース。
第４　因１１’ｉ　ｐ１３ｓ−ＰＲ１１０１３Ｃ１ａ　
カＧ）ＰＲ８−ＰＲｌ　０１３　Ｅｃｏの構築を表わす
説明図である。　　ＰＲ−１ａ遺伝子を含有する五６ｋ
ｂＥｃｏＲＩ断片をブルースクリプトプラスミドのＥｃ
ｏＲＩ部位内にサブクローン化する。Ｃ＝　Ｃ１ａ　Ｉ
　、　Ｒ＝ＥｃｏＲＩ　。
ＬＧＴアガロース＝ゲル化温度の低いアガロース。
第５図はｐＢＳ−ＰＲ１０１３ＥｃｏからＰＢＳ−ＰＲ
ｌｏ　１ｓ　ＥｃｏΔＰｓｉの構築を表わす説明図であ
る。
６ｏｏｂｐＰｓｔＩＴＴ片をｐＢＳ−ＰＲ１０１５Ｅｃ
ｏがら欠失させる。　Ｐ＝Ｐｓｔ　Ｉ　、　Ｒ＝Ｅｃｏ
ＲＩ　、　Ｘ＝ＸｈｏＩ。
Ｓ　＝　Ｓａｌ　Ｉ　、　ＬＧＴアガロース＝ゲル化温
度の低いアガロース。
第６図はｐＢＳ−ＰＲ１０１３ＥｃｏΔＰｓｔからＰＢ
Ｓ−ＰＲ１０１３ＥｃｏΔＰ　５ｔＡＸｈｏ　（Ｄ　構
築を表わす説明図である。　２　ｋｂ　ＸｈｏＩをｐＢ
Ｓ　−ＰＲ１０１３Ｅｃ。
ΔＰｓｔから欠失させる。Ｒ＝ＥｃｏＲＩ　、　Ｐ＝Ｐ
ｓｔ　Ｉ　。
Ｘ＝Ｘｈｏ　Ｉ　、　５＝Ｓａｌ　Ｉ　、　ＬＧＴ　７
ガロ一ス＝ゲル化温度の低いアガロース。
第７図はｐＢｌｌｏｌ、３とｐＢＳ−ＰＲ１０１３Ｅｃ
。
ΔＰｓｔΔＸｈｏとからのｐＣＩＢ２７Ｑの構築を表わ
す説明図である。ＰＲ−１ａ遺伝子の一部および５′配
置配列を含有するＰｓｉ　Ｉ　−Ｘｈｏ　Ｉ断片をＳａ
ｌ　Ｉ　−ＢａｍＨＩ消化ｐＢＩｊ１．３内にサブクロ
ーン化する。）（ｈｏ　ＩおよびＳａｌ　Ｉ部位は一致
しておシ、そして連結されるとき両制限部位を破壊する
。Ｐｓｔ　Ｉ部位は分子アダプターを用いてＢａｍＨ１
部位に適応させる。Ｘ＝Ｘｈｏ　Ｉ　、　Ｐ＝Ｐｓｔ　
Ｉ　。
（Ｘ／Ｓ　）　＝　Ｘｈｏ　ＩとＳａｌ　Ｉ融合部位。
どちらの酵素もこの（Ｘ／Ｓ　）部位で今切らないであ
ろう。
ＬＤ＝Ｔ　−ＤＮＡ　左側ｔＪ界、ＲＢ　＝Ｔ　−ＤＮ
Ａ　　右０ｉ１１　境界。ＰＲ−１ａ訪導性領域から転
写の方向はｐＣＩＢ２７０上に矢印で示す。ｐｃＩＢ２
７０上の網目状のハツチはＮＯ８遺伝子の３′−プロセ
シング部位を表わす。ｐｃＩＢ２７０の細かい点を付し
た領域はβ−グルクロニダーゼ遺伝子を表わす。
ｐｃＩＢ２７０の粗い点を付した領域はネオマイシンホ
スホトランスフェラーゼ冨遺伝子を表わす。
ｐｃｒＢ２７０の白ヌキ領域はＮＯＳプロモーターを表
わす。
第８図はＭｌｓｍｐ　１ａ　−ＰＲ１ｏ　１３ＥｃｏΔ
ＰｓｔΔＸｈｏおよびＭｌ　３ｍｐ　１９−ＰＲ１０１
３ＥｃｏΔＰｓｔΔＸｂｏの構築を表わす説明図である
。ＰＲ，−１ａコ一ド配列の一部と５′配置配列を含有
するｐＢＳ−ＰＲ１ｏ１ｓＥｃｏΔＰｓｔΔＸｈｏから
のＰｓｔ　Ｉ　−Ａｓｐ　７１８断片をＡｓｐ　７１８
−　Ｐｓｔ　Ｉ消化Ｍｌ　３　ｍｐ　１８または１９内
にサブクローン化する。Ｒ＝ＥｃｏＲＩ　、Ｈ＝ｆｌｉ
ｎｄ　ｌ　、　Ｐ＝Ｐｓｔ　Ｉ　、　Ｋ＝ＫｐｎＩ　（
Ａｓｐ　７１８はＫｐｎＩのイノチゾマーである）、Ｌ
ＧＴアガロース＝ゲル化温度の低いアガロース。
第９図はＩ’ＴＬ−１個のＡＴＧ　：ｆドンノＮｃｏＩ
　　部位への変換を示す説明図である。Ｍ１３ｍｐ１８
−ＰＲ１０１３ＥｃｏΔＰｓｔΔＸｈｏの一本鎖ＤＮＡ
を実線で示す。配列ＴＣＡＴＧＣ）を部位関連突然変異
誘発によりＣＣＡＴＧＧに変換する。Ｋ＝Ｋｐｎ　Ｉ　
、　　Ｘ＝Ｘｈｏ　Ｉ　、　Ｂ＝Ｂｓｔ　Ｅ　Ｉ　、　
Ｐ＝Ｐｓｔ　Ｉ。
＠１０スはｐｃＩＩ３２６８の構築を表わす説明図であ
る。Ｍｌ　５　ｍｐ　１　Ｂ−Ｐｌｌ、１０１５　Ｅｃ
ｏΔｌ’ｓｔΔＸｈ。
の復製物から誘導されるＢｓｔＥｌ−ＰｓｔＩ断片をＢ
ｓｔＥＩ−Ｐｓｔ　Ｉ消化ｐＢ８−　ＰＲ１ｏ　１ｓ　
ＥｃｏΔＰｓｔΔＸＩ＋ｏ内にサブクローン化し、ｐＣ
ＩＢ２６８を形成する。Ｘ＝Ｘｈｏ　Ｉ　、　Ｂ＝Ｂｓ
ｔ　Ｅ　Ｈ、Ｎ＝Ｎｃｏ　Ｉ　、　Ｐ＝Ｐｓｔ　Ｉ　。
第１１図はｐＢＳ−ＧＵＳｔ２とｐＣＩＢ２６８とから
［）ＣＩＢ２６９の構築を表わす説明図である。
Ｘ＝Ｘｈｏ　Ｉ　、　Ｎ＝Ｎｃｏ　Ｉ　、　Ｐ＝ｌ’ｓ
ｔ　Ｉ。Ｉ）ＣＩＢ　２６９の網目状のハツチはＧＵ８
遺伝子配列を示し、そして細かい点を付した部分はＰＲ
−１ａ遺伝子から誘導された配列を示す。
ｖｌｌ　２　図ハＩ）ＢＳ−ＧＵＳ　１．２　（７１１
７Ｍ　ヲ表ｈス説明図である。ｐＢＳ−ＧＵＳ　１．２
はｐＲ，ＡＪ　２６　ｓ　。
ｐＢＩ２２１．１　　およびブルースクリプトプラスミ
ドから誘導された断片から５本の連結により作製される
。５＝８ａｌＩ、几＝Ｅｃｏ几Ｉ　、　Ｎ＝Ｎｃｏ　Ｉ
　。
第１３図はｐＣＩＢ２６９とｐｃＩＢ２００とからｐＣ
ＩＢ２７１の構築を表わす説明図である。
Ｘ＝Ｘｈｏ　Ｉ　、　Ｎ＝Ｎｃｏ　Ｉ　、　Ｒ＝Ｅｃｏ
几Ｉ　、　５＝Ｓａｌ　Ｉ　。
（Ｓ／Ｘ）　＝Ｓａｌ　Ｉ　オよびＸｈｏ　Ｉ部位の融
合、ＬＧＴアガロース＝ゲル化温度の低いアガロース。
第１４図はｐＣＩＢ　２１９の制限エンドヌクレアーゼ
地図を表わす、このプラスミドはＥｃｏＲＩ／ＸｈｏＩ
アダプターをＰＲ−１およびＧＵＳ遺伝子を含有するｐ
ＣＩＢ２６９　ＸｈｏＩ／ＥｃｏＲＩ断片に添加し、そ
してＳａｌ　Ｉ制限化ｐＣＩＢ７１２内にそれを連結す
ることにより構築される。
第１５因はｐＣＩＢ２７２の制限エンドヌクレアーゼ地
図を表わす、このプラスミドはＰＲ−１／ＧＵＳ遺伝子
（ＰＲ−１ａ　Ｏ：）　−８３３ないし＋１）を含有す
るｐＣＩ８２８２から（Ｄ　Ａｓｐ　７１８　Ｉ／Ｂａ
ｍＨＩ断片をＡｓｐ　７１８　Ｉ　／　ＢａｍＨＩ制限
化ｐＣＩＢ２００内に連結することによシ構築される。
第１６図はｐｃＩＢ２７３の制限エンドヌクレアーゼ地
図である。このプラスミドはＰＲ−１７ＧＵ８遺伝子（
ＰＲ−１個の−６０５ないし＋１）を含有するｐＣＩＢ
２８３からのＡｓｐ　７１８　Ｉ／ＢａｍＨＩ　　断片
をＡｓｐ　７１８　Ｉ／ＢａｍＨＩ制限化ｐｃＩＢ２０
０内に連結することにより構築される。
第１７図はｐｃＩＢ１ｏｏ４の制限エンドヌクレアーゼ
地図である。このプラスミドはｐＣより２６９（ＰＲ−
１３プロモーター含有）からのＸｈｏＩ／ＮｃｏＩ断片
