KR100337755B1 - 트랜스게닉현화식물 - Google Patents

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인터내쇼날 플라워 디벨럽먼트 피티와이. 리미티드
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Abstract

본 발명은 일반적으로 돌연변이 화훼에 관한 것이다. 구체적으로, 본 발명은 유전적 변형으로 플라보노이드 3',5'-히드록실라아제의 발현을 가능하게 하므로써 플라보노이드 경로의 중간체를 조작할 수 있는 돌연변이 장미, 카테이션 및 국화 식물에 관한 것이다.

Description

트랜스게닉 현화식물
본 발명은 일반적으로 트랜스게닉 현화식물(transgenic flowering plants)에 관한 것이다. 구체적으로, 본 발명은 플라보노이드 3',5'-히드록실아제의 발현을 가능하여 유전적으로 변형시키므로써 플라보노이드 경로의 중간체의 조작을 가능케 한 트랜스게닉 장미, 카네이션 및 국화 식물에 관한 것이다.
화훼 산업은 질병 및 병원체에 대한 내성으로부터 변경된 화서(inflorescence, ,花序)에 이르기까지 개선된 특성을 보유하는 신종 및 변종 현화식물을 개발하기 위해 노력해왔다. 고전적인 품종 개량 기법을 사용하여 일부 성공을 거두었지만, 이 접근법은 특정 종의 유전자 풀(pool)을 사용하는 것으로만 한정 제한되어 왔다.
예를 들어, 단일종이 보다 유색 품종의 완전한 스펙트럼을 나타내는 것은 드문 일이다. 따라서, 이러한 특성을 나타내는 트랜스게닉 식물을 생성하려는 시도로서 상당한 노력이 행해져왔다. 예를 들면, 주요한 꽃꽃이 종인 장미, 카네이션 및 국화의 청색 변종의 개발은 꽃꽃이 및 장식품 시장에 중요한 기회를 제공할 수 있다.
꽃의 색상은 주로 플라보노이드와 카로티노이드라는 두 가지 유형의 색소가 크게 영향을 준다. 플라보노이드는 황색으로부터 적색, 청색까지의 색범위에 기여한다. 카로티노이드는 오렌지색 또는 연황색을 부여하며, 황색 및 오렌지색 꽃의독특한 색소이다. 꽃은 색상에 주된 영향을 미치는 플라보노이드는 시아니딘, 델피니딘, 페투니딘, 페오니딘, 말비딘 및 펠라고니딘의 글리코실화된 유도체인 안토시아닌으로서 이것은 액포 내에 존재한다. 다양한 안토시아닌이 현저한 색상의 차이를 나타내게 할 수 있다. 또한, 꽃의 색상은 무색 플라보노이드, 금속착물, 글리코실화, 아실화, 메틸화 및 액포 pH에 의한 보조 색소 형성에도 영향받는다(참조:Fokmann, 1991).
플라보노이드 색소의 생합성 경로(이하 "플라보노이드 경로"라 칭함)는 잘 확립되어 있다. 이는 제1도에 도시되어 있다(참조 : Ebel 및 Hahlbrock, 1988, Hahlbrock 및 Grisebach, 1979; Wiering 및 de Vlaming, 1984; Schram 등, 1984; Stafford, :1990). 상기 경로의 제1 단계는 3분자의 말로닐-CoA와 1분자의 p-쿠마로일-CoA와의 축합 반응이다. 이 반응은 칼론 신타아제(chalcone synthase, CHS) 효소에 의해 촉매된다. 이 반응의 생성물인 2',4,4',6'-테트라히드록시칼콘은 보통 칼콘 플라바논 이소머라아제(CHI) 효소에 의해 신속하게 이성화되어 나린게닌을 형성한다. 이후 나린게닌은 플라보논 3-히드록실라아제(F3H)에 의해 중심 환의 3위치에서 히드록실화되어 디히드로카엠프페롤(DHK)을 형성한다.
디히드로카엠프페롤의 B-환은 3', 또는 3' 및 5' 위치 둘 다에서 히드록실화되어 각각 디히드로퀘르세틴(DHQ) 및 디히드로미리세틴(DHM)을 형성한다. 상기 경로에 관여하는 2개의 중심 효소는 플라보노이드 3'-히드록실라아제 및 플라보노이드 3',5'-히드록실라아제이다. 플라보노이드 3'-히드록실라아제는 DHK에 작용하여 DHQ를 형성하고, 나린게닌에 작용하여 에리오딕티올을 형성한다. 플라보노이드3',5'-히드록실라아제(이하, 3',5'-히드록실라아제)는 작용 범위가 넓은 효소로써, 3' 및 5' 위치에서 나린게닌 및 DHK의 히드록실화 및 5' 위치에서 에리오딕티올 및 DHQ의 히드록실화를 촉매하여 이 두가지의 경우에서 각각 펜타히드록시 플라보논 및 DHM을 형성한다. 안토시아닌의 B-환의 히드록실화 패턴은 꽃잎의 색상 결정에 중요한 역할을 한다.
상기한 바와 같이, 유전자 풀이 제한되었기 때문에 다수의 주된 꽃꽃이 종은 3',5'- 히드록실라아제가 결핍되어 있어 결핍되어 있지 않으면 가능했었을 색상 범위를 나타내지 못하게 된다. 이는 전세계적으로 꽃꽃이 시장의 대부분을 차지하는 특히, 장미, 카네이션 및 국화의 경우에 특히 그러하다. 따라서, 식물, 특히 장미, 카네이션 및 국화를 변형하여 3',5'-히드록실라아제를 형성하므로써, DHK 대사 뿐 아니라 DHQ, 나린게닌 및 에리오딕티올 같은 기타 기질의 대사를 조절하는 수단을 제공하는 트랜스게닉 식물을 생성할 필요가 있다. 이러한 조절은 안토시아닌의 히드록실화 패턴에 영향을 미치며, 델피니딘으로부터 유도된 안토시아닌의 형성을 가능하게 하므로써 꽃잎의 색상을 변형시키며, 단일 종이 더 넓은 스펙트럼의 색상을 발현할 수 있게 한다. 여기에는 델피니딘으로부터 유도되는 고 수준의 안토시아닌을 형성하는 트랜스게닉 식물을 특별히 생산할 필요성이 존재한다. 본 발명에 따르면, 유전자 구성물을 제작한 뒤 이를 사용하면 동일 종의 비-트랜스게닉 식물에 비해 높은 수준으로 델피니딘 및/또는 그의 유도체를 발현하는 트랜스게닉 식물이 생산된다. 본 발명의 유전자 구성물은 플라보노이드 3',5'-히드록실라아제에 작동가능하게 결합된 플라보노이드 경로 효소를 암호화하는 유전자에서 얻은 프로모터를함유함으로써 델피니딘 유도의 안토시아닌을 고수준으로 형질발현케 할 수 있다. 고 수준으로 델피니딘 및 관련 분자를 생성하는 것은 변경된 화서 특성을 나타내는 식물 개발에 특히 유용하다.
따라서, 본 발명은 장미, 카네이션 및 국화로부터 선택되는 트랜스게닉 식물 또는 그의 후대 또는 그의 화서부에 관한 것이다. 여기서 트랜스게닉 식물은 플라보노이드 3',5'-히드록실라아제를 암호화하는 유전자에 작동가능하게 결합된 플라보노이드 경로의 효소를 암호화하는 유전자에서 얻은 프로모터 함유의 유전자 구조물을 지니므로 동일 종의 비-트랜스게닉 식물에 비해 델피니딘으로부터 유도되는 고 수준의 안토시아닌을 형성한다.
플라보노이드 3',5'-히드록실라아제는 페튜니아, 버베나, 델피니움, 그레이프, 아이리스, 프리지아, 수국속, 시클라멘, 포테이토, 팬지, 가지, 리지안투스 또는 초롱꽃속 유래의 것이 바람직하다.
가장 바람직한 플라조노이드 3',5'-히드록실라아제는 페튜니아 유래의 것이다.
본 발명의 유전자 구성물은 3',5'-히드록실라아제를 암호화하는 서열을 암호화하는 핵산 분자를 포함하며, 필요에 따라 트랜스게닉 식물 내에서 상기 분자의 발현을 가능하게 하는 프로모터 및 종결 서열 같은 추가 유전자 서열을 포함한다. 유전자 구성물이 DNA인 경우, 이는 cDNA이거나 또는 게놈성 DNA일 수 있다. DNA는 식물 게놈 내로 통합되어 본 발명의 트랜스게닉 식물을 형성할 수 있는 키메라 유전자 구성물을 포함하는 이원성 벡터 형태인 것이 바람직하다. 키메라 유전자 구성물은 플라보노이드 경로의 효소를 암호화하는 유전자로부터 얻은 식물 프로모터를 지닌다. 바람직한 프로모터는 CHS를 암호화하는 유전자 유래의 것이다. 여기서는 이를 "CHS 프로모터"로 통칭한다. CHS 프로모터가 특히 유용한데, 그 이유는 CHS 프로모터가 프로모터 하류에 작동 가능하게 연결된 유전자 서열을 고 수준으로 발현되도록 하기 때문이다. 가장 바람직한 이원성 벡터는 pCGP484, pCGP485, pCGP653 및 pCGP1458이다.
