JP2010207233A - 植物細胞培養物および植物組織培養物の処理方法 - Google Patents
植物細胞培養物および植物組織培養物の処理方法 Download PDFInfo
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Abstract
【解決手段】液体植物培養物を第1のDNAメチル化阻害剤に接触させ、該DNAメチル化阻害剤に接触させた液体植物培養物を継代培養し、該継代培養物をエリシター系に接触させ、該エリシター系に接触させた液体培養物を維持することを含む、植物培養物における二次代謝物の産生に影響を及ぼす方法。液体植物培養物が植物細胞の懸濁培養物である、方法。
【選択図】なし
Description
本発明は、植物化学物質産生および発育特性に影響を及ぼすよう植物細胞および植物組織を処理する方法に関する。一般的な植物細胞または植物組織培養方法には、種子を発芽させる工程、移植片組織からカルス培養物を作出する工程、継代培養によってカルスを維持する工程、懸濁培養などの液体培養を作出する工程、および継代培養によって液体培養を維持する工程などが含まれる。植物細胞および植物組織培養方法に関するこのような一般的な手法は周知である。代表的な教材には、プラント セル カルチャー、ア プラクティカル アプローチ(Plant Cell Culture,A Practical Approach)(R.A.ディクソン(Dixon)編)、アイアールエルプレス(IRL Press)、オックスフォード(Oxford)、ワシントン(Washington)(1985):非特許文献1およびプラント セル アンド ティシュー カルチャー(Plant Cell and Tissue Culture)(A.スタフォード(Stafford)およびG.ワレン(Warren)編)オープン ユニバーシティ プレス(Open University Press)、ミルトン(Milton)、ケインズ(Keynes)(1991):非特許文献2が挙げられる。
本発明は、2種類の処理、すなわち、DNAメチル化阻害剤による処理およびエリシター系による処理による、植物細胞および組織培養物の処理に関する。DNAメチル化阻害剤による処理は、未発芽の種子、発芽中の種子、移植片もしくは組織培養物、または液体培養物に対して行われる。また、DNAメチル化阻害剤による連続的処理も包含される。本発明は、例えば、未発芽種子をDNAメチル化阻害剤で処理(第1の処理)し、処理した種子を発芽させ、発芽した種子に由来する組織からカルスを増殖させ、カルスから懸濁培養物を誘導し、および液体懸濁継代培養物をDNAメチル化阻害剤で処理(第2の処理)することを含む方法を包含する。処理が一回の場合でも連続の場合でも、最終的には、液体培養物はDNAメチル化阻害剤による処理を受けた植物細胞または組織に由来する。
処理を受けた植物細胞に対する影響は、一部には、一時的ストレスによって誘発される影響である。さらに重要なことは、本発明による処理は、処理を受けた未発芽種子、発芽種子、移植片もしくは組織培養物、または液体培養物に由来する継代培養物の二次代謝物の産生にも影響を及ぼすことである。本発明は、一部には、DNAメチル化阻害剤による処理効果は、二次代謝物の発現の変化に対して発生機構学的に安定であるとの発見に基づいている。
DNAメチル化阻害剤の具体例としては、5-アザシチジン(5-AC)、5-アザ-2'-デオキシシチジン、5-フルオロシチジン、シュードイソシチジン、DL-エチオニン、および2-アミノ-5-エトキシカルボニルピリミジン-4(3H)オンが含まれる。本発明において、DNAメチル化阻害剤は、単一のDNAメチル化阻害剤、および複数のDNAメチル化阻害剤の混合物を含む。実験プロトコールの例は、アーフマン(Arfmann)ら、Z. naturforsch. (1985)40c、21〜25;ブラウン(Brown)ら、Theor. Appl. Genet. 78:321〜328(1989);バーン(Burn)ら、Proc. Nat'l. Acad. Sci. USA 90:287〜291(1993)およびスタッフォード(Stafford)ら、MANIPULATING SECONDARY METABOLISM IN CULTURE(培養系における二次代謝の操作)(R. T. RobinsおよびM.J.C. Rhodes編)pp. 31〜40(1988)に記載されている。
