CN108220260B - 一种催化柚皮素生成山萘酚的融合酶及其应用 - Google Patents

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Abstract

一种催化柚皮素生成山萘酚的融合酶及其应用，氨基酸序列如SEQ ID NO.13所示。本发明通过组合筛选策略获得能有效催化柚皮素生成山萘酚的黄烷酮3‑羟化酶（PeF3H）和黄酮醇合成酶（CuFLS），是目前报道的最佳组合。通过连接肽的筛选，获得了能适合PeF3H和CuFLS功能化融合的连接肽TPTPTPTP，通过该连接肽构建的融合酶（F69）能高效催化柚皮素生成山萘酚。携带该融合酶（F69）的重组菌BL21‑F69，通过高密度发酵，山萘酚的产量达到1010.2 mg/L，是目前报道最高产量的17倍。

Description

一种催化柚皮素生成山萘酚的融合酶及其应用
技术领域
本发明属于基因工程技术及生物医药领域，具体涉及一种融合酶的构建及其在催化柚皮素产山萘酚中的应用。
背景技术
山萘酚属于黄酮类化合物，分子式为C15H10O6，分子量为286.23。山萘酚广泛存在于多种植物中，具有抗氧化、抗炎症、抗癌等多种细胞保护功能。(1)抗氧化作用：山奈酚具有抑制AGE(Advanced glycation endproducts)形成和消除自由基功能，在预防细胞内酯类及DNA氧化损伤等方面具有较强抗氧化作用；(2)抗炎症作用：山萘酚作用于血管上皮细胞即表现出明显的抗炎症作用，效果强于其结构类似物槲皮素；研究还发现，人类口服低剂量山萘酚较槲皮素更易于吸收。山萘酚还能有效抑制一氧化氮生成，下调炎症反应中iNOS、TNF-a、NF-kB等因子的表达，从而有助于保护大脑，预防缺血性中风导致的脑损伤以及其它慢性炎症疾病；(3)抗癌作用：山萘酚通过激活前凋亡因子、抗肿瘤细胞增殖和生长等作用，能够诱导肿瘤细胞凋亡并降低各种癌症如肺癌、大肠癌、卵巢癌、乳腺癌和胰腺癌等的发病率。随着对山萘酚作用机理的深入研究，逐步发现山萘酚在预防动脉粥样硬化和糖尿病、抗衰老、抗微生物感染等方面具有特殊功效。而且山萘酚也是银杏叶提取物(GBE)重要的功能性化合物，也是其质量控制的标志性化合物之一。
目前山萘酚主要从桑叶、银杏等植物中通过提取制备，但其在植物中含量很低，因此通过提取分离手段制备难度大、产率低、成本高，且受植物分布、种类等因素限制(中国发明专利ZL200610152524.6)。由此可见，如何有效获取山萘酚是值得我们去深入研究的重大科技问题，解决这一问题，无疑对人类疾病的预防和治疗具有重要意义。柚皮素是山萘酚的前体化合物，植物通过合成途径关键酶黄烷酮3-羟化酶(F3H)催化柚皮素生成二氢山萘酚，二氢山萘酚再通过黄酮醇合成酶(FLS)的催化生成山萘酚。但目前报道的催化柚皮素生成山萘酚的产量还很低。分析可能的原因是：(1)黄烷酮3-羟化酶(F3H)和黄酮醇合成酶(FLS)催化能力还有待提高，需要筛选催化效率更高的基因源；(2)F3H和FLS的催化能力不匹配，容易造成二氢山萘酚的积累。
由此可见，获得催化性能优异的黄烷酮3-羟化酶(F3H)和黄酮醇合成酶(FLS)是高效催化柚皮素制备山萘酚的关键因素之一。但目前只有有限的几个基因已经克隆、表达并定性，因此我们无法通过文献报道获得催化性能优异的酶基因。本研究主要通过组合筛选策略对不同来源的黄烷酮3-羟化酶(F3H)和黄酮醇合成酶(FLS)基因进行了筛选，获得了最佳组合。另一方面，融合酶技术也被广泛应用异源合成途径的构建，通过融合酶技术可有效降低中间产物的生成，并能大幅提高目标产物的产量。但融合酶技术需要通过合适的连接肽才能使融合酶正确折叠，发挥催化作用。因此本研究另一方面的工作是对合适的连接肽进行筛选，获得最有利于融合酶发挥催化功能的连接肽。最终使融合酶能有效减少中间产物二氢山萘酚的产生，从而解除了中间产物对菌体生长的影响，实现了山萘酚的高效合成。
发明内容
解决的技术问题：本发明提供了一种催化柚皮素生成山萘酚的融合酶及其应用，携带该融合酶基因的重组菌能高效转化柚皮素制备山萘酚。
技术方案:一种催化柚皮素生成山萘酚的融合酶，氨基酸序列如SEQ ID NO:13所示。
催化柚皮素生成山萘酚的融合酶，连接肽为TPTPTPTP。
编码上述融合酶的基因，核酸序列如SEQ ID NO:10所示。
含有上述核苷酸序列的重组质粒。
含有上述重组质粒的大肠杆菌。
上述融合酶在催化柚皮素生成山萘酚中的应用。
上述大肠杆菌在催化柚皮素生成山萘酚中的应用。
上述应用的步骤为：将大肠杆菌在50μg/mL氨苄青霉素的LB平板上经过37℃培养过夜，挑转化子到150mL的LB培养基中，所述LB培养基内含有50μg/mL氨苄青霉素，37℃，200rpm振荡培养20h，将种子液接入3L发酵培养基中，37℃，并控制流加速度，使菌体浓度达到OD600 50–55，随后添加终浓度为0.1mM IPTG，并每隔1h添加终浓度为400mg/L的柚皮素，30℃转化培养9h，在转化过程中培养基葡萄糖浓度小于5g/L。
有益效果：1.通过组合筛选策略获得能有效催化柚皮素生成山萘酚的黄烷酮3-羟化酶(PeF3H)和黄酮醇合成酶(CuFLS)，是目前报道的最佳组合。
2.通过连接肽的筛选，获得了能适合PeF3H和CuFLS功能化融合的连接肽TPTPTPTP，通过该连接肽构建的融合酶(F69)能高效催化柚皮素生成山萘酚。
3.携带该融合酶(F69)的重组菌BL21-F69，通过高密度发酵，山萘酚的产量达到1010.2mg/L，是目前报道最高产量的17倍。
附图说明
图1为不同连接肽对融合酶转化柚皮素生成山萘酚的影响图；
图2为诱导温度、诱导菌浓度及IPTG浓度对重组菌BL21-F69转化柚皮素制备山萘酚的影响图，其中a为温度影响，b为诱导菌浓度影响，c为IPTG浓度影响；
图3为添加不同碳源对重组菌BL21-F69转化柚皮素制备山萘酚的影响图；
图4为底物浓度对重组菌BL21-F69转化柚皮素制备山萘酚的影响图；
图5为高密度培养重组菌BL21-F69转化柚皮素制备山萘酚图。
具体实施方式
以下实施例只为说明本发明的技术构思及特点，其目的在于让熟悉此项技术的人是能够了解本发明的内容并据以实施，并不能以此限制本发明的保护范围。凡根据本发明精神实质所做的等效变换或修饰，都应涵盖在本发明的保护范围之内。
为了进一步理解本发明，下面结合实施例对本发明进行详细阐述，其中，如无特殊说明，实施例中涉及的各种反应试剂均可以通过商业渠道购买得到；如无特殊说明，实施例中涉及的具体操作参见《分子克隆实验指南第三版》。
实施例1
1.黄烷酮3-羟化酶(F3H)和黄酮醇合成酶(FLS)的筛选
1.1黄烷酮3-羟化酶(F3H)和黄酮醇合成酶(FLS)基因的优化合成