본 명세서에서 사용한 용어 "핵산 분자"는 3',5'-히드록실라아제에서 아미노산 서열을 특정화하는 임의의 인접하는 뉴클레오티드 염기 시리즈를 의미한다. 상기 핵산은 완전 길이의 효소 또는 그의 기능성 유도체를 암호화할 수 있다. "유도체"라는 용어는 천연 발생하는 효소에 비해 임의의 단일 또는 다수의 아미노산이 치환, 결실 및/또는 첨가된 효소를 의미한다. 이 경우, 상기 핵산은 3',5'-히드록실라아제를 암호화하는 천연 발생하는 뉴클레오티드 서열을 포함하거나, 상기 천연 발생하는 서열에 대해 단일 또는 다수 뉴클레오티드 치환, 결실 및/또는 첨가를 포함할 수 있다. 또한, "유사체" 및 "유도체"라는 용어는 3',5'-히드록실라아제의 임의의 기능적 화학 등가물까지 포함하는 의미이며, 상기 핵산 분자는 본 발명에 따른 트랜스게닉 식물을 생산하는 경우 이 트랜스게닉 식물이 하기 특성중 하나 이상의 특성을 나타낼 것을 요구한다.
(i) 3',5'-히드록실라아제-특이성 mRNA의 생성;
(ii) 3',5'-히드록실라아제 단백질의 생성;
(iii) 델피니딘 및/또는 그의 유도체의 단백질의 생성 ; 및/또는
(iv) 변경된 화서.
더 구체적으로 상기 트랜스게닉 식물은 하기 특성중 하나 이상의 특성을 나타낸다:
(i) 비-트랜스게닉 내인성 수준을 상회하는 증가된 수준의 3',5'-히드록실라아제-특이성 mRNA의 형성.
(ii) 3',5'-히드록실라아제 단백질의 증가된 생산성;
(iii) 비-트랜스게닉 내인성 수준을 상회하는 증가된 수준의 델피니딘 및/또는 그의 유도체의 생성; 및/또는
(iv) 변경된 화서.
본 명세서에 사용한 핵산 분자는 단독 또는 벡터 분자, 바람직하게는 발현 벡터와의 조합으로 존재할 수 있다. 상기 벡티 분자는 진핵 세포 및/또는 원핵 세포에서 복제 및/또는 발현된다. 벡터 분자 또는 이의 부분은 식물 게놈 내로 통합할 수 있는 것이 바람직하다. 이외에, 핵산 분자는 상기 통합을 용이하게 하는데 유용한 서열 및/또는 식물 세포 내에서 핵산 분자의 발현을 유도할 수 있는 프로모터 서열을 보유할 수 있다. 상기 핵산 분자 및 프로모터는 전기적 천공법, 미세 발사체 투하(micro-projectile bombardment) 또는 아그로박테리움이 매개하는 트랜스퍼 같은 임의 수단에 의해 세포 내로 도입될 수 있다.
본 발명에 따르면, 3',5'-히드록실라아제를 암호화하는 핵산 분자는 장미, 카네이션 및 국화로 구성되는 군으로부터 선택되는 트랜스게닉 식물 내로 도입되어 발현되므로써, DHK 및/또는 기타 바람직한 기질을 페투니딘, 말비딘 및 특히 델리니딘과 같은 안토시아니딘의 안토시아닌 유도체로 전환시키는 수단을 제공한다. 이들 안토시아닌의 형성은 여러가지 색조의 청색 또는 청색 유사 색상을 나타내는데 기여할 수 있으며, 또는 안토시아닌 형성은 펠라르고니딘, 시아니딘 및 페오니딘 및 그의 유도체에서 델피니딘 및 그의 유도체로 전환케 하므로써 꽃의 색상을 변화시킬 수 있다. 식물에서 상기 핵산의 발현은 구성적이며, 유도 가능하며, 발전적이다. 용어 "변경된 화서"는 화서의 정상적인 변화를 고려하면서 자연 발생적인 꽃비 색상에 비해 그 꽃의 색상에 임의의 변화가 있음을 의미한다. 변경된 화서는 비-트랜스게닉 식물의 색상과는 다른 여러 가지 색조의 청색, 자주색 또는 분홍색을 나타내는 것을 포함한다.
또한, 본 발명은 비-트랜스게닉 내인성 수준을 상회하는 상승된 수준의 델피니딘 및/또는 그의 유도체 생성을 나타내는 트랜스게닉 현화식물을 생산하는 방법을 포함하는데, 상기 방법은 핵산 분자가 실질적으로 발현할 수 있는 조건하에서 3',5'-히드록실라아제를 암호화하는 서열을 암호화하는 핵산 서열을 장미, 카네이션 및 국화로 구성되는 군으로부터 선택한 식물의 세포에 도입하는 단계; 상기 세포로부터 트랜스게닉 식물을 재생하고, 상기 트랜스게닉 식물을 일정 기간 동안 상기 핵산 분자가 3',5'-히드록실라아제 효소로 발현할 수 있는 충분한 조건하에서 성장시키는 단계를 포함한다. 또한, 본 발명은 장미, 카네이션 및 국화로부터 선택되는 트랜스게닉 식물을 형성하는 방법에 관한 것이다. 이때 상기 방법은 트랜스게닉 식물이 동일 종의 비-트랜스게닉 식물에 비해 델피니딘으로부터 유도된 더 높은 수준의 안토시아닌을 형성하는 것을 특징으로 하여 플라보노이드 3',5'-히드록실라아제를 암호화하는 핵산 서열을 함유하는 유전자 구성물을 상기 식물에 도입하는 단계를 포함한다.
바람직한 양태에서, 트랜스게닉 현화식물은 상승된 수준의 델피니딘 형성과 함께 변경된 화서 특성을 나타내며, 변경된 화서는 청색 꽃의 형성 또는 수용체 식물의 생리적 조건에 의존하는 기타 청색의 꽃을 형성함을 포함한다. 임의의 식물 종에서, 평균 꽃잎 액포 pH 보다 높은 pH를 보유하는 변종으로 정의되는 "높은 pH 라인"을 선택하는 것이 바람직하다. 재조합 3',5'-히드록실라아제 또는 이의 트랜스게닉체 및 변이체의 기원은 페튜니아, 버베나, 델피니움, 그레이프, 아이리스, 프리지아, 수국속, 시클라멘, 포테이토, 팬지, 리지안투스, 초롱꽃속 또는 가지를 포함할 수 있다.
결과적으로, 본 발명은 3',5'-히드록실라아제 및/또는 임의의 동족체 또는 이의 관련 형태를 나타내는 핵산 분자 전부 또는 부분을 함유하는 트랜스게닉 장미, 카네이션 또는 국화 식물까지 포함되며, 구체적으로 증가된 3',5'- 히드록실라아제-특이적 mRNA 및/또는 증가된 델피니딘 유도체의 형성 및/또는 변경된 화서 특성을 나타내는 트랜스게닉 식물을 포함한다. 따라서, 트랜스게닉 식물은 3',5'-히드록실라아제를 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는, 안정하게 도입된 핵산 분자를 함유한다. 또한, 본 발명은 상기 트랜스게닉 식물로부터 생성된 식물 후대도 포함하며, 또한 그것을 위한 재생 재료(예를 들어, 씨앗)까지도 포함한다. 특히 착색된 경우 상기 씨앗은 특히 식물을 독점적으로 표시하는 데도 유용할 것이다.
본 발명은 하기 참고적인 비제한적인 도면 및 실시예에 의해 추가로 기술된다.
