CN114480241B - 一种生产7-o甲基圣草酚的重组大肠杆菌及应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种生产7‑O甲基圣草酚的重组大肠杆菌及应用，属于基因工程和生物工程技术领域。本发明在大肠杆菌中异源表达来源于Perillafrutescens的甲氧基转移酶基因，实现了7‑O甲基圣草酚的合成。并通过内源强化甲硫氨酸合成途径、动态调控ATP、强化5’‑磷酸吡哆醛的合成进而整体调控转硫路径、分批添加底物等多种方式，提高了7‑O甲基圣草酚的积累量，最佳工程菌株7‑O甲基圣草酚产量达到306mg/L，为工业化生产7‑O甲基圣草酚提供了一种新的方法。

Description

一种生产7-O甲基圣草酚的重组大肠杆菌及应用

技术领域

本发明涉及一种生产7-O甲基圣草酚的重组大肠杆菌及应用，属于基因工程及生物工程技术领域。

背景技术

甲基化是黄酮类化合物基本结构形成后常见的修饰反应，甲基化后的黄酮类化合物水溶性和脂溶性较原黄酮类化合物都有所增加，从而进一步增加了黄酮类化合物的应用价值。7-O甲基圣草酚是从北美圣草中提取出的一种活性物质，除了具有常见的黄酮类化合物的抗炎、抗细菌等功效之外，据美国索尔克生物研究所于2019年2月20日发布的研究成果显示，7-O甲基圣草酚也能够治疗阿尔茨海默症；研究人员通过测试对小鼠神经细胞能量消耗，以及其他与年龄相关的神经毒性的影响等，证明了7-O甲基圣草酚可以防止神经衰弱且能缓解记忆衰退；另外，7-O甲基圣草酚能够保护角质免受辐射和年龄的影响，从而在防止头发变灰方面具有一定的功效，且可以帮助黑发再生。

传统化学合成法对反应条件要求高，会产生很多不需要的副产物，产物收率低。因此，可以考虑应用基于代谢工程、基因工程的生物合成法获取甲基化黄酮类化合物。目前还没有研究报道了7-O甲基圣草酚的生物合成，理论上其可以由7-FOMT催化圣草酚7-OH进行甲基化反应合成。目前已有研究者证明了多个7-OH甲氧基转移酶可以催化黄酮类化合物7-OH甲基化反应，比如来源于紫苏叶的甲氧基转移酶pFOMT3，来源于链霉菌的SaOMT2等。然而，甲基化反应过程中需要甲基供体S-腺苷甲硫氨酸(SAM)的参与，由于大肠杆菌自身SAM的供应不足，可能会限制7-O甲基圣草酚的合成。因此如何利用生物法合成7-O甲基圣草酚并获得较高的产量是目前亟需解决的问题。

发明内容

为实现7-O甲基圣草酚的生产，本发明通过在大肠杆菌中表达了来源于紫苏叶的7-OH甲氧基转移酶基因pFOMT3，实现了7-O甲基圣草酚的合成。接着，通过强化内源甲硫氨酸的供应途径基因MetA、CysE的表达，进而增加了S-腺苷甲硫氨酸的供应。然后引入了来源于枯草芽孢杆菌的ydaO来动态调控胞内ATP的含量，以及异源表达来自酿酒酵母的5’-磷酸吡哆醛合成酶SNZ3和能够调控胞内腺苷、吡哆醛、吡哆胺含量的RPS18B、RFC4，其中吡哆醛、吡哆胺可以进一步转化为5’-磷酸吡哆醛，进而能够整体调控转硫路径和胞内能量代谢。最后分批添加圣草酚至合理浓度获得了高效合成7-O甲基圣草酚的菌株。

本发明提供了一株合成7-O甲基圣草酚的重组大肠杆菌，所述重组大肠杆菌是以大肠杆菌BL21(DE3)为出发菌株，在大肠杆菌中表达来源于Perilla frutescens的甲氧基转移酶基因pFOMT3。

在一种实施方式中，所述重组大肠杆菌中过表达大肠杆菌内源基因MetA和cysE，从而强化内源甲硫氨酸的生物合成途径；所述基因MetA和cysE分别为高丝氨酸琥珀酰转移酶和L-丝氨酸-O乙酰转移酶的编码基因。

在一种实施方式中，表达来源于枯草芽孢杆菌的ATP核糖体感应开关ydaO基因，实现细胞内ATP的动态调控。

在一种实施方式中，在大肠杆菌中异源表达来源于酿酒酵母的SNZ3、RPS18B、RFC4基因来调控胞内5’-磷酸吡哆醛的含量来调控转硫路径及胞内的能量代谢；所述SNZ3、 RFC4、RPS18B基因分别为编码5’-磷酸吡哆醛合成酶的基因、编码DNA结合蛋白的基因、编码核糖体亚单位的基因。

在一种实施方式中，所述基因pFOMT3、OsNOMT、SaOMT2的核苷酸序列如SEQ IDNO.1、SEQ ID NO.2和SEQ ID NO.3所示。

在一种实施方式中，所述MetA基因序列如SEQ ID NO.4所示。

在一种实施方式中，所述CysE基因核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示。

在一种实施方式中，所述ydaO基因序列如SEQ ID NO.6所示。

在一种实施方式中，所述5’-磷酸吡哆醛合成酶基因SNZ3序列如SEQ ID NO.7所示。

在一种实施方式中，所述调节转硫路径相关基因RPS18B、RFC4核苷酸序列如SEQID NO.8和SEQ ID NO.9所示。

本发明提供了生产7-O甲基圣草酚的方法，所述方法是利用所述的重组大肠杆菌发酵生产7-O甲基圣草酚。

在一种实施方式中，将所述重组大肠杆菌接种至发酵体系中在30~37℃下培养至OD₆₀₀为0.8±0.1，加入终浓度为0.1~0.2mM的IPTG，在20~25℃，180~220 r/min下诱导8~10h，再加入终浓度为200~250 mg/L的圣草酚，再反应8~10 h。