本発明の一部の形態によれば、未発芽種子をDNAメチル化阻害剤に接触させる。本明細書において用いる種子は、播かれた場合に発芽して実生植物となることができる授精胚珠の産物である。この種子は、裸子植物、およびすべての顕花植物からなる群から選択され、後者は被子植物(Anthophyta)(以前はAngiospermaeと表記)である。被子植物には単子葉植物および双子葉植物の2綱が含まれ、全部で約241,000種がある。裸子植物には、ソテツ科植物、球果植物、イチイ属を含む5つの現存する群が含まれ、全部で約760種がある。
エリシターの具体的分類には、植物由来のエリシター、微生物由来のエリシター、および化学的に規定されたエリシターが含まれる。第1に、化学的に規定されたエリシターには、植物防御反応における細胞内および細胞間メディエーター、またはそのアゴニスト、ならびに特定の無機塩が含まれる。例えば、一例としては、植物防御経路における既知の生体シグナル変換分子であるジャスモン酸メチルが挙げられる。その他の化学的に規定されたエリシターには、サリチル酸、グルタチオン、2,6-ジクロロイソニコチン酸、セルラーゼ、キトサン、キチン、ニゲラン(nigeran)、アラキドン酸、および過酸化物カスケードにおける中間生成物が含まれる。非生物的な化学的に規定されたエリシターには、硝酸銀、塩化銅、硫酸銅、および塩化水銀が含まれる。
本発明において、エリシター系を特徴づけるとすれば、エリシターの数、エリシターの種類、接触の順序と持続時間、および接触間の時間により行われる。例えば、あるエリシター系は、ジャスモン酸メチル(化学的に規定されたエリシター)およびカンジタ・アルビカンス(Candida albicans)抽出物(微生物由来のエリシター)の両方を含み、一度に両方のエリシターを同時に懸濁培養物に添加する。
(1)同一の微生物に由来する3つのエリシター;(2)それぞれ異なる微生物に由来する2つのエリシター;(3)ひとつの微生物由来のエリシターおよび2つの化学的に規定された細胞内メディエーター;および(4)無機塩および細菌毒素、である。エリシター系で一連のエリシター処理を行う場合、エリシターは独立に選択される。すなわち、各処理に他の処理と同じエリシターを用いてもよいし、各処理がそれぞれ異なっていてもよい。組み合わせて用いる場合の各エリシターの量は、非毒性であればどのような割合であってもよく、与えられたエリシターの量は一連の各処理において異なってもよい。あるエリシター系におけるそれぞれのエリシターへの接触順序と持続時間は異なっていてもよい。エリシター系は単一の短時間処理でありうるし、または特定の時間(例えば、3回の継代培養後3日目)および濃度(1リットルの液体植物細胞培養物あたり50 mgの乾燥重量微生物培養物)での一連の処理でありうる。例えば、別のエリシター系ではカンジタ・アルビカンス(Candida albicans)抽出物を含み、それを特定の継代培養の後の最初の週に48時間ごとに添加する。処理の持続時間および頻度は、各エリシターの安定性および代謝経路に一部依存しており、希釈、培養液交換、またはさらなる継代培養によって改変することができる。エリシター処理の例は、Chappell, J.およびHahlbrock,K. Nature (1984) 311:76〜84;Threlfall, D.R.およびWhitehead, I.M., Biochem. Soc. Trans. (1988) 16:71-75;およびRobbins,M.P.ら、Plant Cell Reports (1991) 10:59〜62;およびKauss, H.ら、Plant physiol.(1993) 102:459〜466に記載されている。
改変二次代謝産物のHPLC分析
以下の12の細胞株を選抜した:Buddleja davidii (Loganiaceae)、Calystegia sepium (Convolvulaceae)、Lavendula sp. (Labiatae)、Ocimum basilicum (Labiatae)、Ribes nigrum (Grossulariaceae)、Scopolia x Petunia (Solanaceae)、Solanum tuberosum (Solanaceae)、Theobroma cacao (Sterculiaceae)、Trigonella foenum-graecum (Leguminosae) (2種)、Fagopyrum esculentum (Polygonaceae)、およびHelianthus annuus (Compositae)。