제1(A)도 및 제1(B)도는 플라보노이드 색소의 생합성 경로의 모식도이다. 경로의 전반부에 관련된 효소는 다음과 같이 표시하였다: PAL=페닐알라닌 암모니아-리아제; C4H=신나메이트 4-히드록실라아제; 4CL=4-쿠마레이트: CoA 리가아제; CHS=칼콘 신타아제; CHI=칼콘 플라보논 이소머라아제; F3H=플라보논 3-히드록실라아제 ; DFR=디히드로플라보놀-4-리덕타아제; UFGT=UDP-글루코오스; 플라보노이드-3-O-글리코실트랜스퍼라아제. 경로의 후반부는 피.하이브리다 꽃에서 발생할 수 있는 전환 반응으로서, 도면상의 숫자가 나타내는 의미는 다음과 같다: 1-시아니딘-3-글루코시드 및 델피니딘-3-글루코시드의 글로코실 잔기에 람노 오즈 당의 첨가; 2=아실화 및 5-O-글루코실화; 3=3'메틸화; 4=5' 메틸화; 5 = 3',5' 메틸화.
제2도는 구성이 실시예 3에서 기술한 바와 같은 이원성 발현 벡터 pCG812의 개략도이다. Gent=젠타마이신 내성 유전자; LB=좌경계; RB=우경계; nptII== 네오마이신 포스포트랜스퍼라아제 II를 위한 발현 카세트: GUS=β-글루쿠로니다아제 암호화 부위, 키메라 유전자 삽입은 실시예 3에 지시 및 기술한 바와 같다. 제한 효소 위치를 표시하였다.
제3도는 구성이 실시예 4에서 기술한 바와 같은 이원성 발현 벡터 pCGP485의 개략도이다. Gent=젠타마이신 내성 유전자: LB=좌경계; RB=우경계: nptII=네오마이신 포스포트랜스퍼라아제 II를 위한 발현 카세트. 키메라 유전자 삽입은 실시예 4에 지시 및 기술한 바와 같다. 제한 효소 위치를 표시하였다.
제4도는 구성이 실시예 5에서 기술한 바와 같은 이원성 발현 벡터 pCGP628의 개략도이다. Gent=젠타마이신 내성 유전자; LB=좌경계; RB=우경계; nptII= 네오마이신 포스포트랜스퍼라아제 II를 위한 발현 카세트; 키메라 유전자 삽압은 실시예 5에 지시 및 기술한 바와 같다. 제한 효소 위치를 표시하였다.
제5도는 구성이 실시예 6에서 기술한 바와 같은 이원성 발현 벡터 pCGP653의 개략도이다. Gent=젠타마이신 내성 유전자; LB=좌경계, RB=우경계; nptII=네오마이신 포스포트랜스퍼라아제 II를 위한 발현 카세트. 키메라 유전자 삽입은 실시예 6에 지시 및 기술한 바와 같다. 제한 효소 위치를 표시하였다.
제6도는 구성이 실시예 7에서 기술한 바와 같은 이원성 발현 벡터 pCGP484의 개략도이다. Gent=젠타마이신 내성 유전자; LB=좌경계: RG=우경계; nptII=네오마이신 포스포트랜스퍼라아제 II를 위한 발현 카세트; 키메라 유전자 삽입은 실시예 7에 지시 및 기술한 바와 같다. 제한 효소 위치를 표시하였다.
제7도는 구성이 실시예 8에서 기술한 바와 같은 이원성 발현 벡터 pCGP1458의 개략도이다. nptI= 네오마이신 포스포트랜스퍼라아제 I 내성 유전자; LB=좌경계; RB=우경계; nptII=네오마이신 포스포트랜스퍼라아제 II를 위한 발현 카세트. 키메라 유전자 삽입은 실시예 8에 지시 및 기술한 바와 같다. 제한 효소 위치를 표시하였다.
제8도는 pCGPE628로 형질 전환된 로얄티(Royalty) 칼루스 조직의 서던 하이브리드화의 방사능 사진이다. 게놈 DNA는 EcoRI으로 분해하고, Hfl cDNA의 720bp의EcoRV 내부 단편으로 검사한다. 음성 대조용(N)은 pCGP293으로 형질전환한 로얄티칼루스 조직이다. 양성 대조용(H)은 Hf1 단편 10pg을 포함한다. 화살표는 형질 전환된 식물에서 기대되는 2kb의EcoRI 단편을 나타낸다.
제9도는 pCGP484로 형질전환된 국화 재배 변종 블루 리지(Blue Ridge) 식물의 서던 하이브리드화의 방사능 사진이다. 게놈 DNA는XbaI으로 분해하여 2.3kb의 Hf1-PLTP 단편이 방출되며, pCGP602로부터 방출된, Hf1 cDNA를 함유하는 1 8kb의FspI/BspHI 단편으로 프로브한다. 음성 대조용(N)은 비-형질 전환된 블루 리지 식물로부터 분리된다. 양성 대조용(P)은XbaI으로 분해한 pCGP485의 플라즈미드 DNA이다. 화살표는 형질 전환된 식물에서 기대되는 2.3kb의 생성물을 나타낸다.
실시예 1
실험 재료
에리오딕티올 및 디히드로퀘르세틴은 칼 로스 케이지(Carl Roth KG)로부터 구입하고, 나린게닌은 시그마에서 구입하였다. 디히드로미리세틴은 미리세틴(프랑스에 소재하는 엑스트라 신세스)으로부터 Vercruysse등(1985)에 의한 방법으로 화학 합성하였다. [3H-나린게닌(5.7Ci/mmole) 및 [3H-디히드로퀘르세틴(12.4Ci/mmole)은 아메르샴으로부터 구입하였다. 모든 효소는 시판되는 것을 구입하였으며, 제조자의 지시에 따라 사용하였다.
하기와 같은 이.콜리 균주를 사용하였다:
DH5asupE44, △(lacZYA-ArgF)U169, φ80lacZ△M15,hsdR17(rk-, mk+),recA1,endA1,gyrA96,thi-1,relA1,deoR.(Hanahan, 1983 및 BRL, 1986)
디스암드(disarmed) 아그로박테리움 투메파시엔스(Agrobacterium tumefaciens) 균주 AGL0(Lazo 등, 1991) 및 LBA4404(Hoekema 등, 1983)은 미합중국 산타 크루즈에 소재하는 캘리포니아 대학 생물학과의 알루드비그박사로부터 얻었다.
암드(armed) 아그로박테리움 투메파시엔스 균주 ICMP8317은 뉴질랜드, 옥클랜드 대학 세포 및 분자 생물학과의 유전 공학 센터의 리차드 가드너 박사로부터 얻었다.
클로닝 벡터 p블루스크립트는 스트라타진으로부터 얻었다.
식물은 특별한 성장실에서 최소 광도 10,000룩스의 낮길이 14 시간 및 22 내지 26℃에서 성장시켰다.
실시예 2
pCGP90의 구성
플라즈미드 pCGP90은 pCGP602(국제 특허 출원 PCT/AU92/00334; 공개 번호 WO 93/01290호)으로부터의 cDNA 삽입물을 pCGP293의 Mac 프로모터 (Comai 등, 1990) 후방의 센스 배향으로 클로닝하므로써 구성하였다.
이원성 발현 벡터 pCGP293은 Ti 이원성 벡터 PCSN1559(McBride 및 Summerfelt, 1990)로부터 유도하였다. 플라즈미드 pCGN1559를KpnI로 분해하고, 돌출하는 3' 말단부를 표준 프로토콜(Sambrook 등, 1989)에 따라 T4 DNA 폴리머라아제로 제거하였다. 그후 상기 벡터를XbaI로 추가 분해하고, 생성되는 5' 돌출부는 DNA 폴리머라아제 I의 클레나우 단편으로 수복하였다. 그후, 상기 벡터를 재 연결하여 pCGP67을 얻었다. Mac 프로모터, mas 종결 서열 및 다양한 클로닝 위치를 함유하는 1.97kb의Pst1 단편(Comai 등, 1990)을 pCGP40으로부터 분리하고, pCGP67의Pst1내로 삽입하여 pCGP293을 제조하였다.
플라즈미드 pCGP40은, pCGNP7334로부터BamHl-SacI 단편으로 GUS 유전자 (Jefferson 등, 1987)를 제거하고, 그것을 다수의 클로닝 위치를 함유하는 pBluescribe M13으로부터의BamHl-SacI 단편으로 대체하여 구성하였다. 플라즈미드 pCGN7334(미합중국, 캘리포니아에 소재하는 칼진, 인코오포레이티드로부터 입수함)는 키메라 Mac-GUS-mas 유전자를 함유하는 단편을 pCNG7329(Comai 등, 1990)의XhoI 위치내로 삽입하므로써 구성하였다.
그후, 상기 cDNA 삽입물을 함유하는BamHI-KpnI 단편을 pCGP602로부터 분리하고, 이를 pCGP293의BamHI/KpnI 단편과 연결하였다. pCGP90내의 삽입물의 정확한 삽입은 젠타마이신 내성 형질 전환제로부터 분리한 DNA의 제한 분석에 의해 이루어졌다.