在一种实施方式中，将所述重组大肠杆菌接种至发酵体系中在30~37℃下培养至OD₆₀₀为0.8±0.1，加入终浓度为0.1~0.2mM的IPTG，在20~25℃，180~220 r/min下诱导2~3h，再加入200~250 mg/L的圣草酚，反应8~10 h后再加入等量的圣草酚，再次反应8~10 h。

在一种实施方式中，将上述重组大肠杆菌在发酵体系中在30~37℃下培养至OD₆₀₀为0.8±0.1，加入终浓度为0.1~0.2 mM的IPTG，在20~25℃、180~220 r/min下诱导8~10 h，再加入200~250 mg/L的圣草酚并同时添加终浓度为0~135μM的5’-磷酸吡哆醛，反应8~10h。

优选地，添加终浓度为45~135μM的5’-磷酸吡哆醛；更优选地，添加终浓度为90~135μM的5’-磷酸吡哆醛。

在一种实施方式中，所述发酵体系中含有3~5 g/L甘油，10~12 g/L蛋白胨，20~24g/L酵母提取物，2~2.5 g/L KH₂PO₄，15~20 g/L K₂HPO₄。

本发明提供了所述重组大肠杆菌在生产7-O甲基圣草酚及其衍生物中的应用。

本发明的有益效果：

本发明以大肠杆菌BL21(DE3)为宿主，异源表达甲氧基转移酶pFOMT3的重组大肠杆菌，实现了7-O甲基圣草酚的合成。并通过强化内源甲硫氨酸的合成途径，异源表达来自枯草芽孢杆菌的ATP感应核糖体开关ydaO来动态调控胞内ATP的供应，强化大肠杆菌内5’-磷酸吡哆醛的合成，进一步提高了7-O甲基圣草酚的积累量，使得摇瓶发酵条件下7-O甲基圣草酚的积累量可达到300 mg/L以上。本发明将植物异源代谢途径转入大肠杆菌内，为高效生产其它甲基化黄酮类化合物生物合成提供了新的思路。

附图说明

图1为大肠杆菌中异源合成7-O甲基圣草酚的代谢示意图。

图2为大肠杆菌在TB培养下的7-O甲基圣草酚质谱图。

图3为大肠杆菌在TB培养下的添加不同浓度5’-磷酸吡哆醛时7-O甲基圣草酚产量图。

图4为大肠杆菌在TB培养下一次性添加不同浓度圣草酚时7-O甲基圣草酚产量图。

图5为大肠杆菌在TB培养下不同改造的情况下分批添加圣草酚至终浓度为500mg/L 时7-O甲基圣草酚产量图。

具体实施方式

（一）培养基

种子培养基(LB)：蛋白胨10 g/L，酵母提取物5 g/L，氯化钠5 g/L；固体培养基添加2%(质量分数)的琼脂粉。

摇瓶发酵培养基(TB)：甘油5 g/L，蛋白胨12 g/L，酵母提取物 24 g/L，KH₂PO₄2.31g/L，K₂HPO₄16.37 g/L。

（二）PCR 反应体系和扩增条件：正向引物 (10μM)1 μL，反向引物 (10μM) 1 μL，模板DNA 20 ng，2×Phanta Max Master Mix 25 μL，双蒸水加至50 μL。扩增条件：95℃预变形3 min；随后30个循环(95℃ 15s，55℃ 15s，72℃ 15s)，72℃继续延伸10 min。

（三）大肠杆菌感受态的制备：从BL21(DE3)甘油管划线于相应的LB平板上，37℃过夜培养(12 h左右)。12 h后挑取扁平、圆润、长势大的菌接种于含5 mL LB培养基的50 mL摇瓶中，以37℃ 220 rpm下培养约8 h-10 h；以1％接种量转接至含50 mL LB的250 mL锥形瓶中；37℃，220 rpm培养约2 h至OD₆₀₀=0.6～0.8；将菌液转移至50 mL离心管管中，冰上放置约10-15 min；4000 rpm，4℃离心5 min去上清；加入5 mL solution A重悬；4000 rpm，4℃离心5 min去上清；加入5 mL solution B重悬菌体，以100 μL/份分装，于-80℃保存。

（四）大肠杆菌的转化：于冰上解冻大肠杆菌感受态细胞；取1-10 μL重组产物(质粒10-20 ng) 加入到100 μL感受态细胞中，轻弹混匀，在冰上静置30 min；于42℃水浴锅中热激90 s，在冰上静置2-3 min；加入1 mL LB培养基，在37℃，220 rpm下摇菌45 min~60min；4500 rpm离心2 min，去900 μL上清，用剩余培养基重悬菌体，涂布于抗性的平板上。

（五）7-O甲基圣草酚HPLC测定：发酵结束后，取500 μL发酵液加入同体积的甲醇，剧烈振荡混匀后，14000 r/min离心5 min，取上清液后用0.22 μm有机相滤膜过滤后使用岛津LC-20A高效液相色谱仪进行产物检测。采用Thermo Fisher C18色谱柱 (4.6 mm×250mm，5 μm) 进行色谱分离；柱温箱温度设置为40℃；进样量为10 μL；流动相分别为：A相为超纯水(加入0.1%三氟乙酸)，B相为乙腈 (加入0.1%三氟乙酸)；总流速为1 mL/min，洗脱方式为梯度洗脱：0 - 10 min，B相：10 - 40%；10 - 20 min，B相：40 - 60%；20 - 25 min，B相：60%- 10%；检测器波长：290 nm。