对Populus eupnratica，Citrus sinensis和Ginko biloba来源的黄烷酮3-羟化酶(F3H)基因(XP_011043194.1，NP_001275816.1，AAU93347.1)按照大肠杆菌K12优势密码子表(http://www.kazusa.or.jp/codon/)对上述基因序列进行优化，选择氨基酸同义密码子使用频率高的密码子作为优势密码子，最终获得优化后的酶基因序列信息，由上海捷瑞生物工程有限公司合成，并在基因的N端和C端分别添加Nco I和BamH I酶切位点，获得优化后的黄烷酮3-羟化酶基因，分别命名为：Pef3h，Cisf3h，Gbf3h。其核酸序列分别为SEQ IDNO:1，SEQ ID NO:2和SEQ ID NO:3所示。
对Citrus unshiu，Cameuia sinensis和Fagopyrum tataricum来源的黄酮醇合成酶(FLS)基因(BAA36554.1，ABM88786.1，AEC33116.1)，按照大肠杆菌K12优势密码子表(http://www.kazusa.or.jp/codon/)对上述基因序列进行优化，选择氨基酸同义密码子使用频率高的密码子作为优势密码子，最终获得优化后的酶基因序列信息，由上海捷瑞生物工程有限公司合成，并在基因的N端和C端分别添加Nco I和BamH I酶切位点，获得优化后的黄酮醇合成酶基因，分别命名为：Cufls，Csfls，Ftfls。其核酸序列分别为SEQ ID NO:4，SEQID NO:5和SEQ ID NO:6所示。
1.2重组质粒构建
1.2.1重组质粒pETDuet-PeF3H，pETDuet-CisF3H和pETDuet-GbF3H的构建
将优化合成的基因Pef3h，Cisf3h和Gbf3h分别用Nco I和BamH I双酶切，同时将重组质粒pETDuet-1也用Nco I和BamH I双酶切，并分别割胶回收，浓缩后16℃连接过夜，将连接产物转化大肠杆菌JM109感受态细胞，筛选阳性克隆，进行序列分析；挑选序列正确的克隆提取质粒，获得重组质粒pETDuet-PeF3H，pETDuet-CisF3H和pETDuet-GbF3H。
1.2.2重组质粒pACYCDuet-CuFLS，pACYCDuet-CsFLS和pACYCDuet-FtFLS的构建
将优化合成的基因Cufls，Csfls和Ftfls分别用Nco I和BamH I双酶切，同时将重组质粒pACYCDuet-1也用Nco I和BamH I双酶切，并分别割胶回收，浓缩后16℃连接过夜，将连接产物转化大肠杆菌JM109感受态细胞，筛选阳性克隆，进行序列分析；挑选序列正确的克隆提取质粒，获得重组质粒pACYCDuet-CuFLS，pACYCDuet-CsFLS和pACYCDuet-FtFLS。
1.3重组菌的获得
将重组质粒pETDuet-PeF3H(A)，pETDuet-CisF3H(B)及pETDuet-GbF3H(C)和pACYCDuet-CuFLS(1)，pACYCDuet-CsFLS(2)及pACYCDuet-FtFLS(3)分别共转化大肠杆菌BL21(DE3)，共获得9个重组子，分别命名为BL21-A1(携带pETDuet-PeF3H和pACYCDuet-CuFLS)，BL21-A2(携带pETDuet-PeF3H和pACYCDuet-CsFLS)，BL21-A3(携带pETDuet-PeF3H和pACYCDuet-FtFLS)，BL21-B1(携带pETDuet-CisF3H和pACYCDuet-CuFLS)，BL21-B2(携带pETDuet-CisF3H和pACYCDuet-CsFLS)，BL21-B3(携带pETDuet-CisF3H和pACYCDuet-FtFLS)，BL21-C1(携带pETDuet-GbF3H和pACYCDuet-CuFLS)，BL21-C2(携带pETDuet-GbF3H和pACYCDuet-CsFLS)，BL21-C3(携带pETDuet-GbF3H和pACYCDuet-FtFLS)。
1.4重组菌转化柚皮素生成山奈酚的比较
分别将上述重组菌(BL21-A1，BL21-A2，BL21-A3，BL21-B1，BL21-B2，BL21-B3，BL21-C1，BL21-C2，BL21-C3)在含有氨苄青霉素(50μg/mL)和氯霉素(35μg/mL)的LB平板(LB培养基：胰蛋白胨10g/L，酵母提取物5g/L，NaCl 5g/L，琼脂15g/L)上经过37℃培养过夜，挑转化子到10mL的LB培养基中(50μg/mL氨苄青霉素和35μg/mL氯霉素)37℃，200rpm振荡培养至OD600为0.6时，加入终浓度为0.2mM异丙基β-D-硫代吡喃半乳糖苷(IPTG)诱导剂，和100mg/L或者400mg/L的柚皮素，30℃转化24h。柚皮素、二氢山萘酚及山萘酚的测定采用HPLC方法测定，HPLC测定的条件为：Agilent 1260Infinity；DAD检测器检测波长为280及368nm，柱温为40℃，流动相流速为0.8mL/min(A:甲醇，B:1％甲酸水＝55：45，15min)。结果表明含有重组菌BL21-A1的转化能力最强(表1)。
表1重组菌转化柚皮素生成山奈酚的比较
Figure BDA0001501652760000051
2.融合酶的构建及筛选
2.1重组质粒的构建
由上述实验结果可以发现Pef3h和Cufls的基因组合效果最佳，能有效催化柚皮素生成山萘酚。因此随后融合酶的构建以Pef3h和Cufls为基因源进行相关实验。连接肽对融合酶的构建至关重要，因为融合酶能否正确折叠发挥催化功能与连接肽密切相关，本研究共对6种连接肽进行了筛选，并分别构建了6种融合酶，分别为：PeF3H-GGGGS-CuFLS(F66)，PeF3H-(GGGGS)2-CuFLS(F67)，PeF3H-TPTP-CuFLS(F68)，PeF3H-(TPTP)2-CuFLS(F69)，PeF3H-EAAAK-CuFLS(F70)和PeF3H-(EAAAK)2-CuFLS(F71)。其核酸序列分别为SEQ ID NO:7，SEQ ID NO:8，SEQ ID NO:9，SEQ ID NO:10，SEQ ID NO:11和SEQ ID NO:12所示。相关的质粒构建如下所述。
2.1.1重组质粒pETDuet-f66，pETDuet-f67，pETDuet-f68，pETDuet-f69，pETDuet-f70和pETDuet-f71的构建
以pETDuet-PeF3H为模板，并以SEQ ID NO:1为基础设计去除终止密码子的引物，引物由上海生物工程有限公司合成。引物为PeF3H-f1：CCCCCATGGCTCCTAGTACACTGAC，PeF3H-f2：CCCGGATCCTGCCAGAATT TCTTCGATAG，下划线表示酶切位点。PCR扩增的条件是95℃，5min；暂停计时，加Pyrobest聚合酶，加40μL石蜡油密封；35次循环(94℃，50s；51℃，90s；72℃，1min)；72℃，10min；反应停止，4℃保温。通过凝胶回收试剂盒对PCR扩增产物进行纯化。得到基因和pETDuet-1分别用Nco I和BamH I进行双酶切，并分别割胶回收，浓缩后16℃连接过夜，将连接产物转化大肠杆菌JM109感受态细胞，筛选阳性克隆，进行序列分析；挑选序列正确的克隆提取质粒，获得重组质粒pETDuet-PeF3H-f。
