CN101492658A

CN101492658A - 植物花色素苷合成关键酶—黄烷酮3-羟化酶编码基因

Info

Publication number: CN101492658A
Application number: CNA2008102260987A
Authority: CN
Inventors: 姚允聪; 沈红香; 宋婷婷; 田佶
Original assignee: Beijing University of Agriculture
Current assignee: Beijing University of Agriculture
Priority date: 2008-11-06
Filing date: 2008-11-06
Publication date: 2009-07-29

Abstract

本发明公开了一种植物花色素苷合成关键酶的编码基因与应用。该蛋白，是如下1)或2)的蛋白质：1)由序列表中序列2所示的氨基酸序列组成的蛋白质；2)将序列表中序列2的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且能改变植物花色或叶色的由1)衍生的蛋白质。

Description

植物花色素苷合成关键酶-黄烷酮3-羟化酶编码基因

技术领域

本发明涉及与植物花色素苷形成相关的酶编码基因与应用。

背景技术

花的颜色是决定花观赏价值的重要因素之一，花色主要由类黄酮(flavonoids)、类胡萝卜素(carotenoids)、生物碱(alkaloid)三大类物质决定(Tanaka Y，S Tsuda，T Kusumi.MetabolicEngineering to modify flowers color.Plant Cell Physioloy，1998(11)：1119-1126.)。

花色素苷(anthocyanins)是类黄酮中一类主要色素，控制着花的粉红色、红色、砖红色、蓝色、紫色等花色，植物中基本的花色素苷有3种，即花葵素、花青素、花翠素，以及这些花色素的甲基化衍生物等。花色素苷合成的前体为丙二酰CoA和香豆酰CoA(p-coumatoyl-CoA)。由查尔酮合酶(chalconesynathase，CHS)催化二者形成黄色的查尔酮(chalcone)。查尔酮异构化形成无色的黄烷酮(flavanone)。此步骤可缓慢自发进行，但在查尔酮-黄烷酮(chalcone-flavanone)异构酶(CHI)催化下可加速完成。在黄烷酮3-羟化酶(flavanone3-hydroxylase)的催化下，黄烷酮在C3位置羟化形成无色的二羟黄酮醇(dihydroflavonol)。进一步还原成无色花色素，由二羟黄酮醇还原酶(dihydroflavonol4-reductase，DFR)催化完成。无色花色素转变成有色的花色素(anthocyandin)，然后糖基化形成花色素普苷(anthocyanin)，由UDP-葡萄糖类黄酮-3-氧-葡萄糖转移酶(UDP-glucoseflavonoid 3-oxy-glucosytransferaseUFGT)催化完成(徐纪尊，王丽辉，潘庆玉.观赏植物花色基因转化的研究进展[J].中国农业科技导报，2006，8(5)：56～60)。

黄烷酮3-羟化酶是类黄酮代谢途径中紧接CHS、CHI的第三个关键酶，与CHS一并构成了类黄酮和花色素苷代谢途径的早期表达结构基因。黄烷酮3-羟化酶催化黄烷酮类底物(flavanones)产生二氢黄酮醇类产物(dihydroflavonols)，为黄酮醇(flavonols)、花色素(anthocyanidins)、儿茶精(catechins)、原花色素(pro anthocyanidins)等类黄酮代谢支路提供前体物(Holton T A，Conish EC.Genetics and biochemistry of anthicyaninbiosynthesis.Plant Cell，1995，7：1072-1083.；Dixon RA，Xie DY，Sharma SB.Proanthocyanidins-afinal frontier in flavonoid research.New phytologist[J]，2005，165(1)：9-28.；Winkel-shirley B.Flavonoid biosynthesis：A colorful model for genetics，biochemistry，cell biology，andbiotechnology.Plant physiol，2001，126(2)：485-493)，是黄烷酮分支点的一个核心酶，因此很可能是整个类黄酮代谢途径的中枢Matthew K.Pelletier and Brenda W.Shirley.Analysis offlavanone 3-Hydroxylase in Arabidopsis Seedings.Plant Physiol，1996，111：339-345.)。黄烷酮3-羟化酶属于依赖2-酮戊二酸的双加氧酶(2-oxoglutarate-dependent dioxygenase，2-ODD)家族，其反应时都要依赖Fe²⁺、氧、2-酮戊二酸等作为辅因子。这个家族还包括类黄酮化合物生物合成途径中的黄酮合成酶I(flavone synthase I，FNS I)，黄酮醇合成酶(flavone synthase，FNS)，以及花色素合成酶(anthocyanidin sythase，ANS)。