（六）菌株信息如表1所示：

表1 本发明中涉及的菌株、基因

菌株名称	基因型
		NS01	E.coli BL21(BE3) carrying pCDF-MetA-CysE、pET28a-pFOMT3
NS02	E.coli BL21(BE3) carrying pCDF-MetA-CysE-ydaO、pET28a-pFOMT3
		NS03	E.coli BL21(BE3) carrying pACYCDueT-SNZ3-RPS18B-RFC4、pET28a-pFOMT3

实施例1：甲氧基转移酶的筛选

三种不同来源的甲氧基转移酶，分别为来自稻叶的OsNOMT，来自链霉菌的SaOMT2，来自紫苏叶的pFOMT3（表2），所用载体为pET28a，由上海生物工程有限公司合成。将其分别转入大肠杆菌BL21(DE3)中。将构建得到的重组大肠杆菌在37℃培养12h，挑取单菌落至4mL的LB培养基中，加入终浓度为50 μg/mL的卡那霉素，37℃，220 r/min培养8-10 h，将种子液接种于25 mL带有终浓度为50 μg/mL的卡那霉素的TB培养基中，控制初始OD₆₀₀为0.1，37℃，220 r/min培养至OD₆₀₀为0.8，加入终浓度为0.1 mM的IPTG，在25℃，220 r/min下诱导10 h，再加入终浓度为100 mg/L的圣草酚，反应10 h后取500 μL发酵液，向发酵液中加入500 μL甲醇，将重悬液静置30 min，震荡混匀后，于12000 × g离心5 min，经过0.22 μm有机滤膜过滤，进行HPLC分析。比较摩尔转化率，摩尔转化效率如表3所示。最终选取pFOMT3用于后续进一步7-O甲基圣草酚的生产。所用基因信息均列在表2中，对应的核苷酸序列如序列表SEQID NO.1、SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3。

表2 甲氧基转移酶有关信息

表3 不同甲氧基转移酶对圣草酚的摩尔转化率

实施例2：内源甲硫氨酸合成途径的强化

强化S-腺苷甲硫氨酸的直接前体物质甲硫氨酸以促进甲基供体S-腺苷甲硫氨酸的供给。

过表达大肠杆菌内源基因MetA、CysE(对应的核苷酸序列分别如SEQ ID NO.4和SEQ ID NO.5所示)，用引物MetA-F/MetA-CysE-R和CysE-MetA-F/CysE-R分别从大肠杆菌基因组上扩增出基因MetA、CysE，用引物pCDF-F/pCDF-M1-R扩增载体pCDFDuet-1，MetA、CysE之间是以SD序列连接至pCDFDute-1的MCS1处。引物序列如表4，用引物进行扩增得到的片段，经过琼脂糖凝胶检测后，进行回收纯化，纯化后的片段通过同源重组克隆至载体pCDFDuet-1，经E.coliJM109扩增后，通过DNA测序(Sangon，China)证实表达质粒(pCDF-MetA-CysE) 是否正确构建，将成功构建的质粒转化至E.coliBL21(DE3)中，得到重组大肠杆菌NS01。

将构建得到的重组大肠杆菌NS01在37℃培养12 h，挑取单菌落至4mL的LB培养基中，加入终浓度为50 μg/mL的链霉素和卡那抗生素，37℃，220 r/min培养8-10 h，将种子液接种于25 mL带有终浓度为50 μg/mL的链霉素和卡那抗生素的TB培养基中，控制初始OD₆₀₀为0.1，37℃，220 r/min培养至OD₆₀₀为0.8，加入终浓度为0.1 mM的IPTG，在25℃，220 r/min下诱导10 h，再加入终浓度为250 mg/L的圣草酚，反应10 h后取500 μL发酵液，向发酵液中加入500 μL甲醇，将重悬液静置30 min，震荡混匀后，于12000 × g离心5 min，经过0.22 μm有机滤膜过滤，进行HPLC分析。结果表明重组大肠杆菌NS01的7-O甲基圣草酚的产量为117mg/L。

表4 引物序列

引物名称	引物序列
		MetA-F	GTTTAACTTTAATAAGGAGATATACCATGGGCATGCCGATTCGTGTGCCGG
MetA-CysE-R	CAATTTCCAGTTCTTCACACGACATGGTATATCTCCTTTTAATCCAGCGTTGGATTCATGTGC
		CysE-F	ATGTCGTGTGAAGAACTGGAAATTGTC
CysE-M2-R	CTTAAGCATTATGCGGCCGCAAGCTTTTAGATCCCATCCCCATACTCAAATGTATG
		pCDF-R	GCCCATGGTATATCTCCTTATTAAAGTTAAAC
pCDF-M2-F	AAGCTTGCGGCCGCAT

实施例3：异源表达ATP核糖体感应开关ydaO动态调控胞内ATP的供应

从枯草芽孢杆菌基因组扩增ATP核糖体感应开关ydaO(对应的核苷酸序列如SEQID NO.6所示)，用引物ydaO-F/ydaO-R扩增ydaO，用引物pCDF-M2-R/pCDF-F以pCDF-MetA-CysE为载体扩增含有MetA-Cys的pCDFDuet-1载体。ydaO连接至pCDF-MetA-CysE载体的MCS2处，使得MetA-Cys共用一个T7启动子，ydaO单独用一个T7启动子。所用的引物序列如表5，经过琼脂糖凝胶检测后，进行回收纯化，纯化后的片段通过同源重组克隆至载体pCDFDuet-1，经E.coliJM109扩增后，通过DNA测序证实表达质粒(pCDF-T7-MetA-CysE-T7-ydaO)的正确构建，将成功构建的质粒转化至E.coliBL21(DE3)中，构建得到重组大肠杆菌NS02。