以pACYCDuet-CuFLS为模板，并以SEQ ID NO:4为基础设计引物，引物由上海生物工程有限公司合成。引物为CuFLS-f1：CCCGGATCCATGGAGGTTGAACGTGTTCA，CuFLS-f2：CCCAA GCTTTTACTGCGGCAGTTTGTTCAGTT，下划线表示酶切位点。PCR扩增的条件是95℃，5min；暂停计时，加Pyrobest聚合酶，加40μL石蜡油密封；35次循环(94℃，50s；51℃，90s；72℃，1min)；72℃，10min；反应停止，4℃保温。通过凝胶回收试剂盒对PCR扩增产物进行纯化。得到基因和pETDuet-PeF3H-f分别用BamH I和Hind III进行双酶切，并分别割胶回收，浓缩后16℃连接过夜，将连接产物转化大肠杆菌JM109感受态细胞，筛选阳性克隆，进行序列分析；挑选序列正确的克隆提取质粒，获得重组质粒pETDuet-PeF3H-f-CuFLS。
以重组质粒pETDuet-PeF3H-f-CuFLS为模板，以UP：TGCCAGAATTTCTTCGATAGGTTTG和F66：
Figure BDA0001501652760000061
ATGGAGGTTGAACGTGTTCAGGCGA为引物，斜体加粗表示连接肽。通过反向PCR扩增。PCR扩增的条件是95℃，5min；暂停计时，加Pyrobest聚合酶，加40μL石蜡油密封；35次循环(94℃，50s；51℃，90s；72℃，6min)；72℃，10min；反应停止，4℃保温。通过凝胶回收试剂盒对PCR扩增产物进行纯化。将获得的片段直接16℃连接过夜，将连接产物转化大肠杆菌JM109感受态细胞，筛选阳性克隆，进行序列分析；挑选序列正确的克隆提取质粒，获得重组质粒pETDuet-f66。
以重组质粒pETDuet-PeF3H-f-CuFLS为模板，以UP：TGCCAGAATTTCTTCGATAGGTTTG和F67：
Figure BDA0001501652760000062
ATGGAGGTTGAACGTGTTCAGGCGA为引物，斜体加粗表示连接肽。通过反向PCR扩增。PCR扩增的条件是95℃，5min；暂停计时，加Pyrobest聚合酶，加40μL石蜡油密封；35次循环(94℃，50s；51℃，90s；72℃，6min)；72℃，10min；反应停止，4℃保温。通过凝胶回收试剂盒对PCR扩增产物进行纯化。将获得的片段直接16℃连接过夜，将连接产物转化大肠杆菌JM109感受态细胞，筛选阳性克隆，进行序列分析；挑选序列正确的克隆提取质粒，获得重组质粒pETDuet-f67。
以重组质粒pETDuet-PeF3H-f-CuFLS为模板，以UP：TGCCAGAATTTCTTCGATAGGTTTG和F68：
Figure BDA0001501652760000074
ATGGAGGTTGAACGTGTTCAGGCGA为引物，斜体加粗表示连接肽。通过反向PCR扩增。PCR扩增的条件是95℃，5min；暂停计时，加Pyrobest聚合酶，加40μL石蜡油密封；35次循环(94℃，50s；51℃，90s；72℃，6min)；72℃，10min；反应停止，4℃保温。通过凝胶回收试剂盒对PCR扩增产物进行纯化。将获得的片段直接16℃连接过夜，将连接产物转化大肠杆菌JM109感受态细胞，筛选阳性克隆，进行序列分析；挑选序列正确的克隆提取质粒，获得重组质粒pETDuet-f68。
以重组质粒pETDuet-PeF3H-f-CuFLS为模板，以UP：TGCCAGAATTTCTTCGATAGGTTTG和F69：
Figure BDA0001501652760000073
ATGGAGGTTGAACGTGTTCAGGCGA为引物，斜体加粗表示连接肽。通过反向PCR扩增。PCR扩增的条件是95℃，5min；暂停计时，加Pyrobest聚合酶，加40μL石蜡油密封；35次循环(94℃，50s；51℃，90s；72℃，6min)；72℃，10min；反应停止，4℃保温。通过凝胶回收试剂盒对PCR扩增产物进行纯化。将获得的片段直接16℃连接过夜，将连接产物转化大肠杆菌JM109感受态细胞，筛选阳性克隆，进行序列分析；挑选序列正确的克隆提取质粒，获得重组质粒pETDuet-f69。
以重组质粒pETDuet-PeF3H-f-CuFLS为模板，以UP：TGCCAGAATTTCTTCGATAGGTTTG和F70：
Figure BDA0001501652760000072
ATGGAGGTTGAACGTGTTCAGGCGA为引物，斜体加粗表示连接肽。通过反向PCR扩增。PCR扩增的条件是95℃，5min；暂停计时，加Pyrobest聚合酶，加40μL石蜡油密封；35次循环(94℃，50s；51℃，90s；72℃，6min)；72℃，10min；反应停止，4℃保温。通过凝胶回收试剂盒对PCR扩增产物进行纯化。将获得的片段直接16℃连接过夜，将连接产物转化大肠杆菌JM109感受态细胞，筛选阳性克隆，进行序列分析；挑选序列正确的克隆提取质粒，获得重组质粒pETDuet-f70。
以重组质粒pETDuet-PeF3H-f-CuFLS为模板，以UP：TGCCAGAATTTCTTCGATAGGTTTG和F71：
Figure BDA0001501652760000071
ATGGAGGTTGAACGTGTTCAGGCGA为引物，斜体加粗表示连接肽。通过反向PCR扩增。PCR扩增的条件是95℃，5min；暂停计时，加Pyrobest聚合酶，加40μL石蜡油密封；35次循环(94℃，50s；51℃，90s；72℃，6min)；72℃，10min；反应停止，4℃保温。通过凝胶回收试剂盒对PCR扩增产物进行纯化。将获得的片段直接16℃连接过夜，将连接产物转化大肠杆菌JM109感受态细胞，筛选阳性克隆，进行序列分析；挑选序列正确的克隆提取质粒，获得重组质粒pETDuet-f71。
2.1融合酶转化效果的评价
将重组质粒pETDuet-f66，pETDuet-f67，pETDuet-f68，pETDuet-f69，pETDuet-f70和pETDuet-f71转化大肠杆菌BL21(DE3)，共获得6个重组子，分别命名为：BL21-F66，BL21-F67，BL21-F68，BL21-F69，BL21-F70和BL21-F71。