をＮｃｏＩ／ＢａｍＨＩ断片としテｐＣＩＢ１０／３５
Ｂｔ（６０７）から切り出したＢＴ遺伝子およびＳ　ａ
ｌ　Ｉ　／ＢａｍＨＩ消化ｐＣＩＢ７１０とを連結する
ことによシ構築される。
第１８図はｐＣＩＢ　２００／ＰＲ１−ＢＴの制限エン
ドヌクレアーゼ地図である。このプラスミドはｐｃＩＩ
３１００４とｐｃＩＢ２Ｑ［ｌとから構築される。
第１９図はｐＣＩＢ１２０７の制限エンドヌクレアーゼ
地図である。アラビドブシスＡＨＡ　Ｓ遺伝子を含有す
るラムダゲノムクローンの５．８　ｋｈ　Ｘｂａ　Ｉ断
片をＸｂａＸ制限化ブルースクリプト内にクローン化す
る。
第２０図はｐＣＩＢ１２１６の制限エンドヌクレアーゼ
地図である。ｐＣＩＢ１２０７からの五３　ｋｂＮｃｏ
Ｉ／ＸｂａＩ断片を、ＧＵ８遺伝子を除去するためにＮ
ｃｏＩとＸｂａ　Ｉで制限化したｐＣＩＢ２６９内にク
ローン化する。
第２１図はｐｃＩＢ１２３３の制限エンドヌクレアーセ
地図である。４．２　ｋｂ　Ｋｐｎ　Ｉ／Ｘｂａ　Ｉ断
片をｐｃＩＤ１２１６から単離し、そしテＫ　ｐｎ　Ｉ
とＸｂａ　Ｉで制限化したｐｃＩＢ２００内に連結する
。
第２２図はｐＢ８　Ｇｌｕｃ　３９．　Ｉ　１０ＵＳの
制限エンドヌクレアーゼ地図である。ｐＢＳＧｌｕｃ　
５９．１のＩＪ６２ｂｐ断片を、ＮＣＯＩとＫｐｎ　Ｉ
で制限化したｐＢＳ−ＧＵＳ１．２内にクローン化する
。
第２３ｒＥ！ＪはｐｃＩＢ２００／Ｇｌｕｃ　５９．１
−ＧＵＳの制限エンドヌクレアーゼ地図である。β−グ
ルカナーゼプロモーターとＧＵＳ　Ｊ公子を含有するＫ
ｐｎ　Ｉ／Ｘｈａ　Ｉ断片をｐＢＳＧＩｕｃ　５９．１
　／ＧＵＳから単離し、そしテＫｐｎ　Ｉと）（ｂａ　
Ｉで制限化したｐｃＩＢ２００内に連結する。
第２４図はｐＣＩ　Ｂ　２００７Ｇｌｕｃ　３９．１−
　ＢＴ　の制限エンドヌクンアーゼ地図である。　ＢＴ
遺伝子を含有するＩ）ＣＩＢ１００４から１７）　Ｋｐ
ｎ　Ｉ／Ｎｃｏ　Ｉ断片、ｐＢＳＧ　Ｉｕｃ　３９．１
／ＧＵ８からノＫｐｎ　Ｉ／Ｎｃｏ　Ｉ断片およびＫｐ
ｎ　Ｉで制限されそしてウシ胸腺アルカリホスフ丁ター
ゼで処理したｐｃＩ８２００を連結する。
第２５図はｐＢＳ（）Ｊｕｃ　３９．１／ＧＵ８のＮｃ
ｏＩ／Ｘｂａ　Ｉ断片およびＡＨＡ８遺伝子を含有する
ｐＣＩＢ１２０７からのＡ　５　ｋｂ　Ｎｃｏ　Ｉ／Ｘ
ｂａ　Ｉ断片から構築されたｐＢＳＧｌｕｃ　５９．　
ｊ　／ＡＨＡＳの制限エンドヌクレアーゼ地図である。
第２６図はｐＣＩ　Ｂ　２００／Ｇ　ｌｕｃ　Ｓ　９．
１−ＡＨＡ８の制限エンドヌクレアーゼ地図である。β
−グルカナーゼプロモーターおよびＡＨＡ　８遺伝子を
含有するＫｐｎＩ／ＸｂａＩ断片をｐ　Ｂ　８ＧＩｕｃ
　５　？、　１　／ＡＨＡ８から単離し、そしてＸｐｎ
ＩとＸｂａ■で制限化したｐｃＩＢ２００内に連結する
。
第２７因はｐＢＳＧ　Ｉｕｃ　５９．３／ＧＵ８の制限
エンドヌクレアーゼ地回である。ｐ１３８Ｇ１ｕｃ　５
９，３の１６７７ｂｐ断片をＮｃｏ　ＩとＫｐｎＩで制
限化したｐＢ８−ＧＵＳｌ、２内にクローン化する。
Ｗｃ２８図はｐｃＩＢ２００／Ｇｌｕｅ３９．３−ＧＵ
Ｓの制限エンドヌクレアーゼ地図である。β−グルカナ
ーゼプロモーターとＧＵＳ遺伝子を含有するＫｐｎ　／
Ｘｂａ　Ｉ断片をｐＢ　５Ｇｌｕｃ　５９．　Ｓ　／Ｇ
ＵＳから単離し、そしてＫｐｎ　ＩとＸｂａ　Ｉで制限
したｐＣＩＢ２００内に連結する。
第２９図はｐｃＩＢ２００／Ｇｌｕｃ　５９．３−ＢＴ
ノ制限エンドヌクレアーゼ地図である。ＢＴ遺伝子を含
有するｐｃＩＢｌｏｏａからのＫｐｎ　Ｉ　／Ｎｃｏ　
Ｉ断片、ｐ　Ｂ　５ＧＩｕｃ　！　９，３　／ＧＵＳか
らのＫｐｎ　Ｉ　／Ｎｅｏ　Ｉ　断片およびＫｐｎ　Ｉ
で制限し、そしてウシ胸腺アルカリホス、７丁ターゼで
処理したｐｃｉ８２００　　を連結する。
第５０図はｐＢＳＧｌｕｃ　５９．３／ＧＵ８　ｃＤ　
Ｎｃｏ　Ｉ／Ｘｂａ　Ｉ断片およびＡＨＡ８遺伝子を含
有するｐＣＩＢ１２０７からの五３　ｋｂ　Ｎ　ｃｏ　
Ｉ　／Ｘｂａ　Ｉ断片から構築されたｐ　Ｂ　５ＧＩｕ
ｃ　５９，３　／Ａｌ−ｌＡｓの制限エンドヌクレアー
ゼ地図である。
第３１図はｐｃＩＢ２００／Ｇｌｕｃ　３９．１４ＨＡ
Ｓ　の制限エンドヌクレアーゼ地図である。β−グルカ
ナーゼプロモーターおよびＡＨＡＳ遺伝子を含有するＫ
ｐｎＩ／ＸｂａＩ断片をｐＢＳＧｌｕｃ　３９．３／Ａ
ＨＡＳから単離し、モしてＫｐｎ　Ｉと）（ｂａ　Ｉで
制限したりＣｌ８２００内に連結する。
！３２１ｇ１ｐＣＩ８１２０Ｂ（ＤｆｌｔｌＪ限ｊ−：
ｚ　トヌクＬ／アーゼ地図である。突然変異したアラビ
ドプシスＡＨＡ　Ｓ遺伝子を含有するラムダゲノムクロ
ーン（Ｄ　＆　８　ｋｂＸｂａ　Ｉ断片をＸｂａ　Ｉ制
限化ブルースクリプト内にクローン化する。
第３３図はｐｃＩＢ１２３０の制限エンドヌクレアーゼ
地図である。ｐ（’ｌｌ３ｆ２０８からの５五ｋｂＮｅ
ｏ　Ｉ　／Ｘｂａ　Ｉ断片を、ＧＵＳ遺伝子を除去する
ためにＮｃｏ　ＩとＸｂａ　Ｉで制限化したｐＣＩＢ２
６９内にクローン化する。
第３４図はｐＣＩＢ　１２５２の制限エンドヌクレアー
セ池図である。　４．２　ｋｂ　Ｋｐｎ　Ｉ／Ｘｂａ　
Ｉ断片をｐｃＩＢ１２３ｏから単離し、そしてＫｐｎＩ
とＸｂａ　Ｉで制限化したｐｃＩＢ２００内に連結する
。
第３５図はｐＢ　８Ｇｌｕｃ　５９．１　／ＧＵ８のＮ
ｃｏＩ／Ｘｂａ　Ｉ断片とＡＨＡＳ遺伝子を含有するｐ
ＣＩＢ１２０８からの五３　ｋｂ　Ｎｅｏ　Ｉ　／Ｘｂ
ａ　Ｉ断片から構築されるｐＢＳＧｌｕｃ　５９．１／
ＡＨＡＳ−８ｕ几の制限エンドヌクレアーゼ地図である
。
第５６図はｐＣＩ　Ｂ　２００　／Ｇｌｕｃ　５９．１
−ＡＨＡＳ８ｕＲの制限エンドヌクレアーゼ地図である
。
β−グルカナーゼプロモーターおよびＡＨＡＳ遺伝子を
含有するＫｐｎ　Ｉ　／Ｘｂａ　Ｉ断片をｐＢＳＧＩｕ
ｃ３９．１　／ＡＨＡＳ−８ｕ几から単離し、そしてＸ
ｐｎＩとＸｂａ　Ｉで制限化したｐＣＩＩ３２００内に
連結する。
第３７図はｐＢＳＧＩｕｃ　３９．３／ＧＵＳのＮｃｏ
　Ｉ／Ｘｂａ　Ｉ断片およびＡＨＡＳ遺云子を含有する
ｐｃＩＢ１２０８からの五３　ｋｂ　Ｎｃｏ　Ｉ／Ｘｂ