将重组大肠杆菌NS02在37℃培养12h，挑取单菌落至4 mL的LB培养基中，加入终浓度为50 μg/mL的链霉素和卡那抗生素，37℃，220 r/min培养8-10 h得到种子液，将种子液接种于25 mL带有终浓度为50 μg/mL的链霉素和卡那抗生素的TB培养基中，控制初始OD₆₀₀为0.1，37℃，220 r/min培养至OD₆₀₀为0.8，加入终浓度为0.1 mM的IPTG，25℃，220 r/min下诱导10 h，加入250 mg/L的圣草酚，反应10 h后取500 μL发酵液，向发酵液中加入500 μL甲醇，将重悬液静置30 min，震荡混匀后，于12000 × g离心5 min，经过0.22 μm有机滤膜过滤，进行HPLC分析。结果表明重组大肠杆菌NS02的7-O甲基圣草酚的产量为194 mg/L。

表5 引物序列

引物名称	引物序列
		ydaO-M2-F	CTTAGTATATTAGTTAAGTATAAGAAGGAGATATACATATGTTAATGTATCATTCAATCAAACGTTTTTTGATTGGG
ydaO-M2-R	GCTCAGCGGTGGCAGCAGCCTAGGTTTACTTTTTAAAATGATACGGCAGTGTGGC
		pCDF-F	ACCTAGGCTGCTGCCAC
pCDF-M2-R	TAACATATGTATATCTCCTTCTTATACTTAACTAATATACTAAGATGG

实施例4：转硫路径的整体调节

（1）外源添加5’-磷酸吡哆醛以提升7-O甲基圣草酚的产量

将实施例1中构建得到的表达了pET28a-pFOMT3质粒的大肠杆菌划线至LB固体培养基中，37℃培养12 h，挑取单菌落至4 mL的LB培养基中，加入终浓度为50 μg/mL的卡那抗生素，37℃，220 r/min培养8-10 h得到种子液，将种子液接种于25 mL带有终浓度为50 μg/mL的卡那抗生素的TB培养基中，控制初始OD₆₀₀为0.1，在37℃、220 r/min培养至OD₆₀₀为0.8，加入终浓度为0.1 mM的IPTG，在25℃、220 r/min下诱导10 h，加入250 mg/L的圣草酚的同时添加不同浓度的5’-磷酸吡哆醛（终浓度分别为0、45、90、135 μM），反应10 h后取500 μL发酵液，向发酵液中加入500 μL甲醇，将重悬液静置30 min，震荡混匀后，于12000 × g离心5 min，经过0.22 μm有机滤膜过滤，进行HPLC分析。如图3，当添加90 μM 5’-磷酸吡哆醛时7-O甲基圣草酚的产量最高，为96 mg/L。由此可知，在外源添加5’-磷酸吡哆醛后，5’-磷酸吡哆醛促进了甲基供体S-腺苷甲硫氨酸(SAM)的供给，从而提升7-O甲基圣草酚的积累量。

（2）调控细胞内5’-磷酸吡哆醛含量以提升7-O甲基圣草酚的产量

为了降低成本，异源表达酿酒酵母基因SNZ3、RPS18B、RFC4(对应的核苷酸序列如SEQ ID NO.7、SEQ ID NO.8和SEQ ID NO.9所示)提高大肠杆菌胞内5’-磷酸吡哆醛的含量。

用引物SNZ3-F/SNZ3-RPS18B-R、RPS18B-F/RPS18B-M1-R从酿酒酵母基因组上分别扩增出基因SNZ3、RPS18B，用引物pACYC-F/pACYC-M1-R扩增载体pACYCDuet-1，与SNZ3、 RPS18B连接，经E.coliJM109扩增后，通过DNA测序证实表达质粒(pACYC-T7-SNZ3-RPS18B)正确构建。用引物pACYC-R/pACYC-M2-F以质粒pACYC-T7-SNZ3-RPS18B为模板扩增出片段pACYC- SNZ3-RPS18B，用引物RFC4-M2-F/RFC4-R从酿酒酵母基因组上扩增出RFC4。所用的引物序列如表6，经过琼脂糖凝胶检测后，进行回收纯化，纯化后的片段通过同源重组将pACYC- SNZ3-RPS18B与RFC4连接，经E.coliJM109扩增后，通过DNA测序证实表达质粒(pACYC-T7-SNZ3-RPS18B-T7-RFC4)正确构建。

将上述测序正确的质粒pACYC-T7-SNZ3-RPS18B-T7-RFC4转化至带有pET28a-pFOMT3质粒的大肠杆菌BL21 (DE3)感受态中，构建得到重组菌NS03，将重组菌NS03在37℃培养12 h，挑取单菌落至4 mL的LB培养基中，加入终浓度为30 μg/mL的氯霉素和50 μg/mL卡那抗生素，37℃，220 r/min培养8-10 h，将种子液接种于25 mL带有终浓度为30 μg/mL的氯霉素和50 μg/mL卡那抗生素的TB培养基中，控制初始OD₆₀₀为0.1，37 ℃，220 r/min培养至OD₆₀₀为0.8，加入终浓度为0.1 mM的IPTG，25℃，220 r/min下诱导10 h，加入250 mg/L的圣草酚，反应10 h 后取500 μL发酵液，加入500 μL甲醇，将重悬液静置30 min，震荡混匀后，于12000 × g离心5 min，经过0.22 μm有机滤膜过滤，进行HPLC分析。结果表明重组工程菌NS03的7-O甲基圣草酚的产量为122 mg/L。

