CN113278648B - 一种通过共转飞燕草苷合成相关基因培育蓝色菊花的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开一种通过共转飞燕草DgAA7GT、DgAA7BG‑GT1和DgSCPL2基因培育蓝色菊花的方法，本发明构建包含DgAA7GT、DgAA7BG‑GT1和DgSCPL2，风铃草Cam F3'5'H和蝶豆CtA3’5’GT五个基因共表达载体，然后导入切花菊。研究证明，将外源飞燕草苷合成基因DgAA7GT、DgAA7BG‑GT1、DgSCPL2基因，在风铃草CamF3'5'H和蝶豆花CtA3'5'GT基因的辅助下，能够使菊花形成了纯正蓝色花色。本发明能填补现有技术只用风铃草CamF3’5’H和蝶豆花CtA3’5’GT基因不能使菊花变成纯正蓝色的空白，为利用基因工程技术选育蓝色菊花提供新颖而实用的方法，将有效推动菊花生物技术育种进程。

Description

一种通过共转飞燕草苷合成相关基因培育蓝色菊花的方法
技术领域
本发明属于植物基因工程技术和转基因育种领域，涉及一种通过共转飞燕草苷合成相关基因培育蓝色菊花的方法，具体涉及包括有飞燕草蓝翠雀花苷(cyanodelphin)、紫翠雀花苷(violdelphin)合成路径的3个基因DgAA7GT、DgSCPL2和DgAA7BG-GT1基因，及风铃草CamF3’5’H和蝶豆花CtA3’5’GT基因的植物表达载体380N-CamF3'5'H-7BG-SCPL2-7GT-Ct3'5'GT构建、转化细胞、转380N-CamF3'5'H-7BG-SCPL2-7GT-Ct3’5’GT载体切花菊的培育、鉴定方法及转基因植株的应用。
背景技术
菊花花色十分丰富，但是唯独缺乏蓝色，因为菊花中缺少合成飞燕草色素苷的生物合成途径。类黄酮3',5'羟化酶(F3'5'H)基因被称之为“蓝色基因”，菊花的花色缺乏蓝色的真正原因在于缺少F3’5’H基因。类黄酮3',5'羟化酶(F3'5'H)催化柚皮素可以产生五氢黄酮，生成的五氢黄酮在二氢黄酮醇4-还原酶(dihydroflavonol 4-reductase,DFR)、花青素合成酶(Anthocyanidin synthase,ANS)的连续催化下生成蓝紫色的飞燕草色素(Tanakaet al.,2006；Noda et al.,2013)。
有报道表明，蓝色色素都是花青素高度修饰的产物如糖基化、酰基化等(Sasakiet al.,2015)。2013年，Noda等用菊花的F3H启动子驱动风铃草的F3'5'H基因(Canterburybells gene F3′5′H)Cam3'5'H导入粉色菊花品种中，实现了菊花花色从粉色转变为蓝紫色，但并不是纯正的蓝色(Noda et al.,2013)；随后该研究团队将风铃草的F3'5'H基因和蝶豆花的UDP-葡萄糖:花青素3',5'-O-葡萄糖基转移酶基因(UDP-glucose:anthocyanin3′,5′-O-glucosyltransferase，CtA3’5’GT)同时转入菊花，成功生成了飞燕草素3',5'-双糖苷化的衍生物，使花瓣呈现了蓝色(Noda et al.,2017)。
花青苷的酰化被认为是蓝色花着色的重要步骤之一(Yoshida et al.,2009)。花青苷可通过酰基转移酶进行酰基化修饰，以阻止花青素水解成无色的查耳酮或使其转变为蓝色的醌酮。Matsuba等(2010)在飞燕草中发现了催化花青苷7位聚酰化反应的催化酶DgAA7GT，其以acyl-glucoses为供体，在花青素3-O-葡萄糖苷7位添加糖基。Nishizaki等(2013)发现飞燕草DgAA7BG以p-酰化葡萄糖(pHBG)为供体，把葡萄糖基团转移到花青素7位pHBG的酚羟基上，为后续酰化奠定基础。Ishii等(2017)发现了DgAA7BG-GT1与DgAA7BG-GT2的双突变体,该突变体无法在7位的酰基上继续添加葡萄糖,故不能生成飞燕草苷,其花色呈现为淡粉色。Nishizaki等(2013)还发现另一个酰基转移酶DgSCPL2在白色飞燕草品种中不表达，7位多聚修饰的花青苷不能被检测出，说明其在飞燕草蓝色花色苷酰基基团的修饰、串联和堆叠中发挥了重要作用。但关于DgAA7GT、DgAA7BG和DgSCPL2在异源植物中是否具有类似的催化活性，从而使菊花花色变成蓝色方面的应用未见相关报道。
参考文献：
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发明内容
针对目前现实生产中菊花缺少蓝色品种，而现有技术中缺少关于共转飞燕草DgAA7GT、DgAA7BG-GT1和DgSCPL2基因使菊花花色变蓝方面的研究，本发明的目的在于提供DgAA7GT、DgAA7BG-GT1和DgSCPL2基因在培育蓝色菊花中的基因工程应用。
本发明的另一目的在于提供一种DgAA7GT、DgAA7BG-GT1和DgSCPL2基因共表达载体。
本发明的又一目的在于提供一种利用DgAA7GT、DgAA7BG-GT1和DgSCPL2基因培育蓝色菊花的方法。
本发明通过农杆菌介导的叶盘法将飞燕草的DgAA7GT、DgAA7BG-GT1和DgSCPL2基因一起导入切花菊以使其花色变成蓝色，这种新的探索为利用基因工程技术选育菊花蓝色品种提供一种新颖而实用的方法。
本发明的技术方案路线如下：构建包含DgAA7GT、DgAA7BG-GT1和DgSCPL2，风铃草Cam F3'5'H和蝶豆CtA3’5’GT五个基因共表达载体，通过农杆菌介导的叶盘法将上述5个基因同时导入切花菊，经过卡纳霉素筛选获得抗性植株，对抗性生根植株进行基因组DNA水平的PCR和转录水平的半定量RT-PCR检测，验证外源基因是否整合到转基因植株的基因组中并进行转录。对转基因株系使用英国皇家园艺协会标准比色卡(RHS)分析和色差仪测定，并采用超高效液相仪-质谱检测器对花色成分进行分析，与转风铃草CamF3'5'H和蝶豆CtA3'5'GT两个基因共表达的转基因相比，证实DgAA7GT、DgAA7BG-GT1和DgSCPL2基因在菊花蓝色花生成中的功能。
本发明的目的具体通过以下技术手段实现：
飞燕草DgAA7GT、DgAA7BG-GT1和DgSCPL2基因在培育蓝色菊花中的基因工程应用。
上述的应用，为将所述飞燕草DgAA7GT、DgAA7BG-GT1和DgSCPL2，及风铃草Cam F3'5'H和蝶豆花CtA3'5'GT基因的共表达载体导入切花菊，在花瓣中特异表达以培育蓝色菊花。
一种飞燕草DgAA7GT、DgAA7BG-GT1和DgSCPL2，及风铃草Cam F3'5'H和蝶豆花CtA3'5'GT基因的共表达载体，其采用以下步骤制备：
在菊花基因F3H的启动子序列(GenBank:FW570860.1)的3’端加上如SEQ ID NO.1所示的NtADH的5’UTR序列得到新的基因片段，将该基因片段分别插入到pYL322d1(GenBank:KY420076.1)和pYL322d2(GenBank:KY420077.1)载体的Xho I和Pst I酶切位点，分别得到d1F3HP和d2F3HP载体；
在蝶豆花CtA3’5’GT基因序列(GenBank:AB115560.1)的终止密码子后加上如SEQID NO.2所示的35S PolyA终止子序列，然后插入到所述d2F3HP载体的Kpn I和Sma I位点，得到d2F3HPCtA3’5’GT载体；
将风铃草CamF3’5’H基因序列(GenBank:D14590.1)加上如SEQ ID NO.3所示的Nos终止子序列，然后插入到所述d1F3HP载体的Kpn I和Sma I位点，得到d1F3HP CamF3’5’H载体；
在由如SEQ ID NO.6所示的章鱼碱合成酶基因(octopine synthase,OCS)启动子中增强子序列和如SEQ ID NO.7所示的月季花瓣特异表达的查尔酮合成酶基因(CHS)启动子片段RCHS拼接后形成的月季花特异嵌合启动子pOCSenhancer-RCHS的3’端加上如SEQ IDNO.1所示的NtADH的5’UTR序列得到新的启动子片段，将该启动子片段插入到pYL322d1(GenBank:KY420076.1)载体的Pst I和Nco I酶切位点，得到d1 RCHSA载体；将飞燕草DgAA7GT基因(GenBank:AB510758)3’端加上如SEQ ID NO.3所示的Nos终止子序列，然后插入到所述d1 RCHSA载体的Nco I和Xma I酶切位点,得到d1 RCHSADg7GT载体；
使用上游引物SEQ ID NO.8和下游引物SEQ ID NO.9对所述的d2F3HPCtA3’5’GT载体中的Ct3’5’GT基因表达盒进行PCR扩增，回收目的片段，设为片段A；使用内切酶Asc I切割所述的d1 RCHSADg7GT载体，将载体线性化，将灭活的酶切混合液置于透析膜上，以1/3TE缓冲液为透析液，根据离子浓度差进行单向渗透，去除混合液中的盐离子等杂质，设为片段B；将片段A与片段B进行Gibson组装后将反应混合液置于透析膜上放置，取透析后的反应混合液电击转化大肠杆菌DH10B，筛选阳性单克隆菌斑并测序验证，从而获得同时含有两个表达盒的新载体322d1-7GT-Ct3’5’GT；