ａ　Ｉ断片から構築されたｐＢＳＧｌｕｃ　５９．３／
Ａｌ−ｌＡ３−　ＳｕＲの制限エンドヌクレアーゼ地図
である。
第３８図はｐｃＩＢ２００／Ｇｌｕｃ　３９．３−Ａｆ
−ＪＡＳ−８ｕＲの利μ艮エンドヌクレアーゼ地図であ
る。β−グルカナーゼプロモーターおよびＡＨＡＳ遺云
子を含有するＫｐｎ　Ｉ／Ｘｂａ　Ｉ　Ｐｆ＋片をｐＢ
Ｓ（）ｌｕｃ３９ｊ／ＡＨＡ　Ｓ　−Ｓ　ｕ几から単離
し、そしテＸｐｎ　ＩとＸｂａ　Ｉで制限化したｐＣＩ
Ｂ２００内に連結する。
特許出願人　　チノく−ガイギー　アクチェング妃ルシ
ャフトλｔｏｂｃｈｒ　ＰＲ１０１３ｔｐら ｐｕｓ−ＰＲ１０１３Ｃ１ａ　ノ４Ｂ　Ｈ↓ｘＬＧＴ　
アカ゛ロース ↓ｘｃＩａ　１ １；逢合 ◆ ↓連帖 ｊ　ｓ；　ｒｘ　ｈ　ｔ＋ ＦＩＧＬＪＩｔＩら２ 入ｔｏｂｃｈｒＰＲ１０１３ｎ・らｐＢＳ−ＰＲ１０１
３Ｅｃｏ　の４１’ｌ↓ＸＥｃｏ　Ｒ１ １ＸＥｃｏ日１ １舶ｂ ↓も１転７キ 日 ＦＴＧｔＪＲＥ　３ ρＢ、５−ＰＲ１０１３Ｃ１ａ　ｔｐうｐｕｓ−ＰＲ１
０１３Ｅｃｏ　ノ４１）　染ｐｓｓ−ＰＲ１０１３Ｅｃ
ｏｎ、；ｐＢＳ−ＰＲ１０１３Ｅｃｏ　△　ＰＳｔの慎
’Ｊト毘合 ↓遁絽 ↓杉買転を央 ↓ｘＬＧＴ　７ｎ’Ｏ−ス ↓連倉舌 ↓η４絋犠 鉱 Ｆ璽ＧＵｆｔＥ　４ ＦＩＧＬＩＲＥ　５ ｐＢＳ−ＰＲ１０１３ＥｃｏΔＰＳｔｒｃ；ｐｕｓ−Ｐ
Ｒ１０１３ＥｃｏΔＰｓｔΔＸｈＯのｍ’１Ｅｐｃｔ　
Ｂ　２７０の構築 ↓Ｉｉｇａｌｅ　ｔｏ　Ｐｓ電１７日ａｒｎＨ１アブブ
タ−↓ｘＢａｍ＋−１１↓ｘＢａｍ　Ｈｌ　　　　　　
　　　　　　↓Ｘ５ａｌ　Ｉト毘合 ↓連鰭 ｅＹｈｆｅ ＦＴにＯＲＥ　６ ｐＢＳ−ＰＲ１０１３ＥｃｏΔＰｓ＋ΔＸｈ。
ＦＩＧＵＲＥ　７ Ｍ＋３　ｍｐ１８−ＰＲ１０１３εｃＯΔＰｓｌΔＸｈ
ｏＪ、ＪｂＭ　Ｉ　３ｍｐ　１９−ＰＲ＋　０１３　Ｅ
ｃｏΔＰｓｌΔＸｈｏノ情染ｘＰｓｌ ↓ｘＬＧＴ？＋＋＋ｏづ １、先番 １達１シ １形″１転１央 ↓ｘＰｓ電１ ｌｘＬＧＴアｆｆＱ−ス ｔ’＋ｃ；ｕｒｕ：　ｓ ｐｃ’５２６８の橋す ↓ｘＰｓ目　　　　　　　　　　　↓ｘＰｓｌ　Ｉ（−
一一一一一一一） ↓、１合 ｊｌ！ｉ： １形買転を央 ＦＩＧｔＪＲＥ　１０ ＦＩＧＵＩＩＥ　９ ｐｃ１８２６９の積り １、昆合 ↓遣ｎ ＩＲシπね墳 ＦＩＧＵＲＥ　１１ ｐＢＳ　ＧＬＩＳＩ・２の１壕 ト静 ＩＩｔ奢Ｇ １１帷捜 ＦＩＧＵｒｔＥ　１２ ＦＩＧＵＩｔＥ　１４ ｐｃＩＢ　２７１の４ｊｔ輩 ↓形Ｖ転潰 ＦＩＧＵＩセＥ１３ ｐｃｉ［１２００内の（：、　ｕ　ｓ　ｉｆｆｆｆ伝流
上流る１）旧Ａブ１」モーター配列（八１ｕｌ−Ｎｃｏ
ｌ）の５゛欠失ＦＩＧｔＪＩｉｌシ１５ ＰＣＩＩ’３２００内のＧｕｓ遺伝子上流にあるＰＲＩ
Ａプｔコモ−ター配列（ｌＩａｅ［１Ｉ−Ｎｃｏｌ）の
５′欠失ＦＩＧＬＪＲＩシ１６ ＵＪ　１ｔＪｉバチルススリンギエンンス内毒素」転子
上流にあるＰＲＩａｉｌｌｌｌム子からのプ！ノモータ
ー配列日ＧＵＩＤＥ　＋８ Ｓａ　ｌ　Ｉ／１３ａｍｌｌ　Ｉ消化ｐ　Ｃ［［３７１
０内にクローン化した切断バチルススリンギエンノス内
毒素ｌｆｆ公子上流にあるＰ１？１ａプロモーター ＦＩＧＵＲＥ１７ ＦＩＧＵＲＥ　１９ ブルースクリプト内にクローン化した野性型アラビドプ
シスＡＩＩ　Ａ　Ｓ遺伝子上流にあるＰＩ？１ａブロモ
−クーＦＩＧＵｆｌＥ　２０ ＦＩＧＵＲＥ　２２ ｐＩ３ｓＧＵｓ１．２からのＧＵＳｉｌＩ伝子上流に公
子β−１゜３−グルクロニダーゼクロー７ｐＢＳＧＩｕ
ｃ３９．１からのプロモーター配列 ＦＩＧＬＩＩ（Ｅ　２３ ブルースクリプト内にクローン化した野性型アラビドブ
シスＡ　ＩＩ　Ａ　Ｓ遺伝子ｌ流にあるグルカナーゼ３
つ、１プａモーターＦＩＧ［ＪＩｔＬ：ツ 切断バチルススリンギエンシス内毒素遺伝子上流にある
β−１，３−グルクロニダーゼクローンｐＢＳＧＩｕｃ
３９．１からのプロモーター配列 ＦＩＧＵＲＥ　２４ 野性型アへ上１′プンス八ＩＩ　Ａ　Ｓ遺伝子上流にあ
るβ−１，３−グルクロニダーゼクローンρｎ５ＧＩｕ
ｃ３り、ｌがらのブリモーター配列 ＦＩＧｔＪＩζＥ２６ ＦＩＧＬＩＲＥ　　２７ ｐＢＳＧＵ３１．２からのＧＵＳ遺伝子上流にあるβ−
１゜３−グルクロニダーゼクローンｐＢＳＧＩｕｃ３９
．３からのプロモーター配列 ＦＩＧＵＲＥ　２Ｂ 除草剤耐性アラビドプシスＡ　ＩＩ　Ａ　Ｓ遺伝子上流
にあるβ−１゜３−グルクロニダーゼクローンｐｎｓｃ
；１ｕｃ３９．１からのプロモーター配列 ブルースクリプト内にクローン化した除草剤耐１生アラ
ビｌ′フ。
シスＡ　ＩＩ　Ａ　Ｓ　遺伝子上流にあるグルカナーゼ
３９．３プロモーター ＦＩＧＵＲＥ　３６ ＦＩＧＵＲＥ　　３フ

Claims (1)

  1. 【特許請求の範囲】 （１）調節が化学調節剤に依存する植物または植物組織
    内の関連ＤＮＡ配列の転写を調節することができる非コ
    ードＤＮＡ配列。 （２）請求項１記載の実質的に純粋な非コードＤＮＡ配
    列。 （３）前記関連ＤＮＡ配列がコード配列である請求項２
    記載のＤＮＡ配列。 （４）前記調節が誘導性化学調節剤に依存する請求項２
    記載のＤＮＡ配列。 （５）天然に生じる化学的に調節可能な遺伝子の一部で
    ある非コード性の化学的に調節可能なＤＮＡ配列である
    か、またはその配列に対して実質的な配列相同性を有す
    る請求項１記載の実質的に純粋なＤＮＡ配列。 （６）関連ＤＮＡ配列がコード配列である植物または植
    物組織内の前記関連ＤＮＡ配列の転写を調節することが
    できる請求項５記載のＤＮＡ配列。 （７）前記転写が誘導性化学調節剤により調節される請
    求項６記載のＤＮＡ配列。 （８）前記化学的に調節可能な遺伝子がＰＲタンパク質
    遺伝子である請求項５記載のＤＮＡ配列。 （９）前記ＰＲタンパク質遺伝子がタバコＰＲ−１ａ、
    ＰＲ−１ｂ、ＰＲ−１ｃ、ＰＲ−１′、ＰＲ−Ｑもしく
    はＰＲ−Ｒ遺伝子、キュウリキチナーゼ遺伝子、または
    タバコ塩基性もしくは酸性β−１，３−グルカナーゼ遺