表6 引物序列

引物名称	引物序列
		SNZ3-F	CTTTAATAAGGAGATATACCATGGGCATGTCAGAATTCAAGGTTAAAACTGGGC
SNZ3-RPS18B-R	GTTCTTGTACAACTAAAGACATGGTATATCTCCTTCTACCATCCGATTTCAGAAAGTCTTGCAC
		RPS18B-F	ATGTCTTTAGTTGTACAAGAACAAGGTTCCTTC
RPS18B-M1-R	CATTATGCGGCCGCAAGCTTTTAAGCTCTTCTTCTACCAGTGGTCTTGG
		pACYC-F	GCCCATGGTATATCTCCTTATTAAAGTTAAACAAAATTATTTCTAC
pACYC-M1-R	AAGCTTGCGGCCGCATAA
		RFC4-M2-F	AGTATAAGAAGGAGATATACATATGATGTCCAAAACTTTATCTTTGCAACTTCCATG
RFC4-R	GGTGGCAGCAGCCTAGGTTAATCAGGCTTTATTATTTAGTTTATGAATTTTCGCTAACATACTAG
		pACYC-R	TTAACCTAGGCTGCTGCCACC
pACYC-M2-F	CATATGTATATCTCCTTCTTATACTTAACTAATATACTAAGATGGGG

实施例5：组合表达后分批添加底物强化7-O甲基圣草酚的合成

将实施例3、4中构建的质粒组合表达来提高7-O甲基圣草酚的积累，实施例3、4中圣草酚的添加浓度皆为250 mg/L，而当一次添加圣草酚的浓度超过250 mg/L时，7-O甲基圣草酚的生成量急剧降低，如图4所示，所以在此次实施中分批添加底物至高浓度。将pCDF-T7-MetA-CysE-T7-ydaO，pACYC-T7-SNZ3-RPS18B-T7-RFC4质粒转化至带有pET28a-pFOMT3质粒的大肠杆菌BL21(DE3)感受态中（构建菌株NS04），37℃培养12 h，挑取单菌落至4 mL的LB培养基中，加入终浓度为50 μg/mL的链霉素、氯霉素和卡那抗生素，37℃，220 r/min培养8-10 h，将种子液接种于25 mL带有终浓度为50 μg/mL的链霉素、30 μg/mL氯霉素和50 μg/mL卡那抗生素的TB培养基中，控制初始OD₆₀₀为0.1，37℃，220 r/min培养至OD₆₀₀为0.8，加入终浓度为0.1 mM的IPTG，25℃，220 r/min下诱导3 h，加入250 mg/L的圣草酚，反应10 h后再加入等量的圣草酚，再次反应10 h，取500 μL的发酵液，加入500 μL甲醇，将重悬液静置30 min，震荡混匀后，于12000 × g离心5 min，经过0.22 μm有机滤膜过滤，进行HPLC分析。结果表明重组工程菌NS04的7-O甲基圣草酚的产量为306 mg/L。如图5所示，与NS04菌株在同等条件下进行发酵培养，NS01、NS02和NS03别积累了211 mg/L、244 mg/L和209 mg/L的7-O甲基圣草酚。

虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。

SEQUENCE LISTING

<110> 江南大学

<120> BAA220029A

<130> 一种生产7-O甲基圣草酚的重组大肠杆菌及应用

<160> 9

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 1059

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

atgaaaaact ctagcaccga tgaagatctg agcatcttcg cgatgcaggt tgctacctct 60

tctatcgtgc cgcgtgcgct gaaagcagtt atcgaactgg atctgctgga aatgatgaaa 120

aaagctggcc gtccgctgtc tacctctgaa atggcggcgc agatccaggc gaccaacccg 180

gaagcggctc tgatgatcga tcgtatcctg cgtgttctga tcgctagcaa catcctggaa 240

tgcaccaccg cggcttctca cggtggtgct gaacgtctgt acagcctggc gccggtttgc 300

aaattcttca ccaaaaacga tgatggcgtt agctgggcgc cgctgttcct gatgatccag 360

gatcgtgttt tcaccgaagc gtgggatcac gttaaagatg cgatcgttga aggcggtatt 420

ccgttcaaca ttgcgcacgg tatgtctggc tttgaatacc cggcaaccga tccgcgttat 480

aataaaatct tcaatcaggc gatgtctgat gaaagcacca tgttcatgca caaaatcctg 540

gaactgtatg atggtttcga tggcctgaaa tctgtggttg atgttggcgg tggcatcggt 600

gcgagcctga aaatgattat cactaaatac ccgtctattc aggctattaa cttcgatctg 660

ccgcacgtta ttcagaacgc tccgagccat ccgggtctgg aacaccgtag cggtgatatg 720

ttcgtttctg ttccgaccgg tgatgcgatc ctgctgaaat ggatcattca taactggtct 780

gatggccatt gtctgaaact gctgaaaaac tgctatgaag cactgccgga aaaaggtaaa 840

gttattatcg ctgatcgtat tctgccggaa accgaaaact ataaagaagc aagcgctagc 900

gttgatctgg cgggtgatgc actgatgctg accctgttca ccggcggcaa agaacgtgct 960

gaagcggaat tccaggcact ggctaaagct agcggcttca aacacttccg taaagtttgc 1020

tgcgcgttct ctacctggat catggaactg tacaaataa 1059

<210> 2

<211> 1137

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

atgggtgata tggttagccc ggttgttcac cgtcacgcgg cgggtggcgg tagcggcggt 60

gatgatgatg atcaggcgtg catgtacgca ctggaactgc tgggtggtag cgttgtttct 120

atgaccctga aagcggcgat cgaactgggt ctggttgacg aactgctggc tgcggcaggc 180

gcagcggtta ccgcggaaga actggcggcg cgtctgcgtc tgccggctgc ggttgcggcg 240

gcggcggcgg tggatcgtat gctgcgtctg ctggcgagct acggcgttgt tcgttgtgcg 300

accgaagcgg gcccggatgg caaagctcgt cgttcctacg cggcggcgcc ggtttgcaaa 360

tggctggcgg cgggcagctc tagcggcgaa ggctcgatgg cgccgctggg tctgctgaac 420

ctggataaag tgttcatgga aaactggtac tacctgaaag aagcggttag cgaaggcggt 480

accgcttttg ataaagcgta cggcacctcc ctgttccagt acctgggtca ggatggtaac 540

gaaccgagca acaccctgtt caaccaggca atggcttctc actccgttgt tatcaccaac 600

aaactgctgc agttcttccg tggcttcgat gctggcgcgg gcgttgatgt tctggttgat 660

gtgggtggtg gcgttggcgc gaccctgcgt atgatcaccg cgcgccaccc gcacctgcgt 720

ggcgttaact acgatctgcc gcacgttatc gcgcaggcgc cgccggttga aggtgttgaa 780

cacatcggcg gctctatgtt cgatcacgtt ccgtctggtt ctgcgatcct gctgaaatgg 840

attctgcacc tgtggggcga cgaagaatgc gttaaaattc tgaaaaactg ctacaaagcg 900

ctgccggcta aaggcaaagt tatcctggtg gaatacgttc tgccggcgag cccggaagcg 960

accctggcgg cgcaggaagc gttccgtctg gatgttatga tgctgaaccg tctggcgggt 1020

ggcaaagaac gtacccagca ggaattcacc gacctggcgg ttgatgcggg cttcagcggt 1080

gattgcaaac cgacctacat cttcaccaac gtttgggcgc tggaattcac caaataa 1137

<210> 3

<211> 1080

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

gttagctgtc gtaccggtac cgataccgtt ccggcaggtt ctcatgaaca gcgtaccgtg 60

gaaagcggcg aagttatggc aaaagaaacc accccgcgtg gcggtggtgt ttgggcggca 120

gcggacctgc tgaccccgat ggccgttcgt gttgctgcga ccctgcgcct ggcggaccac 180

atcgctgccg gcgcgcgcac caccgaagcg ctggcagaag cagttggtgc agatcgtgac 240

gccctgggcc gtctgctgga ccacctggtt accgctggcg tgctgtctgg caccggtcca 300

ggtgcctacg acctgaccgc gatgggtcgt cacctgtgcg aaggtgcgcc ggaagatatg 360

cgtgcgatcc tggatatcga aggtgctctg ggccacgctg aactgtctct ggttcacctg 420

ctgcacaccg ttcgcaccgg cgaagcggcg ttcccgcagc agtacggtgt tactttctgg 480

gatgatctgt ccagcgacga tggccgtgcg gaatctttcg ataccctgat gggcgcgcgc 540

ctgactgcgc actccccggc agttgcaggc gcgtacccgt ggggtactct gcgtcacgtt 600

gtggatgttg gtggcggcga tggtaccatg ctgatcgcga tcctgcagag ccatccggat 660

ctgcgcggca ccgttgtgga tctgccgggt ccggtgcgtc gtgcggaaaa agcgattgcg 720

gcggcgggcc tggatcaccg tgcggacatc gcggctggct ccttcttcga cgcgctgccg 780

gcgggtgctg atggctatct gctgagctct atcctgcata actgggatga tgcgagcgcg 840

gctcgtatcc tgcgccgttg cgcggatgcg gcgcagacca ccggccgtgt tctggttgtc 900

gactatttcg gcgatcgtac tgttcagacc gaaggcgatc tgcgcatgct gggctatttc 960

ggcggccgcc agcacaccct ggaacagctg gcggaactgg cgggcactgt tggtctgcac 1020

accacctctg tgaccccggc aggccgctac tccgtggttg aactgcgtgc agtgggctaa 1080

<210> 4

<211> 930

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 4

