CN111996198B

CN111996198B - 一种茄子茎中花青素调控基因SmbHLH1及其应用

Info

Publication number: CN111996198B
Application number: CN202010871434.4A
Authority: CN
Inventors: 杨凤娟; 段兆飞; 田世玉; 魏珉; 李静; 杨国斌
Original assignee: Shandong Agricultural University
Current assignee: Shandong Agricultural University
Priority date: 2020-08-26
Filing date: 2020-08-26
Publication date: 2022-06-24
Anticipated expiration: 2040-08-26
Also published as: CN111996198A

Abstract

本发明公开了一种茄子茎中花青素调控基因SmbHLH1及其应用。属于生物技术和植物遗传育种技术领域。包括茄子茎中花青素调控基因SmbHLH1，其核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示，氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示。含有基因SmbHLH1的生物材料；基因SmbHLH1或生物材料在调控植物花青素含量、制备转基因植物和植物育种中的应用，以及提高或鉴定植物基因SmbHLH1的方法。本发明通过实验验证了过表达基因SmbHLH1可以降低植物茎中花青素含量，为研究生产出富含花青素的茄子打下了基础。

Description

一种茄子茎中花青素调控基因SmbHLH1及其应用

技术领域

本发明涉及生物技术和植物遗传育种技术领域，更具体的说是涉及一种茄子茎中花青素调控基因SmbHLH1及其应用。

背景技术

茄子(Solanum melongena L.)，为一年生茄科茄属作物，是我国栽培面积较大的蔬菜作物之一，种质资源丰富，栽培种类繁多。果蔬颜色可暗示其独特的营养，茄子果皮有紫色、绿色、黑色、橘红色和白色等，其中大多数地区以紫色茄子栽培最多，而我国南通地区以栽培绿茄居多，少有栽培茄皮颜色为白色和橘红色的野生型茄子。紫色茄子中含有多种有益身心健康的化合物，如总酚、花青素、生物碱及甾类，还存在抗真菌、抗病毒和抗肿瘤等活性物质。茄子中的茄碱成分物质可以减低胆固醇，增强肝脏生理功能。紫茄皮中的水溶性花青素具有较高的稳定性与实用性，常吃茄子(茄皮)对防治高血压、动脉硬化、老年痴呆有一定的功效。

bHLH转录因子在植物的发育过程和防御反应中发挥重要调节作用，参与花青素的生物合成，其家族基因在许多植物中已被鉴定出，但在茄子中尚未见报道，且bHLH转录因子在花青素生物合成过程中的研究相对较少。

因此，如何提供一种茄子茎中花青素调控基因是本领域技术人员亟需解决的问题。

发明内容

有鉴于此，本发明提供了一种茄子茎中花青素调控基因SmbHLH1及其应用。

为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

一种茄子茎中花青素调控基因SmbHLH1，其核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示，氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示。

本发明还提供了含有上述基因SmbHLH1的生物材料，生物材料为表达载体、克隆载体、工程菌或非可再生的植物部分。

本发明还提供了上述基因SmbHLH1或上述生物材料在调控植物花青素含量中的应用，植物为茄子。

本发明还提供了上述基因SmbHLH1或上述生物材料在制备转基因植物中的应用，植物为茄子。

本发明还提供了上述基因SmbHLH1或上述生物材料在植物育种中的应用，植物为茄子。

优选的：育种的目的为调控植物花青素含量。

本发明还提供了一种降低植物花青素含量的方法，方法包括：使植物过表达上述基因SmbHLH1；其中植物为茄子。

本发明还提供了鉴定植物的方法，植物是包含上述基因SmbHLH1的茄子，或包含上述生物材料的茄子，或者由上述方法获得的茄子，其包括如下步骤：测定植物是否包含上述基因SmbHLH1。

优选的：测定方法为PCR，所需引物包括35S-F和SmbHLH1-R1，其核苷酸序列：

35S-F：5'-CTATCCTTCGCAAGACCCTTC-3'，如SEQ ID NO：3所示；

SmbHLH1-R1：5'-TCAAGGAGATTCAAG-3'，如SEQ ID NO：4所示。

优选的：PCR反应程序：

预变性95℃3min；变性95℃15s、退火58℃15s，延伸72℃1min，32个循环；彻底延伸72℃5min。

经由上述的技术方案可知，与现有技术相比，本发明公开提供了一种茄子茎中花青素调控基因SmbHLH1及其应用，本发明找到调控茄子茎中花青素的转录因子SmbHLH1，为研究生产出富含花青素的茄子打下了基础。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据提供的附图获得其他的附图。

