CN102660561A

CN102660561A - 桑树花青素生物合成三个关键基因及应用

Info

Publication number: CN102660561A
Application number: CN2012101666415A
Authority: CN
Inventors: 余茂德; 李军; 张琼予; 刘长英; 赵爱春; 王茜龄; 鲁成; 金筱耘; 吕蕊花; 吴存容
Original assignee: Southwest University
Current assignee: Southwest University
Priority date: 2012-05-25
Filing date: 2012-05-25
Publication date: 2012-09-12

Abstract

本发明公开了来源于桑树的花青素生物合成途径三个关键基因：黄烷酮3-羟化酶（MaF3H）、类黄酮-3′-羟化酶(MaF3′H)和二氢黄酮醇-4-还原酶基因（MaDFR）的基因序列及应用。MaF3H基因片段长369bp，编码了123个氨基酸，MaF3′H基因片段长857bp，编码了285个氨基酸，MaDFR基因片段长535bp，编码了178个氨基酸。这三个基因是植物花青素合成路径中的关键基因，可以应用到植物中调控花青素的含量，改善植物的品质。

Description

桑树花青素生物合成三个关键基因及应用

技术领域

本发明涉及植物基因工程领域，特别是涉及桑树花青素生物合成三个关键基因：黄烷酮3-羟化酶、类黄酮-3'-羟化酶及二氢黄酮醇-4-还原酶基因及其应用。

背景技术

花青素（anthocyanin）属于黄酮类化合物，是广泛存在于被子植物（主要是开花植物）中的水溶性天然色素，主要以糖苷的形式存在于植物细胞的液泡中，在液泡不同的pH值下，使花瓣呈现五彩缤纷的颜色，也是花和果实的主要色素，控制花和果实呈现红色、粉红色、蓝色和紫罗兰色等不同颜色。桑树的成熟果实桑椹，口味鲜美，色泽艳丽，花青素含量极为丰富，主要成分是矢车菊-3-葡萄糖苷（C3G）和矢车菊-3-芸香苷（C3Y），是桑椹品质的重要指标之一。

在花青素生物合成途径中，黄烷酮3-羟化酶(F3H) 催化黄槲皮素形成二氢黄酮醇；类黄酮-3'-羟化酶(F3′H)催化二氢黄酮醇形成二氢槲皮素；二氢黄酮醇-4-还原酶(DFR)分别催化二氢黄酮醇、二氢槲皮素和二氢杨梅素分别生成无色天竺葵素、无色矢车菊素和无色飞燕草素。编码这三个酶的基因是花青素生物合成途径的关键基因，直接关系到花青素的合成。因此桑树花青素生物合成关键基因：黄烷酮3-羟化酶、类黄酮-3′-羟化酶与二氢黄酮醇-4-还原酶基因可应用于桑树花青素生物合成的调控，改良桑树的品质。

发明内容

本发明的目的在于提供桑树花青素生物合成三个关键基因：黄烷酮3-羟化酶、类黄酮-3′-羟化酶和二氢黄酮醇-4-还原酶基因的核苷酸序列与氨基酸序列。

本发明所述的桑树黄烷酮3-羟化酶基因（MaF3H）、类黄酮-3′-羟化酶基因(MaF3′H)和二氢黄酮醇-4-还原酶基因（MaDFR）序列的克隆，依次通过以下步骤得到：

1）提取桑椹总RNA，并将提取的总RNA进行反转录合成cDNA；

2）根据蔷薇科植物草莓和苹果的黄烷酮3-羟化酶基因（MaF3H）、类黄酮-3′-羟化酶基因(MaF3′H)和二氢黄酮醇-4-还原酶基因（MaDFR）序列，分别设计兼并引物，以前述cDNA为模板，扩增得到基因片段，连接到T克隆载体pMD19-T simple vector上，转化进入大肠杆菌，挑取阳性克隆并测序。

上述基因片段采用信息分析的方法预测基因结构及编码的氨基酸序列。

本发明同时提供三个基因在不同果色果实中的表达检测

1）采用超声提取不同果色桑椹花青素，利用高效液相色谱检测花青素的含量；

2）分别提取不同果色果实总RNA，并反转录成cDNA；

3）以肌动蛋白基因作为内参，采用半定量PCR技术检测三个基因的表达情况。

通过不同果色果实中的表达检测结果，可以判定黄烷酮3-羟化酶基因（MaF3H）、类黄酮-3′-羟化酶基因(MaF3′H)和二氢黄酮醇-4-还原酶基因（MaDFR）在桑树花青素生物合成中起不可缺少的作用。