各細胞株は上記の4つの異なる条件(T1〜T4)で培養した。具体的には、T2処理では培養物を生産培地への容量的に継代培養により、移行した。継代培養7日後に、ジャスモン酸メチルを終濃度250μMとなるよう添加した。培養物は誘発後3〜5日に回収した。T3処理は、カンジダ・アルビカンス(C. albicans)の調製物を終濃度50mg/mlでジャスモン酸メチルと同時に加える以外は、T2処理と同様に行った。T4処理においては、継代培養物を最初に、終濃度3×10-5Mの5-アザシチジンに、継代培養後3日目に接触させた。4代継代培養後、ジャスモン酸メチルおよびカンジダ・アルビカンス(C. albicans)由来の調製物(上記T3と同様)を組み合わせて添加した。
凍結乾燥細胞バイオマスは、塩化メチレン/メタノールで抽出し、280nmのUV検出器を装備したHPLCで分析した。溶出条件は以下のように標準化した:抽出物10mg/ml、注入量20μL、Nova-Pak C-18(60Å、3.9×150mm)カラム、および280nmのUV検出器。溶媒の濃度勾配は以下の通り(時間:分、%水、%メタノール、%アセトニトリル):(0、100、0、0);(30、10、10、80);(45, 10, 10, 80);(55、100、0、0);および(75、100、0、0)。T1の対照HPLCの特徴と比較したところ、T2〜T4群の特徴では、大きさ、数、およびピークの位置により、植物化学物質生産が明らかに異なっていることが示された(図1-3参照)。
ウイルス感染の阻害
Syringa vulgarisおよびHelianthus annuusの培養物から調製した抽出物を、ヘルペスシンプレックス(simplex)ウイルス・タイプ2の生育阻害アッセイにおける阻害活性についてスクリーニングした。96穴のフォーマット上で、HSV-2(MS株)を感染させた哺乳類のベロ細胞(vero cells)に、ウイルス感染1時間後に、100μg/mlの抽出物を接触させた。ウイルス、細胞および抽出物は5%CO2中で37℃で18時間インキュベートし、次にホルマリンで固定した。ウイルス増殖の程度は、ウイルスに特異的な細胞表面抗原の発現を、ELISAフォーマットをポリクローナル抗HSV抗血清(DAKO)と共に用いて測定することにより評価した。ウイルスの感染は、ウイルスに感染したもののO.D.値を、各プレート上の非感染対照と比較することにより定量した。これらの対照については、非免疫性のポリクローナル抗血清を用いて、抗体との非特異的な結合についてもテストした。さらに、陽性対照である抗ウイルス剤(アシクロビールまたはフォスカーネット)も各アッセイプレートに添加した。
テストしたサンプル(抽出物または陽性対照である抗ウイルス剤)によるウイルス抗原発現の阻害率は、非感染対照のO.D.値をテストしたサンプルおよび感染した対照の両者から引いて、以下の公式で決定した:100-[(テストしたサンプルのO.D.値 + 感染した対照のO.D.値) × 100]。両細胞株において、T2-T4群の抽出物は通常、T1(対照)と比較して活性の増加を示した。通常見られる阻害活性の増加は、(a)DNAメチル化阻害剤による前誘発処理、および(b)エリシター系による処理、の組み合わせによる植物細胞における二次代謝産物産生への影響を証明するものである。
種子の前処理
未発芽のE. californicaの種子を5-アザシチジンに接触させる前処理を行った、または前処理を行わなかった。均一に発芽させ、カルス誘導および継代培養、懸濁物作出、および懸濁培養物の継代培養を行った後、得られた懸濁培養物の継代培養物をT1(対照)およびT3の条件に供した。有機溶媒により細胞バイオマスを抽出後、HPLC分析を行ったところ、5-アザシチジンのようなDNAメチル化阻害剤にさらす前処理を行うと、クロマトグラム上のピークの大きさ、数、位置が顕著に変わることが示された(図4参照)。これらのデータは、DNAメチル化阻害剤が構成的(エリシター無処理)および誘導的(エリシター処理)代謝産物の両方の生産に影響していることを示す。
HCV ATPアーゼの阻害
HCV ATPアーゼの阻害は、マイクロタイタープレートフォーマット上で、Suzichらの方法を改変した方法により検定した。反応液は、全量100μL中に50mM MOPS(pH 6.5)、1.95mMホスホエノールピルビン酸、100μg/mLピルビン酸キナーゼ、25μg/mL乳酸デヒドロゲナーゼ、100μg/mL NADH、2.5mM MgCl2、1mM ATP、および5μg/mLクローン化HCV ATPアーゼ(クローンNS3b、Medical College of VerginiaのDr. Darryl Petersonより入手)を含有した。反応は340nmで20分間連続的にモニターし、初期速度は反応曲線をデータに合わせて決定した。選択した抽出物は、対照となる抽出物よりも高い阻害活性を示した。