图1附图为本发明提供的‘非洲红茄’示意图。

图2附图为本发明提供的PCR扩增SmbHLH1全长示意图，其中，泳道1为2000Marker，泳道2和3为扩增的SmbHLH1全长。

图3附图为本发明提供的对SmbHLH1的蛋白进行序列分析示意图。

图4附图为转基因植株验证电泳示意图，其中，泳道1为2000MarKer，泳道2和泳道3是‘非洲红茄’植株，泳道4和泳道5是‘非洲红茄’转基因植株。

图5附图为本发明提供的SmbHLH1表达量上升以及花青素合成相关的结构基因SmCHS，SmDFR，SmF3H和SmF3GT的表达量显著降低示意图，其中WT为‘非洲红茄’植株。T-Green为‘非洲红茄’转基因变绿植株。

具体实施方式

下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

本发明实施例公开了一种茄子茎中花青素调控基因SmbHLH1及其应用。

实施例所需原料、试剂盒、载体均为市售渠道获得，未提及的方法均为常规实验方法，在此不再赘述。

实施例1

SmbHLH1基因的克隆方法

1.1利用Trizol法进行‘非洲红茄’(参见图1)叶片总RNA的提取

(1)在RNase-free离心管中加入1ml的Trizol试剂；

(2)取100mg植物组织用液氮充分研磨至粉末，加入上述1ml Trizol中，涡旋振荡混匀，室温静置5min；

(3)12000rpm，4℃低温离心10min；

(4)取上清，转入新离心管中，加入200μl氯仿，用手剧烈震荡15s去除蛋白，室温静置5min；

(5)12000rpm，4℃低温离心15min；

(6)此时溶液分为三层，取最上层清液(约500μl)于新离心管中，加入等体积异丙醇，上下颠倒混匀，室温静置10min；

(7)12000rpm，4℃低温离心10min；

(8)弃上清，加入1ml 75％乙醇，充分洗涤管盖和管壁，并轻弹管底，使沉淀悬浮，静置5min；

(9)12000rpm，4℃低温离心5min；

(10)沉淀用1ml 75％乙醇再清洗1次，弃去上清，室温敞口干燥沉淀；

(11)加入适量RNase-free ddH₂O(约50μl)溶解；

(12)待完全溶解，取适量RNA溶液，测定RNA浓度及用1％浓度的琼脂糖检测RNA完整性。

1.2PCR扩增SmbHLH1全长

取5μl总RNA，按照

One-Step gDNA Removal and cDN A SynthesisSuperMix(TRANS)试剂的说明书进行反转录，将反应稀释液稀释5倍作为PCR扩增的模板，引物序列：SmbHLH1F：5'-CATATGCCCGTCGACATGCAGGCCCAGATC-3'，如SEQ ID NO:5所示，其中，CATATGCCCGTCGAC为特异性扩增引物前加上的载体序列上的同源臂，方便利用同源重组酶构建表达载体；SmbHLH1R2：5'-ACCCCCGGGGTCGACTCAAGGAGATTCAAG-3'如SEQ ID NO:6所示，其中，ACCCCCGGGGTCGAC为特异性扩增引物前加上的载体序列上的同源臂，方便利用同源重组酶构建表达载体。表1为PCR扩增体系。

表1

PCR反应程序：预变性95℃3min/30sec；变性95℃15s、退火58℃15s，延伸72℃1min(变性+退火+延伸)共32个循环；彻底延伸72℃5min。