실시예 3
pCGP812의 구성
pCGP812는 Ti 이원성 벡터 pCGN1558(McBride 및 Summerfelt, 1990)으로부터 유도하였다. 키메라성 mas-35S-GUS-ocs 유전자를 포함하는 5.2kb의XhoI 단편은 pKIWI101(Jannsen 및 Gardner, 1989)로부터 분리하고, p블루스크립트 KS의XhoI 위치 내로 서브클론하여 pCGP82를 얻었다. 그후, 5.2kb 단편을HindIII/KpnI로 분해하여 재 분리하고 pCGN1558의HindIII/KpnI 위치 내로 서브클론하여 pCGP83을 얻었다.
플라즈미드 pCGP83은KpnI로 제한 분해하고, 돌출된 3' 말단부는 표준 프로토콜 (Sambrook 등, 1989)에 따라 T4 DNA 폴리머라아제로 제거하였다. 그후,SamI-BamHI 어댑터를 플러시된 KpnI 위치에 연결하여BamHI "점착성 말단부를 얻었다. pCGP807(하기함)로부터의 키메라 Mac-Hf1-mas 유전자를 함유하는 3.8kb의BglII 단편을 pCGP83의BamHI "점착성" 말단부와 연결하여 pCGP812(제2도)를 얻었다.
플라즈미드 pCGP807은 pCGP602로부터의 상기 Hflc DNA를 함유하는 1.8kb의BamHI-KpnI 단편과 pCGP40의BamHI-KpnI 말단부와 연결하여 구성하였다.
실시예 4
pCGP485의 구성
이원성 벡터 pCGP485는 Ti 이원성 벡터 pCGN1547(McBride 및 Summerfelt, 1990)로부터 얻었다. (i) 금어초의 CHS 유전자로부터의 프로모터 서열; (ii) 페튜니아의 pCGP602로부터의 상기 cDNA 삽입물의 암호화 부위; 및 (iii) 페튜니아 포스포리퍼드 트랜스퍼라아제 단백질(PLTP) 종결 서열로 구성되는 키메라 유전자를 구성하였다. CHS 프로모터는 번역 개시 위치의 1.2kb의 유전자 단편 5'으로 구성된다(Sommer 및 Saedler, 1986). 페튜니아 cDNA 삽입물은 pCGP602 (국제 특허 출원 PCT/AU92/00334; 공개 번호 WO93/01290)의 cDNA 클론으로부터의 1.6kbBclI/FspI 단편으로 구성된다. PLTP 종결 서열은 pCGP13△BaM(Holton, 1992)로부터의 0.7kb의SmaI/XhoI 단편으로 구성되며, PLTP 유전자의 전사된 부위의 150bp의 비번역 부위를 포함한다. 키메라성 CHS/cDNa 삽입물/PLTP 유전자를 pCGN1547의PstI 위치내로 클론하여 pCGP485를 생성하였다.
실시예 5
pCGP 628의 구성
플라즈미드 pCGP176(국제 특허 출원 PCT/AU92/00334; 공개 번호 WO93/01290)는EcoRI 및SpeI로 분해하였다. 분해된 DNA는 표준 프로토콜(Sambrook 등, 1989)에 따라 클레나우 단편으로 충전하여 자체 연결하였다. 이렇게 얻은 플라즈미드를 pCGP627로 명명하였다. 총진GP627의XbaI/KpnI 분해물은 pCGP293의XbaI/KpnI 분해에 의해 얻은 14.5kb 단편과 연결된 1.8kb 단편을 형성하였다. 이렇게 형성한 플라즈미드를 pCGP628로 명명하였다.
실시예 6
pCGP653의 구성
플라즈미드 pCGP293(실시예 2에 기술함)을XbaI으로 분해하고, 생성되는 5'돌출부를 표준 프로토콜(Sambrook 등, 1989)에 따라 클레나우 단편으로 충진하였다. 그후,HindIII로 분해하였다. 상기 과정중에, Mac 프로모터 (Comai 등, 1990)를 결실시켰다. pCGP669(하기함)로부터의 0.8kb 페튜니아 CHS-A 프로모터를 평활 단부EcoRI/HindIII 단편으로 상기 백본에 연결하였다. 이 플라즈미드 생성물을 pCGP672로 명명하였다.
pCGP807(실시예 3에 기술함)의XbaI/Asp718 분해로 Hfl cDNA를 함유하는 1.8kb의 단편을 형성하였으며, 이것은 pCGP672로부터의 16.2kbXbaI/Asp718 단편으로 연결하였다. 이렇게 형성한 플라즈미드를 pCGP653으로 명명하였다.
올리고뉴클레오티드 CHSA-782 및 CHSA+34를 프라이머(하기 서열 참조)로, 페튜니아 하이브리다(petunia hybrida) V30 게놈 DNA를 주형으로 사용하여 CHS-A 유전자의 프로모터 단편을 PCR로 증폭하였다. PCR 생성물을 ddT-꼬리의 p Bluescript(Holton 및 Graham, 1991)내로 클론하고, 유전자 단편의 배향은 제한 효소 지도화로 확인하였다. 이렇게 형성된 플라즈미드를 PCGP669로 명명하였다. 올리고뉴클레오티드 프라이머는 페튜니아 CHS-A 프로모터(koes, 1988) 공지 서열로 구성되었다.
실시예 7
pCGP484의 구성
pCGP484의 구성은 실시예 4에 개략하여 기술한 pCGP485의 절차와 동일 하나, pCGP484는 반대 방향으로 3.5kb의PstI 단편(키메라 유전자 CHS-Hf1-PLTP를 함유함)을 포함하였다.
실시예 8
pCGP1458의 구성
플라즈미드 pCGP1458은 백본으로서 10kb의 이원성 벡터 pBIN19(Bevan, 1984)를 사용하여 구성하였다. 플라즈미드 pBIN19를EcoRI으로 분해하고, 생성되는 5'돌출부는 표준 프로토콜(Sambrook 등, 1989)에 따라 클레나우 단편을 사용하여 충천하였다. 플라즈미드 pCGP485는PstI으로 분해하여 3.5kb 단편인 키메라 CHS/cDNA 삽입물/PLTP 유전자를 제거하였다.PstI 분해로 생성된 3'-돌출부를 T4 DNA 폴리머라아제로 제거한 후, 이를 플라즈미드 pBIN19의EcoRI 위치에서 충전된 것에 연결하였다.
실시예 9
이.콜리 및 에이.투메파시엔스의 형질전환
벡터 pCGP812, pCGP90, pCGP485, pCGP628, pCGP653, pCGP484 또는 pCGP1458 중 하나 또는 다른 것으로 이.콜리 균주 DH5a-세포의 형질 전환시키는 것은 표준 과정(Sambrook 등, 1989) 또는 Inoue 등(1990)의 과정에 따라 수행하였다.
MG/L(Garfinkel 및 Nester, 1980) 배양물 50mL를 접종하고, 28℃에서 진탕하면서 16 시간 동안 성장시켜 제조한 경쟁력 있는 아그로박테리움 투메파시엔스 세포 100μL에 플라즈미드 DNA 5μg을 첨가하므로써 플라즈미드 pCGP812, pCGP90, pCGP485, pCGP628, pCGP653, pCGP484 또는 pCGP1458을 적합한 아그로박테리움 투메파시엔스 균주내로 도입하였다. 그후, 상기 세포를 펠릿화하고, 85%(v/v) 100mM CaCl2/15%(v/v) 글리세롤 0.5mL에 재현탁시켰다. DNA-아그로박테리움 혼합물을 액체 질소에서 2분 동안 배양하므로써 동결시킨후, 37℃에서 5분 동안 배양하여 해동시켰다. 그후, DNA/박테리아 혼합물을 얼음위에 10를 더 부었다. 그후, 상기 세포를 MG/L, 배지 1 mL와 혼합하고, 28℃에서 16 시간동안 진탕하면서 배양하였다.pCGP812, pCGP90, pCGP485, pCGP628, pCGP653 또는 pCGP484 중 하나를 보유하는 에이. 투메파시엔스 세포를 젠타마이신 100 μg/mL을 함유하는 MG/L 한천 평판상에서 선택하였다. pCGP1458을 보유하는 에이. 투메파시엔스 세포를 카나마이신 100 μg/mL를 함유하는 MG/L 한천 평판상에서 선택하였다. 상기 플라즈미드의 존재는 젠타마이신-내성 형질전환체로부터 분리한 DNA의 서던 분석으로 확인하였다.