    伝子である請求項８記載のＤＮＡ配列。 （１０）前記ＰＲタンパク質遺伝子がタバコＰＲ−１ａ
    、ＰＲ−１ｂ、ＰＲ−１ｃ、ＰＲ−１′もしくはＰＲ−
    Ｒ遺伝子またはキュウリキチナーゼ遺伝子である請求項
    ８記載のＤＮＡ配列。 （１１）前記ＰＲタンパク質遺伝子がタバコＰＲ−１ａ
    遺伝子である請求項８記載のＤＮＡ配列。 （１２）前記ＰＲタンパク質遺伝子がタバコＰＲ−１′
    遺伝子である請求項８記載のＤＮＡ配列。 （１３）前記ＰＲタンパク質遺伝子が塩基性タバコβ−
    １，３−グルカナーゼ遺伝子である請求項８記載のＤＮ
    Ａ配列。 （１４）前記ＰＲタンパク質遺伝子の５′配置領域に位
    置する請求項８記載のＤＮＡ配列。 （１５）前記転写が安息香酸、サリチル酸、アセチルサ
    リチル酸、ポリアクリル酸およびそれらの置換誘導体か
    らなる群から選択される調節剤により調節される請求項
    ６記載のＤＮＡ配列。 （１６）前記転写がベンゾ−１，２，３−チアジアゾー
    ルカルボン酸、ベンゾ−１，２，３−チアジアゾールチ
    オカルボン酸、シアノベンゾ−１，２，３−チアジアゾ
    ール、ベンゾ−１，２，３−チアジアゾールカルボン酸
    アミド、ベンゾ−１，２，３−チアジアゾールカルボン
    酸ヒドラジド、およびそれらの誘導体からなる群から選
    択される調節剤により調節される請求項６記載のＤＮＡ
    配列。 （１７）前記転写がメチルベンゾ−１，２，３−チアジ
    アゾール−７−カルボキシレートにより調節される請求
    項１６記載のＤＮＡ配列。 （１８）前記転写がジクロロイソニコチン酸またはそれ
    らの誘導体により調節される請求項６記載のＤＮＡ配列
    。 （１９）天然に生ずる化学的に調節可能な遺伝子の非コ
    ード性の化学的に調節可能なＤＮＡ配列であるか、また
    はその配列に実質的な配列相同性を有する第一のＤＮＡ
    成分配列、この第一の成分配列は前記調節が化学調節剤
    に依存する植物または植物組織内の関連ＤＮＡ配列の転
    写を調節することができるものであり、これと天然に生
    じる化学的に調節可能な遺伝子内で第一の成分が関連す
    る転写可能なＤＮＡ配列の全てでなく部分であるか、ま
    たはこれに実質的な配列相同性を有する第二のＤＮＡ成
    分配列とからなるＤＮＡ配列。 （２０）請求項１９記載の実質的に純粋なＤＮＡ配列。 （２１）前記天然に生じる化学的に調節可能な遺伝子が
    植物に由来し、そして前記第二のＤＮＡ成分配列がコー
    ド配列である請求項２０記載のＤＮＡ配列。 （２２）前記遺伝子がＰＲタンパク質遺伝子である請求
    項２１記載のＤＮＡ配列。 （２３）コード配列がシグナルペプチドをコードする請
    求項２１記載のＤＮＡ配列。 （２４）調節が化学調節剤に依存する植物または植物組
    織内の関連ＤＮＡ配列の転写を調節することができる非
    コード性の化学的に調節可能な第一のＤＮＡ成分配列お
    よび植物または植物組織内で転写され得る第二のＤＮＡ
    成分配列からなるキメラＤＮＡ配列。 （２５）前記第二のＤＮＡ成分配列がアンチセンス機構
    により表現型の特徴の発現を調節することができる請求
    項２４記載のキメラＤＮＡ配列。 （２６）前記第二のＤＮＡ成分配列が転写および翻訳さ
    れて、表現型の特徴を生ずるポリペプチドを産生するこ
    とができるコード配列である請求項２４記載のキメラＤ
    ＮＡ配列。（２７）前記第二のＤＮＡ成分配列が第一の
    成分配列に隣接している請求項２４記載のキメラＤＮＡ
    配列。 （２８）前記第一のＤＮＡ成分配列が抑制性化学調節剤
    により調節される請求項２４記載のキメラＤＮＡ配列。 （２９）前記第一のＤＮＡ成分配列が誘導性化学調節剤
    により調節される請求項２４記載のキメラＤＮＡ配列。 （３０）前記第一のＤＮＡ成分配列が植物からの天然に
    生じる化学的に調節可能な遺伝子内の化学的に調節可能
    なＤＮＡ配列であるか、またはその配列に実質的な配列
    相同性を有する請求項２４記載のキメラＤＮＡ配列。 （３１）前記第一のＤＮＡ成分配列が植物からの天然に
    生じる化学的に調節可能な遺伝子内の化学的に調節可能
    なＤＮＡ配列であるか、またはその配列に実質的な配列
    相同性を有し、そして前記第二のＤＮＡ成分配列が、転
    写および翻訳されて表現型の特徴を生ずるポリペプチド
    を産生し得るコード配列である請求項２４記載のキメラ
    ＤＮＡ配列。 （３２）前記第二のＤＮＡ成分配列が第一のＤＮＡコー
    ド配列に隣接している請求項３１記載のキメラＤＮＡ配
    列。 （３３）前記第一のＤＮＡ成分配列が誘導性化学節剤に
    より調節される請求項３１記載のキメラＤＮＡ配列。 （３４）前記第一のＤＮＡ成分配列がＰＲタンパク質遺
    伝子内の化学的に誘導可能なＤＮＡ配列であるか、また
    はその配列に実質的な配列相同性を有する請求項３１記
    載のキメラＤＮＡ配列。 （３５）前記ＰＲタンパク質遺伝子がタバコＰＲ−１ａ
    、ＰＲ−１ｂ、ＰＲ−１ｃ、ＰＲ−１′、ＰＲ−Ｑもし
    くはＰＲ−Ｒ遺伝子、キュウリキチナーゼ遺伝子、また
    はタバコ塩基性もしくは酸性β−１，３−グルカナーゼ
    遺伝子である請求項３４記載のキメラＤＮＡ配列。 （３６）前記ＰＲタンパク質遺伝子がタバコＰＲ−１ａ
    、ＰＲ−１ｂ、ＰＲ−１ｃ、ＰＲ−１′もしくはＰＲ−
    Ｒ遺伝子またはキュウリキチナーゼ遺伝子である請求項
    ３４記載のキメラＤＮＡ配列。 （３７）前記ＰＲタンパク質遺伝子がタバコＰＲ−１ａ
    またはＰＲ−１′遺伝子である請求項３４記載のキメラ
    ＤＮＡ配列。 （３８）前記ＰＲタンパク質遺伝子が塩基性タバコβ−
    １，３−グルカナーゼ遺伝子である請求項３４記載のキ