PCR产物纯化回收，片段大小约为1983bp(如图2所示)，核苷酸序列为ATGCAGGCCCAGATCCATGGGCTAACACCCACAGAAAACTACCGAAATCGCATGTTTTCTGTTCATCGTCCCATAAAATCCTACCAGGCCTCCGCCAACGCCGTCGGGCTACCTGGGCCTCTTGCCAGGCTAGTTGCGGACCCATCCACTGTCGTTTGTATTCCTCTGTTGGACGGTGGAGTGGAACTGGGAACTACAGAAAGGGTTGGAGAAGACATTGGATTCATACATCATATAAAAAGTTTCGTCACTGAGCAACCACTACCTAAGCCAGCTTTATCTGAGCACTCTACCTCCAATCCCACCGTCTTTTCGGAGCCATGCTTTTACTCCAGCAATACTCCGTCATCCATTGATATTTGTCCAGACGGTAGAATTGCTGGAGAAGAAGAAAATGAGGATGAGGACGCGAGGAAGAAGATGATCGAGCAGAAGATGATCCTGAATCCACCGAATGTAGATACCATTCGTGGGAAGGCTTATTCAAAGAAACATCACATATGGATAGTGGGCGCAAACGAGGTTGACAGTAAAGTCTTCTGTAGAGCTATTCTTGCAAAGACTGTCGTTTGTATTCCTCTATTGGACGGTGTAGTGGAACTGGGAACTACAGAAAGGGTTGAAGAAGACATTGGATTCATACATCATATAAAAAGCTTCTTCACTGAGCAACCACCACCTAAGCCAGCTTTATCTGAGCACTCTACCTCCAATCCCACCGCCTTCTCGGAGCCATGTTTTTACTCCGGCAGTACTCCGTCATCCATTGATATTTGCCCAGACGGTAGAACTGCTAGAGAAGAAGAAAATGAGGACGAGGACGAGGAAGAAGATGATGATGAAGCTGAATTAGGCTCGAATGGTATAGCAGTTCAAAGTGGGGTTGGGTCGGCTGAGGCTAGTGAGCTCATGCAGCTTGATATGTCTGAAGCTATACGGCTTGGCTCCCCGGATGATGGCTCTAATAATATGGACTCTGATTTTCATTTGGTTGGGGTTAGCCAAGCTGGAAATACAGCTGAATCTTTCAAAGCTGAGACTGCAATTAGTTGGGCTAACTTCCAAGACCTTCAACATGTACCAGGTGTCCCTATTTATGATAAATTATCACAAGAAGATAACCATTATTCCCAAACAGTATCAGCCGTTCTGGAACACCTCTCAAACACAAGCACTACCGTAATGGGCTGTATTTCTCATGACTCAGCCCAATCCGCCTTCACATCATGGCCTACCATTTGCAGCCCAAATCCCTCCCGCCACGATAATGGCGGGGGCAGCCGGCAGTGGCTGCTCAAAAGCATACTCTTCACTGTCCCATTTCTCCACAATAATAAATTACACCAATCAACTGAAGCTGAATCTCCAAAGTTGCGTGAGATGGCGGTCGACTCATCGGCCACCGCTTCTCAATTCCAGAAAGAGCAAGAAGAGCCGAGCGGGAATCATGTCTTAGCGGAACGACGTCGTAGAGAGAAGCTGAACGAGCGTTTTATAATTTTAAGGTCTTTAGTCCCGTTCGTTACGAAAATGGATAAAGCATCGATACTTGGTGATACCATAGAGTATGTGAAGCAGTTACGTAAGAAAGTTCACGATCTTGAAGCGCGTGCTCGTCACACACAGGCCATCACAGATGCAGATGAAAACAGTGGTACAGCAACAGTGAAGGGGAAGAGGAGAATGGAGGAAAGTACTGGCGGAGGGGCGGATGAGGAGGTTTTGCAAGTACAAGTTTCGATTATCGAGAACGATGCACTGGTGGAGCTCCGGTGTCCGTACAAAGAAGGGTTGTTGTTAGATATAATGCAAATGCTAAGGGAACTCAAAGTTGAAGTTGTAGCCATCCAGTCATCTCTTAATACCGGCATCTTAGTGGCTGAGTTAAGAGCCAAGGTTGTTGTATCCTGGAGGGGACAAATCAAGAAGAGTACTGCTGGACCGGTGAAAAAATTTTGCTGCAGTGGGCTTGAATCTCCTTGA，如SEQ ID NO：1所示。