atgccgattc gtgtgccgga cgagctaccc gccgtcaatt tcttgcgtga agaaaacgtc 60

tttgtgatga caacttctcg tgcgtctggt caggaaattc gtccacttaa ggttctgatc 120

cttaacctga tgccgaagaa gattgaaact gaaaatcagt ttctgcgcct gctttcaaac 180

tcacctttgc aggtcgatat tcagctgttg cgcatcgatt cccgtgaatc gcgcaacacg 240

cccgcagagc atctgaacaa cttctactgt aactttgaag atattcagga tcagaacttt 300

gacggtttga ttgtaactgg tgcgccgctg ggcctggtgg agtttaatga tgtcgcttac 360

tggccgcaga tcaaacaggt gctggagtgg tcgaaagatc acgtcacctc gacgctgttt 420

gtctgctggg cggtacaggc cgcgctcaat atcctctacg gcattcctaa gcaaactcgc 480

accgacaaac tctctggcgt ttacgagcat catattctcc atcctcatgc gcttctgacg 540

cgtggctttg atgattcatt cctggcaccg cattcgcgct atgctgactt tccggcagcg 600

ttgattcgtg attacaccga tctggaaatt ctggcagaga cggaagaagg ggatgcatat 660

ctgtttgcca gtaaagataa gcgcattgcc tttgtgacgg gccatcccga atatgatgcg 720

caaacgctgg cgcaggaatt tttccgcgat gtggaagccg gactagaccc ggatgtaccg 780

tataactatt tcccgcacaa tgatccgcaa aatacaccgc gagcgagctg gcgtagtcac 840

ggtaatttac tgtttaccaa ctggctcaac tattacgtct accagatcac gccatacgat 900

ctacggcaca tgaatccaac gctggattaa 930

<210> 5

<211> 822

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 5

atgtcgtgtg aagaactgga aattgtctgg aacaatatta aagccgaagc cagaacgctg 60

gcggactgtg agccaatgct ggccagtttt taccacgcga cgctactcaa gcacgaaaac 120

cttggaagtg cactgagcta catgctggcg aacaagctgt catcgccaat tatgcctgct 180

attgctatcc gtgaagtggt ggaagaagcc tacgccgctg acccggaaat gatcgcctct 240

gcggcctgtg atattcaggc ggtgcgtacc cgcgacccgg cagtcgataa atactcaacc 300

ccgttgttat acctgaaggg ttttcatgcc ttgcaggcct atcgcatcgg tcactggttg 360

tggaatcagg ggcgtcgcgc attggcaatc tttctgcaaa accaggtttc tgtgacgttc 420

caggtcgata ttcacccggc agcaaaaatt ggccgtggca ttatgctcga ccacgccacg 480

ggcatcgttg tgggtgaaac ggcggtaatt gaaaacgacg tatcgattct gcaatctgtg 540

acgcttggcg gtacgggtaa atctggtggt gaccgtcacc cgaaaattcg tgaaggtgtg 600

atgattggcg cgggcgcgaa aatcctcggc aatattgaag ttggtcgcgg cgcgaagatt 660

ggcgcaggtt ccgtggtgct gcaaccggtg ccgccgcata caaccgccgc tggcgttccg 720

gctcgtattg tcggtaaacc agacagcgat aagccatcaa tggatatgga ccagcatttc 780

aacggtatta accatacatt tgagtatggg gatgggatct aa 822

<210> 6

<211> 1824

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 6

atgtatcatt caatcaaacg ttttttgatt gggaaaccac taaaatccca agcagctgga 60

gagcaaaaac tgacgaaatt aaaagccttg gctatgcttt cctcagatgc gctgtcatct 120

gtcgcatatg ggacagaaca aattctaatc attttggcaa caatcagtgc agccgcattt 180

tggtactcca ttccgattgc ggttggcgtt ctcatcttgc tgctcgcact gattctttca 240

tacaggcaaa ttatttacgc ttatccgcag ggcggcgggg cgtatatcgt ttctaaagaa 300

aatctcggtg aaaaaccggg attgattgcg ggcggttcat tgcttgttga ttatatttta 360

acagtagcgg taagtatttc cgcaggcacg gatgccatca cgtcagcctt tcctgcattg 420

catgattatc atgtgccgat cgctattttt ctcgtgttag tgattatgat tttgaacctg 480

cgcgggcttt cggaatcagc atccatactt gcctacccgg tttatctgtt tgtggtggcg 540

cttttggttc tcattgcagt cgggttgttt aaacttatga caggacaaat agaccagcca 600

gcccatcata catcgctcgg cacacctgta gccggcatta cgctattttt gctgcttaag 660

gctttttcct ccggatgctc agcgttgacc ggggttgagg ccatttctaa tgcgattcct 720

gcattcaaaa acccgcctgc gcgaaacgcg gcaagaacgc ttgcgatgat ggggattttg 780

ctggcgattc tgttttccgg catcacggtt ctcgcgtacg ggtatggtac ggcgccgaaa 840

cctgatgaaa cagtggtttc acaaattgcg tccgaaacct ttgggcggaa tgtgttctac 900

tatgtcatcc aaggtgtcac atcgcttatt ttggttcttg cggcaaatac gggattctca 960

gccttcccgc agcttgcctt caacctggcg agagaccagt atatgccgcg aatgtttaca 1020

gtcaggggcg accgcttagg cttctcaaat gggattatct ttttaggctt tgcctccatt 1080

gttctcatta tcttattcgg gggacagacg gagcacttaa tcccgttata tgctgtgggc 1140

gtatttattc catttacgct ttcacaaacc ggcatgtgca tgaaatggat caagcaaaaa 1200

ccaaaaggct ggatcggaaa aatgctgatc aactcctgcg gcgctctgat atcatttatg 1260

gttctatcca ttctgtttgt gacgaagttt aatgtcgtat ggcctgtgtt aatctttatg 1320

cctatcgtcg ttttgctgtt ttttgcgatt aaaaatcact atactgcggt tggtgaacag 1380

cttcgcatcg tagacaaaga gccggaagaa atcaaaggca ccgttgtgat tgtgcctgtg 1440

gccggtgtca ccaccgtcgt gcaaaaatcg attcactatg cgaaatcact gtccgatcag 1500

gtgatcgccg ttcacgtgtc atttgacaga gaacaggaaa agaaattcga aaaacgttgg 1560

gaagagctta ataacggagt gcgtctcgtg acgcttcact cctcttacag aagccttgtc 1620

catccgtttg ataagttttt ggaaacagtt gaggcaaaag cgaagaagga gcagttttcc 1680

gttatggtgc tgtttccgca atttataacg aaaaaacgct ggcacaccat ccttcacaac 1740

caatcggcct tcctcctcag agtccggctg ttctggaaaa aggacataat ggttgccaca 1800