分别将上述重组菌(BL21-F66，BL21-F67，BL21-F68，BL21-F69，BL21-F70和BL21-F71)在含有氨苄青霉素(50μg/mL)的LB平板(LB培养基：胰蛋白胨10g/L，酵母提取物5g/L，NaCl 5g/L，琼脂15g/L)上经过37℃培养过夜，挑转化子到10mL的LB培养基中(50μg/mL氨苄青霉素)37℃，200rpm振荡培养至OD600为0.6时，加入终浓度为0.2mM异丙基β-D-硫代吡喃半乳糖苷(IPTG)诱导剂，400mg/L的柚皮素，30℃转化24h。柚皮素、二氢山萘酚及山萘酚的测定采用HPLC方法测定，HPLC测定的条件为：Agilent 1260Infinity；DAD检测器检测波长为280及368nm，柱温为40℃，流动相流速为0.8mL/min(A:甲醇，B:1％甲酸水＝55：45，15min)。结果表明含有重组菌BL21-F69的转化能力最强，山萘酚的产量131.9±9.3mg/L。(图1)。
3.重组菌BL21-F69转化条件的优化
3.1溶氧对重组菌BL21-F69转化柚皮素制备山萘酚的影响
将重组菌BL21-F69在含有氨苄青霉素(50μg/mL)的LB平板(LB培养基：胰蛋白胨10g/L，酵母提取物5g/L，NaCl 5g/L，琼脂15g/L)上经过37℃培养过夜，挑转化子到5mL的LB培养基试管中(50μg/mL氨苄青霉素)，并分别用硅胶塞(低氧)和8层纱布(高氧)隔绝培养，37℃，200rpm振荡培养至OD600为0.6时，加入终浓度为0.2mM异丙基β-D-硫代吡喃半乳糖苷(IPTG)诱导剂，400mg/L的柚皮素，30℃转化24h。结果发现重组菌BL21-F69用8层纱布(高氧)培养的山萘酚产量为170.7mg/L，远高于用硅胶塞(低氧)培养的130.6mg/L(表2)。由此可见，氧供应对重组菌BL21-F69转化柚皮素制备山萘酚至关重要。
表2溶氧对重组菌BL21-F69转化柚皮素制备山萘酚的影响
Figure BDA0001501652760000081
3.1诱导温度、诱导菌浓及IPTG浓度对重组菌BL21-F69转化柚皮素制备山萘酚的影响
将重组菌BL21-F69在含有氨苄青霉素(50μg/mL)的LB平板(LB培养基：胰蛋白胨10g/L，酵母提取物5g/L，NaCl 5g/L，琼脂15g/L)上经过37℃培养过夜，挑转化子到5mL的LB培养基试管中(50μg/mL氨苄青霉素)，并用8层纱布(高氧)隔绝培养，37℃，200rpm振荡培养至OD600为0.6时，加入终浓度为0.2mM异丙基β-D-硫代吡喃半乳糖苷(IPTG)诱导剂，400mg/L的柚皮素，并分别16，20，25，30或37℃转化24h。结果发现重组菌BL21-F69在30℃转化条件下山萘酚的产量最高(图2a)。
将重组菌BL21-F69在含有氨苄青霉素(50μg/mL)的LB平板(LB培养基：胰蛋白胨10g/L，酵母提取物5g/L，NaCl 5g/L，琼脂15g/L)上经过37℃培养过夜，挑转化子到5mL的LB培养基试管中(50μg/mL氨苄青霉素)，并用8层纱布(高氧)隔绝培养，37℃，200rpm振荡培养至OD600为0.8时，加入终浓度分别为0.02，0.05，0.1，0.2或0.4mM异丙基β-D-硫代吡喃半乳糖苷(IPTG)诱导剂，400mg/L的柚皮素，30℃转化24h。结果发现重组菌BL21-F69在IPTG浓度为0.1mM转化条件下，山萘酚的产量最高(图2b)。
将重组菌BL21-F69在含有氨苄青霉素(50μg/mL)的LB平板(LB培养基：胰蛋白胨10g/L，酵母提取物5g/L，NaCl 5g/L，琼脂15g/L)上经过37℃培养过夜，挑转化子到5mL的LB培养基试管中(50μg/mL氨苄青霉素)，并用8层纱布(高氧)隔绝培养，37℃，200rpm振荡培养至OD600为0.5，0.8，1.2，1.6，2.0时，加入终浓度为0.1mM异丙基β-D-硫代吡喃半乳糖苷(IPTG)诱导剂，400mg/L的柚皮素，30℃转化24h。结果发现重组菌BL21-F69在OD600为0.8时开始转化，此时山萘酚的产量最高(图2c)。
3.3添加不同碳源对重组菌BL21-F69转化柚皮素制备山萘酚的影响
将重组菌BL21-F69在含有氨苄青霉素(50μg/mL)的LB平板(LB培养基：胰蛋白胨10g/L，酵母提取物5g/L，NaCl 5g/L，琼脂15g/L)上经过37℃培养过夜，挑转化子到5mL的LB培养基试管中(50μg/mL氨苄青霉素)，并用8层纱布(高氧)隔绝培养，37℃，200rpm振荡培养至OD600为0.8时，加入终浓度为0.1mM异丙基β-D-硫代吡喃半乳糖苷(IPTG)诱导剂，400mg/L的柚皮素，不同种类及浓度的碳源(0.5％葡萄糖，2％葡萄糖，0.5％果糖，2％果糖，0.5％甘油，2％甘油)30℃转化24h。结果发现添加0.5％甘油，重组菌BL21-F69转化柚皮素生成山萘酚的产量最高，达到196.5mg/L(图3)。
3.4底物浓度对重组菌BL21-F69转化柚皮素制备山萘酚的影响
将重组菌BL21-F69在含有氨苄青霉素(50μg/mL)的LB平板(LB培养基：胰蛋白胨10g/L，酵母提取物5g/L，NaCl 5g/L，琼脂15g/L)上经过37℃培养过夜，挑转化子到5mL的LB培养基试管中(50μg/mL氨苄青霉素)，并用8层纱布(高氧)隔绝培养，37℃，200rpm振荡培养至OD600为0.8时，加入终浓度为0.1mM异丙基β-D-硫代吡喃半乳糖苷(IPTG)诱导剂，0.5％甘油，并分别加入100，400，800，1600mg/L的柚皮素，30℃转化24h。结果发现底物浓度为800mg/L，重组菌BL21-F69转化柚皮素生成山萘酚的产量最高，达到246.4mg/L(图4)。
4.高密度培养重组菌BL21-F69转化柚皮素制备山萘酚
种子培养基为LB培养基：胰蛋白胨10g/L，酵母粉5g/L，氯化钠10g/L。
发酵培养基：4.2g/L NaH2PO4·2H2O，8.7g/L K2HPO4·3H2O，50.0g/L酵母粉，30g/L葡萄糖，5.5g/L(NH4)2SO4，2.5g/L MgSO4·7H2O，1.1g/L EDTA，1mL/L生物素，0.3g/L消泡剂。
流加培养基：12.6g/L NaH2PO4·2H2O，26.0g/L K2HPO4·3H2O，200g/L酵母粉，16.5g/L(NH4)2SO4，20g/L MgSO4·7H2O，3.3g/L EDTA，3mL/L生物素，0.3g/L foam，800g/L葡萄糖。
发酵条件：发酵pH控制7.0，前期温度控制在37℃，诱导转化温度控制在30℃，在发酵过程中，培养基中葡萄糖的浓度控制在小于5g/L，溶氧控制在大于15％。