실시예 10
디안투스 카리오프빌루스(Dianthus caryopbyllus)의 형질전환
a. 식물재료
디안투스 카리오프빌루스(즉, 크롤리 심, 레드 심, 라구나)의 자른가지(cuttings)를 오스트레일리아, 빅토리아에 소재하는 반 윅 앤드 산 플라워 서플라이로부터 입수하였다. 외엽은 제거하고, 자른가지를 70%(v/v) 에탄올에서 간단히 멸균한후, 1.25%(w/v) 나트륨히포클로라이트(트윈 20과 함께)로 6분 동안 멸균하고, 멸균수로 3 회 세정하였다. 보이는 모든 잎과 엽액 싹은 동시 재배하기 전에 이분 현미경하에서 제거하였다
b. 아그로박테리움 및 디안투스 조직의 동시 재배
이원성 벡터 pCGP90, pCGP812, pCGP485 또는 pCGP653 중 임의의 하나를 포함하는 아그로박테리움 투메파시엔스 균주 ACL0 (laso등, 1991)을 젠타마이신 100 mg/L를 보유하는 MG/L(Garfinkel 및 Nester, 1980) 한천 평판상에서 4℃로 유지하였다. 단일 콜로니를 액체 MG/L 브로스내에서 밤새 성장시키고, 접종전 익일에 5 X108세포/mL로 희석하였다. 디안투스 조직은 3% 수크로오즈(w/v), 5 mg/L의 α-나프탈렌아세트산 (NAA), 20 μm 아세토시릴온 및 0.8% 디프코 박토 한천(pH 5.7)이 보충된 무라쉬그 앤드 스쿡(1962) 배지(MS)상에서 아그로박테리움과 동시 배양되었다.
c. 트랜스게닉 디안투스 식물의 회수
동시 재배한 조직을 1 mg/L의 벤질아미노푸린(BAP), 0.1 mg/L의 NAA, 150 mg/L의 카나마이신, 500 mg/L의 티카실린 및 0.8% 디프코 박토 한천으로 보충된 MS 배지(선택 배지)에 이전하였다. 3 주후, 외식편을 신선한 선택배지에 이전하고, 이 단계에서 가지 외식편으로부터 엽액의 신생 가지(shoot)를 조심스럽게 제거하였다. 6-8주후, 선택 배지상에서 건강한 우생의 신생 가지를 3% 수크로오즈, 150 mg/L의 카나마이신, 500 mg/L의 트리카실린, 0.8%의 디프코 박토 한천을 함유하며 호르몬을 보유하지 않은 MS 배지로 이전하였다. 이 단계에서, GUS 조직화학 분석(Jefferson 1987) 및/또는 NPT II 도트-블로트 분석(McDonneII 등, 1987)을 사용하여 트랜스게닉 신생 가지를 동정하였다. 트랜스 게닉 신생 가지는 3% 수크로오즈, 500 mg/L의 티카실린 및 0.4%(w/v) 겔라이트 겔란 검(슈베이제르홀)으로 보충된 MS 배지에 뿌리 유도를 위해 이전하였다. 모든 배양물은 23 ±2℃에서 16 시간의 광주기(120 μE 백색 형광등) 하에서 유지하였다. 식물이 뿌리를 내리고, 4-6 cm로 자란 경우, 수분이 있는 새로운 환경에 적응하도록 하였다. 수경 재배용 혼합물(Kandreck 및 Black, 1984)내에 흡수된 고 비율(75% 또는 그 이상)의 펄라이트를함유하는 혼합물을 새로운 환경에 적응하는데 사용하는데, 이 과정은 일반적으로 4-5 주 동안 계속되었다. 식물을 23℃, 14 시간의 광주기(200 μE 할로겐화 수은등)하에서 새로운 환경에 적응토록 하였다.
실시예 11
로사 하이브리다(Rosa hybrida)의 형질전환
1. 로사 하이브리다 즉, 로얄티
장미 재배종 로얄티의 식물 조직을 PCT 91/04412(WO 92/00371)에 개시된 방법에 따라 형질전환하였다.
2. 로사 하이브리다 즉, 카디날
a. 식물재료
카디날 신생 가지는 오스트레일리아, 빅토리아에 소재하는 반 윅 앤드 산 플라워 서플라이로부터 얻었다. 외엽은 제거하고, 남아있는 신생 가지 (5-6cm)를 1.25%(w/v)나트륨 히포클로라이트(트윈 20과 함께)내에서 5분 동안 멸균한 후, 멸균수로 3회 세정하였다. 분리한 신생 가지 끝을 멸균수에 1 시간동안 담그고, 동시 배양전에 3% 수크로오즈, 0.1 mg/L의 EAP, 0.1 mg/L의 키네틴, 0.2 mg/L의 지베렐린산, 0.5%(w/v)폴리비닐피롤리돈 및 0.25% 겔라이트 겔란 검을 함유하는 MS 배지상에서 2 일동안 예비배양 하였다.
b. 아그로박테지움 및 로사 신생 가지 조직의 동시 재배
이원성 벡터 pCGP812를 포함하는 아그로박테리움 균주 ICMP8317(Janssen 및 Gardner, 1989) 및 ACL0를 100 mg/L의 젠타마이신을 함유하는 MG/L 한천 평판상에서 4℃로 유지하였다. 각각의 아그로박테리움 균주로부터의 단일 콜로니를 액체 MG/L 브로스내에서 밤새 성장시켰다. 최종 농도 5 x 108세포/mL는 액체 MG/L 중에서 희석에 의해 다음날 제조하였다. 접종전에, 2 개의 아그로박테리움 배양물을 10:1의 비로 혼합하였다(AGLD/pCGP812 : 8317/pCGP812). 신생 가지 끝을 세로 방향으로 절단하고, 혼합된 아그로박테리움 배양물 분액 2 μl를 신생 가지 끝에 적가 하였다. 신생 가지 끝을 전배양에 사용된 것과 동일한 배지상에서 5 일동안 동시 재배 하였다.
이원성 벡터 pCGP1458을 함유하는 아그로박테리움 투메파시엔스 균주 ASL0를 카나마이신 100 mg/L를 보유하는 MG/L 한천 평판상에서 4℃로 유지하였다. 각각의 아그로박테리움 균주로부터의 단일 콜로니를 액체 MG/L 브로스 내에서 밤새 성장시켰다. 최종 농도 5 ×108세포/mL는 액체 MG/L 증에서 희석에 의해 다음날 제조하였다.
c. 트랜스게닉 로사 식물의 회수
동시 재배후, 신생 가지 끝을 선택 배지에 이전하였다. 신생 가지 끝은 매 3-4 주일마다 새로운 선택 배지에 이전하였다. 신생 가지 끝에서 관찰된 벗겨진 부분은 직경이 6-8 mm 가 되는 경우 절단하였다. 분리한 벗겨진 부분은 3% 수크로오즈, 25 mg/L의 카나마이신, 250 mg/L의 세포탁심 및 0.25% 겔라이트 겔란 검을 포함하는 MS 배지에 신생 가지 형성을 위해 이전하였다. 벗겨진 부분의 조직으로부터 재생된 신생 가지를 분리하고 선택 배지로 이전하였다. GUS 조직화학 분석 및 유합조직 분석을 사용하여 형질질환 신생 가지를 확인하였다. 3% 수크로오즈, 200 mg/L의 세포탁심 및 0.25%의 겔라이트 겔란 검을 함유하는 MS 배지내로 뿌리 유도를 위해 트랜스게닉 신생 가지는 이전하였다. 모든 배양물은 23 ± 2℃, 16 시간의 광주기(60 μE 백색 형광등)하에서 유지하였다. 뿌리 체계가 잘 발달하고, 신생 가지의 길이가 5-7 cm 가 되는 경우, 트랜스게닉 장미 식물은 8 cm 튜브 내의 멸균한 데브코 514110/2 보존용 혼합물에 이전하였다. 2-3 주후, 식물을 동일한 보존용 혼합물을 이용하는 15 cm의 화분에 다시 심고, 14 시간의 광주기 (300 μE 할로겐화 수은등)하에 23℃ 온도에서 유지하였다. 1-2 주후, 화분에 심은 식물을 온실(낮/밤 온도 : 25-28/14)로 이전하고, 화서시까지 성장시켰다.