在菊花启动子CmCCD4a-5promoter(GenBank:AB763911.1)的5’端加上如SEQ IDNO.6所示的章鱼碱合成酶基因启动子(octopine synthase,OCS)中增强子序列得到新的基因片段，将该基因片段插入到pYL322d2(GenBank:KY420077.1)载体的Pst I和Nco I酶切位点，得到d2CCD4P载体；将飞燕草DgSCPL2(GenBank:AB811449)3’端加上如SEQ ID NO.2所示的35S PolyA终止子序列，然后插入到所述d2CCD4P载体的Xma I和Sal I酶切位点，得到d2CCD4PDgSCPL2载体；
在牵牛花启动子InMYB1P(GenBank:AB232773.1)的3’端加上如SEQ ID NO.1所示的NtADH的5’UTR序列得到新的基因片段，将该基因片段插入到pYL322d1(GenBank:KY420076.1)载体的Pst I和Nco I酶切位点，得到d1MYB1P载体；将飞燕草DgAA7BG-GT1(GenBank:AB811444)3’端加上如SEQ ID NO.3所示的Nos终止子序列，然后插入到所述d1MYB1P载体的Xma I和Sal I酶切位点，得到d1MYB1P Dg7BG-GT1载体；
使用上游引物SEQ ID NO.10和下游引物SEQ ID NO.11对载体d1MYB1P Dg7BG-GT1中的Dg7BG-GT1基因表达盒进行PCR扩增，回收目的片段，设为片段C，使用内切酶Asc I切割d2CCD4PDgSCPL2载体，将载体线性化，将灭活的酶切混合液置于透析膜上放置，回收透析后的反应混合液，设为片段D；将片段D与片段C进行Gibson组装后将反应混合液置于透析膜上放置，取透析后的反应混合液电击转化大肠杆菌DH10B，筛选阳性单克隆菌斑并测序验证，从而获得同时含有两个表达盒的新载体322d2-7BG-SCPL2；
将等量的空载体pYLTAC380N(Genebank:KY420082.1,简称380N)和上述载体322d1-7GT-Ct3’5’GT混合均匀后电击转化NS3529感受态菌株中，NS3529菌株内表达的细菌噬菌体P1的I型拓扑异构酶(Cre酶)能在loxP位点的作用下进行片段间置换，将7GT-Ct3’5’GT双表达盒整合到380N载体上，电击转化后在卡纳霉素(Kan)+氯霉素(Chl)双抗平板上培养，收集平板上所有菌落进行质粒提取，获得质粒混抽液，该质粒混抽液体系为质粒间进行片段置换各种时期质粒共存的混合体，使用归巢酶I-Sce I将未完成置换的载体线性化，仅保留已完成反应的环状载体，将混合液置于透析膜上放置后，取透析后的反应混合液电击转化大肠杆菌DH10B，筛选阳性单克隆菌斑并测序验证，从而获得同时含有两个表达盒的新载体380N-7GT-Ct3’5’GT；
将等量的载体380N-7GT-Ct3’5’GT和载体322d2-7BG-SCPL2混合均匀后电击转化NS3529感受态菌株中，NS3529菌株内表达的Cre酶能在loxP位点(分别位于两个载体上)的作用下进行片段间置换，将7BG-SCPL2双表达盒整合到380N-7GT-Ct3’5’GT载体上；电击转化后在卡纳霉素(Kan)+氨苄青霉素(Amp)双抗平板上培养，收集平板上所有菌落进行质粒提取，获得质粒混抽液，该质粒混抽液体系为质粒间进行片段置换各时期共存的混合体，使用归巢酶PI-Sce I将未完成置换的载体线性化，仅保留已完成反应的环状载体，将混合液置于透析膜上放置后，取透析后的反应混合液电击转化大肠杆菌DH10B，筛选阳性单克隆菌斑，从而获得同时含有四个表达盒的新载体380N-7BG-SCPL2-7GT-Ct3’5’GT；
重复上述步骤，将上述载体d1F3HPCamF3’5’H与载体380N-7BG-SCPL2-7GT-Ct3’5’GT混匀后电击转化NS3529感受态菌株，将CamF3’5’H表达盒整合到载体380N-7BG-SCPL2-7GT-Ct3’5’GT上，从而获得新载体380N-CamF3’5’H-7BG-SCPL2-7GT-Ct3’5’GT。
作为一种更详细的技术方案，该植物表达载体采用以下步骤制备：
(1)CamF3'5'H和CtA3’5’GT两个基因共表达载体构建：
在菊花基因F3H的启动子序列(GenBank:FW570860.1)的3’端加上如SEQ ID NO.1所示的NtADH的5’UTR序列得到新的基因片段，将该基因片段分别插入到pYL322d1(GenBank:KY420076.1)和pYL322d2(GenBank:KY420077.1)载体的Xho I和Pst I酶切位点，分别得到d1F3HP和d2F3HP载体；
在蝶豆花CtA3'5'GT基因序列(GenBank:AB115560.1)的终止密码子后加上如SEQID NO.2所示的35S PolyA终止子序列，然后插入到所述d2F3HP载体的Kpn I和Sma I位点，得到d2F3HPCtA3'5'GT载体；
将风铃草Cam F3'5'H基因序列(GenBank:D14590.1)加上如SEQ ID NO.3所示的Nos终止子序列，然后插入到所述d1F3HP载体的Pst I和Spe I位点，得到d1F3HP CamF3'5'H载体；
用Not I和Sma I酶切所述的d2F3HPCtA3'5'GT载体，把回收的F3HPCtA3'5'GT片段连接到pORE-R4(GenBank:AY562547.1)载体上，得到R4-CtA3'5'GT载体；
用SEQ ID NO.4所示的上游引物和SEQ ID NO.5所示的下游引物，以d1F3HP CamF3'5'H质粒DNA为模板进行PCR扩增，高保真获得PCR产物，将PCR产物连接到所述R4-CtA3'5'GT载体的Not I和Spe I位点，转化大肠杆菌，提取阳性表达载体质粒R4-CamF3'5'HCtA3'5'GT得到所述风铃草CamF3'5'H和蝶豆CtA3'5'GT两个基因共表达载体，以作为5个基因共表达载体转化的对照载体。
(2)DgAA7GT、DgAA7BG-GT1、DgSCPL2，及Cam F3'5'H和CtA3'5'GT五个基因共表达载体构建：
在由如SEQ ID NO.6所示的章鱼碱合成酶基因(octopine synthase,OCS)启动子中增强子序列和如SEQ ID NO.7所示的月季花瓣特异表达的查尔酮合成酶基因(CHS)启动子片段RCHS拼接后形成的月季花特异嵌合启动子pOCSenhancer-RCHS的3’端加上如SEQ IDNO.1所示的NtADH的5’UTR序列得到新的启动子片段，将该启动子片段插入到pYL322d1(GenBank:KY420076.1)载体的Pst I和Nco I酶切位点，得到d1 RCHSA载体；将飞燕草DgAA7GT(GenBank:AB510758)3’端加上如SEQ ID NO.3所示的Nos终止子序列，然后插入到所述d1RCHSA载体的Nco I和Xma I酶切位点,得到d1 RCHSADg7GT载体；
使用上游引物SEQ ID NO.8和下游引物SEQ ID NO.9对载体d2F3HPCtA3’5’GT中的Ct3’5’GT基因表达盒进行PCR扩增，琼脂糖凝胶回收2.78Kb处的目的片段，设为片段A。使用内切酶Asc I切割载体d1 RCHSADg7GT，将载体线性化。300ng载体配制成10μl体系，反应37℃，1h。反应完成后80℃，20min灭活酶活。酶切混合液置于透析膜上放置10min，以1/3TE缓冲液为透析液，根据离子浓度差进行单向渗透，去除混合液中的盐离子等杂质。设为片段B。让片段A与片段B进行Gibson组装，反应50℃，50min。完成反应后，将混合液置于透析膜上放置10min后回收于干净的离心管中。取透析后的反应混合液1μl电击转化大肠杆菌DH10B，涂于氯霉素(Chl)平板上培养12h。隔日筛选阳性单克隆菌斑并测序验证，从而获得同时含有两个表达盒的新载体322d1-7GT-Ct3’5’GT。
在菊花启动子CmCCD4a-5promoter(GenBank:AB763911.1)的5’端加上如SEQ IDNO.6的所示的章鱼碱合成酶基因启动子(octopine synthase,OCS)中增强子序列得到新的基因片段，将该基因片段插入到pYL322d2(GenBank:KY420077.1)载体的Pst I和Nco I酶切位点，得到d2CCD4P载体；将飞燕草DgSCPL2(GenBank:AB811449)3’端加上如SEQ ID NO.2所示的35S PolyA终止子序列，然后插入到所述d2CCD4P载体的Xma I和Sal I酶切位点，得到d2CCD4PDgSCPL2载体；
在牵牛花启动子InMYB1P(GenBank:AB232773.1)的3’端加上如SEQ ID NO.1所示的NtADH的5’UTR序列得到新的基因片段，将该基因片段插入到pYL322d1(GenBank:KY420076.1)载体的Pst I和Nco I酶切位点，得到d1MYB1P载体；将飞燕草DgAA7BG-GT1(GenBank:AB811444)3’端加上如SEQ ID NO.3所示的Nos终止子序列，然后插入到所述d1MYB1P载体的Xma I和Sal I酶切位点，得到d1MYB1P Dg7BG-GT1载体；