将重组菌BL21-F69在含有氨苄青霉素(50μg/mL)的LB平板上经过37℃培养过夜，挑转化子到150mL的LB培养基中(50μg/mL氨苄青霉素)，37℃，200rpm振荡培养20h。将种子液接入3L发酵培养基中，37℃，并控制流加速度，使菌体浓度达到OD600 50–55左右。随后添加终浓度为0.1mM的IPTG，并每隔1h添加终浓度为400mg/L的柚皮素，30℃转化培养9h，在转化过程主要通过控制培养基葡萄糖浓度小于5g/L，来控制乙酸的积累对重组菌的毒害。最终重组菌转化柚皮素生成山萘酚的产量达到1010.2mg/L(图5)。
序列表
<110> 南京林业大学
<120> 一种催化柚皮素生成山萘酚的融合酶及其应用
<140> 2017113046149
<141> 2017-12-11
<160> 24
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 1089
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
atggctccta gtacactgac ggccttagcc ggcgaaaaaa ccctgaatcc gagctttgtt 60
cgttttcagg atgaacgtcc taaagttgcg tataatgagt tcagcaacga gattccagtt 120
attagcttag cgggcatcga tgatgtgggc ggtaaacgcg ccgaaatctg caagaagatt 180
gtggaagcct gtgaagattg gggtatcttt caggttgtgg atcatggtgt tgatgccaaa 240
ctgatctcag atatgacacg tctggctacg gaatttttcg ctctgcctcc ggaagaaaaa 300
ctgaaatttg atatgagcgg cggcaaaaaa ggcggcttta ttgtgtcaag tcacctacag 360
ggtgaagttg ttaaagattg gcgcgaaatc gtgacatatt tttcttttcc taaacagtca 420
cgcgattatt ctcgctggcc agataaaccg gaaggttgga tggaagtgac caaagaatat 480
agtgataaac tgatgggtgt tgcatgtaaa ctgctggaag ttctgtcaga agctatgggc 540
ttagaaaaag aagccctgac caaggcctgc gttgatatgg atcagaaaat cgtggttaat 600
tattatccta aatgtccaca gccggacctg acactgggcc tgaaacgcca taccgatccg 660
ggaactatta cgctgctgtt acaggatcag gttggcggtt tgcaagctac caaagataat 720
ggcaaaacgt ggattacggt gcagccgatc gaaggtgcgt ttgtggttaa tctgggggat 780
catggtcatt atctgtctaa tggtcgcttt aaaaatgccg atcatcaggc agtggttaat 840
agcaatagta gtcgcctgtc tattgccacc tttcagaatc cagcaccgga agcgaccgtg 900
tatccgctga aaattcgcga aggcgaaaaa ccagtgctgg aagaacctat cccgtttagc 960
gaaatgtatc gtcgcaaaat gagtaaagac ctcgaactgg cccgcctgaa aaaactggcc 1020
aatgagaaaa agcagtatag tgaaaaagct aaattagatg ccaaacctat cgaagaaatt 1080
ctggcataa 1089
<210> 2
<211> 1092
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
atggcaccga gtaccctgac ggccttagca gagaagaaaa cattacaggc aagttttgtg 60
cgcgatgaag atgaacgtcc taaagttgca tataatcagt tttctaacga gattccagtt 120
atctctattg cgggcatcga tgatggcggt gaaaaacgcg ccgaaatctg caacaaaatc 180
gttgaggcct gcgaagaatg gggcgtgttt cagattgttg atcatggcgt tgatgccaaa 240
ttagtgagcg agatgaaaac actggccaaa gaatttttcg ccctgcctcc ggaagataaa 300
ttacgctttg atatgagcgg cggcaaaaaa ggcggcttta ttgtgtcaag tcatctacag 360
ggtgaagccg ttcaggattg gcgcgaaatc gtgacgttct ttagctatcc tattcgtacc 420
cgcgattata gtcgttggcc agataaaccg gaagcgtgga aagcagtgac ggaagaatat 480
tcaaagaaac tgatggaatt agcctgtaaa ctgctgggtg tgctgagcga agctatgggc 540
ttagaaacgg aagcgctgac caaagcgtgc gttgatatgg atcagaaagt ggttgttaat 600
ttttatccta aatgtccgca gccggatctg accttaggtc tgaaacgtca taccgatccg 660
ggaactatca cgctgttact acaagatacg gtgggcggtt tacaggctac gagagataat 720
ggcaaaacgt ggattacggt tcagcctgtg gaaggtgcat ttgtggttaa tctcggcgat 780
catggtcatt acttgagtaa tggtcgcttt cgcaatgccg atcatcaggc cgtggttaat 840
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attctggcat aa 1092
<210> 3
<211> 1074
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
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cgcggtcgcg ttcgcgaaga agttcgtgcc gcttgtgaag aatggggcat ctttcaggtg 240