1.3PCR产物胶回收

电泳跑完之后，使用凝胶成像仪拍摄照片，选取符合目的条带的长度进行胶回收，参照

Quick Gel Extraction Kit(TRANS)DNA胶回收试剂盒，具体操作步骤如下：

(1)将特异性好的单一目的条带放在紫外灯下切取(快速操作，以防紫外光下碱基发生突变)，并放入干净的1.5ml离心管中；

(2)向离心管中加入3倍体积溶液GSB(约600μl)，55℃水浴锅中10min左右，期间摇晃几次，确保融化完全，融化完全后溶液为黄色；

(3)将融化的凝胶溶液冷却至室温(高温离心柱结合DNA能力弱)，加入离心管中静置1min；

(4)10000rpm常温离心5min，弃流出液，加入650μl溶液WB；

(5)10000rpm常温离心1min，倒掉废液；

(6)重复上一步骤；

(7)将离心柱置于新的1.5ml离心管中，开盖静置2min，使残留的乙醇挥发干净。在柱的中央加入40μl预热至60℃的ddH₂O，室温静置2min；

(6)10000rpm常温离心1min，得到DNA溶液，-20℃保存。

1.4克隆载体连接

使用

-Blunt Simple Cloning Kit(TRANS)试剂，将PCR胶回收产物连接到克隆载体

-Blunt Simple Cloning Vector上，操作如下，表2为克隆反应体系。

表2

轻轻混合上述反应液，20℃-37℃连接30min(反应时间根据片段大小确定)，反应结束后将离心管置于冰上。

1.5克隆载体转化及阳性克隆筛选

(1)将连接好的产物及大肠杆菌感受态置于冰上，取融化的大肠杆菌感受态50μl加入到10μl的重组产物中；

(2)轻轻混匀，在冰上放置30min，打开水浴锅42℃及在超净工作台中准备500μl液体LB；

(3)42℃水浴中热激30s，之后马上转至冰上2min；

(4)加入到600μl的液体LB培养基中混匀；

(5)250rpm，37℃培养1h，使细菌复苏，准备超净工作台及涂布器；

(6)4000rpm离心30s，弃上清；

(7)在超净工作台中反复吸打，用灭菌的涂布器将其均匀涂布在含有卡那霉素抗生素的LB琼脂培养基上；

(8)倒放置于黑暗37℃恒温培养箱中过夜培养；

(9)用灭菌牙签挑取单克隆菌落划板并沾取到PCR体系离心管中，使用

DNA Polymerase(TRANS)试剂进行PCR验证，体系如下表3。

表3

PCR反应程序：预变性95℃3min；变性95℃30s、退火56～72℃30s，延伸72℃1min(变性+退火+延伸)共32个循环；彻底延伸72℃7min。

(10)待反应结束后，加入5μl 6×DNA Loading Buffer，进行电泳检测，取阳性克隆送生工生物工程(上海)股份有限公司测序。将测序结果进行BLAST分析。

1.6序列比对分析

对SmbHLH1的蛋白进行序列分析(参见图3)，氨基酸序列如下：

MQAQIHGLTPTENYRNRMFSVHRPIKSYQASANAVGLPGPLARLVADPSTVVCIPLLDGGVELGTTERVGEDIGFIHHIKSFVTEQPLPKPALSEHSTSNPTVFSEPCFYSSNTPSSIDICPDGRIAGEEENEDEDARKKMIEQKMILNPPNVDTIRGKAYSKKHHIWIVGANEVDSKVFCRAILAKTVVCIPLLDGVVELGTTERVEEDIGFIHHIKSFFTEQPPPKPALSEHSTSNPTAFSEPCFYSGSTPSSIDICPDGRTAREEENEDEDEEEDDDEAELGSNGIAVQSGVGSAEASELMQLDMSEAIRLGSPDDGSNNMDSDFHLVGVSQAGNTAESFKAETAISWANFQDLQHVPGVPIYDKLSQEDNHYSQTVSAVLEHLSNTSTTVMGCISHDSAQSAFTSWPTICSPNPSRHDNGGGSRQWLLKSILFTVPFLHNNKLHQSTEAESPKLREMAVDSSATASQFQKEQEEPSGNHVLAERRRREKLNERFIILRSLVPFVTKMDKASILGDTIEYVKQLRKKVHDLEARARHTQAITDADENSGTATVKGKRRMEESTGGGADEEVLQVQVSIIENDALVELRCPYKEGLLLDIMQMLRELKVEVVAIQSSLNTGILVAELRAKVVVSWRGQIKKSTAGPVKKFCCSGLESP如SEQ ID NO：2所示。发现SmbHLH1存在碱性区域和螺旋-环-螺旋区域。并与SIAH，PhAN1，VvMYC等均处于同一分支，N-端保守基序中存在能与DNA结合的氨基酸谷氨酸和精氨酸。

实施例2

为验证SmbHLH1基因的花青素调控功能，本实验在实施过程中提供了SmbHLH1转基因植株，观察到转基因植株表型的变化。

2.1SmbHLH1过表达载体的构建

2.1.1质粒提取

本试验使用PurePlasmid Mini Kit(CWBIO)高纯度质粒小提试剂盒提取质粒：

(1)取1ml过夜培养的菌液加入到1.5ml离心管中，13000rpm离心30s收集菌体沉淀，尽量弃上清；

(2)重复上述步骤两次；

(3)向留有菌体沉淀的离心管中加入250μl Buffer P1(已加入RNase A)，使用涡旋振荡器充分混匀，悬浮菌体沉淀(如果未彻底混匀，将会影响裂解效果，导致提取量和纯度偏低)；