对黄烷酮3-羟化酶基因的研究主要集中在矮牵牛、玉米、金鱼草等模式植物上。1991年，首先从金鱼草的colorata位点克隆出黄烷酮3-羟化酶基因的cDNA(Martin C，PrescottA，Mackay S，Bartlett J，Vrijlandt E.Control of anthocyanin Biosynthesis in fowers of Antirrhinummajus.Plant J，1991，1：37-49.)，随后从矮牵牛、大麦、拟南芥、玉米、茄子、苜蓿、葡萄、苹果、柑桔、紫苏、豌豆花、康乃馨、翠菊、Japanse morning glory等植物中陆续克隆到黄烷酮3-羟化酶基因。研究表明，黄烷酮3-羟化酶基因在大多数物种中仅以单拷贝形式存在，且同源性较高。在甘蓝型油菜基因组中可能有5-7条或更多的基因成员(许本波.甘蓝型油菜类黄酮途径CHI、F3H和F3’H基因家族的克隆及在黄、黑籽之间的差异表达：[博士学位论文].重庆：西南农业大学，2006.)，在紫苏中黄烷酮3-羟化酶基因有2-3个拷贝。

对黄烷酮3-羟化酶基因表达的大量研究表明，在不同的物种中黄烷酮3-羟化酶基因具有不同的表达和调控模式。玉米和拟南芥的互补实验进一步的表明，黄烷酮3-羟化酶基因有不同的表达控制模式，黄烷酮3-羟化酶基因对黄酮醇和花青素的合成都是重要的，黄酮醇对玉米花粉来说是必需的，而花青素却无关紧要。用金鱼草的黄烷酮3-羟化酶探针从玉米中分离出黄烷酮3-羟化酶基因的cDNA，氨基酸序列显示与其他物种有很高的同源性。且在玉米中也是单拷贝形式存在，位于染色体2S的顶端位置。在玉米授粉后26天的核中和色素外壳上发现高水平的黄烷酮3-羟化酶表达，而在授粉18天的核中和幼苗的胚芽鞘上却低水平表达。在调节基因：基因的存在下，幼苗中黄烷酮3-羟化酶基因转录水平随白光照射率(high fluence-rate)的增加而增加(Deboo GB，Albertsen MC，Taylor LP.Flavanone3-hydroxylase transcripts and flavonol accumulation are temporally coordinate in maizeanthers.Plant J，1995，7(5)：703-713.)。

在各物种之间，调节基因是高度相似的，而且功能相同的，但基因启动子的顺式调控序列存在差异是造成代谢调控网络存在物种差异的原因(Quattrocchio F，Wing J.F，Van derWoude K，Mol J.N.M，Koes R.Analysis of bHLH and MYB domain proteins：species specificregulatory differences are caused by divergent evolution of target anthocyanin genes.PlantJ，1998，12(4)：475-488.)。如在豆科植物中，黄烷酮3-羟化酶基因在根瘤的维管束中表达，而不在根中表达(Benedicte Charrier，Hanh Trinh，Simine Poirier，Adam Kondorosi，and PascalRatet.Flavanone 3-hydroxylase(F3H)expression and flavonoid localization in nodules of threelegume plants reveal distinct tissue specificite.Molecular Plant-Microbe，interaction 1998，11(9)：924-932.)，在伞形花科植物的茎、蕾、叶、花不成熟的种子都具有黄烷酮3-羟化酶的酶活性(Gebhardt Y，Witte S，Forkmann G，Lukacin R，Matern U，Martens S.Molecularevolution of flavonoid dioxygenases in the familyApiaceae.Phytochemistry，2005，66：1273-1284.)，黄烷酮3-羟化酶基因在苜蓿中的研究表明，其不在叶中表达，而在花，根瘤，根中都有表达(Charrier B，Coronado C，Kondorosi A，RatetP.Molecular characterization and expression of alfafa(Medicago sativa L.)flavanone-3-hydroxylase and dihydroflavonol-4-redutase encoding genes[J].Plant Mol Biol，1989，29：773-786.)