ttacatcatg gtgttccgag cgacctcgtt catcgcatgt cacagctgtc tcgtagcttc 300
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tttgttgtga gtagtcatct ccagggcgaa agcgtgttag attggcgcga aatctttact 420
tattttagct atccgctgcg ctctcgtgat tatagtcgtt ggcctcagaa tcctgatggt 480
tggcgcgaag tggttgaaga atatagtcag gaactgatga aactggcttg caaactgtta 540
gaaattatta gcgaatctct gggcttagaa ccacaggcag tgaccaaagc atgtttagat 600
atggatcaga aagttgtgat caatttttat cctaaatgtc cacagccgga tatgacctta 660
ggtctgaaac gtcataccga tccggggaca atcaccttac tgttacagga tcaggtgggt 720
ggtctgcaag ctaccaaaga tggcctgaat tggattaccg tggaaccagt tgaaggcgcc 780
tttgtggtta atctgggaga ccacatgcat tatctaagca atggtaaata taagaatgcg 840
gatcatcagg ccgtggttaa tgctgatacc tcacgcctgt ctatcgctac gtttcagaat 900
ccagcccagg aagccattgt gtatccgctg gaaggtgtgg ttaaagcgga agataaatgc 960
gttatggaag aacctattac gtttgctcag atgtattcac ataagatgaa tcgcgatctg 1020
gaattagcac gccagaaaaa actggccaaa ttgcagcagg atgaaagtaa ataa 1074
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<212> DNA
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gcggaagcgt ctcgtgaatg gggtatcttc caggtgacca accacggtat cccgtctgac 240
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agctctatta actaccgctt ctggccgaag aacccgccgt cctatcgtgc ggttaacgaa 480
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ctgaaaatca actactatcc gccgtgcccg cgtccggatc tggcgctggg cgttgtggcg 660
cacaccgacc tgtctgcgct gaccgtgctg gttccgaacg aagttccggg tctgcaggtt 720
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ggcgaccaga tcgaaattct gagcaacggt aagtacaagg cagtgctgca tcgtaccacc 840
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ctggaaccgc cggcagatac tgttgttggt ccgctgccgc agctggttga cgatgaaaac 2040
ccgccgaaat acaaagcgaa aaagttcaag gactactctt actgcaaact gaacaaactg 2100
ccgcagtaa 2109
<210> 8
<211> 2124
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
atggctccta gtacactgac ggccttagcc ggcgaaaaaa ccctgaatcc gagctttgtt 60
cgttttcagg atgaacgtcc taaagttgcg tataatgagt tcagcaacga gattccagtt 120
attagcttag cgggcatcga tgatgtgggc ggtaaacgcg ccgaaatctg caagaagatt 180
gtggaagcct gtgaagattg gggtatcttt caggttgtgg atcatggtgt tgatgccaaa 240
ctgatctcag atatgacacg tctggctacg gaatttttcg ctctgcctcc ggaagaaaaa 300
ctgaaatttg atatgagcgg cggcaaaaaa ggcggcttta ttgtgtcaag tcacctacag 360
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<210> 9
<211> 2106
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 9
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<210> 10
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<212> DNA
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aacaaactgc cgcagtaa 2118
<210> 11
<211> 2109
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 11
atggctccta gtacactgac ggccttagcc ggcgaaaaaa ccctgaatcc gagctttgtt 60
cgttttcagg atgaacgtcc taaagttgcg tataatgagt tcagcaacga gattccagtt 120
attagcttag cgggcatcga tgatgtgggc ggtaaacgcg ccgaaatctg caagaagatt 180