(4)向离心管中加入250μl Buffer P2，温和地上下颠倒混匀4～6次(剧烈震荡，会打断基因组DNA，造成提取的质粒中混有基因组DNA片段)，使菌体充分裂解，此时溶液应变得清亮粘稠，此步骤所用时间不超过5min，避免质粒受到破坏；

(5)向离心管中加入350μl Buffer N3，立即上下颠倒混匀8-10次，此时出现白色絮状沉淀，13000rpm离心12min；

(6)将所得的上清液分批转移到收集管的吸附柱(Spin Columns DM)中，13000rpm离心30s，倒掉收集管中的废液，将吸附柱重新放回收集管中；

(7)向吸附柱中加入150μl Buffer PB，13000rpm离心30s，倒掉收集管中的废液；

(8)向吸附柱中加入400μl Buffer PW(已加入无水乙醇)，13000rpm离心1min，倒掉收集管中的废液；

(9)将吸附柱重新放回收集管中，13000rpm离心1min，倒掉收集管中的废液；

(10)将吸附柱置于一个新的1.5ml离心管中，向吸附膜中加入60μl Buffer EB，室温放置3min，13000rpm离心1min，得到质粒溶液，-20℃保存。

2.1.2质粒酶切

酶切体系如下，表4质粒酶切反应体系。

表4

37℃酶切30min，酶切产物及对照进行琼脂糖凝胶电泳检测，将线性化片段胶回收。

2.1.3表达载体连接

使用

-Uni Seamless Cloning and Assembly Kit(TRANS)产品，利用特殊的重组酶和同源重组的原理，实现高效无缝拼接，体系如下，表5表达反应体系的建立。

表5

轻轻混合以上体系(Linearized vector为步骤2.1.2胶回收产物，Inserts为步骤1.3胶回收产物)，50℃反应15min。反应结束后，将离心管置于冰上冷却数秒，之后将产物用于转化到大肠杆菌(步骤同实施例1中1.5部分)，之后将阳性克隆提取质粒，转化到农杆菌内。

2.1.4冻融法转化农杆菌

(1)将LBA4404农杆菌感受态置于冰上融化，取10μl表达载体及50μl农杆菌感受态于1.5ml离心管中，轻轻混匀置于冰上30min，打开水浴锅37℃，准备LB液体培养基；

(2)拿出液氮速冻3min，37℃水浴热激5min，然后立即放置冰上2min；

(3)将其全部加入到600μl LB液体培养基中，220rpm在28℃下振荡培养2～3h，准备超净工作台及涂布器；

(4)4000rpm离心1min，弃上清；

(5)将沉淀菌液反复吸打，在超净工作台中用灭菌的涂布器将其涂布于含有25mg/L利福平(Rifampicin)和50mg/L卡那霉素(Kanamycin)的LB培养基上进行抗性筛选，28℃倒置在恒温培养箱中培养，待长出单菌落；

(6)挑取单菌落进行PCR验证阳性克隆验证及保存菌液。

2.2农杆菌侵染获得转基因苗

在超净工作台中播种‘非洲红茄’茄子种子，黑暗培养至发芽后，转到光下培养约7d茄子子叶展平，切取子叶平铺在预培养基上.将含有重组质粒pRI-SmbHLH1的农杆菌LBA4404摇菌过夜，第二天3000g离心10min，在超净工作台内弃去上清液，用MS液体培养基溶解附着于离心管管底的农杆菌沉淀，制成农杆菌悬浮液，吸取适量加入到20ml的MS液体培养基中使侵染浓度OD值在0.3左右。用灭菌的镊子轻轻将预培养基上的子叶外植体浸没在农杆菌悬浮液中15～20min，期间每隔5min摇晃一次。侵染结束后将镊子子叶取出，尽量不破伤子叶，用无菌纸吸干外植体表面残留的菌液，再将子叶接种于预培养基上放于黑暗中进行共培养，共培养的时间为2d。经侵染后的子叶放到分化及筛选培养基上生长。培养基每15d左右更换一次，约4个月愈伤分化出小苗。小苗是否是转基因植株，需进一步验证。