发明内容

本发明的目的是提供一种与植物花色素苷形成相关的酶编码基因与.

本发明所提供的与植物花色素苷形成相关的酶，名称为F3H，来源于苹果属王族海棠(Malus Royalty)，是如下1)或2)的蛋白质：

1)由序列表中序列2所示的氨基酸序列组成的蛋白质；

2)将序列表中序列2的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且与植物花色素苷形成相关的由1)衍生的酶。

上述与植物花色素苷形成相关的酶的cDNA基因也属于本发明的保护范围。

与植物花色素苷形成相关的酶的cDNA基因具体可为如下1)-4)中任一所述的基因：

1)其编码序列是序列表中序列1的自5′末端第1-1423位脱氧核糖核苷酸；

2)其核苷酸序列是序列表中的序列1；

3)在严格条件下可与序列表中序列1限定的DNA序列杂交且编码上述与植物花色素苷形成相关的酶的DNA分子；

4)与1)的基因具有95％以上的同源性，且编码上述与植物花色素苷形成相关的酶的DNA分子。

序列表中的序列1由1423个碱基组成，其开放阅读框架(ORF)为自5′末端第1-1423位碱基，编码氨基酸序列是序列表中序列2的F3H。

扩增上述F3H基因全长或任一片段的引物对也属于本发明的保护范围。

具体实施方式

下述实施例中所用方法如无特别说明均为常规方法，所用引物合成及测序工作均由上海生工生物技术服务有限公司完成。限制性内切酶EcoR I、HindIII和Taq酶，T4DNA连接酶均购自大连宝生物工程有限公司，pBS-T-Vector Kit载体试剂盒购自天为时代生物公司，BD SMART^TM RACE cDNA Amplification Kit购自Clontech公司。

Amp抗生素、Tris饱和酚、水饱和酚、DEPC、DL2000 DNA Marker、琼脂糖、酵母提取物、胰蛋白胨均购自北京鼎国生物技术有限公司。

一、MrF3H基因3’端序列的获得

以王族海棠(Malus Royalty)(北京农学院海棠种质资源圃)为实验材料，提取其叶片的总RNA，将提取得到的总RNA用50μl的DEPC水溶解，电泳检测。经甲醛变性凝胶电泳分析，结果如图1所示。从图中可以清晰地看到28SrRNA和18SrRNA两条带，且28SrRNA和18SrRNA含量之比大约为1∶1-2∶1。结果表明，提取得到的RNA是完整的，染色结果显示，提取得到的总RNA可以用来进行反转录。

以上述提取得到的叶总RNA为模板，将其反转录为cDNA。再以此cDNA为模板，跟据近缘物种植物F3H基因保守区段序列，设计3’race上游引物F3H3F扩增MrF3H基因的3’端序列。Master Mix预混物体系如下：

总体积34μl，将上述Master Mix预混物平均分成2管，按照下表加入引物：

PCR反应条件：先95℃预变性3min；然后95℃变性15S；68℃退火6min，共30个循环；最后72℃延伸10min。

取10μL PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳检测，结果如图3所示，其中，M为MARKER II的DNA分子量标准，1为样品组的PCR扩增结果，2为F3H3F和3R双引物对照。结果表明，双引物对照组没有扩增出特异条带，只有样品组扩增得到670bp左右的片段。

切下目的条带，纯化回收后按照pBS-T-Vector Kit载体试剂盒(天为时代生物公司)说明书将PCR产物连接到pBS-T载体上，进行测序。经同源性比较分析后确定获得的1002bp片段即是F3H基因的3’端序列。

二、F3H基因5’端序列的获得

以步骤一获得的保守序列为模板，在其5′端设计引物，进行PCR反应，扩增MrF3H基因的5’端序列。Master Mix预混物体系如下：

PCR反应条件：先95℃预变性3min；然后95℃变性15S；64℃退火6min，共30个循环；最后72℃延伸7min。

将第一轮PCR产物稀释1000倍，取1μL作为模板，以F3H5R1和F3H5R2(序列表中序列5和6)为引物，进行巢式PCR反应，PCR反应条件与第一轮相同。取10μL第二轮PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳检测，结果如图2所示，其中，M为MARKER II的DNA分子量标准，1为样品组的PCR扩增结果，2为F3H5R2和5F双引物对照。结果表明，双引物对照组没有扩增出特异条带，只有样品组扩增得到480bp左右的片段。