使用上游引物SEQ ID NO.10和下游引物SEQ ID NO.11对载体d1MYB1P Dg7BG-GT1中的Dg7BG-GT1基因表达盒进行PCR扩增，琼脂糖凝胶回收3Kb处的目的片段，设为片段C。使用内切酶Asc I切割载体d2CCD4PDgSCPL2，将载体线性化。300ng载体配置成10μl体系，反应37℃，1h。反应完成后80℃，20min灭活酶活。酶切混合液置于透析膜上放置10min，后回收于干净的离心管中。设为片段D。其中，让片段D与片段C进行Gibson组装，反应50℃，50min。完成反应后将混合液置于透析膜上放置10min后回收于干净的离心管中。取透析后的反应混合液1μl电击转化大肠杆菌DH10B，涂于氨苄青霉素(Amp)平板上培养12h。隔日筛选阳性单克隆菌斑并测序验证，从而获得同时含有两个表达盒的新载体322d2-7BG-SCPL2。
将空白载体pYLTAC380N(Genebank:KY420082.1,简称380N)和上述载体322d1-7GT-Ct3’5’GT各取100ng置于干净的离心管中混匀，混合液电击转化于编号为NS3529的感受态菌株中，NS3529菌株内表达的细菌噬菌体P1的I型拓扑异构酶(Cre酶)能在loxP位点(分别位于两个载体上)的作用下进行片段间置换，将7GT-Ct3’5’GT双表达盒整合到380N载体上。电击转化后的NS3529菌株在卡纳霉素(Kan)+氯霉素(Chl)双抗平板培养24h。收集平板上所有菌落进行质粒提取，获得质粒混抽液，该体系为质粒间进行片段置换各种时期共存的混合体。此时，使用归巢酶I-Sce I将未完成置换的载体线性化，仅保留已完成反应的环状载体。将混合液置于透析膜上放置30min后回收于干净的离心管中。取透析后的反应混合液1μl电击转化大肠杆菌DH10B，涂于Kan单抗平板上培养12h。隔日筛选阳性单克隆菌斑并测序验证，从而获得同时含有两个表达盒的新载体380N-7GT-Ct3’5’GT。
将载体380N-7GT-Ct3’5’GT和载体322d2-7BG-SCPL2各取100ng置于干净的离心管中混匀，混合液电击转化于编号为NS3529的感受态菌株中，NS3529菌株内表达的Cre酶能在loxP位点(分别位于两个载体上)的作用下进行片段间置换，将7BG-SCPL2双表达盒整合到380N-7GT-Ct3’5’GT载体上。电击转化后的NS3529菌株在Kan+Amp双抗平板培养24h。收集平板上所有菌落进行质粒提取，获得质粒混抽液，该体系为质粒间进行片段置换各时期共存的混合体。此时，使用归巢酶PI-Sce I将未完成置换的载体线性化，仅保留已完成反应的环状载体。将混合液置于透析膜上放置30min后回收于干净的离心管中。取透析后的反应混合液1μl电击转化大肠杆菌DH10B，涂于Kan单抗平板上培养12h。隔日筛选阳性单克隆菌斑并测序验证，从而获得同时含有四个表达盒的新载体380N-7BG-SCPL2-7GT-Ct3’5’GT。
重复上述步骤，再次将载体d1F3HPCamF3’5’H与载体380N-7BG-SCPL2-7GT-Ct3’5’GT混匀后电击转化NS3529感受态菌株，将CamF3’5’H表达盒整合到载体380N-7BG-SCPL2-7GT-Ct3’5’GT上，从而最终获得5个基因共表达的新载体380N-CamF3’5’H-7BG-SCPL2-7GT-Ct3’5’GT。
包含有上述DgAA7GT、DgAA7BG-GT1、DgSCPL2、CamF3’5’H和CtA3’5’GT五个基因植物表达载体380N-CamF3’5’H-7BG-SCPL2-7GT-Ct3’5’GT的转化细胞，及含有CamF3’5’H和CtA3’5’GT两个基因共表达载体R4-CamF3'5'HCtA3’5’GT的转化细胞。
一种蓝色切花菊的培育方法，将上述的DgAA7GT、DgAA7BG-GT1、DgSCPL2，CamF3’5’H和CtA3’5’GT基因的植物表达载体380N-CamF3’5’H-7BG-SCPL2-7GT-Ct3’5’GT，导入切花菊中(以CamF3’5’H和CtA3’5’GT两个基因共表达载体R4-CamF3'5'HCtA3’5’GT为对照)，经过卡纳霉素(Kan)抗性筛选得到阳性转化植株，对阳性转化植株进行DNA的PCR鉴定、半定量RT-PCR检测，分别获得转DgAA7GT、DgAA7BG-GT1、DgSCPL2，CamF3’5’H和CtA3’5’GT五个基因共表达切花菊，及CamF3’5’H和CtA3’5’GT两个基因共表达切花菊。
对阳性转化植株进行PCR鉴定、半定量RT-PCR检测的过程具体包括如下步骤：
(1)PCR检测
分别提取野生型植株、转380N-CamF3’5’H-7BG-SCPL2-7GT-Ct3’5’GT载体、转R4-CamF3'5'HCtA3’5’GT载体的菊花抗性生根植株的基因组DNA，将抗性基因Kan和Ct3'5'GT作为检测目标，检测植物表达载体是否整合到植物基因组中，引物序列如下：
上游引物Kan-F：序列如SEQ ID NO.12所示，
下游引物Kan-R：序列如SEQ ID NO.13所示；
上游引物Ct3'5'GT-F：序列如SEQ ID NO.14所示；
下游引物Ct3'5'GT-R：序列如SEQ ID NO.15所示。
以提取的DNA为模板，分别以Kan-F和Kan-R，Ct3'5'GT-F和Ct3'5'GT-R为引物进行PCR反应，扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳检测分析；
(2)半定量RT-PCR分子检测
分别提取用Kan、Ct3'5'GT引物进行PCR扩增检测有目的条带的植株叶片总RNA，消化基因组DNA，反转录合成第一链cDNA，建立半定量RT-PCR扩增体系，特异引物序列如下：
上游引物qCtA3'5'GT-F：序列如SEQ ID NO.16所示，
下游引物qCtA3'5'GT-R：序列如SEQ ID NO.17所示；
上游引物qCamF3'5'H-F：序列如SEQ ID NO.18所示，
下游引物qCamF3'5'H-R：序列如SEQ ID NO.19所示；
上游引物qDg7GT-F：序列如SEQ ID NO.20所示，
下游引物qDg7GT-R:序列如SEQ ID NO.19所示；
上游引物qDg7BG-GT1-F：序列如SEQ ID NO.21所示，
下游引物qDg7BG-GT1-R:序列如SEQ ID NO.19所示；
上游引物qDgSCPL2-F:序列如SEQ ID NO.22所示，
下游引物qDgSCPL2-R:序列如SEQ ID NO.23所示；
所用内参基因为EF1α，引物序列为：
上游引物CmEF1α-F：序列如SEQ ID NO.24所示，
下游引物CmEF1α-R：序列如SEQ ID NO.25所示；
经过PCR、半定量RT-PCR检测均为阳性，确定获得转基因菊花株系。
上述的DgAA7GT、DgAA7BG-GT1、DgSCPL2、CamF3’5’H和CtA3’5’GT五个基因植物共表达载体380N-CamF3’5’H-7BG-SCPL2-7GT-Ct3’5’GT，及CamF3’5’H和CtA3’5’GT两个基因共表达载体R4-CamF3'5'HCtA3’5’GT在培育蓝色菊花上的应用。
上述的转化农杆菌细胞在培育蓝色菊花上的应用。
通过分别将R4-CamF3'5'HCtA3’5’GT、380N-CamF3’5’H-7BG-SCPL2-7GT-Ct3’5’GT表达载体，转入农杆菌感受态细胞EHA105，获得阳性农杆菌，通过叶盘法将CamF3’5’H和CtA3’5’GT两个基因，DgAA7GT、DgAA7BG-GT1、DgSCPL2、CamF3’5’H和CtA3’5’GT五个基因分别同时导入菊花中，获得转基因切花菊。对转基因株系进行花色表型观察，并使用英国皇家园艺协会标准比色卡(RHS)和色差仪分析，证实DgAA7GT、DgAA7BG-GT1、DgSCPL2基因在菊花蓝色花色中的功能。说明飞燕草中飞燕草苷合成基因DgAA7GT、DgAA7BG-GT1、DgSCPL2，在风铃草CamF3’5’H和蝶豆花CtA3’5’GT基因的辅助下，与只用风铃草CamF3’5’H和蝶豆花CtA3’5’GT两个基因转化菊花相比，使菊花形成了纯正蓝色花色。
本发明的有益效果：
1.本发明通过转基因技术，将外源飞燕草苷合成基因DgAA7GT、DgAA7BG-GT1、DgSCPL2基因，在风铃草CamF3'5'H和蝶豆花CtA3'5'GT基因的辅助下，使菊花形成了纯正蓝色花色。导入菊花基因组中并在花瓣中正常转录表达，获得蓝色的菊花，对环境不产生污染，能填补现有技术只用风铃草CamF3’5’H和蝶豆花CtA3’5’GT基因不能使菊花变成纯正蓝色的空白，为利用基因工程技术选育蓝色菊花提供新颖而实用的方法，将有效推动菊花生物技术育种进程。
2.本发明提供的方法选育了转基因菊花材料，通过野生型、CamF3’5’H和CtA3’5’GT两个基因共表达的转基因株系Cam-26与Cam-17，DgAA7GT、DgAA7BG-GT1、DgSCPL2、CamF3’5’H和CtA3’5’GT五个基因共表达的转基因株系Cam5G 43与Cam5G 48开花期花色表型观察，发现Cam5G 43与Cam5G 48两个株系表型变为纯正蓝色(图5,6)。经皇家园艺协会标准比色卡(RHS)比色，发现其色度分别为VIOLET-BLUE GROUP 94Light Violet D与VIOLET-BLUEGROUP 92Light Violet C，和WT、Cam-26与Cam-17色度区别较大(图6)。