DNA/RNAポリメラーゼの阻害
HIV逆転写酵素およびウシ胸腺DNAポリメラーゼαについてのアッセイをAugustらの方法で、およびHSV-2 DNAポリメラーゼについてのアッセイをElionらの方法で行った。ただし、反応はマイクロタイタープレート上で行い、[α-32P]TTPを[3H]TTPの代わりに用いた。反応は等量の10%トリクロロ酢酸を加えて終結させ、氷上に15分静置した。沈殿物を次に、Tomtec Harvester 96を用いてグラスファイバーのフィルターマットに移し、取り込まれた放射活性を液体シンチレーション計測により決定した。選択した抽出物は対照よりも高い阻害活性を示した。
細胞毒性および抗菌類活性
特定の抽出物が、U937細胞培養物中での増殖またはカンジダ・アルビカンス(Candida albicans)の増殖を阻害する能力を、抽出物存在下でこれらの生物を増殖させ、RoemらによるXTT法を用いて非処理の培養に対する生存能を決定することにより決定した。同様に、抽出物のベロ細胞(Vero cells)増殖阻害能を、スルホロダミンB法(Sigma Chemical Co.)を用い、製造者の指示に従って決定した。選択した抽出物は、顕著な抗菌類活性および望ましい細胞毒性を示した。
HIV プロテアーゼの阻害
1μg/mLの組換えHIV-1プロテアーゼを、5μMの合成基質(7-メトキシクマリン-4-イル)アセチル-GSQNYPIVGK(2,4-ジニトロフェニル)-CONH2)、0.1M酢酸ナトリウム(pH 4.7)、1M NaCl、1mM EDTA、1mM DTT、および1mg/mLウシ血清アルブミンとともに、全量100μL中でインキュベートした。インキュベーションは37℃で20分間行い、反応は100μLの1M酢酸ナトリウム(pH4.0)を加えて終結させた。励起波長328nm、放射波長421nmで、プレートリーダーを装備したPerkin Elmer LS-50B 発光スペクトロメーターで蛍光を測定した。Ac-Thr-Ile-Nle(CH2NH)Nle-Gln-Arg-NH2を、陽性対照として用いた。Knight, C.G.ら、(1992) FEBS Letters, 296:163-266、Matayoshi, E.D.ら、(1990) Science, 247:954-958も参照。選択した抽出物は対照となる抽出物よりも高い阻害活性を示した。
CMVプロテアーゼの阻害
E.coliで発現した精製サイトメガロウイルス(CMV)プロテアーゼを、合成蛍光基質(7-メトキシクマリン-4-イル)アセチル-RGVVNASSRLAK(2,4-ジニトロ-フェニル)K-COOH)を用いてアッセイした。反応液(全量30μL)は、1μMのCMVプロテアーゼ、30μMの合成基質、0.1M MOPS(pH 7.2)、0.1mg/mLウシ血清アルブミン、および10%グリセロールを含み、37℃で30分インキュベートした。反応は120μLの酢酸ナトリウム(pH 4.0)を加えて終結させた。蛍光は励起波長328nm、放射波長416nmで、プレートリーダーを装備したPerkin Elmer LS-50B発光スペクトロメーターにより測定した。塩化亜鉛を陽性対照として用いた。選択した抽出物は、対照となる抽出物より高い阻害活性を示した。
低温保存に対する安定性
本発明の懸濁培養物を、細胞および液胞の水分量を減少させるためにosmoticumまたはosmoprotectant(たとえば、マンニトール、ソルビトール、またはグルコース)を含む生育前(pre-growth)培地に置いた。こうして水分を減少させることにより、次の凍結の際、内部の氷の結晶による損傷が軽減される。osmoticumの濃度は通常0.5Mから0.75Mの間である。25℃で3-4日間前培養した後、細胞の一部(たとえば1グラム)を培養液から回収し、低温バイアルに移す。各バイアルには、独立に選択したosmoticum(たとえば、DMSO、プロリン、およびグリセロールを含む混合液)を含む凍結防止剤の混合液を加える。バイアルを氷水中で1時間インキュベートする。凍結は2段階で行う、すなわち0℃で10分、1℃/分で-35℃までゆっくり凍結し、その後急速冷凍して液体窒素中で保存する。