    メラＤＮＡ配列。 （３９）前記第一のＤＮＡ成分配列がタバコＰＲ−１ａ
    遺伝子の５′配置領域であり、そして転写開始部位に隣
    接して約３００またはそれ以上の塩基対を含有する請求
    項３１記載のキメラＤＮＡ配列。 （４０）前記第一のＤＮＡ成分配列が転写開始部位に隣
    接して約６００と１０００の間の塩基対を含有する請求
    項３９記載のキメラＤＮＡ配列。 （４１）第二のＤＮＡ成分配列が表現型の特徴をコード
    する請求項３１記載のキメラＤＮＡ配列。 （４２）前記表現型の特徴が除草剤、菌類、ウィルス、
    バクテリア、昆虫、線虫もしくはクモ形類動物に対する
    許容性もしくは耐性、二次代謝物の産生、雄性もしくは
    雌性不稔性および酵素もしくはその他のリポーター化合
    物の産生からなる群から選択される請求項４１記載のキ
    メラＤＮＡ配列。 （４３）前記表現型の特徴が除草剤に対する許容性もし
    くは耐性または昆虫に対する耐性である請求項４１記載
    のキメラＤＮＡ配列。 （４４）前記除草剤に対する許容性または耐性が野生型
    または除草剤耐性アセトヒドロキシ酸シンターゼ（ＡＨ
    ＡＳ）をコードするＤＮＡ配列に起因する請求項４３記
    載のキメラＤＮＡ配列。 （４５）前記昆虫に対する耐性がバチラススリンギエン
    シス内毒素（ＢＴ）をコードするＤＮＡ配列に起因する
    請求項４３記載のキメラＤＮＡ配列。 （４６）前記表現型の特徴が、ルシフェラーゼ（ＬＵＸ
    ）、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ
    （ＣＡＴ）、ネオマイシンホスホトランスフェラーゼ（
    ＮＰＴ）、ノパリンシンターゼ（ＮＯＳ）、オクトピン
    シンターゼ（ＯＣＳ）、β−１，３−グルクロニダーゼ
    （ＧＵＳ）、アセトヒドロキシ酸シンターゼ（ＡＨＡＳ
    ）およびバチラススリンギエンシス内毒素（ＢＴ）から
    なる群から選択されるリポーター化合物である請求項４
    １記載のキメラＤＮＡ配列。 （４７）前記表現型の特徴がβ−１，３−グルクロニダ
    ーゼ（ＧＵＳ）、アセトヒドロキシ酸シンターゼ（ＡＨ
    ＡＳ）およびバチラススリンギエンシス内毒素（ＢＴ）
    おらなる群から選択されるリポーター化合物である請求
    項４１記載のキメラＤＮＡ配列。 （４８）前記第一のＤＮＡ成分配列が植物内のＰＲタン
    パク質遺伝子を誘導する化学調節剤により調節される請
    求項２４記載のキメラＤＮＡ配列。 （４９）化学調節剤が安息香酸、サリチル酸、アセチル
    サリチル酸、ポリアクリル酸およびそれらの置換誘導体
    からなる群から選択される請求項４８記載のキメラＤＮ
    Ａ配列。 （５０）化学調節剤がベンゾ−１，２，３−チアジアゾ
    ールカルボン酸、ベンゾ−１，２，３−チアジアゾール
    チオカルボン酸、シアノベンゾ−１，２，３−チアジア
    ゾール、ベンゾ−１，２，３−チアジアゾールカルボン
    酸アミド、ベンゾ−１，２，３−チアジアゾールカルボ
    ン酸ヒドラジド、およびそれらの誘導体からなる群から
    選択される請求項４８記載のキメラＤＮＡ配列。 （５１）化学調節剤がベンゾ−１，２，３−チアジアゾ
    ール−７−カルボン酸、ベンゾ−１，２，３−チアジア
    ゾール−７−チオカルボン酸、７−シアノベンゾ−１，
    ２，３−チアジアゾール、ベンゾ−１，２，３−チアジ
    アゾール−７−カルボン酸アミド、ベンゾ−１，２，３
    −チアジアゾール−７−カルボン酸ヒドラジド、および
    それらの誘導体からなる群から選択される請求項４８記
    載のキメラＤＮＡ配列。 （５２）化学調節剤がベンゾ−１，２，３−チアジアゾ
    ールカルボン酸、化合物中のアルキル基が１ないし６個
    の炭素原子を有するアルキルベンゾ−１，２，３−チア
    ジアゾールカルボキシレート、およびこれら化合物の置
    換誘導体からなる群から選択される請求項４８記載のキ
    メラＤＮＡ配列。 （５３）化学調節剤がジクロロイソニコチン酸またはそ
    の誘導体である請求項４８記載のキメラＤＮＡ配列。 （５４）化学調節剤がベンゾ−１，２，３−チアジアゾ
    ール−７−カルボン酸、メチルベンゾ−１，２，３−チ
    アジアゾール−７−カルボキシレート、ｎ−プロピルベ
    ンゾ−１，２，３−チアジアゾール−７−カルボキシレ
    ート、ベンジルベンゾ−１，２，３−チアジアゾール−
    ７−カルボキシレート、ベンゾ−１，２，３−チアジア
    ゾール−７−カルボン酸第二ブチルヒドラジド、２，６
    −ジクロロイソニコチン酸、およびメチル２，６−ジク
    ロロイソニコチネートからなる群から選択される請求項
    ４８記載のキメラＤＮＡ配列。 （５５）化学調節剤がメチルベンゾ−１，２，３−チア
    ジアゾール−７−カルボキシレートである請求項４８記
    載のキメラＤＮＡ配列。 （５６）天然に生ずる化学的に調節可能な遺伝子の非コ
    ード性の化学的に調節可能なＤＮＡ配列であるか、また
    はその配列に実質的な配列相同性を有する第一のＤＮＡ
    成分配列、この第一の成分配列はこの調節が化学調節剤
    に依存する植物または植物組織内の関連ＤＮＡ配列の転
    写を調節することができるものであり、これと天然に生
    じる化学的に調節可能な遺伝子内で第一の成分が関連す
    る転写可能なＤＮＡ配列の全てでなく部分であるか、ま
    たはこれに実質的な配列相同性を有する第二のＤＮＡ成
    分配列と、そして植物または植物組織内で転写され得る
    第三のＤＮＡ成分配列とからなる請求項２４記載のキメ
    ラＤＮＡ配列。 （５７）第一のＤＮＡ成分配列がＰＲタンパク質遺伝子
    内の化学的に誘導可能なＤＮＡ配列であるか、またはそ