附图说明
图1为R4-CamF3'5'HCtA3’5’GT植物表达载体构建流程图；
其中，(a)d2F3HPCtA3’5’GT构建；(b)d1F3HP CamF3'5'H构建；(c)基于a和b的R4-CamF3'5'HCtA3’5’GT构建。
图2为380N-CamF3’5’H-7BG-SCPL2-7GT-Ct3’5’GT植物表达载体构建流程图；
其中，(a)d2CCD4PDgSCPL2构建；(b)d1MYB1PDg7BG-GT1构建；(c)d1RCHSADg7GT构建；(d)322d2-7BG-SCPL2构建；(e)322d1-7GT-CtA3’5’GT构建；(f)380N-7GT-CtA3’5’GT构建；(g)380N-7BG-SCPL2-7GT-CtA3’5’GT构建；(h)380N-CamF3'5'H-7BG-SCPL2-7GT-CtA3’5’GT构建。
图3为R4-CamF3'5'HCtA3’5’GT和380N-CamF3’5’H-7BG-SCPL2-7GT-Ct3’5’GT植物表达载体的酶切鉴定；
其中，A:R4-CamF3'5'HCtA3’5’GT用Not I和Sma I、Not I和Spe I双酶切鉴定；
B:380N-CamF3'5'H-7BG-SCPL2-7GT-CtA3’5’GT用Not I酶切鉴定。
图4为转基因抗性植株形成过程；
其中，A、B：抗性愈伤组织；C：抗性芽的筛选；D、E：生根筛选；F：转基因植株。
图5为分别转R4-CamF3'5'HCtA3'5'GT(A)和380N-CamF3'5'H-7BG-SCPL2-7GT-CtA3’5’GT(B)抗性生根植株DNA检测电泳图；
其中，M：2000DNA Marker；0：水；-：阴性对照；+：阳性质粒对照；1～36：再生植株。
图6为分别转R4-CamF3'5'HCtA3’5’GT(A)和320N-CamF3'5'H-7BG-SCPL2-7GT-CtA3’5’GT(B)株系中基因相对表达量水平；
注：Cam，Cam5G加数字代表转基因株系，WT为野生型；A为R4-CamF3'5'HCtA3’5’GT转基因鉴定结果，B为320N-CamF3'5'H-7BG-SCPL2-7GT-CtA3’5’GT转基因鉴定结果，内参引物F:qCmEF1α-F；R:qCmEF1α-R。
图7为分别转R4-CamF3'5'HCtA3’5’GT(A)和320N-CamF3'5'H-7BG-SCPL2-7GT-CtA3’5’GT(B)菊花株系花色表型。
图8为分别转R4-CamF3'5'HCtA3’5’GT(A)和320N-CamF3'5'H-7BG-SCPL2-7GT-CtA3’5’GT(B)转基因菊花盛开期舌状花花色表型CIElab分布图。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明做进一步说明，下面实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照本领域的公知手段。
实施例1.
(1)R4-CamF3'5'HCtA3’5’GT植物表达载体的构建
1)d2F3HPCtA3’5’GT载体的构建
根据公共数据库(NCBI)上公布的菊花基因F3H的启动子序列(Chrysanthemum F3HPromoter，CmF3HP，GenBank:FW570860.1)，并在该启动子序列的3’端加上如SEQ ID NO.1所示的NtADH(烟草乙醇脱氢酶基因)的5’UTR序列，及中间载体pYL322d2(GenBank:KY420077.1)多克隆位点(MCS)，在序列的上游引入Xho I酶切位点，下游引入Pst I酶切位点，委托通用生物公司合成后，对pYL322d2(GenBank:KY420077.1)质粒和合成的片段Xho I和Pst I分别进行双酶切；20μL反应体系：10×FastDigest Buffer 2.0μL，pYL322d2质粒1.0μL，Xho I 1.0μL，Pst I 1.0μL，ddH2O 15.0μL；合成的序列产物，其余试剂同上，ddH2O补足20.0μl；37℃酶切1h；对酶切产物进行琼脂糖凝胶电泳分析，凝胶回收试剂盒(AXYGEN)回收pYL322d2载体片段和目的基因F3H启动子片段。用T4 DNA连接酶(Fermentas)连接两个回收的产物，连接反应体系10μL：10×T4 DNA ligase Buffer 1μL，F3H启动子片段6μL，pYL322d2载体片段2μL，T4 DNA连接酶1μL；22℃连接1h，取5μL连接产物转化DH5α感受态细胞，37℃过夜培养，挑取阳性单克隆扩大培养，提取阳性载体质粒d2F3HP(图1，a)；在此基础上，根据蝶豆花CtA3’5’GT的基因序列(GenBank:AB115560.1)，并在该基因序列的终止密码子后加上如SEQ ID NO.2所示的35S PolyA终止子序列，在序列的上游引入Kpn I酶切位点，下游引入Sma I酶切位点，由通用生物公司合成后，按照上述的酶切、连接方法和体系，插入到所述d2F3HP载体的Kpn I和Sma I位点，该载体被命名为d2F3HPCtA3’5’GT(图1,a)。
2)d1F3HP CamF3'5'H载体的构建
根据公共数据库(NCBI)上公布的菊花基因F3H的启动子序列(Chrysanthemum F3HPromoter，CmF3HP，GenBank:FW570860.1)，并在该启动子序列的3’端加上如SEQ ID NO.1所示的NtADH(烟草乙醇脱氢酶基因)的5’UTR序列，及中间载体pYL322d1(GenBank:KY420076.1)多克隆位点(MCS)，在序列的上游引入Xho I酶切位点，下游引入Pst I酶切位点，委托通用生物公司合成后，对pYL322d1(GenBank:KY420076.1)质粒和合成的片段Xho I和Pst I分别进行双酶切；20μL反应体系：10×FastDigest Buffer 2.0μL，pYL322d1质粒1.0μL，Xho I 1.0μL，Pst I 1.0μL，ddH2O 15.0μL；合成的序列产物，其余试剂同上，ddH2O补足20.0μl；37℃酶切1h；对酶切产物进行琼脂糖凝胶电泳分析，凝胶回收试剂盒(AXYGEN)回收pYL322d1载体片段和目的基因F3H启动子片段。用T4 DNA连接酶(Fermentas)连接两个回收的产物，连接反应体系10μL：10×T4 DNA ligase Buffer 1μL，F3H启动子片段6μL，pYL322d1载体片段2μL，T4 DNA连接酶1μL；22℃连接1h，取5μL连接产物转化DH5α感受态细胞，37℃过夜培养，挑取阳性单克隆扩大培养，提取阳性载体质粒d1F3HP(图1,b)；在此基础上，根据公共数据库(NCBI)上公布的风铃草CamF3’5’H基因的序列(GenBank:D14590.1)，并加上如SEQ ID NO.3所示的Nos终止子序列，在序列的上游引入Kpn I酶切位点，下游引入Sma I酶切位点，由通用生物公司合成后，按照上述的酶切、连接方法和体系，插入到d1F3HP载体的Kpn I和Sma I位点，该载体被命名为d1F3HP CamF3'5'H(图1,b)。
3)R4-CamF3'5'HCtA3’5’GT表达载体的构建
利用上述的酶切、连接体系，用Not I和Sma I酶切d2F3HPCtA3’5’GT载体，同时酶切pORE-R4空载体(GenBank:AY562547.1)，把回收的F3HPCtA3’5’GT片段连接到酶切后的pORE-R4载体上，该载体被称为R4-CtA3’5’GT；用SEQ ID NO.4所示的上游引物(引入Spe I位点)和SEQ ID NO.5所示的下游引物(引入Not I位点)，以d1F3HP CamF3'5'H质粒DNA为模板进行PCR扩增，反应体系(50μL)：10×PCR Buffer 5.0μL，上下游引物各1.0μL(10μmol L-1)，dNTP mix 5.0μL(2mmol L-1)，Pfusion DNA Polymerase 0.5μL，质粒DNA模板2μL，ddH2O35.5μL；反应程序：95℃预变性2min，95℃解链30s，55℃退火30s，72℃延伸40s，24个循环，72℃延伸7min；反应结束后将PCR产物进行0.8％琼脂糖凝胶电泳，用凝胶回收试剂盒(AXYGEN)回收，20μl ddH2O溶解。利用上述的酶切、连接体系，将PCR产物连接到R4-CtA3’5’GT载体的Not I和Spe I位点，转化大肠杆菌后，提取阳性表达载体质粒R4-CamF3'5'HCtA3’5’GT(图1,c)，进一步用Not I和Spe I、Not I和Sma I双酶切确认(图3A)。
4)322d1-7GT-Ct3’5’GT载体的构建：
由如SEQ ID NO.6所示的章鱼碱合成酶基因(octopine synthase,OCS)启动子中增强子序列和如SEQ ID NO.7所示的月季花瓣特异表达的查尔酮合成酶基因(CHS)启动子片段RCHS拼接后形成月季花特异嵌合启动子pOCSenhancer-RCHS，在3’端加上如SEQ IDNO.1所示的NtADH的5’UTR序列得到新的启动子片段，将该基因片段插入到pYL322d1(GenBank:KY420076.1)载体的Pst I和Nco I酶切位点，得到d1 RCHSA载体；将飞燕草DgAA7GT(GenBank:AB510758)3’端加上如SEQ ID NO.3所示的Nos终止子序列，然后插入到所述d1 RCHSA载体的Nco I和Xma I酶切位点，得到d1 RCHSADg7GT载体(图2,a)；