切下目的条带，纯化回收后按照pBS-T-Vector Kit载体试剂盒(天为时代生物公司)说明书将PCR产物连接到pBS-T载体上，进行测序。经同源性比较分析后确定获得的485bp片段即是MrF3H基因的5’端序列。

三、MrF3H基因全长cDNA序列的获得

将上述PCR扩增获得的MrF3H基因5’端序列以及3’端序列进行同源性比较，利用DNAMAN等生物软件进行拼接校正，拼接出MrF3H基因全长cDNA序列。根据拼接的MrF3H基因全长cDNA序列设计引物F3HF和F3HR(序列表中序列7和序列8)，提取王族海棠叶的总RNA，反转录为cDNA，利用RT-PCR方法扩增全长MrF3H基因，用高保真Pfu酶替换Taq酶，PCR反应混合物如下：

10×PCR缓冲液	2.5μl
10×PCR缓冲液	2.5μl	dNTP Mixture(2.5mM)	2.0μl
引物F3HF(100ng/μl)	0.5μl	dNTP Mixture(2.5mM)	2.0μl
引物F3HF(100ng/μl)	0.5μl	引物F3HR(100ng/μl)	0.5μl
模板(反转录的cDNA)	1.5μl	引物F3HR(100ng/μl)	0.5μl
模板(反转录的cDNA)	1.5μl	Pfu酶(5U/μl)	0.3μl
ddH₂O	17.7μl	Pfu酶(5U/μl)	0.3μl
ddH₂O	17.7μl	Total	25μl

PCR反应条件：先94℃预变性3min；然后94℃50S，55℃1min，72℃2min，共35个循环；再72℃延伸7min，4℃保存。

PCR产物进行1％琼脂糖凝胶电泳检测，结果如图4所示，其中，M为MARKER II的DNA分子量标准，1为MrF3H基因全长cDNA序列的PCR产物。结果表明获得约1000bp的条带。切下该目的条带，纯化回收后按照pBS-T-Vector Kit载体试剂盒(天为时代生物公司)说明书将PCR产物连接到pBS-T载体上。对扩增得到的MrF3H基因全长cDNA序列进行测序，测序结果表明，获得1095bp的条带，该1095bp的核苷酸片段即为MrF3H，其核苷酸序列如序列表中序列1所示，其编码的氨基酸序列如序列表中序列2所示。

序列表

序列一

DNA

苹果属王族海棠(Malus Royalty)