    の配列に実質的な配列相同性を有する請求項５６記載の
    キメラＤＮＡ配列。 （５８）第二のＤＮＡ成分配列がシグナルペプチドをコ
    ードする請求項５６記載のキメラＤＮＡ配列。 （５９）第二のＤＮＡ成分配列が、ＰＲタンパク質遺伝
    子からのシグナルペプチドであるか、またはそれに実質
    的な配列相同性を有するペプチドをコードする請求項５
    ８記載のキメラＤＮＡ配列。 （６０）ＰＲタンパク質遺伝子がＰＲ−１ａ遺伝子であ
    る請求項５９記載のキメラＤＮＡ配列。 （６１）第三のＤＮＡ成分配列が表現型の特徴をコード
    する請求項５６記載のキメラＤＮＡ配列。 （６２）請求項１記載の非コードＤＮＡ配列からなるベ
    クター。 （６３）請求項２４記載のキメラＤＮＡ配列からなる請
    求項６２記載のベクター。 （６４）植物細胞内またはアグロバクテリウム内で機能
    する請求項６２記載のベクター。（６５）１９８８年２
    月１２日に寄託した大腸菌ＨＢ１０１／ｐＴＪＳ７５−
    ＿Ｋ＿ｍ（ＡＴＣＣ番号６７６２８）である請求項６２
    記載のベクター。 （６６）１９８８年２月１２日に寄託したグラスミドｐ
    ＢＳ−ＰＲ１０１３Ｃｌａ（ＡＴＣＣ番号４０４２６）
    である請求項６２記載のベクター。 （６７）１９８８年２月１２日に寄託したグラスミドｐ
    ＢＳ−ＰＲ１０１９（ＡＴＣＣ番号４０４２７）である
    請求項６２記載のベクター。 （６８）１９８８年１２月２９日に寄託したプラスミド
    ｐＢＳ−Ｇｌｕｃ３９．１（ＡＴＣＣ番号４０５２６）
    である請求項６２記載のベクター。 （６９）１９８８年１２月２９日に寄託したプラスミド
    ｐＢＳ−Ｇｌｕｃ３９．３（ＡＴＣＣ番号４０５２７）
    である請求項６２記載のベクター。 （７０）１９８８年１２月２９日に寄託したプラスミド
    ｐＢＳｃｕｃｃｈｉ／キチナーゼ（ＡＴＣＣ番号４０５
    ２８）である請求項６２記載のベクター。 （７１）１９８９年１月１８日に寄託したプラスミドｐ
    ＢＳＧＬ６ｅ（ＡＴＣＣ番号４０５３５）である請求項
    ６２記載のベクター。 （７２）請求項２４記載のキメラＤＮＡ配列を含有する
    植物組織、植物体または種子。 （７３）次式： 【アミノ酸配列があります】 で表わされるアミノ酸配列を有する実質的に純粋なシグ
    ナルペプチドまたは該ペプチドに実質的な配列相同性を
    有するペプチド。 （７４）請求項７３記載のシグナルペプチドまたは該ペ
    プチドに実質的な配列相同性を有するペプチドをコード
    するＤＮＡ配列。 （７５）次式： 【アミノ酸配列があります】 配列１（１） 【アミノ酸配列があります】 配列１（２） 【遺伝子配列があります】 配列１（３） で表わされる「配列１」で示されるか、または該「配列
    １」で示される配列に実質的な配列相向性を有する請求
    項１９記載の実質的に純粋なＤＮＡ配列。 （７６）次式 【遺伝子配列があります】 配列２（１） 【遺伝子配列があります】 配列２（２） 【アミノ酸配列があります】 配列２（３） で表わされる「配列２」で示されるか、または該「配列
    ２」で示される配列に実質的な配列相同性を有する請求
    項１９記載の実質的に純粋なＤＮＡ配列。 （７７）次式： 【アミノ酸配列があります】 配列３（１） 【アミノ酸配列があります】 配列３（２） で表わされる「配列３」で示されるか、または該「配列
    ３」で示される配列に実質的な配列相向性を有する実質
    的に純粋なＤＮＡ配列。 （７８）次式： 【遺伝子配列があります】 配列４ で表わされる「配列４」で示されるか、または該「配列
    ４」で示される配列に実質的な配列相向性を有する実質
    的に純粋なＤＮＡ配列。 （７９）次式： 【遺伝子配列があります】 配列５（１） 【遺伝子配列があります】 配列５（２） 【遺伝子配列があります】 配列５（３） で表わされる「配列５」で示されるか、または該「配列
    ５」で示される配列に実質的な配列相向性を有する請求
    項１９記載の実質的に純粋なＤＮＡ配列。 （８０）次式： 【遺伝子配列があります】 配列６（１） 【遺伝子配列があります】 配列６（２） 【遺伝子配列があります】 配列６（３） 【遺伝子配列があります】 配列６（４） で表わされる「配列６」で示されるか、または該「配列
    ６」で示される配列に実質的な配列相向性を有する請求
    項１９記載の実質的に純粋なＤＮＡ配列。 （８１）次式： 【遺伝子配列があります】 配列７ で表わされる「配列７」で示されるか、または該「配列
    ７」で示される配列に実質的な配列相向性を有する実質
    的に純粋なＤＮＡ配列。 （８２）次式： 【アミノ酸配列があります】 配列８ で表わされる「配列８」で示されるか、または該「配列
    ８」で示される配列に実質的な配列相同性を有する実質
    的に純粋なＤＮＡ配列。 （８３）化学的に調節可能な遺伝子を含有する天然に生
    ずる系内で化学的に調節可能な遺伝子から実質的に純粋
    な化学的に調節可能なＤＮＡ配列を調製する方法であっ
    て、以下の段階： （ａ）化学的に調節可能な遺伝子からＲＮＡの前記系内
    での発現を活性化し、 （ｂ）前記ＲＮＡを単離し、 （ｃ）前記の活性化した系から単離したＲＮＡから生じ
    たＲＮＡ並びに活性化していない対照系から単離したＲ
    ＮＡから生じたＲＮＡに対するゲノムライブラリィを別
    々にスクリーニングし、 （ｄ）ゲノムクローンを単離し、 （ｅ）前記ゲノムクローンから化学的に調節可能な遺伝
    子をサブクローン化し、そして （ｆ）所望する化学的に調節可能なＤＮＡ配列を単離す
    る、 からなる前記方法。 （８４）請求項８３記載の方法により単離された実質的
    に純粋なＤＮＡ配列。 （８５）前記系が植物であり、以下の段階： （ａ）化学的に調節可能な遺伝子からのポリＡ＋ＲＮＡ