使用上游引物SEQ ID NO.8和下游引物SEQ ID NO.9对载体d2F3HPCtA3’5’GT中的Ct3’5’GT基因表达盒进行PCR扩增，琼脂糖凝胶回收2.78Kb处的目的片段，设为片段A。使用内切酶Asc I切割载体d1 RCHSADg7GT，将载体线性化。300ng载体配制成10μl体系，反应37℃，1h。反应完成后80℃，20min灭活酶活。酶切混合液置于透析膜上放置10min，以1/3TE缓冲液为透析液，根据离子浓度差进行单向渗透，去除混合液中的盐离子等杂质。设为片段B。让片段A与片段B进行Gibson组装，反应50℃，50min。完成反应后，将混合液置于透析膜上放置10min后回收于干净的离心管中。取透析后的反应混合液1μl电击转化大肠杆菌DH10B，涂于氯霉素(Chl)平板上培养12h。隔日筛选阳性单克隆菌斑并测序验证，从而获得同时含有两个表达盒的新载体322d1-7GT-Ct3’5’GT(图2,b)。
5)322d2-7BG-SCPL2载体的构建：
在菊花启动子CmCCD4a-5promoter(GenBank:AB763911.1)的5’端加上如SEQ IDNO.6的所示的章鱼碱合成酶基因启动子(octopine synthase,OCS)中增强子序列得到新的启动子片段，将该启动子片段插入到pYL322d2(GenBank:KY420077.1)载体的Pst I和Nco I酶切位点，得到d2CCD4P载体；将飞燕草DgSCPL2(GenBank:AB811449)3’端加上如SEQ IDNO.2所示的35S PolyA终止子序列，然后插入到所述d2CCD4P载体的Xma I和Sal I酶切位点，得到d2CCD4PDgSCPL2载体(图2,c)；
在牵牛花启动子InMYB1P(GenBank:AB232773.1)的3’端加上如SEQ ID NO.1所示的NtADH的5’UTR序列得到新的基因片段，将该启动子片段插入到pYL322d1(GenBank:KY420076.1)载体的Pst I和Nco I酶切位点，得到d1MYB1P载体；将飞燕草DgAA7BG-GT1(GenBank:AB811444)3’端加上如SEQ ID NO.3所示的Nos终止子序列，然后插入到所述d1MYB1P载体的Xma I和Sal I酶切位点，得到d1MYB1P Dg7BG-GT1载体(图2,d)；
使用上游引物SEQ ID NO.10和下游引物SEQ ID NO.11对载体d1MYB1P Dg7BG-GT1中的Dg7BG-GT1基因表达盒进行PCR扩增，琼脂糖凝胶回收3Kb处的目的片段，设为片段C。使用内切酶Asc I切割载体d2CCD4PDgSCPL2，将载体线性化。300ng载体配置成10μl体系，反应37℃，1h。反应完成后80℃，20min灭活酶活。酶切混合液置于透析膜上放置10min，后回收于干净的离心管中。设为片段D。其中，让片段D与片段C进行Gibson组装，反应50℃，50min。完成反应后将混合液置于透析膜上放置10min后回收于干净的离心管中。取透析后的反应混合液1μl电击转化大肠杆菌DH10B，涂于氨苄青霉素(Amp)平板上培养12h。隔日筛选阳性单克隆菌斑并测序验证，从而获得同时含有两个表达盒的新载体322d2-7BG-SCPL2(图2,e)。
6)380N-CamF3’5’H-7BG-SCPL2-7GT-Ct3’5’GT表达载体的构建
将空白载体pYLTAC380N(Genebank:KY420082.1,简称380N)和上述载体322d1-7GT-Ct3’5’GT各取100ng置于干净的离心管中混匀，混合液电击转化于编号为NS3529的感受态菌株中，NS3529菌株内表达的细菌噬菌体P1的I型拓扑异构酶(Cre酶)能在loxP位点(分别位于两个载体上)的作用下进行片段间置换，将7GT-Ct3’5’GT双表达盒整合到380N载体上。电击转化后的NS3529菌株在卡纳霉素(Kan)和氯霉素(Chl)双抗平板培养24h。收集平板上所有菌落进行质粒提取，获得质粒混抽液，该体系为质粒间进行片段置换各种时期共存的混合体。此时，使用归巢酶I-Sce I将未完成置换的载体线性化，仅保留已完成反应的环状载体。将混合液置于透析膜上放置30min后回收于干净的离心管中。取透析后的反应混合液1μl电击转化大肠杆菌DH10B，涂于Kan单抗平板上培养12h。隔日筛选阳性单克隆菌斑并测序验证，从而获得同时含有两个表达盒的新载体380N-7GT-Ct3’5’GT(图2,f)。
将上述载体380N-7GT-Ct3’5’GT和载体322d2-7BG-SCPL2各取100ng置于干净的离心管中混匀，混合液电击转化于编号为NS3529的感受态菌株中，NS3529菌株内表达的Cre酶能在loxP位点(分别位于两个载体上)的作用下进行片段间置换，将7BG-SCPL2双表达盒整合到380N-7GT-Ct3’5’GT载体上。电击转化后的NS3529菌株在卡纳霉素(Kan)和氨苄青霉素(Amp)双抗平板培养24h。收集平板上所有菌落进行质粒提取，获得质粒混抽液，该体系为质粒间进行片段置换各时期共存的混合体。此时，使用归巢酶PI-Sce I将未完成置换的载体线性化，仅保留已完成反应的环状载体。将混合液置于透析膜上放置30min后回收于干净的离心管中。取透析后的反应混合液1μl电击转化大肠杆菌DH10B，涂于Kan单抗平板上培养12h。隔日筛选阳性单克隆菌斑并测序验证，从而获得同时含有四个表达盒的新载体380N-7BG-SCPL2-7GT-Ct3’5’GT(图2,g)。
重复上述步骤，再次将载体d1F3HPCamF3’5’H与载体380N-7BG-SCPL2-7GT-Ct3’5’GT混匀后电击转化NS3529感受态菌株，将CamF3’5’H表达盒整合到载体380N-7BG-SCPL2-7GT-Ct3’5’GT上，从而最终获得5个基因共表达的新载体380N-CamF3’5’H-7BG-SCPL2-7GT-Ct3’5’GT(图2,h)，进一步用Not I酶切确定(图3B)。(2)农杆菌EHA105介导的叶盘法转化菊花
1)农杆菌EHA105感受态细胞的制备
取-70℃保存的根癌农杆菌EHA105于含50μg/ml利福平的YEB板划线，28℃培养2-3d，从YEB平板上挑取单菌落，接种于50ml含50μg/ml利福平的YEB液体培养基中，200rpm，28℃培养至OD600达0.5-0.6，菌液冰浴30min，4℃，5000rpm离心收集菌体，将菌体重悬于2ml预冷的含15％甘油的0.1M无菌CaCl2溶液中，200μl/管分装，冰浴保存立即使用，或液氮速冻1min，-80℃保存备用。
2)冻融法转化农杆菌
分别取5μl R4-CamF3'5'HCtA3’5’GT、380N-CamF3’5’H-7BG-SCPL2-7GT-Ct3’5’GT质粒，各加入100μl感受态细胞，冰浴30min，液氮速冻5min，37℃水浴5min，加入800μl YEB液体培养基，28℃，200rpm培养4-6h，菌液涂布于YEB固体平板上(含利福平50μg/ml和卡那霉素50μg/ml)，28℃倒置培养2-3d，挑取单克隆检测，选取阳性克隆摇菌，用于菊花的遗传转化。
3)农杆菌介导的叶盘法转化菊花
以组培瓶中的切花菊‘南农粉翠’苗顶端叶片为受体材料，切成0.5cm×0.5cm叶盘，近轴面(有叶脉的一面)向下置于预培养培养基(MS+1.0mg/L 6-BA+0.5mg/L NAA)中预培养2-3d，浸入备好的农杆菌菌液中侵染8-10min，用滤纸吸干叶盘上附着的菌液后接种到共培养培养基(MS+1mg/L 6-BA+0.5mg/L NAA)上，28℃暗培养3d后转入脱羧培养基(MS+1mg/L 6-BA+0.5mg/L NAA+500mg/L Carb)上，脱羧培养5-7d，然后转入筛选培养基(MS+1mg/L 6-BA+0.5mg/L NAA+300mg/L Carb+50mg/L Kan)进行继代选择培养3-4代。在筛选培养初期，转化的叶盘分化出抗性愈伤组织(图4A,B)，随着继代培养基中逐渐降低筛选压，愈伤组织分化出抗性不定芽(图4C)，待分化出的抗性芽长到2-3cm时转入生根筛选培养基上(MS+30mg/L Kan)进行生根筛选(图4D,E)，初步获得长势正常的抗性植株(图4F)。
(3)转R4-CamF3'5'HCtA3’5’GT、380N-CamF3’5’H-7BG-SCPL2-7GT-Ct3’5’GT抗性植株的分子检测
1)PCR检测
分别提取野生型植株和转R4-CamF3'5'HCtA3’5’GT、380N-CamF3’5’H-7BG-SCPL2-7GT-Ct3’5’GT抗性生根植株的基因组DNA，将抗性基因Kan和Ct3'5'GT作为检测目标，检测植物表达载体是否整合到植物基因组中，引物序列如下：上游引物Kan-F：序列如SEQ IDNO.12所示，下游引物Kan-R：序列如SEQ ID NO.13所示；上游引物Ct3'5'GT-F：序列如SEQID NO.14所示，下游引物Ct3'5'GT-R：序列如SEQ ID NO.15所示。