解凍も連続的なプロセスで、温かい水槽中で急速に(たとえば+9℃/分)行う。バイアルの内容物を、寒天培地上に置いた濾紙上に慎重に移す。凍結防止剤は、細胞をきれいな濾紙に何度も移すことにより取り除かれる。活性炭などの濾過物質を毒性物質の吸収に用いる。暗所で25℃で3日おいた後、濾紙を新しい培地に移し、観察結果を記録する。保存が成功していれば、カルス培養として新しい増殖が続く28日以内に見られる。これらの培養より、懸濁培養を再開し、植え継ぎ、誘発剤システムにさらし、それらの化学的特性および薬理学的活性を分析する。
上記の説明より、当業者は容易に本発明の重要な特性を確かめることができ、またその精神および範囲から離れることなく、様々な利用および条件に対応すべく、本発明に様々な改変を加えることができる。従って、その他の態様も請求の範囲に含まれる。
Claims (32)
- (a)液体植物培養物を第1のDNAメチル化阻害剤に接触させ、
(b)該DNAメチル化阻害剤に接触させた液体植物培養物を継代培養し、
(c)該継代培養物をエリシター系に接触させ、
(d)該エリシター系に接触させた液体培養物を維持する
ことを含む、植物培養物における二次代謝物の産生に影響を及ぼす方法。 - 工程(b)の後で、工程(c)の前に、該継代培養物を第2のDNAメチル化阻害剤に接触させる工程をさらに含む、請求項1記載の方法。
- 液体植物培養物が植物細胞の懸濁培養物である、請求項1記載の方法。
- 第1および第2のDNAメチル化阻害剤のそれぞれが、5-アザシチジン、5-アザ-2'-デオキシシチジン、5-フルオロシチジン、シュードイソシチジン、DL-エチオニン、および2-アミノ-5-エトキシカルボニルピリミジン-4(3H)オンから独立に選択される、請求項3記載の方法。
- 第1および第2のDNAメチル化阻害剤のそれぞれが5-アザシチジンである、請求項4記載の方法。
- エリシター系が少なくとも1つのエリシターを有し、それぞれのエリシターが微生物由来のエリシター、植物由来のエリシター、および化学的に規定されたエリシターから独立に選択される、請求項3記載の方法。
- エリシターのそれぞれが、ジャスモン酸メチル、サリチル酸、グルタチオン、2,6-ジクロロイソニコチン酸、セルラーゼ、キトサン、キチン、ニゲラン、アラキドン酸、過酸化物カスケード中間生成物、ならびにカンジダ・アルビカンス(Candida albicans)、サッカロミセス・セレビシエ(Saccharomyces cerevisiae)、アスペルギルス・ニガー(Aspergillus niger)、フィトフトーラ・クリプトゲア(Phytophthora cryptogea)、シュードモナス・シリンゲ(Pseudomonas syringae)およびエルウィニア・カロトボーラ(Erwinia caratovora pv. carotovora)に由来するエリシターから独立に選択される、請求項6記載の方法。
- 継代培養が、液体培養物の少なくとも2回の継代培養である、請求項3記載の方法。
- 液体培養物が、胚、根、苗条、毛状根、および奇形腫から選択される分化した液体植物培養物である、請求項3記載の方法。
- 第1および第2のDNAメチル化阻害剤のそれぞれが、5-アザシチジン、5-アザ-2'-デオキシシチジン、5-フルオロシチジン、シュードイソシチジン、DL-エチオニン、および2-アミノ-5-エトキシカルボニルピリミジン-4(3H)オンから独立に選択される、請求項9記載の方法。
- 第1および第2のDNAメチル化阻害剤のそれぞれが、5-アザシチジンである、請求項10記載の方法。
- エリシター系が少なくとも1つのエリシターを有し、それぞれのエリシターが微生物由来のエリシター、植物由来のエリシター、および化学的に規定されたエリシターから独立に選択される、請求項9記載の方法。
- エリシターのそれぞれが、ジャスモン酸メチル、サリチル酸、グルタチオン、2,6-ジクロロイソニコチン酸、セルラーゼ、キトサン、キチン、ニゲラン、アラキドン酸、過酸化物カスケード中間生成物、ならびにカンジダ・アルビカンス(Candida albicans)、サッカロミセス・セレビシエ(Saccharomyces cerevisiae)、アスペルギルス・ニガー(Aspergillus niger)、フィトフトーラ・クリプトゲア(Phytophthora cryptogea)、シュードモナス・シリンゲ(Pseudomonas syringae)およびエルウィニア・カロトボーラ(Erwinia caratovora pv. carotovora)に由来するエリシターから独立に選択される、請求項13記載の方法。
- (a)未発芽種子を第1のDNAメチル化阻害剤に接触させ、