2.3转基因植株验证

2.3.1茄子DNA提取

用CTAB法提取茄子总DNA，步骤如下：

(1)打开水浴锅65℃，在离心管中加入取1ml 2％CTAB提取液，放入水浴锅中预热15min；

(2)取茄子组织材料0.2g用液氮研磨成粉末状，移至预热的CTAB中混匀，65℃恒温15-30min，期间振荡几次；

(3)10000rpm常温离心7min，取上清液约700μl；

(4)加入等体积的氯仿/异戊醇(24/1)抽提，剧烈震荡混匀；

(5)12000rpm常温离心10min，取上清液约650μl；

(6)加入等体积异丙醇，轻轻混匀，-20℃放置20min；

(7)12000rpm常温离心5min，弃上清；

(8)沉淀用75％乙醇清洗2遍，晾干；

(9)加入ddH₂O 40μl混溶，电泳检测，-20℃保存。

使用35S-F：5'-CTATCCTTCGCAAGACCCTTC-3'，如SEQ ID NO：3所示；和SmbHLH1-R1：5'-TCAAGGAGATTCAAG-3'，如SEQ ID NO：4所示，进行PCR转基因验证(步骤同实施例1中1.2部分中的PCR扩增体系)，结果表明，泳道4和泳道5为转SmbHLH1植株(如图4所示)。分别提取野生型和转基因植株茎表皮的RNA(步骤同实施例1中1.1部分)，并进行荧光定量验证。

2.3.2实时荧光定量PCR

试验使用ChamQTM Universal

qPCR Master Mix(Vazyme)试剂，仪器为Applied BiosystemsTM 7500Fast Dx Real-Time PCR，操作如下：

荧光定量所用引物序列见表6。

表6

(2)在0.2ml荧光定量光学平盖8连管中加入以下体系，参见表7：

表7

(3)程序：预变性95℃，3min；95℃，10s，60℃，30s，40cycles；Melt curve，End。

结果表明，在转基因植株中，SmbHLH1表达量显著提升，转基因植株的茎由紫色变为绿色，而且与花青素合成相关的结构基因SmCHS，SmDFR，SmF3H和SmF3GT的表达量显著降低(如图5所示)，表明SmbHLH1能调控花青素的合成，降低植物茎中花青素含量。

本说明书中各个实施例采用递进的方式描述，每个实施例重点说明的都是与其他实施例的不同之处，各个实施例之间相同相似部分互相参见即可。

对所公开的实施例的上述说明，使本领域专业技术人员能够实现或使用本发明。对这些实施例的多种修改对本领域的专业技术人员来说将是显而易见的，本文中所定义的一般原理可以在不脱离本发明的精神或范围的情况下，在其它实施例中实现。因此，本发明将不会被限制于本文所示的这些实施例，而是要符合与本文所公开的原理和新颖特点相一致的最宽的范围。