以提取的DNA为模板，分别以Kan-F和Kan-R，Ct3'5'GT-F和Ct3'5'GT-R为引物进行PCR反应，扩增体系为：10×PCR Buffer 4μL，上下游引物各1.0μL，dNTP mix 2.0μL(2.5mmol L-1)，rTaq 0.2μL，DNA模板1μL，ddH2O补足体积25μL。扩增条件为：95℃预变性5min；94℃变性45s，58℃退火45s，72℃延伸45s，35个循环；72℃延伸10min；4℃保存；反应完成后取PCR产物用1.5％琼脂糖凝胶进行电泳检测(图5)。转R4-CamF3'5'HCtA3’5’GT、380N-CamF3’5’H-7BG-SCPL2-7GT-Ct3’5’GT的阳性植株均可扩增出与阳性对照质粒相同的特异性Kan和Ct3'5'GT条带，未转化植株不能扩增出条带。
2)半定量RT-PCR分子检测
提取R4-CamF3'5'HCtA3’5’GT、380N-CamF3’5’H-7BG-SCPL2-7GT-Ct3’5’GT转基因阳性菊花株系以及WT菊花株系的舌状花取样，每个株系随机选取3株单株，取样重复3次，放入液氮速冻后提取RNA。取1000ng上述提取RNA，分别反转录获得cDNA。得到的cDNA用CmEF1α为内参基因进行cDNA质量检测，要求PCR获得单一且清晰的条带。进行半定量RT-PCR时，先根据内参引物PCR得到的条带微调cDNA的用量，确保内参引物下条带亮度一致。确定cDNA用量后，根据条带亮度说明基因在不同株系之间的表达差异。每个样品至少设两个重复。
扩增体系为：10×PCR Buffer 4μL，S-F、S-R引物各1.0μL，dNTP mix 2.0μL(2.5mmol L-1)，rTaq 0.2μL，DNA模板1μL，ddH2O补足体积40μL。扩增条件为：95℃预变性5min；94℃变性45s，58℃退火45s，72℃延伸45s，35个循环；72℃延伸10min；4℃保存；反应完成后取PCR产物用1.5％琼脂糖凝胶进行电泳检测(图6)，证实内源基因已转入切花菊基因组中并表达。
上游引物qCtA3'5'GT-F：序列如SEQ ID NO.16所示，
下游引物qCtA3'5'GT-R：序列如SEQ ID NO.17所示；
上游引物qCamF3'5'H-F：序列如SEQ ID NO.18所示，
下游引物qCamF3'5'H-R：序列如SEQ ID NO.19所示；
上游引物qDg7GT-F：序列如SEQ ID NO.20所示，
下游引物qDg7GT-R:序列如SEQ ID NO.19所示；
上游引物qDg7BG-GT1-F：序列如SEQ ID NO.21所示，
下游引物qDg7BG-GT1-R:序列如SEQ ID NO.19所示；
上游引物qDgSCPL2-F:序列如SEQ ID NO.22所示，
下游引物qDgSCPL2-R:序列如SEQ ID NO.23所示；
所用内参基因为EF1α，引物序列为：
上游引物CmEF1α-F：序列如SEQ ID NO.24所示，
下游引物CmEF1α-R：序列如SEQ ID NO.25所示；
(4)转R4-CamF3'5'HCtA3’5’GT、380N-CamF3’5’H-7BG-SCPL2-7GT-Ct3’5’GT菊花花色表型观察和分析
将获得的R4-CamF3'5'HCtA3’5’GT、380N-CamF3’5’H-7BG-SCPL2-7GT-Ct3’5’GT转基因株系和WT分别进行大量扩繁，炼苗后种植于南京农业大学‘中国菊花种质资源中心’，观察植株花色变化。阳性株系Cam-26与Cam-17(图7A)、Cam5G 43与Cam5G 48(图7B)表型变化较为明显。经皇家园艺协会标准比色卡(RHS)比色，阳性株系Cam-26与Cam-17色度分别为VIOLETT GROUP 85Light Purple A与PURPLE-VIOLET GROUP N80 Light Purple D，与WT色度RED-PPURPLE GROUP N74-Vivid Reddish Purple C区别较大(图8A)；Cam5G 43与Cam5G48两个株系色度分别为VIOLET-BLUE GROUP 94Light Violet D与VIOLET-BLUE GROUP92Light Violet C，与WT色度区别更大(图8B)。进一步进行色差测定。色差指标中L值代表亮度，L为正值代表样品较标准品亮；a值代表红绿度，a大于0说明样品比标准品偏红，a小于0说明样品比标准品偏绿；b值代表黄蓝度，b大于0，说明样品较标准品偏黄；b小于0，说明样品比标准品偏蓝。通过色度角H°来评估花卉颜色的色调。仪器经亮度校正后，对R4-CamF3'5'HCtA3’5’GT的舌状花色彩的Lab值进行测定，Cam-26、Cam-17与WT亮度有差异；WT舌状花a*值与b*值最大，红度最大，蓝度最低，H°处于350°附近，处于红色组。Cam-26与Cam-17较WT红度降低，蓝度增加，H°处于330°附近，处于紫色到紫罗兰色组(图8A)；对380N-CamF3’5’H-7BG-SCPL2-7GT-Ct3’5’GT的舌状花色彩的Lab值进行测定，Cam5G 43与Cam5G 48与WT亮度无明显差异；WT舌状花红度最大，蓝度最低，H°处于350°附近，处于红色组；Cam5G 43与Cam5G 48红度较WT明显降低，蓝度明显增加，H°处于310°附近，处于紫罗兰到蓝色组(图8B)。
可以知道，上述实施例仅为了说明发明原理而采用的实例性实施方式，然而本发明不仅限于此，本领域技术人员在不脱离本发明实质情况下，可以做出各种改进和变更，这些改进和变更也属于本发明的保护范围。
序列表
<110> 南京农业大学
华南农业大学
<120> 一种通过共转飞燕草苷合成相关基因培育蓝色菊花的方法
<160> 25
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 91
<212> DNA
<213> 烟草(Nicotiana tabacum L.)
<400> 1
tatttaactc agtattcaga aacaacaaaa gttcttctct acataaaatt ttcctatttt 60
agtgatcagt gaaggaaatc aagaaaaata a 91
<210> 2
<211> 209
<212> DNA
<213> 花椰菜花叶病毒(CaMV)
<400> 2
gatctgtcga tcgacaagct cgagtttctc cataataatg tgtgagtagt tcccagataa 60
gggaattagg gttcctatag ggtttcgctc atgtgttgag catataagaa acccttagta 120
tgtatttgta tttgtaaaat acttctatca ataaaatttc taattcctaa aaccaaaatc 180
cagtactaaa atccagatcc cccgaatta 209
<210> 3
<211> 253
<212> DNA
<213> 根癌农杆菌(Agrobacterium tumefacierm)
<400> 3
gatcgttcaa acatttggca ataaagtttc ttaagattga atcctgttgc cggtcttgcg 60
atgattatca tataatttct gttgaattac gttaagcatg taataattaa catgtaatgc 120
atgacgttat ttatgagatg ggtttttatg attagagtcc cgcaattata catttaatac 180
gcgatagaaa acaaaatata gcgcgcaaac taggataaat tatcgcgcgc ggtgtcatct 240
atgttactag atc 253
<210> 4
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
ggactagttt acaaaaccat gtgcaagaat 30
<210> 5
<211> 41
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
aagaatgcgg ccgcgatcta gtaacataga tgacaccgcg c 41
<210> 6
<211> 187
<212> DNA
<213> 根癌农杆菌(Agrobacterium tumefacierm)
<400> 6
ctgcagcttc ggtgcgatgc ccccatcgta ggtgaaggtg gaaattaatg atccatcttg 60
agaccacagg cccacaacag ctaccagttt cctcaagggt ccaccaaaaa cgtaagcgct 120
tacgtacatg gtcgataaga aaaggcaatt tgtagatgtt aacatccaac gtcgctttca 180
gggatcc 187
<210> 7
<211> 265
<212> DNA
<213> 月季(Rosa chinensisJacq.)