(b)該DNAメチル化阻害剤に接触させた種子から組織を誘導し、
(c)該誘導した組織からカルス培養物を作出し、
(d)該作出したカルス培養物を継代培養し、
(e)該カルス継代培養物から懸濁培養物を作出し、
(f)該作出した懸濁培養物を維持する
ことを含む、植物培養物における二次代謝物の産生特性に影響を及ぼす方法。 - 作出工程(e)の後に、懸濁培養物の継代培養物を第2のDNAメチル化阻害剤に接触させる工程をさらに含む、請求項14記載の方法。
- 第1および第2のDNAメチル化阻害剤のそれぞれが、5-アザシチジン、5-アザ-2'-デオキシシチジン、5-フルオロシチジン、シュードイソシチジン、DL-エチオニン、および2-アミノ-5-エトキシカルボニルピリミジン-4(3H)オンから独立に選択される、請求項14記載の方法。
- 第1および第2のDNAメチル化阻害剤のそれぞれが5-アザシチジンである、請求項16記載の方法。
- 接触工程(a)が、3×10−5から3×10−4Mの濃度の5-アザシチジン溶液中へ未発芽種子を浸漬させることを含む、請求項14記載の方法。
- 継代培養工程(d)が、該カルス培養物を少なくとも2回継代培養することを含む、請求項14記載の方法。
- 維持工程(f)が、懸濁培養物を少なくとも5回継代培養することを含む、請求項14記載の方法。
- 維持工程(f)が、該懸濁培養物を少なくとも10回継代培養することを含む、請求項20記載の方法。
- 維持工程(f)の後に、懸濁培養物をエリシター系に接触させる工程をさらに含む、請求項14記載の方法。
- エリシター系が少なくとも1つのエリシターを有し、それぞれのエリシターが微生物由来のエリシター、植物由来のエリシター、および化学的に規定されたエリシターから独立に選択される、請求項22記載の方法。
- (a)未発芽種子を第1のDNAメチル化阻害剤に接触させ、
(b)該DNAメチル化阻害剤に接触させた種子から組織を誘導し、
(c)該誘導した組織から培養物を作出し、
(d)該作出した培養物の継代培養物をエリシター系に接触させ、
(e)該エリシターに接触させた継代培養物を維持する
ことを含む、植物培養物における二次代謝物の産生に影響を及ぼす方法。 - 作出工程(c)の後に、作出した培養物の継代培養物を第2のDNAメチル化阻害剤に接触させる工程をさらに含む、請求項24記載の方法。
- 第1および第2のDNAメチル化阻害剤のそれぞれが、5-アザシチジン、5-アザ-2'-デオキシシチジン、5-フルオロシチジン、シュードイソシチジン、DL-エチオニン、および2-アミノ-5-エトキシカルボニルピリミジン-4(3H)オンから独立に選択される、請求項24記載の方法。
- 第1および第2のDNAメチル化阻害剤のそれぞれが5-アザシチジンである、請求項26記載の方法。
- 接触工程が、3×10−6から3×10−4Mの濃度の5-アザシチジン溶液中へ未発芽種子を浸漬させることを含む、請求項24記載の方法。
- 誘導工程(b)が、カルス培養物を作出し、該カルス培養物を少なくとも2回継代培養することを含み、作出工程(c)が該第2のカルス継代培養物から懸濁培養物を作出することを含み、作出工程(c)の後で、エリシターへの接触工程(d)の前に、該懸濁培養物を少なくとも1回継代培養する工程をさらに含む、請求項24記載の方法。
- 工程(c)の培養物が、胚、根、苗条、毛状根、および奇形腫から選択される分化した液体植物培養物である、請求項24記載の方法。
- エリシター系が少なくとも1つのエリシターを有し、それぞれのエリシターが微生物由来のエリシター、植物由来のエリシター、および化学的に規定されたエリシターから独立に選択される、請求項24記載の方法。
- エリシターのそれぞれが、ジャスモン酸メチル、サリチル酸、グルタチオン、2,6-ジクロロイソニコチン酸、セルラーゼ、キトサン、キチン、ニゲラン、過酸化物カスケード中間生成物、ならびにカンジダ・アルビカンス(Candida albicans)、サッカロミセス・セレビシエ(Saccharomyces cerevisiae)、アスペルギルス・ニガー(Aspergillus niger)、フィトフトーラ・クリプトゲア(Phytophthora cryptogea)、シュードモナス・シリンゲ(Pseudomonas syringae)およびエルウィニア・カラトボーラ(Erwinia caratovora pv. carotovora)に由来するエリシターから独立に選択される、請求項31記載の方法。
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