실시예 12
크리산티멈 모리폴리움(Chrysanthemum morifolium)의 형질전환
a. 식물 재료
크리산티멈 모리폴리움(재배변종 블루리지, 페닌 코러스)의 자른 가지를 오스트레일리아, 빅토리아에 소재하는 에프 앤드 아이 바굴리 플라워 번트 플랜트 그로웨스로부터 입수하였다. 자른 가지로부터 잎을 제거한후, 70% (v/v) 에탄올에 이어서 1.25%(w/v) 나트륨 히포클로라이트(트윈 20과 함께)로 3분 동안 간단히 멸균하고, 멸균수로 3 회 세정하였다. 절간 스템 부위를 사용하여 동시 재배하였다.
b. 아그로박테리움과 크리산티엄 조직의 동시 재배
이원성 벡터 pCGP90, pCGP484, pCGP485 또는 pCGP628 중 어느 하나를 함유하는 아그로박테리움 투메파시엔스 균주 LBA4404(Hoekema 등, 1983) 50 mg/L의 리파마이신 및 10 mg/L의 젠타마이신을 함유하는 MG/L 한천 평판상에서 성장시켰다. 각각의 아그로박테리움으로부터의 단일 콜로니를 동일한 액체 배지내에서 밤새 성장시켰다. 이들 액체 배지는 글리세롤을 사용하여 10%로 하고, 분획량 1 mL를 냉동기(-80℃)에 이전하였다. 각각의 냉동된 아그로박테리움 분획량 100-200 μl를 50 mg/L의 리파마이신 및 10 mg/L의 젠타마이신을 함유하는 액체 MG/L 내에서 밤새 성장시켰다. 최종 농도 5 x 108세포/mL를 3%(w/v) 수크로오즈를 함유하는 액체 MS 내에서 희석하여 익일 제조하였다. 스템 부위를 LBA4404/pCGP90, LBA4404/pCGP484, LBA4404/pCGP485 또는 LBA4404/pCGP628 중 어느 하나를 함유하는 아그로박테리움과 함께 동시 재배 배지상에서 4 일동안 동시 재배하였다.
c. 트랜스게닉 크리산티멈 식물의 회수
동시 재배후, 스템 부위를 선택 배지로 이전하였다. 3-4 주후, 재생하는 외식편을 신선한 배지로 이전하였다. 카나마이신 선택에서 살아남은 우생의 신생 가지를 분리하고 신생 가지 신장과 뿌리 유도를 위해 카나마이신 및 세포탁심을 함유하는 MS 배지로 옮겼다. 모든 배양물은 23 ±2℃에서 16 시간의 광주기 (80 μE 백색형광등)하에 유지하였다. 잎생들을 카나마이신 상에서 뿌리를 내린 식물로부터 채집하고, 서던 블로트 분석을 이용하여 트랜스게닉 식물을 확인하였다. 트랜스게닉 국화 식물의 길이가 4-5 cm에 이른 경우, 그들을 8 cm 튜브내의 멸균한 데브코 51410/2 보존용 혼합물에 옮겼다. 2 주후, 식물을 동일한 보존용 혼합물을 이용하여 15 cm 화분에 다시 심고, 23℃ 및 14 시간의 광주기(300 μE 할로겐화 수은등)하에서 유지하였다. 2 주후, 화분에 심은 식물을 온실(낮/밤 온도 : 25-28℃/14℃)에 이전하고, 화서할때까지 성장시켰다.
실시예 13
서던 분석
a. 디안투스로부터 게놈 DNA의 분리
DNA를 Dellaporta 등(1983)에 의해 실질적으로 기술된 바와 같은 조직으로부터 분리하였다. DNA 제조물은 CsCl 부유 밀도 원심분리에 의해 추가 정제하였다(Sambrook 등, 1989).
b. 크리산티멈으로부터 게놈 DNA의 분리
DNA는 4.5 M 구아니디늄 티오시아네이트, 50 mH EDTA(pH 8.0), 25mM 나트륨 시트레이트(pH 7.0), 0.1 M 2-메르캅토에탄올, 2%(v/v)라우릴 사르코신을 포함하는 추출 완충액을 이용하여 잎 조직으로부터 분리하였다. 식물 조직은 액체 질소내에서 미개분말로 분쇄한후, 추출 완충액을 첨가(5 mL/g 조직)하고, 상기 용액을 회전 휠상에서 16 시간동안 혼합하였다. 그후, 혼합물을 페놀 : 클로로포름 : 이소아밀알콜(50 : 49 : 1)을 이용하여 2 회 추출하고, 3 부피의 에탄올을 첨가하여 게놈 DNA를 침전시키고 10,000 rpm에서 15분 동안 원심분리하였다.
c. 로사로부터 게놈 DNA의 분리
액체 질소 존재하에서 막자사발과 공이를 사용하여 조직을 분쇄하고, 65℃에서 가열한 추출 완충액 1 ml(0.14 M 소르비톨, 0.22 M, 트리스-HCl[pH 8.0], 0.22 M EDTA, 0.8 M NaCl, 0.8%(w/v) CTAB, 1% N-라우릴사르코신)를 첨가하여 DNA 추출하고, 이후 클로로포름(200 μl)을 첨가하고, 상기 혼합물을 65℃에서 15분 동안 배양하였다. 원심분리후, 상청액을 페놀-클로로포름으로 추출하고, 등부피의 이소프로판올을 첨가하여 혼합물을 제조하였다. 상기 혼합물을 원심분리하고, 펠렛을 95% 에탄올로 세척한후, 다시 원심분리하고, 70% 에탄올로 세척하였다. 펠렛을 진공 건조하고 30 μl의 TE 완충액(pH 8.0)에 재현탁시켰다.
d. 서던 블로트
게놈 DNA(10 μg)을 16 시간동안 60 유니트의EcoRI으로 분해하고, TAE 시험 완충액(40 mH 트리스-아세테이트, 50 mH EDTA)의 0.7%(w/v) 아가로오즈겔을 통해 전기영동하였다. 그후, 변성용액(1.5 M NaCl/0.5 NaOH)내에서 1 내지 1.5 시간동안 DNA를 변성키시고, 0.5 M 트리스-HCl(pH 7.5)/1.5 M NaCl 내에서 2 내지 3 시간동안 중화한후, DNA를 20 x SSC 내의 하이본드 N(아메르샴) 필터에 이전하였다.
카나마이신에 대한 선택후 얻은 추정 트랜스게닉 디안투스, 로사 및 크리산티멈 식물의 서던 분석은 적합한 키메라 유전자가 게놈내로 통합되었음을 확인시켜 주었다.
실시예 14
노던 분석
a. 디안투스 및 크리산티멈 RNA
전체 RNA를 액체 질소내에서 냉동된 조직으로부터 분리하고, 막자 사발 및 공이를 이용하여 미세 분말로 분쇄하였다. 4 M 구아니디늄 이소티오시아네이트, 50 mM 트리스-HCl(pH 8.0), 20 mM EDTA, 0.1%(v/v) 사코실로 제조한 추출 완충액을 조직에 첨가하고, 상기 혼합물을 최고 속도의 폴리트론을 이용하여 1분 동안 균질화하였다. 미라클로스 (칼바이오켐)를 통해 상기 현탁액을 여과하고, 10,000 rpm에서 10분 동안 JA20 로터를 이용하여 원심분리 하였다. 상청액을 수거하고, 0.2 g/mL의 CsCl(w/v)로 제조하였다. 그후, 샘플을 [3.85 mL의 신속하게 밀봉되는 원심분리 튜브내의] 5.7 M CsCl, 50 mM EDTA(pH 7.0)으로 제조한 쿠션 10 mL 위에 위치시키고, Ti-70 로터를 이용하여 23℃에서 12-16 시간동안 42,000 rpm에서 원심분리하였다. 펠렛을 TE/SDS(10 mM 트리스-HCl (pH 7.5), 1 mM EDTA, 0.1%(w/v) SDS)내에 재현탁시키고, 10 mM EDTA(pH 7.5)내에 포화된 페놀 : 클로로포름 : 이소아밀 알콜(25 : 24 : 1)로 추출하였다. 에탄올 침전후, RNA 펠렛을 TS/SDS 내에 재현탁시켰다.
RNA 샘플을 40 mM 모르폴리노프로판술폰산(pH 7.0), 5 mM 아세트산 나트륨, 0.1 mM EDTA(pH 8.0)을 함유하는 시청 완충액을 이용하여 2.2 M 포름알데히드/1.2%(w/v) 아가로즈 겔을 통해 전기영동하였다. RNA를 제조자의 지시에 따라 하이본드-N 필터에 이전하고,32P-표지된 cDNA 단편(108cmp/μg, 2 X 106cpm/mL)으로 검사하였다. 예비하이브리드화(42℃에서 1 시간) 및 하이브리드화(42℃에서 16 시간)을 50%(v/v)포름아미드, 1 M NaCl, 1%(w/v) SDS, 10%(w/v) 덱스트란 술페이트 내에서 수행하였다. 분해된 연어 정자 DNA (100 μg/mL)를 하이브리드화 단계를 위한32P-표지된 프로브와 함께 첨가하였다.