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ccgcagtaa 2109
<210> 12
<211> 2124
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 12
atggctccta gtacactgac ggccttagcc ggcgaaaaaa ccctgaatcc gagctttgtt 60
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ccgaagaacc cgccgtccta tcgtgcggtt aacgaagaat acgcgaagta tatgcgtgaa 1620
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aaagaggctg ctggcggcga cgacatcgaa tacatgctga aaatcaacta ctatccgccg 1740
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aaactgaaca aactgccgca gtaa 2124
<210> 13
<211> 705
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 13
Met Ala Pro Ser Thr Leu Thr Ala Leu Ala Gly Glu Lys Thr Leu Asn
1 5 10 15
Pro Ser Phe Val Arg Phe Gln Asp Glu Arg Pro Lys Val Ala Tyr Asn
20 25 30
Glu Phe Ser Asn Glu Ile Pro Val Ile Ser Leu Ala Gly Ile Asp Asp
35 40 45
Val Gly Gly Lys Arg Ala Glu Ile Cys Lys Lys Ile Val Glu Ala Cys
50 55 60
Glu Asp Trp Gly Ile Phe Gln Val Val Asp His Gly Val Asp Ala Lys
65 70 75 80
Leu Ile Ser Asp Met Thr Arg Leu Ala Thr Glu Phe Phe Ala Leu Pro
85 90 95
Pro Glu Glu Lys Leu Lys Phe Asp Met Ser Gly Gly Lys Lys Gly Gly
100 105 110
Phe Ile Val Ser Ser His Leu Gln Gly Glu Val Val Lys Asp Trp Arg
115 120 125
Glu Ile Val Thr Tyr Phe Ser Phe Pro Lys Gln Ser Arg Asp Tyr Ser
130 135 140
Arg Trp Pro Asp Lys Pro Glu Gly Trp Met Glu Val Thr Lys Glu Tyr
145 150 155 160
Ser Asp Lys Leu Met Gly Val Ala Cys Lys Leu Leu Glu Val Leu Ser
165 170 175
Glu Ala Met Gly Leu Glu Lys Glu Ala Leu Thr Lys Ala Cys Val Asp
180 185 190
Met Asp Gln Lys Ile Val Val Asn Tyr Tyr Pro Lys Cys Pro Gln Pro
195 200 205
Asp Leu Thr Leu Gly Leu Lys Arg His Thr Asp Pro Gly Thr Ile Thr
210 215 220
Leu Leu Leu Gln Asp Gln Val Gly Gly Leu Gln Ala Thr Lys Asp Asn
225 230 235 240
Gly Lys Thr Trp Ile Thr Val Gln Pro Ile Glu Gly Ala Phe Val Val
245 250 255
Asn Leu Gly Asp His Gly His Tyr Leu Ser Asn Gly Arg Phe Lys Asn
260 265 270
Ala Asp His Gln Ala Val Val Asn Ser Asn Ser Ser Arg Leu Ser Ile
275 280 285
Ala Thr Phe Gln Asn Pro Ala Pro Glu Ala Thr Val Tyr Pro Leu Lys
290 295 300
Ile Arg Glu Gly Glu Lys Pro Val Leu Glu Glu Pro Ile Pro Phe Ser
305 310 315 320
Glu Met Tyr Arg Arg Lys Met Ser Lys Asp Leu Glu Leu Ala Arg Leu
325 330 335
Lys Lys Leu Ala Asn Glu Lys Lys Gln Tyr Ser Glu Lys Ala Lys Leu
340 345 350
Asp Ala Lys Pro Ile Glu Glu Ile Leu Ala Thr Pro Thr Pro Thr Pro
355 360 365
Thr Pro Met Glu Val Glu Arg Val Gln Ala Ile Ala Ser Leu Ser His
370 375 380
Ser Asn Gly Thr Ile Pro Ala Glu Phe Ile Arg Pro Glu Lys Glu Gln
385 390 395 400
Pro Ala Ser Thr Thr Tyr His Gly Pro Ala Pro Glu Ile Pro Thr Ile
405 410 415
Asp Leu Asp Asp Pro Val Gln Asp Arg Leu Val Arg Ser Ile Ala Glu
420 425 430
Ala Ser Arg Glu Trp Gly Ile Phe Gln Val Thr Asn His Gly Ile Pro
435 440 445
Ser Asp Leu Ile Cys Lys Leu Gln Ala Val Gly Lys Glu Phe Phe Glu
450 455 460
Leu Pro Gln Glu Glu Lys Glu Val Tyr Ser Arg Pro Ala Asp Ala Lys
465 470 475 480