    の前記植物内での発現を活性化し、 （ｂ）前記ポリＡ＋ＲＮＡを単離し、 （ｃ）前記ポリＡ＋ＲＮＡからｃＤＮＡライブラリィを
    構築し、 （ｄ）前記ｃＤＮＡラリブラリィと活性化していない対
    照植物内のＲＮＡから生じたｃＤＮＡとを別々にスクリ
    ーニングし、 （ｅ）化学的に調節可能であるｃＤＮＡクローンを単離
    し、 （ｆ）段階（ｅ）のｃＤＮＡクローンをブローブとして
    用い前記植物のゲノムライブラリィからゲノムクローン
    を単離し、 （ｇ）前記ゲノムクローンから化学的に調節可能な遺伝
    子をサブクローン化し、そして （ｈ）所望する化学的に調節可能なＤＮＡ配列を単離す
    る、 からなる請求項８３記載の方法。 （８６）前記化学的に調節可能な遺伝子がＰＲタンパク
    質遺伝子である請求項８５記載の方法。 （８７）前記ＰＲタンパク質遺伝子が化学誘導剤または
    病原体により段階（ａ）で活性化される請求項８６記載
    の方法。 （８８）前記化学誘導剤が安息香酸、サリチル酸、アセ
    チルサリチル酸、ポリアクリル酸、ベンゾ−１，２，３
    −チアジアゾールカルボン酸、ベンゾ−１，２，３−チ
    アジアゾールチオカルボン酸、シアノベンゾ−１，２，
    ３−チアジアゾール、ベンゾ−１，２，３−チアジアゾ
    ールカルボン酸アミド、ベンゾ−１，２，３−チアジア
    ゾールカルボン酸ヒドラジド、ジクロロイソニコチン酸
    、およびそれらの誘導体からなる群から選択される請求
    項８７記載の方法。 （８９）請求項２４記載のキメラＤＮＡ配列を含有する
    植物組織、植物体または種子に化学調節剤を施用するこ
    とからなる化学的に調節可能な遺伝子の転写を調節する
    方法。 （９０）前記化学調節剤が安息香酸、サリチル酸、アセ
    チルサリチル酸、ポリアクリル酸、ベンゾ−１，２，３
    −チアジアゾールカルボン酸、ベンゾ−１，２，３−チ
    アジアゾールチオカルボン酸、シアノベンゾ−１，２，
    ３−チアジアゾール、ベンゾ−１，２，３−チアジアゾ
    ールカルボン酸アミド、ベンゾ−１，２，３−チアジア
    ゾールカルボン酸ヒドラジド、ジクロロイソニコチン酸
    、およびそれらの誘導体からなる群から選択される請求
    項８９記載の方法。 （９１）前記キメラＤＮＡの第一のＤＮＡ成分配列が、
    ＰＲ遺伝子の化学的に誘導可能な配列であるか、または
    その配列に実質的な配列相同性を有する化学的に誘導可
    能な配列である請求項８９記載の方法。 （９２）化学的に調節可能な遺伝子が生長状態、不稔性
    、病気耐性、有害生物耐性、除草剤許容性または耐性、
    二次代謝物の産生および検定可能な酵素マーカーの産生
    からなる群から選択される表現型の特徴をコードする請
    求項８９記載の方法。 （９３）前記酵素マーカーがルシフェラーゼ（ＬＵＸ）
    、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（
    ＣＡＴ）、ネオマイシンホスホトランスフェラーゼ（Ｎ
    ＰＴ）、ノパリンシンターゼ（ＮＯＳ）、オクトピンシ
    ンターゼ（ＯＣＳ）、β−１，３−グルクロニダーゼ（
    ＧＵＳ）、アセトヒドロキシ酸シンターゼ（ＡＨＡＳ）
    またはバチラススリンギエンシス内毒素（ＢＴ）である
    請求項９２記載の方法。 （９４）前記酵素マーカーがβ−１，３−グルクロニダ
    ーゼ（ＧＵＳ）、アセトヒドロキシ酸シンターゼ（ＡＨ
    ＡＳ）またはバチラススリンギエンシス内毒素（ＢＴ）
    である請求項９３記載の方法。 （９５）請求項３１記載のキメラＤＮＡ配列または該キ
    メラＤＮＡ配列を含有するベクターで宿主を形質転換し
    、その形質転換された宿主に推定される化学調節剤を施
    用し、そして表現型の特徴の発現を測定することからな
    る化学調節剤を同定する方法。 （９６）形質転換された宿主が植物組織または植物細胞
    である請求項９５記載の方法。 （９７）前記キメラＤＮＡの第一のＤＮＡ成分配列が、
    ＰＲタンパク質遺伝子の化学的に誘導可能な配列である
    か、またはその配列に実質的な配列相同性を有する化学
    的に誘導可能な配列である請求項９６記載の方法。 （９８）キメラＤＮＡによりコードされた表現型の特徴
    が検定可能な酵素マーカーである請求項９５記載の方法
    。 （９９）前記酵素マーカーがルシフェラーゼ（ＬＵＸ）
    、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（
    ＣＡＴ）、ネオマイシンホスホトランスフェラーゼ（Ｎ
    ＰＴ）、ノパリンシンターゼ（ＮＯＳ）、オクトピンシ
    ンターゼ（ＯＣＳ）、β−１，３−グルクロニダーゼ（
    ＧＵＳ）、アセトヒドロキシ酸シンターゼ（ＡＨＡＳ）
    またはバチラススリンギエンシス内毒素（ＢＴ）である
    請求項９８記載の方法。 （１００）以下の段階： （ａ）推定される化学的に調節可能なＤＮＡ配列または
    該配列を含有するベクター、宿主選択性遺伝子マーカー
    である第二のＤＮＡ配列および表現型の特徴をコードす
    る第三のＤＮＡ配列で宿主を形質転換し、 （ｂ）この形質転換された宿主に化学調節剤を施用し、
    そして （ｃ）前記第三のＤＮＡ配列によりコードされた表現型
    の特徴の発現を測定するか、またはその発現における変
    化を選択する、 ことからなる化学的に調節可能なＤＮＡ配列を同定する
    方法。 （１０１）前記第三のＤＮＡ配列が宿主選択可能なまた
    は検定可能な遺伝子マーカーである請求項１００記載の
    方法。 （１０２）形質転換された宿主が植物組織または植物細