<400> 7
atgtggattt tgatcacaca aaaacaccat acacgtgcca ttcggtggtg gtttccaacg 60
aggcaattaa gcaggcacgt gatcccccag ctacccatca atcctctctt tttttcatat 120
ataaatacaa ttccatttct cataccatta tattctaaca ttttttgcct tgctactgca 180
acacaacata aacagttcaa tccatccttg ttcctcctag cctccccatt ttgatctttt 240
ctcgacactt cttcgagata tcaca 265
<210> 8
<211> 56
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
gatcgatgca tgcggccgct agctcgagag gctaattcgg gggatctgga ttttag 56
<210> 9
<211> 58
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 9
gcagaattct agagctcacc ggtaggcggc cgcagttaca aaaccatgtg caagaatg 58
<210> 10
<211> 54
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 10
gcagaattct agagcaccgg taaggccagg agcaggtttt gggtataaat tgac 54
<210> 11
<211> 53
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 11
gatcgatgca tgcggccgct agctcgagac gatctagtaa catagatgac acc 53
<210> 12
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 12
agaggcagca gatggggaat 20
<210> 13
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 13
ccgatgaatg agaatgaagt 20
<210> 14
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 14
aggccattgt tttggatgga 20
<210> 15
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 15
tagctagagg aaatcatttc cacc 24
<210> 16
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 16
gtcttcaaac tcgctcacgc 20
<210> 17
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 17
cgggcacata accctctgg 19
<210> 18
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 18
ttcgcatacc caaaaacact 20
<210> 19
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 19
cggcaacagg attcaatctt 20
<210> 20
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 20
tccagacttc catcgtttac 20
<210> 21
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 21
attactacac agcgttctac 20
<210> 22
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 22
aatggaacaa acggagaagt 20
<210> 23
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 23
ctcatacgac aaccatttct 20
<210> 24
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 24
ttttggtatc tggtcctgga g 21
<210> 25
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 25
ccattcaagc gacagactca 20

Claims (6)

1.飞燕草DgAA7GT、DgSCPL2和DgAA7BG-GT1基因在培育蓝色菊花中的应用，其特征在于：为将所述飞燕草DgAA7GT、DgSCPL2和DgAA7BG-GT1、及风铃草Cam F3'5'H和蝶豆花CtA3'5'GT基因的共表达载体导入切花菊，进行特异表达以培育蓝色菊花。
2. 根据权利要求1所述的应用，其特征在于：所述的飞燕草DgAA7GT、DgSCPL2和DgAA7BG-GT1、及风铃草Cam F3'5'H和蝶豆花CtA3'5'GT基因的共表达载体采用以下步骤制备：
在GenBank登录号为 FW570860.1的菊花基因F3H的启动子序列的 3’端加上如SEQ IDNO. 1所示的NtADH的5’UTR序列得到新的基因片段，将该基因片段分别插入到GenBank登录号为KY420076.1的pYL322d1和GenBank登录号为KY420077.1的pYL322d2载体的Xho I和Pst I酶切位点，分别得到d1F3HP和d2F3HP载体；
在GenBank登录号为AB115560.1的蝶豆花CtA3’5’GT基因序列的终止密码子后加上如SEQ ID NO. 2所示的35S PolyA终止子序列，然后插入到所述d2F3HP载体的Kpn I和Sma I位点，得到d2F3HPCtA3’5’GT载体；
将GenBank登录号为D14590.1的风铃草CamF3’5’H基因序列加上如SEQ ID NO. 3所示的Nos终止子序列，然后插入到所述d1F3HP载体的 Kpn I和Sma I位点，得到d1F3HP CamF3’5’H载体；
在由如SEQ ID NO.6所示的章鱼碱合成酶基因启动子中增强子序列和如SEQ ID NO.7所示的月季花瓣特异表达的查尔酮合成酶基因启动子片段RCHS拼接后形成的月季花特异嵌合启动子pOCSenhancer-RCHS的3’端加上如SEQ ID NO. 1所示的NtADH的5’UTR序列得到新的启动子片段，将该启动子片段插入到GenBank登录号为 KY420076.1的pYL322d1载体的Pst I和Nco I酶切位点，得到d1 RCHSA载体；将GenBank登录号为AB510758的飞燕草DgAA7GT 基因的3’端加上如SEQ ID NO. 3所示的Nos终止子序列，然后插入到所述d1RCHSA载体的Nco I和Xma I酶切位点，得到d1 RCHSADg7GT载体；
使用上游引物SEQ ID NO.8和下游引物SEQ ID NO.9对所述的d2F3HPCtA3’5’GT载体中的Ct3’5’GT基因表达盒进行PCR扩增，回收目的片段，设为片段A；使用内切酶Asc I切割所述的d1 RCHSADg7GT载体，将载体线性化，将灭活的酶切混合液置于透析膜上，以1/3 TE缓冲液为透析液，根据离子浓度差进行单向渗透，去除混合液中的盐离子等杂质，设为片段B；将片段A与片段B进行Gibson组装后将反应混合液置于透析膜上放置，取透析后的反应混合液电击转化大肠杆菌DH10B，筛选阳性单克隆菌斑并测序验证，从而获得同时含有两个表达盒的新载体322d1-7GT-Ct3’5’GT；
在GenBank登录号为AB763911.1的菊花启动子CmCCD4a-5 promoter的5’端加上如SEQID NO.6所示的章鱼碱合成酶基因启动子中增强子序列得到新的基因片段，将该基因片段插入到GenBank登录号为KY420077.1的pYL322d2载体的Pst I和Nco I酶切位点，得到d2CCD4P载体；将GenBank登录号为AB811449的飞燕草DgSCPL2 的3’端加上如SEQ ID NO. 2所示的35S PolyA终止子序列，然后插入到所述d2CCD4P载体的Xma I和 Sal I 酶切位点，得到d2CCD4PDgSCPL2载体；
在GenBank登录号为AB232773.1的牵牛花启动子InMYB1P的3’端加上如SEQ ID NO. 1所示的NtADH的5’UTR序列得到新的基因片段，将该基因片段插入到GenBank登录号为KY420076.1的pYL322d1载体的Pst I和Nco I酶切位点，得到d1MYB1P载体；将GenBank登录号为AB811444的飞燕草DgAA7BG-GT1的3’端加上如SEQ ID NO. 3所示的Nos终止子序列，然后插入到所述d1MYB1P载体的Xma I和 Sal I酶切位点，得到d1MYB1P Dg7BG-GT1载体；
使用上游引物SEQ ID NO.10和下游引物SEQ ID NO.11对载体d1MYB1P Dg7BG-GT1中的Dg7BG-GT1基因表达盒进行PCR扩增，回收目的片段，设为片段C，使用内切酶Asc I切割d2CCD4PDgSCPL2载体，将载体线性化，将灭活的酶切混合液置于透析膜上放置，回收透析后的反应混合液，设为片段D；将片段D与片段C进行Gibson组装后将反应混合液置于透析膜上放置，取透析后的反应混合液电击转化大肠杆菌DH10B，筛选阳性单克隆菌斑并测序验证，从而获得同时含有两个表达盒的新载体322d2-7BG-SCPL2；
将Genebank登录号为KY420082.1的空载体pYLTAC380N称为380N，将等量的空载体380N和上述载体322d1-7GT-Ct3’5’GT混合均匀后电击转化NS3529感受态菌株中，NS3529菌株内表达的细菌噬菌体P1的I型拓扑异构酶能在loxP位点的作用下进行片段间置换，将7GT-Ct3’5’GT双表达盒整合到380N载体上，电击转化后在卡纳霉素Kan+氯霉素Chl双抗平板上培养，收集平板上所有菌落进行质粒提取，获得质粒混抽液，该质粒混抽液体系为质粒间进行片段置换各种时期质粒共存的混合体，使用归巢酶I-Sce I将未完成置换的载体线性化，仅保留已完成反应的环状载体，将混合液置于透析膜上放置后，取透析后的反应混合液电击转化大肠杆菌DH10B，筛选阳性单克隆菌斑并测序验证，从而获得同时含有两个表达盒的新载体380N-7GT-Ct3’5’GT；