序列表

<110> 山东农业大学

<120> 一种茄子茎中花青素调控基因SmbHLH1及其应用

<160> 18

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1983

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

atgcaggccc agatccatgg gctaacaccc acagaaaact accgaaatcg catgttttct 60

gttcatcgtc ccataaaatc ctaccaggcc tccgccaacg ccgtcgggct acctgggcct 120

cttgccaggc tagttgcgga cccatccact gtcgtttgta ttcctctgtt ggacggtgga 180

gtggaactgg gaactacaga aagggttgga gaagacattg gattcataca tcatataaaa 240

agtttcgtca ctgagcaacc actacctaag ccagctttat ctgagcactc tacctccaat 300

cccaccgtct tttcggagcc atgcttttac tccagcaata ctccgtcatc cattgatatt 360

tgtccagacg gtagaattgc tggagaagaa gaaaatgagg atgaggacgc gaggaagaag 420

atgatcgagc agaagatgat cctgaatcca ccgaatgtag ataccattcg tgggaaggct 480

tattcaaaga aacatcacat atggatagtg ggcgcaaacg aggttgacag taaagtcttc 540

tgtagagcta ttcttgcaaa gactgtcgtt tgtattcctc tattggacgg tgtagtggaa 600

ctgggaacta cagaaagggt tgaagaagac attggattca tacatcatat aaaaagcttc 660

ttcactgagc aaccaccacc taagccagct ttatctgagc actctacctc caatcccacc 720

gccttctcgg agccatgttt ttactccggc agtactccgt catccattga tatttgccca 780

gacggtagaa ctgctagaga agaagaaaat gaggacgagg acgaggaaga agatgatgat 840

gaagctgaat taggctcgaa tggtatagca gttcaaagtg gggttgggtc ggctgaggct 900

agtgagctca tgcagcttga tatgtctgaa gctatacggc ttggctcccc ggatgatggc 960

tctaataata tggactctga ttttcatttg gttggggtta gccaagctgg aaatacagct 1020

gaatctttca aagctgagac tgcaattagt tgggctaact tccaagacct tcaacatgta 1080

ccaggtgtcc ctatttatga taaattatca caagaagata accattattc ccaaacagta 1140

tcagccgttc tggaacacct ctcaaacaca agcactaccg taatgggctg tatttctcat 1200

gactcagccc aatccgcctt cacatcatgg cctaccattt gcagcccaaa tccctcccgc 1260

cacgataatg gcgggggcag ccggcagtgg ctgctcaaaa gcatactctt cactgtccca 1320

tttctccaca ataataaatt acaccaatca actgaagctg aatctccaaa gttgcgtgag 1380

atggcggtcg actcatcggc caccgcttct caattccaga aagagcaaga agagccgagc 1440

gggaatcatg tcttagcgga acgacgtcgt agagagaagc tgaacgagcg ttttataatt 1500

ttaaggtctt tagtcccgtt cgttacgaaa atggataaag catcgatact tggtgatacc 1560

atagagtatg tgaagcagtt acgtaagaaa gttcacgatc ttgaagcgcg tgctcgtcac 1620

acacaggcca tcacagatgc agatgaaaac agtggtacag caacagtgaa ggggaagagg 1680

agaatggagg aaagtactgg cggaggggcg gatgaggagg ttttgcaagt acaagtttcg 1740

attatcgaga acgatgcact ggtggagctc cggtgtccgt acaaagaagg gttgttgtta 1800

gatataatgc aaatgctaag ggaactcaaa gttgaagttg tagccatcca gtcatctctt 1860

aataccggca tcttagtggc tgagttaaga gccaaggttg ttgtatcctg gaggggacaa 1920

atcaagaaga gtactgctgg accggtgaaa aaattttgct gcagtgggct tgaatctcct 1980

tga 1983

<210> 2

<211> 660

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

Met Gln Ala Gln Ile His Gly Leu Thr Pro Thr Glu Asn Tyr Arg Asn

1 5 10 15

Arg Met Phe Ser Val His Arg Pro Ile Lys Ser Tyr Gln Ala Ser Ala

20 25 30

Asn Ala Val Gly Leu Pro Gly Pro Leu Ala Arg Leu Val Ala Asp Pro

35 40 45

Ser Thr Val Val Cys Ile Pro Leu Leu Asp Gly Gly Val Glu Leu Gly

50 55 60

Thr Thr Glu Arg Val Gly Glu Asp Ile Gly Phe Ile His His Ile Lys

65 70 75 80

Ser Phe Val Thr Glu Gln Pro Leu Pro Lys Pro Ala Leu Ser Glu His

85 90 95

Ser Thr Ser Asn Pro Thr Val Phe Ser Glu Pro Cys Phe Tyr Ser Ser

100 105 110

Asn Thr Pro Ser Ser Ile Asp Ile Cys Pro Asp Gly Arg Ile Ala Gly

115 120 125

Glu Glu Glu Asn Glu Asp Glu Asp Ala Arg Lys Lys Met Ile Glu Gln

130 135 140

Lys Met Ile Leu Asn Pro Pro Asn Val Asp Thr Ile Arg Gly Lys Ala

145 150 155 160

Tyr Ser Lys Lys His His Ile Trp Ile Val Gly Ala Asn Glu Val Asp

165 170 175

Ser Lys Val Phe Cys Arg Ala Ile Leu Ala Lys Thr Val Val Cys Ile

180 185 190

Pro Leu Leu Asp Gly Val Val Glu Leu Gly Thr Thr Glu Arg Val Glu

195 200 205

Glu Asp Ile Gly Phe Ile His His Ile Lys Ser Phe Phe Thr Glu Gln

210 215 220

Pro Pro Pro Lys Pro Ala Leu Ser Glu His Ser Thr Ser Asn Pro Thr

225 230 235 240

Ala Phe Ser Glu Pro Cys Phe Tyr Ser Gly Ser Thr Pro Ser Ser Ile

245 250 255

Asp Ile Cys Pro Asp Gly Arg Thr Ala Arg Glu Glu Glu Asn Glu Asp

260 265 270

Glu Asp Glu Glu Glu Asp Asp Asp Glu Ala Glu Leu Gly Ser Asn Gly

275 280 285