    胞である請求項１００記載の方法。 （１０３）第二または第三のＤＮＡ配列が除草剤耐性ま
    たは抗生物質耐性に対する遺伝子マーカーである請求項
    項１００記載の方法。 （１０４）前記遺伝子マーカーがハイグロマイシン、カ
    ナマイシン、クロラムフェニコール、ブレオマイシン、
    ピューロマイシン、リンコマイシンおよびメトトレキセ
    イト耐性遺伝子からなる群から選択される抗生物質耐性
    遺伝子である請求項１００記載の方法。 （１０５）遺伝子マーカーがアミノグリコシドホスホト
    ランスフェラーゼIVハイグロマイシン耐性遺伝子である
    請求項１００記載の方法。 （１０６）第三のＤＮＡ配列がルシフェラーゼ（ＬＵＸ
    ）、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ
    （ＣＡＴ）、ネオマイシンホスホトランスフェラーゼ（
    ＮＰＴ）、ノパリンシンターゼ（ＮＯＳ）、オクトピン
    シンターゼ（ＯＣＳ）、β−１，３−グルクロニダーゼ
    （ＧＵＳ）、アセトヒドロキシ酸シンターゼ（ＡＨＡＳ
    ）およびバチラススリンギエンシス内毒素（ＢＴ）から
    なる群から選択される検定可能な酵素マーカーをコード
    する請求項１００記載の方法。 （１０７）第三のＤＮＡ配列がβ−１，３−グルクロニ
    ダーゼ（ＧＵＳ）、アセトヒドロキシ酸シンターゼ（Ａ
    ＨＡＳ）およびバチラススリンギエンシス内毒素（ＢＴ
    ）からなる群から選択される検定可能な酵素マーカーを
    コードする請求項１００記載の方法。 （１０８）請求項１００記載の方法により同定された実
    質的に純粋な化学的に調節可能なＤＮＡ配列。 （１０９）（ａ）公知の化学調節剤で推定される形質転
    換体を処理し、そして（ｂ）第二のＤＮＡ配列によりコ
    ードされた表現型の特徴の発現による形質転換体を選択
    することからなる、公知の化学調節剤により化学的に調
    節可能である第一のＤＮＡ成分配列および表現型マーカ
    ーをコードする関連した第二のＤＮＡ配列からなる形質
    転換性ＤＮＡに晒された形質転換された植物細胞または
    組織を選択する方法。 （１１０）前記表現型の特徴が抗生物質耐性である請求
    項１０９記載の方法。 （１１１）前記抗生物質耐性がハイグロマイシン、カナ
    マイシン、クロラムフェニコール、ブレオマイシン、ピ
    ューロマイシン、リンコマイシン、Ｇ４１８およびメト
    トレキセイトに対する耐性である請求項１１０記載の方
    法。 （１１２）前記表現型の特徴が検定可能な酵素マーカー
    である請求項１０９記載の方法。（１１３）前記酵素マ
    ーカーがルシフェラーゼ（ＬＵＸ）、クロラムフェニコ
    ールアセチルトランスフェラーゼ（ＣＡＴ）、ネオマイ
    シンホスホトランスフェラーゼ（ＮＰＴ）、ノパリンシ
    ンターゼ（ＮＯＳ）、オクトピンシンターゼ（ＯＣＳ）
    、β−１，３−グルクロニダーゼ（ＧＵＳ）、アセトヒ
    ドロキシ酸シンターゼ（ＡＨＡＳ）およびバチラススリ
    ンギエンシス内毒素（ＢＴ）からなる群から選択される
    請求項１１２記載の方法。 （１１４）前記酵素マーカーがβ−１，３−グルクロニ
    ダーゼ（ＧＵＳ）、アセトヒドロキシ酸シンターゼ（Ａ
    ＨＡＳ）およびバチラススリンギエンシス内毒素（ＢＴ
    ）からなる群から選択される請求項１１３記載の方法。 （１１５）１．５ないし３ｍＭ４−メチルウムベリフェ
    リルグルクロニドを含有する０．５ｍｌ以下の試料中の
    捕物組織抽出物を約３７℃で１ないし５時間反応させ、
    そして遊離された蛍光指示剤の濃度を測定することから
    なるβ−１，３−グルクロニダーゼ（ＧＵＳ）酵素活性
    の改良された検定方法。 （１１６）（ａ）長さが１２と１８の間のヌクレオチド
    のＲＮＡの特定のプライマーオリゴヌクレオチドを高い
    比放射能まで標識し、 （ｂ）このＲＮＡと０．１と２０ｎＭの間の濃度の標識
    オリゴヌクレオチドとを２分と２４時間の間、約３７℃
    の温度でハイブリッド形成させ、 （ｃ）０．００３と１ｍＭの間の濃度のヌクレオチド三
    リン酸の存在下、１と１２０分間の間、プライマーオリ
    ゴヌクレオチドを逆転写酵素で延長し、そして （ｄ）延長物をオートラジオグラフィーで分離し、そし
    て視覚化することからなるＲＮＡ溶液中の特定のＲＮＡ
    量を決定する方法。 （１１７）調節が化学調節剤に依存する植物または植物
    組織内の関連ＤＮＡ配列の転写を調節することができる
    非コード性の化学的に調節可能な第一のＤＮＡ成分配列
    と、植物または植物組織内で転写され得る第二のＤＮＡ
    成分配列とからなる化学的に調節可能なキメラＤＮＡ配
    列の製造方法であって、これらのＤＮＡ成分配列を連結
    することを特徴とする方法。 （１１８）天然に生ずる化学的に調節可能な遺伝子の非
    コード性の化学的に調節可能なＤＮＡ配列であるか、ま
    たはその配列に実質的な配列相同性を有する第一のＤＮ
    Ａ成分配列、この第一の成分配列はこの調節が化学調節
    剤に依存する植物または植物組織内の関連ＤＮＡ配列の
    転写を調節することができるものであり、これと天然に
    生じる化学的に調節可能な遺伝子内で第一の成分が関連
    する転写可能なＤＮＡ配列の全てでなく部分であるか、
    またはこれに実質的な配列相同性を有する第二のＤＮＡ
    成分配列と、そして植物または植物組織内で転写され得
    る第三のＤＮＡ成分配列とからなるキメラＤＮＡ配列の
    製造方法であって、前記ＤＮＡ成分配列を同時にまたは
    連続的に連結することを特徴とする方法。
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