将等量的载体380N-7GT-Ct3’5’GT和载体322d2-7BG-SCPL2混合均匀后电击转化NS3529感受态菌株中，NS3529菌株内表达的细菌噬菌体P1的I型拓扑异构酶能在loxP位点的作用下进行片段间置换，将7BG-SCPL2双表达盒整合到380N-7GT-Ct3’5’GT载体上；电击转化后在卡纳霉素Kan+氨苄青霉素Amp双抗平板上培养，收集平板上所有菌落进行质粒提取，获得质粒混抽液，该质粒混抽液体系为质粒间进行片段置换各时期共存的混合体，使用归巢酶PI-Sce I将未完成置换的载体线性化，仅保留已完成反应的环状载体，将混合液置于透析膜上放置后，取透析后的反应混合液电击转化大肠杆菌DH10B，筛选阳性单克隆菌斑，从而获得同时含有四个表达盒的新载体380N-7BG-SCPL2-7GT-Ct3’5’GT；
重复上述步骤，将上述载体d1F3HPCamF3’5’H与载体380N-7BG-SCPL2-7GT-Ct3’5’GT混匀后电击转化NS3529感受态菌株，将CamF3’5’H表达盒整合到载体380N-7BG-SCPL2-7GT-Ct3’5’GT上，从而获得新载体380N-CamF3’5’H-7BG-SCPL2-7GT-Ct3’5’GT。
3.一种飞燕草DgAA7GT、DgSCPL2和DgAA7BG-GT1、及风铃草CamF3’5’H和蝶豆花CtA3’5’ GT基因的共表达载体，其特征在于，采用以下步骤制备：
在GenBank登录号为FW570860.1的菊花基因F3H的启动子序列的 3’端加上如SEQ IDNO. 1所示的NtADH的5’UTR序列得到新的基因片段，将该基因片段分别插入到GenBank登录号为KY420076.1的pYL322d1和GenBank登录号为KY420077.1的pYL322d2载体的Xho I和Pst I酶切位点，分别得到d1F3HP和d2F3HP载体；
在GenBank登录号为AB115560.1的蝶豆花CtA3’5’GT基因序列的终止密码子后加上如SEQ ID NO. 2所示的35S PolyA终止子序列，然后插入到所述d2F3HP载体的Kpn I和Sma I位点，得到d2F3HPCtA3’5’GT载体；
将GenBank登录号为D14590.1的风铃草CamF3’5’H基因序列加上如SEQ ID NO. 3所示的Nos终止子序列，然后插入到所述d1F3HP载体的 Kpn I和Sma I位点，得到d1F3HP CamF3’5’H载体；
在由如SEQ ID NO.6所示的章鱼碱合成酶基因启动子中增强子序列和如SEQ ID NO.7所示的月季花瓣特异表达的查尔酮合成酶基因启动子片段RCHS拼接后形成的月季花特异嵌合启动子pOCSenhancer-RCHS的3’端加上如SEQ ID NO. 1所示的NtADH的5’UTR序列得到新的启动子片段，将该启动子片段插入到GenBank登录号为KY420076.1的pYL322d1载体的Pst I和Nco I酶切位点，得到d1 RCHSA载体；将GenBank登录号为AB510758的飞燕草DgAA7GT 基因的3’端加上如SEQ ID NO. 3所示的Nos终止子序列，然后插入到所述d1RCHSA载体的Nco I和Xma I酶切位点, 得到d1 RCHSADg7GT载体；
使用上游引物SEQ ID NO.8和下游引物SEQ ID NO.9对所述的d2F3HPCtA3’5’GT载体中的Ct3’5’GT基因表达盒进行PCR扩增，回收目的片段，设为片段A；使用内切酶Asc I切割所述的d1 RCHSADg7GT载体，将载体线性化，将灭活的酶切混合液置于透析膜上，以1/3 TE缓冲液为透析液，根据离子浓度差进行单向渗透，去除混合液中的盐离子等杂质，设为片段B；将片段A与片段B进行Gibson组装后将反应混合液置于透析膜上放置，取透析后的反应混合液电击转化大肠杆菌DH10B，筛选阳性单克隆菌斑并测序验证，从而获得同时含有两个表达盒的新载体322d1-7GT-Ct3’5’GT；
在GenBank登录号为AB763911.1的菊花启动子CmCCD4a-5 promoter的5’端加上如SEQID NO.6所示的章鱼碱合成酶基因启动子中增强子序列得到新的基因片段，将该基因片段插入到GenBank登录号为KY420077.1的pYL322d2载体的Pst I和Nco I酶切位点，得到d2CCD4P载体；将GenBank登录号为AB811449的飞燕草DgSCPL2的3’端加上如SEQ ID NO. 2所示的35S PolyA终止子序列，然后插入到所述d2CCD4P载体的Xma I和 Sal I 酶切位点，得到d2CCD4PDgSCPL2载体；
在GenBank登录号为AB232773.1的牵牛花启动子InMYB1P的3’端加上如SEQ ID NO. 1所示的NtADH的5’UTR序列得到新的基因片段，将该基因片段插入到GenBank登录号为KY420076.1的pYL322d1载体的Pst I和Nco I酶切位点，得到d1MYB1P载体；将GenBank登录号为AB811444的飞燕草DgAA7BG-GT1 的3’端加上如SEQ ID NO. 3所示的Nos终止子序列，然后插入到所述d1MYB1P载体的Xma I和 Sal I酶切位点，得到d1MYB1P Dg7BG-GT1载体；
使用上游引物SEQ ID NO.10和下游引物SEQ ID NO.11对载体d1MYB1P Dg7BG-GT1中的Dg7BG-GT1基因表达盒进行PCR扩增，回收目的片段，设为片段C，使用内切酶Asc I切割d2CCD4PDgSCPL2载体，将载体线性化，将灭活的酶切混合液置于透析膜上放置，回收透析后的反应混合液，设为片段D；将片段D与片段C进行Gibson组装后将反应混合液置于透析膜上放置，取透析后的反应混合液电击转化大肠杆菌DH10B，筛选阳性单克隆菌斑并测序验证，从而获得同时含有两个表达盒的新载体322d2-7BG-SCPL2；
将Genebank登录号为KY420082.1的空载体pYLTAC380N称为380N，将等量的空载体380N和上述载体322d1-7GT-Ct3’5’GT混合均匀后电击转化NS3529感受态菌株中，NS3529菌株内表达的细菌噬菌体P1的I型拓扑异构酶能在loxP位点的作用下进行片段间置换，将7GT-Ct3’5’GT双表达盒整合到380N载体上，电击转化后在卡纳霉素Kan+氯霉素Chl双抗平板上培养，收集平板上所有菌落进行质粒提取，获得质粒混抽液，该质粒混抽液体系为质粒间进行片段置换各种时期质粒共存的混合体，使用归巢酶I-Sce I将未完成置换的载体线性化，仅保留已完成反应的环状载体，将混合液置于透析膜上放置后，取透析后的反应混合液电击转化大肠杆菌DH10B，筛选阳性单克隆菌斑并测序验证，从而获得同时含有两个表达盒的新载体380N-7GT-Ct3’5’GT；
将等量的载体380N-7GT-Ct3’5’GT和载体322d2-7BG-SCPL2混合均匀后电击转化NS3529感受态菌株中，NS3529菌株内表达的细菌噬菌体P1的I型拓扑异构酶能在loxP位点的作用下进行片段间置换，将7BG-SCPL2双表达盒整合到380N-7GT-Ct3’5’GT载体上；电击转化后在卡纳霉素Kan+氨苄青霉素Amp双抗平板上培养，收集平板上所有菌落进行质粒提取，获得质粒混抽液，该质粒混抽液体系为质粒间进行片段置换各时期共存的混合体，使用归巢酶PI-Sce I将未完成置换的载体线性化，仅保留已完成反应的环状载体，将混合液置于透析膜上放置后，取透析后的反应混合液电击转化大肠杆菌DH10B，筛选阳性单克隆菌斑，从而获得同时含有四个表达盒的新载体380N-7BG-SCPL2-7GT-Ct3’5’GT；
重复上述步骤，将上述载体d1F3HPCamF3’5’H与载体380N-7BG-SCPL2-7GT-Ct3’5’GT混匀后电击转化NS3529感受态菌株，将CamF3’5’H表达盒整合到载体380N-7BG-SCPL2-7GT-Ct3’5’GT上，从而获得新载体380N-CamF3’5’H-7BG-SCPL2-7GT-Ct3’5’GT。
4.一种蓝色菊花的培育方法，其特征在于：将权利要求3所述的表达载体导入切花菊中，经过抗性筛选得到阳性转化植株，对阳性转化植株进行PCR鉴定、荧半定量RT-PCR检测，获得转飞燕草苷DgAA7GT、DgSCPL2、DgAA7BG-GT1、及风铃草CamF3’5’H和蝶豆花CtA3’5’GT基因共表达的切花菊。
5. 根据权利要求4所述的蓝色菊花的培育方法，其特征在于：对阳性转化植株进行PCR鉴定、半定量RT-PCR检测的过程具体包括如下步骤：
（1）PCR检测
分别提取待检测菊花抗性生根植株的基因组DNA，将抗性基因Kan和Ct3'5'GT作为检测目标，检测植物表达载体是否整合到植物基因组中，引物序列如下：
上游引物Kan-F：序列如SEQ ID NO.12所示，
下游引物Kan-R：序列如SEQ ID NO.13所示；
上游引物Ct3'5'GT-F：序列如SEQ ID NO.14所示;
下游引物Ct3'5'GT-R：序列如SEQ ID NO.15所示；
以提取的DNA为模板，分别以Kan-F和Kan-R，Ct3'5'GT-F和Ct3'5'GT-R为引物进行PCR反应，扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳检测分析；
（2）半定量RT-PCR分子检测
分别提取用Kan、Ct3'5'GT引物进行PCR扩增检测有目的条带的植株叶片总RNA，消化基因组DNA，反转录合成第一链cDNA，建立半定量RT-PCR扩增体系，特异引物序列如下：
上游引物qCtA3'5'GT-F：序列如SEQ ID NO. 16所示，
下游引物qCtA3'5'GT-R：序列如SEQ ID NO.17所示；
上游引物qCamF3'5'H-F：序列如SEQ ID NO.18所示，
下游引物qCamF3'5'H-R：序列如SEQ ID NO.19所示；
上游引物qDg7GT-F：序列如SEQ ID NO.20所示，
下游引物qDg7GT-R: 序列如SEQ ID NO.19所示；
上游引物qDg7BG-GT1-F： 序列如SEQ ID NO.21所示，
下游引物qDg7BG-GT1-R: 序列如SEQ ID NO.19所示；
上游引物qDgSCPL2-F: 序列如SEQ ID NO.22所示，
下游引物qDgSCPL2-R: 序列如SEQ ID NO.23所示；
所用内参基因为EF1α，引物序列为：
上游引物CmEF1α-F：序列如SEQ ID NO. 24所示，
下游引物CmEF1α-R：序列如SEQ ID NO.25所示；
经过PCR、半定量RT-PCR检测均为阳性，确定获得转基因菊花株系。
6.权利要求3所述的飞燕草苷合成相关的基因DgAA7GT、DgAA7BG、DgSCPL2、及风铃草CamF3’5’H和蝶豆CtA3’5’GT五个基因共表达载体380N-CamF3’5’H-7BG-SCPL2-7GT-Ct3’5’GT在培育蓝色菊花上的应用。
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Isolation and Functional Analysis of Genes Involved in Polyacylated Anthocyanin Biosynthesis in Blue Senecio cruentus;Chenfei Lu et al.;Front Plant Sci;第12卷;640746 *

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