필터는 2 x SSC/ 1%(w/v)SDS 내에서 1 내지 2 시간동안 65℃에서 세척한후, 0.2 x SSC/1%(w/v)SDS 내에서 0.5 내지 1 시간동안 65℃에서 다시 세척하였다. 필터를 KODAK XAR필름에 증감 스크린을 사용하여 -70℃에서 48시간동안 노광시켰다.
플라즈미드 pCGP90으로 형질전환된 디안투스 재배 변종 레드 심을 노던 분석하면 13 개의 식물중 8 개가 양성임을 나타냈다.
b. 로사 RNA
전체 RNA를 꽃잎(수확 5 일후의 싹 및 꽃)으로부터 Manning (1991)의 방법에 따라 추출하였다.
실시예 15
DNA 프로브의 32 P-표지화
DNA 단편(50 내지 100 ng)은 올리고 표지화 키트(브레사테크)로 50 μCi 의 [α-32P]-dCTP를 이용하여 방사능 표지하였다. 혼입되지 않은 [α-32P]-dCTP는 세파텍스 G-50(가는) 컬럼상에서 크로마토그래피로 제거하였다.
실시예 16
안토시아니딘 분석
HPLC 분석전에 꽃잎 추출물 내에 존재하는 안토시아닌 분자는 산 가수 분해하여 안토시아딘 중심으로부터 글리코실 부분을 제거하였다. 안토시아니딘 색소의 B-환에 대한 히드록실화 패턴은 안토시아니딘 중심 분자의 HPLC 분석으로 결정하였다. 본 분석은 다중파장 검출기(MWD)가 장착된 휴렛-팩커드 1050 HPLC 시스템을 이용하여 수행하였다. 역상 크로마토그래피 분리는 스페리소브 S5ODS2 카트리지 컬럼, 250 mm x 4 mm ID 상에서 수행하였다.
a. 안토시아닌 및 플라보노이드의 추출
꽃 색소는 꽃잎 절편(약 50 mg)으로부터 1%(v/v) 6 M 수성 염화수소산을 함유하는 메탄올 5 ml를 이용하여 추출하였다. 추출물은 물로 희석(1 : 9) 하고, HPLC 시스템내로 주입하기 전에 여과하였다(밀렉스 HV, 0.45 μ).
b. 안토시아닌의 가수분해
상기 a에서 얻은 조 메탄올 추출물(100 μL)을 실온에서 건조 질소 스트림을 이용하는 피어스 리엑티-용기내에서 증발 및 건조시켰다. 잔류물을 2 M HCl 200 μL 내에 용해시키고, 용기의 뚜껑을 닫은후 100℃에서 30분 동안 가열하였다. 가수분해 혼합물을 물로 희석(1 : 9)하고, HPLC 분석 전에 여과하였다(밀렉스 HV, 0.45 μ).
c. 크로마토그래피
꽃 색소의 분리는 하기 시스템을 이용하는 구배 용출에 의해 수행하였다:
용매 A : (트리에틸아민 : 진한 H3PO4: H2O) (3 : 2.5 : 1000)
용매 B : 아세토니트릴
구배 조건 : 20분에 걸쳐서 5% B 내지 40% B
유속 : 1 ml/분
온도 : 35℃
검출 : 280, 350 및 564 nm에서 동시 자료 획득에 의한 MWD.
안토시아니딘 피크는 공지된 표준물을 참고로하여 확인하였다. 꽃잎 추출물내에 존재하는 안토시아닌 분자의 분석을 위한 대체 방법은 문헌 [참조 : Brugliera 등(1994)]에 기술되어 있다.
HPLC 분석을 수행하여 플라즈미드 pCGP90, pCGP485, pCGP484, pCGP628, pCGP653 또는 PCGP1458 중 하나에 의해 형질전환된 카네이션, 국화 및 장미의 샘플 내에서 델피니딘, 펠라고니딘 및 시아니딘의 존재를 확인하였다. 트랜스게닉 카네이션 꽃 내의 pCGP90, pCGP485 및 pCGP653의 대표적인 자료는 표 1에 기록하였다.
실시예 17
3',5'-히드록실라아제 활성 분석을 위한 식물 추출물의 제조
식물조직을 10 배 부피의 빙-냉 추출 완충액(100 mMe 인산염 완충용액(pH 7.5), 1 mM EDTA, 0.25 M 수크로오즈, 0.25 M 만니톨, 0.1%(w/v)BSA, 0.1 mg/mL PMSF, 20 mM 2-메르캅토에탄올 및 10 mg/mL 폴리카르 AT)내에서 균질화하였다. 균질물은 JA20 로터(베크만)를 이용하여 13,000 rpm으로 4℃애서 10분 동안 원심분리하고, 상청액의 분액을 3',5'-히드록실라아제 활성에 대해 분석하였다.
3',5'-히드록실라아제 분석
3',5'-히드록실라아제 효소 활성은 Stotz 및 Forkmann에 의해 기술된 방법의 변형법(1982)을 이용하여 측정하였다. 분석 반응 혼합물은 일반적으로 최종부피 200 μL 중에 분석 완충액(100 mM 인산염 완충용액(pH 8.0), 1 mM EDTA 및 20 mM 2-메르캅토에탄올) 중의 식물 추출물 195 μL, 50 mM NADPH 5 μL 및 105rpm[14C] 나린게닌을 포함하였다. 23℃에서 밤새 배양한후, 반응 혼합물을 에틸아세테이트 0.5 mL를 이용하여 2 회 추출하였다. 에틸아세테이트상을 진공하에 건조한후, 에틸 아세테이트 10 μL에 재현탁시켰다. 그후, 방사능 표지된 플라보노이드 분자는 셀룰로오즈 박층 평판(메륵아트 5577, 독일연방공화국) 상에서 클로로포름 : 아세트산 : 물(10 : 9 : 1, v/v) 용매 시스템을 이용하여 분리하였다. 크로마토그래피 완료시, TLC 평판은 공기 건조하고, 반응 생성물은 방사능 사진법으로 국재화(localized)한 뒤 비-방사능 나린게닌, 에리오딕티올, 디히드로퀘르세틴 및 디히드로미리세틴 표준물과 비교하이 확인하였다. 이 표준물은 반응 생성물 옆에 위치하며 UV 광 하에 가시화할 수 있는 물질이다.
실시예 18
여러가지 품종의 형질전환
구성물 pCGP90, pCGP812, pCGP628, pCGP485, pCGP653, pCGP484 또는 pCGP1458 중 임의의 한 구성물 내에 포함된 키메라성 유전자는 실시예 10, 11 및 12에 기술한 바와 같이 아그로박테리움-중재된 유전자 전이를 이용하여 여러가지 장미, 카네이션 및 국화 식물내로 도입하였다. 식물 게놈내로 적합한 키메라성 유전자의 통합은 카나마이신 선택후 얻은 식물의 서던 분석으로 확인하였으며, HPLC 분석을 이용하여 상기 실시예 16에 기술한 바와 같이 안토시아닌의 존재를 검출하였다.
성공적으로 트랜스게닉이 이루어졌으며 본 발명에 따라 트랜스게닉 유전자를 발현할 수 있는 식물은 3',5'-히드록실라아제 활성하에 필요한 유전자를 함유하지 않은 비-트랜스게닉 대조군과 비교시, 상담한 수준의 3',5'- 히드록실라아제 효소 활성이외에 3',5'-히드록실화된 안토시아닌(참조 : 실시예 16)을 지녔다.
실시예 19
카네이션 재배 변종 크롤리 심 + pCGP90
실시예 10에 기술한 바와 같이 아그로박테리움-중재의 유전자 전이를 이용하여 플라즈미드 pCGP90을 카네이션 품종 크롤리 심내에 도입하였다. 식물 게놈내의 구성물의 통합은 카나마이신 선별후 얻은 식물의 서던 분석으로 확인하였다. 9 개의 식물을nptII 및 Hf1 유전자의 존재 및 델피니딘 형성에 대해 조사하였다. 분석한 9 개중 8 개의 식물은nptII 및 Hf1 둘다에 대해 양성이었으나 HPLC 분석으로는이들 식물에 의한 델피니딘 형성의 어떤 증거도 검출할 수 없었다(참조 : 표 2 ; "Kan"=카나마이신).
실시예 20
카네이션 재배 변종 라구나 + pCGP485
실시예 10에 기술한 바와 같이 아그로박테리움-중재의 유전자 전이를 이용하여 플라즈미드 pCGP485를 카네이션 재배 CV. 라구나 내에 도입하였다. 상기 실시예 16에 기술된 절차에 따라 꽃잎 추출물 내에 존재하는 안토시아닌 분자의 HPLC 분석을 수행하며 3',5'-히드록실화된 안토시아닌 유도체의 존재를 확인하였다. 이들 3',5'-히드록실화된 안토시아닌은 이원성 벡터 pCGP485를 사용하는 형질전환에 의해 도입된 외인성 DNA 서열, 즉Hf1cDNA 서열의 발현의 결과로서만 형성되었다.