Ile Ala Val Gln Ser Gly Val Gly Ser Ala Glu Ala Ser Glu Leu Met

290 295 300

Gln Leu Asp Met Ser Glu Ala Ile Arg Leu Gly Ser Pro Asp Asp Gly

305 310 315 320

Ser Asn Asn Met Asp Ser Asp Phe His Leu Val Gly Val Ser Gln Ala

325 330 335

Gly Asn Thr Ala Glu Ser Phe Lys Ala Glu Thr Ala Ile Ser Trp Ala

340 345 350

Asn Phe Gln Asp Leu Gln His Val Pro Gly Val Pro Ile Tyr Asp Lys

355 360 365

Leu Ser Gln Glu Asp Asn His Tyr Ser Gln Thr Val Ser Ala Val Leu

370 375 380

Glu His Leu Ser Asn Thr Ser Thr Thr Val Met Gly Cys Ile Ser His

385 390 395 400

Asp Ser Ala Gln Ser Ala Phe Thr Ser Trp Pro Thr Ile Cys Ser Pro

405 410 415

Asn Pro Ser Arg His Asp Asn Gly Gly Gly Ser Arg Gln Trp Leu Leu

420 425 430

Lys Ser Ile Leu Phe Thr Val Pro Phe Leu His Asn Asn Lys Leu His

435 440 445

Gln Ser Thr Glu Ala Glu Ser Pro Lys Leu Arg Glu Met Ala Val Asp

450 455 460

Ser Ser Ala Thr Ala Ser Gln Phe Gln Lys Glu Gln Glu Glu Pro Ser

465 470 475 480

Gly Asn His Val Leu Ala Glu Arg Arg Arg Arg Glu Lys Leu Asn Glu

485 490 495

Arg Phe Ile Ile Leu Arg Ser Leu Val Pro Phe Val Thr Lys Met Asp

500 505 510

Lys Ala Ser Ile Leu Gly Asp Thr Ile Glu Tyr Val Lys Gln Leu Arg

515 520 525

Lys Lys Val His Asp Leu Glu Ala Arg Ala Arg His Thr Gln Ala Ile

530 535 540

Thr Asp Ala Asp Glu Asn Ser Gly Thr Ala Thr Val Lys Gly Lys Arg

545 550 555 560

Arg Met Glu Glu Ser Thr Gly Gly Gly Ala Asp Glu Glu Val Leu Gln

565 570 575

Val Gln Val Ser Ile Ile Glu Asn Asp Ala Leu Val Glu Leu Arg Cys

580 585 590

Pro Tyr Lys Glu Gly Leu Leu Leu Asp Ile Met Gln Met Leu Arg Glu

595 600 605

Leu Lys Val Glu Val Val Ala Ile Gln Ser Ser Leu Asn Thr Gly Ile

610 615 620

Leu Val Ala Glu Leu Arg Ala Lys Val Val Val Ser Trp Arg Gly Gln

625 630 635 640

Ile Lys Lys Ser Thr Ala Gly Pro Val Lys Lys Phe Cys Cys Ser Gly

645 650 655

Leu Glu Ser Pro

660

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<212> DNA

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<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

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<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

catatgcccg tcgacatgca ggcccagatc 30

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<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

acccccgggg tcgactcaag gagattcaag 30

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<211> 22

<212> DNA

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<400> 7

atgtggctac accgatggat tt 22

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<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

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<211> 21

<212> DNA

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<211> 21

<212> DNA

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acggttcaaa cgcctttatc a 21

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<211> 21

<212> DNA

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ggtaagaaag gtggattcat t 21

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<211> 20

<212> DNA

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ccatccttgt ggtttgtcgg 20

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<212> DNA

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<212> DNA

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<211> 20

<212> DNA

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<400> 18

ataggacctc agggcaacgg 20

Claims

1.基因SmbHLH1或生物材料在降低茄子茎中花青素含量中的应用，其特征在于，所述生物材料为含有基因SmbHLH1的表达载体、克隆载体、工程菌或非可再生的植物部分，所述基因SmbHLH1核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示，氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示。

2.基因SmbHLH1或生物材料在茄子育种中的应用，其特征在于，所述育种的目的为降低茄子茎中的花青素含量；所述生物材料为含有基因SmbHLH1的表达载体、克隆载体、工程菌或非可再生的植物部分，所述基因SmbHLH1核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示，氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示。

3.一种降低茄子茎中花青素含量的方法，其特征在于，所述方法包括：使植物过表达权利要求1中所述基因SmbHLH1；所述基因SmbHLH1核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示，氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示。