ctgccgtatc attttaaaaa gtaa 1824

<210> 7

<211> 897

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 7

atgtcagaat tcaaggttaa aactgggctt gcccaaatgt taaagggcgg tgtgattatg 60

gacgtcgtca cacctgaaca ggctattatc gcagaaagag cgggcgcttg tgctgtaatg 120

gcattggaac gcattccagc tgacatgcgc aagtctggcc aagtatgccg tatgtcagat 180

cctcgcatga tcaaagaaat tatggaagct gtttcaattc cggtgatggc aaaggtccgt 240

attggacact tcgtggaggc acagatcctg gaagagctgc aagtagacta cattgacgaa 300

agtgaggttt tgactccagc tgattggaca catcacattg agaagcataa cttcaaggtg 360

ccatttgttt gcggtgccaa ggatctaggt gaggctttga gaagaataaa cgaaggtgct 420

gcaatgatcc gtaccaaagg tgaagcaggt accggtgacg tttccgaggc cgtcaagcac 480

atcaccaaga ttaaggcgga gatccagcag tataaagaga atttgaagac cgaatccgat 540

tttgcagcta aggccacaga attacgcgtc cctgtcgact tgctgaagac aacactatca 600

gagggaaagc tacctgtagt caattttgct gctggtggag ttgctactcc agcagacgct 660

gctctattga tgcaattggg ttgtgaaggt gttttcgtcg gctcaggtat attcaaatcg 720

tcagatcctg agaagttagc atgtgctatc gttgaagcca cgactcacta cgataaccca 780

gcaaaactat tgcaagtttc cagcgatttg ggtgacttga tgggtggtat ttccatccaa 840

tcaattaatg aagcaggagg caaaaacggt gcaagacttt ctgaaatcgg atggtag 897

<210> 8

<211> 441

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 8

atgtctttag ttgtacaaga acaaggttcc ttccaacaca ttttacgttt gttgaacacc 60

aatgtcgatg gtaacattaa aattgtttac gctttgacca ctattaaggg tgttggtcgt 120

cgttactcca acttggtctg taagaaggct gatgttgatt tgcacaagag agctggtgaa 180

ttgacccaag aagaattgga aagaattgtc caaatcatgc aaaacccaac tcattacaag 240

atcccagcct ggttcttaaa ccgtcaaaac gacattactg atggtaagga ctaccacact 300

ttggctaaca acgtcgaatc caagttgaga gatgacttgg aaagattaaa gaagatcaga 360

gcccaccgtg gtattagaca cttctggggt ttacgtgtta gaggtcaaca caccaagacc 420

actggtagaa gaagagctta a 441

<210> 9

<211> 911

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 9

ctgatatagt cggtaataaa gagaccattg atagacttca gcaaatcgct aaagatggta 60

acatgcccca tatgatcata tcaggtatgc caggtatagg taagaccact tcggtacatt 120

gccttgctca cgagctcctt ggccgctctt atgctgacgg tgttttagag ttgaacgctt 180

cagatgacag aggtattgat gtcgtcagaa accaaataaa acattttgcc cagaagaaac 240

tacatttgcc tccagggaaa cataaaatcg ttattcttga tgaggcggat tccatgactg 300

ctggtgctca gcaagcgttg agaaggacca tggagctata ttcgaactct acaaggtttg 360

catttgcttg taatcaatca aacaagatca ttgagccgct gcaaagtaga tgtgcgattt 420

tgaggtattc taaactatcc gatgaagacg ttctaaaacg tcttttacaa atcataaagc 480

tagaggatgt taagtataca aatgatgggt tagaagcaat catttttaca gcggagggtg 540

acatgagaca ggccataaac aatctacaaa gtacagtagc aggacacggt ttagtgaacg 600

cagacaatgt cttcaaaatt gttgattctc ctcaccctct aatagtgaag aaaatgttac 660

tagcctccaa cctagaagat tcaattcaaa tcttaagaac agatctttgg aaaaagggtt 720

attcctcgat tgatatcgtc acaacatctt tccgcgttac caaaaactta gcacaagtga 780

aagaatcagt aagattggaa atgataaaag aaatcggttt gacccatatg agaattctgg 840

agggtgttgg aacgtacttg caactggcta gtatgttagc gaaaattcat aaactaaata 900

ataaagcctg a 911

Claims (7)

1.一种重组大肠杆菌，其特征在于，在大肠杆菌中表达来源于Perilla frutescens的甲氧基转移酶的编码基因；所述重组大肠杆菌中过表达编码高丝氨酸琥珀酰转移酶的基因和编码L-丝氨酸-O乙酰转移酶的基因；表达来源于枯草芽孢杆菌的ATP核糖体感应开关ydaO基因；在大肠杆菌中表达来源于酿酒酵母的编码5’-磷酸吡哆醛合成酶的基因、编码DNA结合蛋白的基因、编码核糖体亚单位的基因；所述甲氧基转移酶的编码基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示；所述编码高丝氨酸琥珀酰转移酶的基因的核苷酸序列如SEQ IDNO.4所示；所述编码L-丝氨酸-O乙酰转移酶的基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示；所述ydaO基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示；所述编码5’-磷酸吡哆醛合成酶的基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.7所示；所述编码DNA结合蛋白的基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.9所示；所述编码核糖体亚单位的基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.8所示。

2.生产7-O甲基圣草酚的方法，其特征在于，利用权利要求1所述的重组大肠杆菌发酵生产7-O甲基圣草酚。

3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，将所述重组大肠杆菌接种至发酵体系中培养至OD₆₀₀为0.8±0.1，加入终浓度为0.1~0.2mM的IPTG，在20~25℃，180~220 r/min下诱导8~10 h，再加入终浓度为200~250 mg/L的圣草酚，再反应8~10 h。

4.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，将所述重组大肠杆菌接种至发酵体系中培养至OD₆₀₀为0.8±0.1，加入终浓度为0.1~0.2mM的IPTG，在20~25℃，180~220 r/min下诱导2~3 h，再加入200~250 mg/L的圣草酚，反应8~10 h后再加入等量的圣草酚，再次反应8~10h。

5.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，将权利要求1所述重组大肠杆菌在发酵体系中培养至OD₆₀₀为0.8±0.1，加入终浓度为0.1~0.2 mM的IPTG，在20~25℃、180~220 r/min下诱导8~10 h，再加入200~250 mg/L的圣草酚并同时添加终浓度为0~135μM的5’-磷酸吡哆醛，反应8~10 h。

6.根据权利要求2~5任一所述的方法，其特征在于，所述发酵体系中含有3~5 g/L甘油，10~12 g/L蛋白胨，20~24 g/L酵母提取物，2~2.5 g/L KH₂PO₄，15~20 g/L K₂HPO₄。

7.权利要求1所述重组大肠杆菌在生产7-O甲基圣草酚及其衍生物中的应用。