실시예 21
장미 재배 변종 로얄티 + pCGP485/pCGP628
실시예 11에 언급한 바와 같이 아그로박테리움-중재된 유전자 전이를 이용하여 장미 변종 로얄티 내로 플라즈미드 pCGP485 및 pCGP628을 도입하였다. 식물 게놈내에 구성물이 통합되었는지는 카나마이신 선택후 얻은 식물의 서던 분석으로 확인하였다. 상기 실시예 16에 기술된 절차에 따라 꽃잎 추출물 내에 존재하는 안토시아닌 분자의 HPLC 분석을 재수행하여 3',5'-히드록실화된 안토시아닌의 존재를 확인하였다. 이들 3',5'-히드록실화된 안토시아닌은 이원성 벡터 pCGP485 또는 pCGP628 중 어느 하나를 이용하는 형질전환에 의해 도입된 외인성 DNA 서열, 즉Hf1cDNA 서열의 발현의 결과로서만 생성된 것이다.
실시예 22
장미 재배 변종 카디날 + pCGP1458
실시예 11에 기술한 바와 같이 아그로박테리움-중재의 유전자 전이를 이용하여 장미 재배 변종 카디날 내로 플라즈미드 pCGP1458을 도입하였다. 식물 게놈내의 구성물의 통합은 카나마이신 선택후 얻은 식물의 서던 분석으로 확인하였다. 상기 실시예 16에 기술한 절차에 따라 꽃잎 추출물 내에 존재하는 안토시아닌 분자의 HPLC 분석을 재수행하여 3',5'-히드록실화된 안토시아닌은 이원성 벡터 pCGP1458을 이용하는 형질전환에 의해 도입된 외인성 DNA 서열, 즉Hf1cDNA 서열의 발현의 결과로서만 얻어짐을 확인하였다.
실시예 23
국화 재배 변종 블루리지 + pCGP484/pCGP485/pCGP628
실시예 12에 기술한 바와 같이 아그로박테리움-중재의 유전자 전이를 이용선, 수탁번호 3655의 경우, 꽃잎에 대한 명백한 청분 효과가 관찰되었다. 레드 심카네이션 재배 변종의 정상적인 오렌지색-적색(왕립 원예 위원회 색상 차트의 약 45A/B에 상응함)은 청색/자주색으로 변화하였다.
본원에서 사용된 트랜스게닉 식물은 조직배양에 의한 클노날번식법 또는 뿌리내린 식물에서 취한 꺽꽃이 법으로 무성 번식된다.
당업자에게 본 명세서에서 기술한 본 발명의 적합한 변경 및 변형 실시가 가능할 것이다. 본 발명은 상기 모든 변경 및 변형을 포함하는 것으로 이해해야 한다. 또한, 본 발명은 본 명세서에서 개별적으로 또는 집합적으로 언급 또는 나타낸 단계, 특징, 조성물 및 화합물 모두를 포함하며, 상기 단계 또는 특징의 임의의 두개 이상의 조합도 포함한다.

Claims (32)

  1. 플라보노이드 3',5'-히드록실라아제를 암호화하는 유전자에 연결된 칼콘선타아제(CHS) 프로모터를 포함하는 유전자 구성물을 지니며, 동일 종의 비-트랜스게닉 식물에 비해 델피니딘으로부터 유래된 더 높은 수준의 안토시아닌을 생성하고, 뿌리내린 식물로부터 취한 꺽꽃이 또는 조직배양을 사용한 클로날 번식에 의해 무성 번식 되는, 장미, 카네이션 및 국화로부터 선텍된 트랜스게닉(transgenic) 식물 또는 그의 후대 또는 이의 화서부.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 플라보노이드 3',5'-히드록실라아제의 기원이 페튜니아, 버베나, 델피니움, 그레이프, 아이리스, 프리지아, 수국속, 시클라멘, 포테이토, 팬지, 가지나무, 리지안투스 또는 초롱꽃속인 트랜스게닉 식물.
  3. 제2항에 있어서,
    상기 플라보노이드 3',5'-히드록실라아제의 기원이 페튜니아인 트랜스게닉 식물.
  4. 제2항에 있어서,
    상기 플라보노이드 3',5'-히드록실라아제의 기원이 리지안투스인 트랜스게닉식물.
  5. 제1항 내지 제4항중 어느한 항에 있어서,
    상기 유전 구성물이 pCGP484, pCGP485, pCGP653 및 pCGP1458로부터 선택되는 플라즈미드 내에 함유되어 있는 트랜스게닉 식물.
  6. 제3항 또는 제4항에 있어서,
    상기 식물이 장미인 트랜스게닉 식물.
  7. 제3항 또는 제4항에있어서,
    상기 식물이 카네이션인 트랜스게닉 식물.
  8. 제3항 또는 제4항에 있어서,
    상기 식물이 국화인 트랜스게닉 식물.
  9. 제1항에 있어서,
    변경된 화서를 나타내는 것인 트랜스게닉 식물.
  10. 제6항에 있어서,
    변경된 화서를 나타내는 트랜스게닉 식물.
  11. 제7항에 있어서,
    변경된 화서를 나타내는 트랜스게닉 식물.
  12. 제8항에 있어서,
    변경된 화서를 나타내는 트랜스게닉 식물.
  13. 플라보노이드 3',5'-히드록실라아제를 암호화하는 핵산 서열에 열결된 칼콘 신타아제(CHS) 프로모터를 포함하는 유전자 구성물을 장미, 카네이션 및 국화로부터 선택되는 트랜스게닉 식물 내로 도입하는 단계를 포함하는 트랜스게닉 식물의 제조방법으로서, 상기 식물이 동일 종의 비-트랜스게닉 식물에 비해 델피니딘으로부터 유도된 더 높은 수준의 안토시아닌의 안토시아니딘 유도체를 생성함을 특징으로 하는 트랜스게닉 식물의 제조 방법.
  14. 제13항에 있어서,
    상기 플라보노이드 3',5'-히드록실라아제의 기원이 페튜니아, 버베나, 델피니움, 그레이프, 아이리스, 프리지아, 수국속, 시클라멘, 포테이토, 팬지, 가지나무, 리지안투스 또는 초롱꽃속인 방법.
  15. 제14항에 있어서,
    상기 플라보노이드 3',5'-히드록실라아제의 기원이 페튜니아인 방법.
  16. 제14항에 있어서,
    상기 폴라보노이드 3',5'-히드록실라아제의 기원이 리지안투스인 방법.
  17. 제14항에 있어서,
    상기 유전자 구성물이 pCGP484, pCGP485, pCGP653 및 pCGP1458로 부터 선택되는 플라즈미드 내에 함유되어 있는 것인 방법.
  18. 제15항, 제16항 또는 제17항에 있어서,
    상기 식물이 장미인 방법.
  19. 제15항, 제16항 또는 제17항에 있어서,
    상기 식물이 카네이션인 방법.
  20. 제15항, 제16항 또는 제17항에 있어서,
    상기 식물이 국화인 방법.
  21. 제13항에 있어서,
    상기 트랜스게닉 식물이 변경된 화서를 나타내는 방법.
  22. 제18항에 있어서,
    상기 트랜스게닉 식물이 변경된 화서를 나타내는 방법.
  23. 제19항에 있어서,
    상기 트랜스게닉 식물이 변경된 화서를 나타내는 방법.
  24. 제20항에 있어서,
    상기 트랜스게닉 식물이 변경된 화서를 나타내는 방법.
  25. 제1항의 트랜스게닉 식물을 생성하기 위해 식물 게놈내로 통합될 수 있는 칼콘 신타아제(CHS) 프로모터 함유의 유전자 구성물을 포함하는 이원성 벡터.
  26. 제25항에 있어서,
    상기 유전자 구성물이 키메라 유전자 구성물인 이원성 벡터.
  27. 제5항에 있어서, 상기 식물이 장미인 트랜스게닉 식물.
  28. 제5항에 있어서, 상기 식물이 카네이션인 트랜스게닉 식물.
  29. 제5항에 있어서, 상기 식물이 국화인 트랜스게닉 식물.
  30. 제27항에 있어서, 변경된 화서를 나타내는 트랜스게닉 식물.
  31. 제28항에 있어서, 변경된 화서를 나타내는 트랜스게닉 식물.
  32. 제29항에 있어서, 변경된 화서를 나타내는 트랜스게닉 식물.
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