1406

1 AGGGGCGAGT CGCATGCTCC GGCCGCCATG GCGGCCGCGG

GAATTCGATT CGCGTATTTC

61 GTTTGAGCCA ATACCAAGTA GACAGAACCA ACAAATTCGA

CACCAAATAT GGCTCCTGCT

121 ACTACGCTCA CATCCATAGC GCATGAGAAA ACCCTGCAAC

AAAAATTTGT CCGAGACGAA

181 GACGAGCGTC CAAAGGTTGC CTACAACGAC TTCAGCAACG

AAATTCCGAT CATCTCGCTT

241 GCCGGGATCG ATGAGGTGGA AGGCCGCCGG GGCGAGATTT

GCAAGAAGAT TGTAGCGGCT

301 TGTGAAGACT GGGGTATTTT CCAGATTGTT GACCATGGGG TTGATGCTGA

GCTCATATCG

361 GAAATGACCG GTCTCGCTAG AGAGTTCTTT GCTTTGCCAT

CGGAGGAGAA GCTCCGCTTC

421 GACATGTCCG GTGGCAAAAA GGGTGGCTTC ATCGTGTCCA

GTCATTTACA GGGAGAAGCT

481 GTGCAAGATT GGCGTGAAAT TGTGACCTAC TTTTCATATC CGATTCGTCA

CCGGGACTAT

541 TCGAGGTGGC CAGACAAGCC TGAGGCCTGG AGGGAGGTGA

CAAAGAAGTA CAGTGACGAG

601 TTGATGGGGC TGGCATGCAA GCTCTTGGGC GTTTTATCAG

AAGCCATGGG GTTGGATACA

661 GAGGCATTGA CAAAGGCATG TGTGGACATG GACCAAAAAG

TCGTCGTGAA TTTCTACCCA

721 AAATGCCCTC AGCCCGACCT AACCCTTGGC CTCAAGCGCC

ATACCGACCC GGGCACAATT

781 ACCCTTCTGC TTCAAGACCA AGTTGGGGGC CTCCAGGCTA

CTCGGGATGA TGGGAAAACG

841 TGGATCACCG TTCAACCAGT GGAAGGAGCT TTTGTGGTCA

ATCTTGGAGA TCATGGTCAT

901 CTTCTGAGCA ATGGGAGGTT CAAGAATGCT GATCACCAAG

CAGTGGTGAA CTCAAACAGC

961 AGCAGGCTGT CCATAGCCAC ATTCCAGAAC CCAGCGCAAG

AAGCAATAGT GTATCCACTC

1021 AGTGTGAGGG AGGGAGAGAA GCCGATTCTC GAGGCGCCAA

TCACCTACAC CGAGATGTAC

1081 AAGAAGAAGA TGAGCAAGGA TCTTGAGCTC GCCAGGCTGA

AAAAACTGGCCAAGGAACAG

1141 CAATCGCAGG ACTTGGAGAA AGCCAAAGTG GATACAAAGC

CAGTGGACGA CATTTTTGCT

1201 TAGACTTTTC CAGTCACTTG AAAGCTCTTT GTGGAACTAT AGCTACTTGT

ACCTTTTCCT

1261 TCCACTTCTT GTACTCGTAA CTTCTTTTTG GTGTGCTGGT GGCTTCCCCC

CTAATCTGTT

1321 TAAGATCCGT GGTTGTCAAG GGCCCTTATA TCCCATATTT AGTTTTTGTT

CTTGAATTTT

1381 CATATCAGTT TCTTATCCTC CAACTTAAAA AAAAAAAAAA

序列二

PRT

苹果属王族海棠(Malus Royalty)

204

1 MAPATTLTSI AHEKTLQQKF VRDEDERPKV AYNDFSNEIP IISLAGIDEV

EGRRGEICKK

61 IVAACEDWGI FQIVDHGVDA ELISEMTGLA REFFALPSEE KLRFDMSGGK

KGGFIVSSHL

121 QGEAVQDWRE IVTYFSYPIR HRDYSRWPDK PEAWREVTKK YSDELMGLAC

KLLGVLSEAM

181 GLDTEALTKA CVDMDQKVVV NFYP

序列三

DNA

人工序列

3R和5F：Long(0.4μM)：

5′-CTAATACGACTCACTATAGGGCAAGCAGTGGTATCACGCAGAGT-3′

Short(2μM)：

5′-CTAATACGACTCACTATAGGGC-3′

序列四

DNA

人工序列

F3H3F：5’-GGCTGGCTTCATCGTGTC-3’。

序列五

DNA

人工序列

F3H5R1：5’-GGCTTGTCTGGCCACCTCG-3’。

序列六

DNA

人工序列

F3H5R2：5′-CCCGGTGACGAATCGGATATG-3′

序列七

DNA

人工序列

F3HF：5’-ATGGCTCCTGCTACTACGCTC-3’

序列八

DNA

人工序列

F3HR：5’-CTAAGCAAAAATGTCGTCCAC-3’

附图说明

图1为王族海棠叶总RNA的提取结果

图2为MrF3H基因的5’RACE PCR扩增结果

图3为MrF3H基因的3’RACE PCR扩增结果

图4为MrF3H基因全长cDNA序列的PCR扩增结果

Claims

1、一种蛋白，是如下1)或2)的蛋白质：

1)由序列表中序列2所示的氨基酸序列组成的蛋白质；

2)将序列表中序列2的氨基酸残基序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且与植物花色素苷形成相关的由1)衍生的蛋白质。

2、权利要求1所述蛋白的编码基因。

3、根据权利要求2所述的编码基因，其特征在于：所述蛋白的cDNA基因为如下1)-4)中任一所述的基因：

2)其核苷酸序列是序列表中的序列1；

3)在严格条件下可与序列表中序列1限定的DNA序列杂交且编码权利要求1所述蛋白的DNA分子；

4)与1)的基因具有95％以上的同源性且编码编码权利要求1所述蛋白的DNA分子。

4、扩增权利要求2或3所述基因的全长或任一片段的引物对。