附图说明

图1为MaF3H基因PCR电泳图。M：Trans2000；1：MaF3H基因片段扩增

图2为MaF3′H基因PCR电泳图。M：Trans2000；1：MaF3′H基因片段扩增

图3为MaDFR基因PCR电泳图。M：Trans2000；1：MaDFR基因片段扩增

图4为四个品种桑果的花青素含量图（mg/g干重）。1：珍珠白；2：嘉陵30号；3：大十；4：红果1号

图5为三个基因在四个品种桑果中的表达。1：珍珠白；2：嘉陵30号；3：大十；4：红果1号

珍珠白为山东省临清市地方品种

嘉陵30号为重庆市蚕桑品种审定委员会2009年审定品种

大十为广东农业科学院蚕业研究所于1977年选育

红果1号为陕西省蚕桑丝绸研究所于2000年选育

本发明的优点是：

本发明提供的花青素生物合成途径三个关键酶基因：黄烷酮3-羟化酶基因（MaF3H）、类黄酮-3′-羟化酶基因(MaF3′H)和二氢黄酮醇-4-还原酶基因（MaDFR），分别将其采用基因工程的方法，导入桑树中，可通过构建过表达或反义转基因表达载体，改变桑树中花青素的含量，间接改良桑树的品质，促进花青素物质的开发利用。

具体实施方式

实施例1：桑树黄烷酮3-羟化酶基因（MaF3H）、类黄酮-3′-羟化酶基因(MaF3′H)和二氢黄酮醇-4-还原酶基因（MaDFR）片段的克隆

1）以桑树嘉陵30号为材料，提取桑椹总RNA，并将提取的总RNA进行反转录合成cDNA；

2）根据蔷薇科植物草莓和苹果的黄烷酮3-羟化酶基因（MaF3H）、类黄酮-3′-羟化酶基因(MaF3′H)和二氢黄酮醇-4-还原酶基因（MaDFR）序列，分别设计兼并引物，以前述cDNA为模板，扩增得到基因片段，连接到T克隆载体PMD19-T simple vector上，转化进入大肠杆菌，挑取阳性克隆并测序。兼并引物序列如下：

F3H-F：5′-CAGAGAGTTCTTCGCTTTG-3′

F3H-R：5′-CAGAATTGGCTTCTCTCCT-3′

F3′H-F：5′-ATGGTGGTGGAGATGATGGTG-3′

F3′H-R：5′-GCTC(G/T)TTGTAGDGTGAGCCCA-3′

DFR-F：5′-AAAGATGACTGGTTGGATG-3′

DFR-R：5′-CCAAGCTGTACTTGAACTC-3′

步骤1）提取总RNA的桑树也可用其它桑树品种或材料，得到相同的结果。

实施例2：不同果色桑椹中花青素含量的高效液相色谱（HPLC）检测

1）桑椹花青素的提取：采摘成熟桑椹，清洗干净后置冷冻干燥器中处理24小时，取出后压碎成粉末状；配制提取液63%甲醇（含1%TFA），按照料液比1：24g/mL的比例量取提取液，并将已称量的桑椹粉末倒入提取液中，将上述混合溶液置于超声清洗器中，在200 W、40 kHZ、43.2℃黑暗条件下超声提取40分钟，室温8000 rpm离心10分钟，取上清。用0.45μm孔径的有机系滤膜过滤上清液，滤出液备用；

2）反相高效液相色谱定性检测花色素苷：色谱柱symmetry C18反相吸附柱（250mm×4.6mm，5μm），流动相A为乙腈，流动相B为甲酸：水（10/90，v/v）。洗脱程序采用等度洗脱，流动相A： B为25%：75%，流速1mL/min，柱温30℃，检测波长520 nm，上样量为10 μL。用10%甲酸溶解矢车菊素-3-葡萄糖苷标准品，并配制成1mg/mL母液，将母液分别稀释成5 μg/mL、10 μg/mL、20 μg/mL、50 μg/mL、100 μg/mL的浓度梯度，根据HPLC的峰面积与浓度构建标准曲线，根据标准曲线计算桑椹中花青素的含量（检测结果如图4所示）。

实施例3：三个基因在不同果色桑椹中的表达检测

分别提取不同果色桑椹总RNA，并反转录成cDNA，根据实施例1获得的基因片段设计半定量PCR引物，分别扩增不同桑椹的cDNA，并进行琼脂糖凝胶电泳检测（检测结果如图5所示）。半定量PCR引物如下：