Asp Val Gln Gly Tyr Gly Thr Lys Leu Gln Lys Glu Val Glu Gly Lys
485 490 495
Lys Ser Trp Val Asp His Leu Phe His Arg Val Trp Pro Pro Ser Ser
500 505 510
Ile Asn Tyr Arg Phe Trp Pro Lys Asn Pro Pro Ser Tyr Arg Ala Val
515 520 525
Asn Glu Glu Tyr Ala Lys Tyr Met Arg Glu Val Val Asp Lys Leu Phe
530 535 540
Thr Tyr Leu Ser Leu Gly Leu Gly Val Glu Gly Gly Val Leu Lys Glu
545 550 555 560
Ala Ala Gly Gly Asp Asp Ile Glu Tyr Met Leu Lys Ile Asn Tyr Tyr
565 570 575
Pro Pro Cys Pro Arg Pro Asp Leu Ala Leu Gly Val Val Ala His Thr
580 585 590
Asp Leu Ser Ala Leu Thr Val Leu Val Pro Asn Glu Val Pro Gly Leu
595 600 605
Gln Val Phe Lys Asp Asp Arg Trp Ile Asp Ala Lys Tyr Ile Pro Asn
610 615 620
Ala Leu Val Ile His Ile Gly Asp Gln Ile Glu Ile Leu Ser Asn Gly
625 630 635 640
Lys Tyr Lys Ala Val Leu His Arg Thr Thr Val Asn Lys Asp Lys Thr
645 650 655
Arg Met Ser Trp Pro Val Phe Leu Glu Pro Pro Ala Asp Thr Val Val
660 665 670
Gly Pro Leu Pro Gln Leu Val Asp Asp Glu Asn Pro Pro Lys Tyr Lys
675 680 685
Ala Lys Lys Phe Lys Asp Tyr Ser Tyr Cys Lys Leu Asn Lys Leu Pro
690 695 700
Gln
705
<210> 14
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 14
cccccatggc tcctagtaca ctgac 25
<210> 15
<211> 29
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 15
cccggatcct gccagaattt cttcgatag 29
<210> 16
<211> 29
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 16
cccggatcca tggaggttga acgtgttca 29
<210> 17
<211> 32
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 17
cccaagcttt tactgcggca gtttgttcag tt 32
<210> 18
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 18
tgccagaatt tcttcgatag gtttg 25
<210> 19
<211> 40
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 19
ggcggtggcg gtagcatgga ggttgaacgt gttcaggcga 40
<210> 20
<211> 55
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 20
ggcggtggcg gtagcggcgg tggcggtagc atggaggttg aacgtgttca ggcga 55
<210> 21
<211> 37
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 21
acaccgacac cgatggaggt tgaacgtgtt caggcga 37
<210> 22
<211> 49
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 22
acaccgacac cgacaccgac accgatggag gttgaacgtg ttcaggcga 49
<210> 23
<211> 40
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 23
gaagccgctg ccaagatgga ggttgaacgt gttcaggcga 40
<210> 24
<211> 55
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 24
gaagccgctg ccaaggaagc cgctgccaag atggaggttg aacgtgttca ggcga 55

Claims (7)

1.一种催化柚皮素生成山萘酚的融合酶，其特征在于氨基酸序列如SEQ ID NO:13所示。
2.编码权利要求1所述融合酶的基因，其特征在于核酸序列如SEQ ID NO:10所示。
3.含有权利要求2所述核苷酸序列的重组质粒。
4.含有权利要求3所述重组质粒的大肠杆菌。
5.权利要求1所述融合酶在催化柚皮素生成山萘酚中的应用。
6.权利要求4所述大肠杆菌在催化柚皮素生成山萘酚中的应用。
7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于步骤为将大肠杆菌在50 μg/mL氨苄青霉素的LB平板上经过37℃培养过夜，挑转化子到150 mL的LB培养基中，所述LB培养基内含有50μg/mL 氨苄青霉素，37℃，200 rpm振荡培养20 h，将种子液接入3 L发酵培养基中，37℃，并控制流加速度，使菌体浓度达到OD600 50–55，随后添加终浓度为0.1 mM IPTG，并每隔1 h添加终浓度为400 mg/L的柚皮素，30℃转化培养9 h，在转化过程中培养基葡萄糖浓度小于5g/L。
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