F3H-1：5′-AAAAGGCGGTTTCATTG-3′

F3H-2：5′-GATTGTTCCTGGATCTGTG-3′

F3′H-1：5′-TGGCAATGGGAAGCACA-3′

F3′H-2：5′-CGCTCACAAGCCTATCTCG-3′

DFR-1：5′-CCCATTTCTTAGTCCCA-3′

DFR-2：5′-CAACGAACATATCCTCCA-3′

序列表（SEQUENCE LISTING）

序列表1：

<110>西南大学

<120>桑树黄烷酮3-羟化酶基因（MaF3H）序列

<130>

<140>

<141>

<160>1

<170>

<210>1

<211>369

<212>DNA

<213>桑树（Morus alba L）

<400>1

1TTGGAGGTATTGTCAGAAGCCATGGGATTAGAAAAGGAGGCTCTAACCAAGGCTTGTGTG

61GACATGGACCAAAAAGTGGTGATCAATTACTATCCCAAATGTCCCCAACCGGATCTCACT

121CTTGGCCTGAAGCGCCACACAGATCCAGGAACAATCACACTTCTTCTTCAGGACCAGGTT

181GGTGGGCTCCAGGCCACTAGAGATGGAGGAAACACTTGGATCACCGTTCAACCTGTTGAA

241GGTGCCTTTGTGGTCAACCTTGGTGATCATGGTCATTATCTGAGCAATGGAAGGTTCAAG

301AATGCTGATCACCAAGCAGTGGTGAACTCAAACTATAGCAGATTGTCAATAGCTACATTT

361 CAAAACCCA

序列表2：

<110>西南大学

<120>桑树黄烷酮3-羟化酶基因（MaF3H）编码的氨基酸序列

<130>

<140>

<141>

<160>1

<170>

<210>1

<211>123

<212> PRT

<213>桑树（Morus alba L）

<400>1

1 LEVLSEAMGL EKEALTKACV DMDQKVVINY YPKCPQPDLT LGLKRHTDPG TITLLLQDQV

61 GGLQATRDGG NTWITVQPVE GAFVVNLGDH GHYLSNGRFK NADHQAVVNS NYSRLSTATF

121 QNP

序列表3：

<110>西南大学

<120>桑树类黄酮-3′-羟化酶基因（MaF3′H）序列

<130>

<140>

<141>

<160>1

<170>

<210>1

<211>857

<212> DNA

<213>桑树（Morus alba L）

<400>1

1ATGGTGGTGGAGATGATGGTGCTAGCGGGAGTATTCAACATCGGAGATTTTGTGCCGGCA

61CTAGATTGGCTAGACTTACAAGGGGTGGCTGCGAGGATGAAGAAGCTCCACAATAGGTTT

121ATGCGTTCTTGACAACAATTATTGAGGAACACAAGGCTAATGTTGGCAAGGGGAAGCAC

181CTGACTTGCTCAGCACGTTGCTTTCACTAAAGGATGATGCGGAGGGCGAGGATGAGAAG

241TCACAGACACTGAAATTAAAGCACTGCTTTTGAACATGTTCACAGCTGGTACGGACACT

301CATCAAGTACGGTGGAATGGGCCATTGCGGAACTCATCCGACACCCCAAAATCTTGGCC

361AAGTTCAAGAAGAACTTGACCGCGTCGTGGGCCGCGATAGGCTCGTGAGCGAATTGGAC

421TTGGCCCAATTGACATATCTCCAGGCCGTGGTGAAGGAGACTTTCCGGCTTCATCCCTCC

481CCCCGATGTCTGTACCACGGATGGCAAACGAAAGCTGTGAAATCAACGGTTACCACATC

541CCAAAGGAACCACTCTTCTTGTAAATGTGTGGGCCATAGCACGTGACCCGGCCGAATGG

601CTGATCCACTAGAGTTCAGGCCCGAAAGATTCTTACCGGGAGGCGAAAAGGCGCAAGTA

661GACATAAGAGGGAATGACTTTGAAGTGATTCCATTTGGGGCTGGGCGCAGGATTTGTGCT

721GGTATGAGTTTGGGCGTGCGCATGGTCCAGCTACTCACTGCAACCCTGGTTCAGGCATTC

781AATTTAGGCCTACCTAATGGACTGGTACCTGAAAAACTCAACATGGATGAAGCATATGGG

841 CTCACACTACAAAGAGC

序列表4：

<110>西南大学

<120>桑树类黄酮-3′-羟化酶基因（MaF3′H）编码的氨基酸序列

<130>

<140>

<141>

<160>1

<170>

<210>1

<211>285

<212> PRT

<213>桑树（Morus alba L）

<400>1

1 MVVEMMVLAG VFNIGDFVPA LDWLDLQGVA ARMKKLHNRF DAFLTTIIEE HKANVGKGKH

61 ADLLSTLLSL KDDAEGEDEK LTDTEIKALL LNMFTAGTDT TSSTVEWAIA ELIRHPKILA

121 KVQEELDRVV GRDRLVSELD LAQLTYLQAV VKETFRLHPS TPMSVPRMAN ESCEINGYHI

181 PKGTTLLVNV WAIARDPAEW TDPLEFRPER FLPGGEKAQV DIRGNDFEVI PFGAGRRICA

241 GMSLGVRMVQ LLTATLVQAF NLGLPNGLVP EKLNMDEAVG LTLQR

序列表5：

<110>西南大学

<120>桑树二氢黄酮醇-4-还原酶基因（MaDFR）序列

<130>

<140>

<141>

<160>1

<170>

<210>1

<211>535

<212> DNA

<213>桑树（Morus alba L）

<400>1

1AAAGATGACTGGTTGGATGTATTTTGTCTCCAAGACTCTAGCCGAGCAAGCGGCATGGAG

61ATTTGCAAAGGAACACGACATGAACTTCATTACTATTATTCCAACGCTCGTGATTGGCCC

121ATTTCTTAGTCCCACTATGCCTCCAAGTCTCATCACCGGACTTGCACCAATCACCAGAAA

181TGAAGCTCACTATTTTATCCTAAAGCAAGGACATTACGTTCACTTGGATGACCTCTGCGA

241AGCTCATATATTCCTGTACGAGCACCCTAAAGCTGAGGGTCGTTACATCGCAAGTTCACA

301TAATACTACAATCTATGAGCTTGTTAAATTGCTGAAGGAAAAATATCCCCAGTATAATAT

361CCCACGAAGTTCAAAGGCTTTGAAGAAGACATAGGAAATGTGGAGTTCTCTTCAAGGAA

421GTTGAAGGAATTGGGTTTCCAATACAAATACAGCTTGGAGGATATGTTCGTTGGAGCAAT

481 TGAGACATGTCGTCAAAAGGGGTTGCTTCCACTTGCTCATGATGAAAGCAAGCCC

序列表6：

<110>西南大学

<120>桑树二氢黄酮醇-4-还原酶基因（MaDFR）编码的氨基酸序列

<130>

<140>

<141>

<160>1

<170>

<210>1

<211>178

<212> PRT

<213>桑树（Morus alba L）

<400>1

1 KMTGWMYFVS KTLAEQAAWR FAKEHDMNF ITIIPTLVIGP FLSPTMPPSL ITGLAPITRN

61 EAHYFILKQG HYVHLDDLCE AHIFLYEHP KAEGRYIASSH NTTIYELVKL LKEKYPQYNI

121 PTKFKGFEED IGNVEFSSRK LKELGFQYK YSLEDMFVGAI ETCRQKGLLP LAHDESKP

Claims

1.桑树花青素生物合成三个关键基因，其特征在于黄烷酮3-羟化酶基因（MaF3H）碱基序列如SEQ ID NO：1所示、类黄酮-3′-羟化酶基因(MaF3′H) 碱基序列如SEQ ID NO：3所示、二氢黄酮醇-4-还原酶基因（MaDFR）碱基序列如SEQ ID NO：5所示。

2.桑树花青素生物合成三个关键基因编码的蛋白质，其特征在于黄烷酮3-羟化酶氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示、类黄酮-3′-羟化酶氨基酸序列如SEQ ID NO：4所示、二氢黄酮醇-4-还原酶氨基酸序列如SEQ ID NO：6所示。

3. 权利要求1所述桑树黄烷酮3-羟化酶基因（MaF3H）序列应用于过表达或反义调控黄烷酮3-羟化酶基因（MaF3H）的表达，改良桑树花青素的含量，获得新的转基因株系。

4. 权利要求1所述桑树类黄酮-3′-羟化酶基因(MaF3′H) 序列应用于过表达或反义调控桑树类黄酮-3′-羟化酶基因(MaF3′H)的表达，改良桑树花青素的含量，获得新的转基因株系。

5. 权利要求1所述桑树二氢黄酮醇-4-还原酶基因（MaDFR）序列应用于过表达或反义调控二氢黄酮醇-4-还原酶基因的表达，改良桑树花青素的含量，获得新的转基因株系。