DE10119432A1 - Genetische Sequenz, die für Flavonsynthase I Enzyme kodiert, und deren Verwendung - Google Patents

Abstract

Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf genetische Sequenzen, die für Enzyme des Flavonoidstoffwechsels kodieren, speziell für die Flavonsynthase I (FNS I), oder Derivate hiervon und deren Verwendung zur gezielten Veränderung der Blütenfarbe, zur Veränderung des Flavongehaltes bzw. -musters in Blättern, Blüten und anderen Geweben von Pflanzen und anderen Organismen und darüber hinaus die Verwendung in Expressionssystemen zur Synthese von natürlichen, funktionellen Flavonen für medizinische oder ähnliche Anwendungen, z. B. zur Krebstherapie oder Verbesserung der menschlichen Immunabwehr.

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft genetische Sequenzen, die für Enzyme des Flavonoid­ stoffwechsels kodieren, speziell für die Flavonsynthase I (FNS I) oder Derivate hiervon und deren Verwendung zur gezielten Veränderung der Blütenfarbe, zur Veränderung des Flavonoid- und Flavongehaltes bzw. -musters in Blättern, Blüten und anderen Geweben von Pflanzen und anderen Organismen und darüberhinaus die Verwendung in verschiedenen Expressionssystemen zur Synthese von natürlichen, funktionellen Flavonen für medizinische, kosmetische oder ähnliche Anwendungen, z. B. zur Krebstherapie.

Flavonoide und deren Funktion in der Pflanze

Flavonoide sind die wichtigsten und am weitesten verbreiteten Pflanzenpigmente, die in ver­ schiedenen Geweben, wie z. B. Blüten, Blättern oder Wurzeln nachgewiesen wurden. Darüber hinaus gehören sie zu den am besten charakterisierten sekundären Metaboliten in Pflanzen. Mehr als 6400 verschiedene Flavonoide sind bislang charakterisiert worden. Sie sind in verschiedene Unterklassen (z. B. Flavone, Flavonole oder Anthocyane), basierend auf dem Grad der Oxidation des zentralen C-Ringes, eingeteilt worden. Jeder Typ kann darüberhinaus durch Hydroxylierung, Acylierung und Glykosylierung modifiziert werden (Heller und Forkmann, 1994; Harborne and Williams, 2001). Aufgrund der unterschiedlichen physikalisch-chemischen Eigenschaften der Moleküle besitzen die Unterklassen zum Teil sehr verschiedene biologische Funktionen.

Die Akkumulation bestimmter Flavonoide in einer Pflanzenzelle ist abhängig von der Verfüg­ barkeit der jeweiligen Enzyme, wobei die Verfügbarkeit der Enzyme letztendlich von der Expression des entsprechenden Gens abhängt. Die Regulierung der Expression von Flavo­ noidbiosynthese-Genen wird im wesentlichen von der Pflanzenart, dem Entwicklungsstadium und den Umweltbedingungen bestimmt.

Flavonoide spielen sowohl innerhalb als auch außerhalb der Pflanze eine wichtige Rolle. So wurde z. B. gezeigt, daß bestimmte Flavonole für das Pollenschlauchwachstum erforderlich sind. Wird die Akkumulation der Flavonole durch eine Blockierung des Biosyntheseweges unterdrückt, erhält man sterile Pollen (Taylor and Jorgensen, 1992). Sowohl biotische als auch abiotische Signale können während der Interaktion der Pflanze mit ihrer Umwelt zu einer Flavonoidakkumulation führen. So führt z. B. eine UV-Bestrahlung zu einer Akkumulation von Flavonolen und Flavonen. Dies wird durch die Induktion der Transkription der jeweiligen Flavonoidbiosynthese-Gene in verschiedenen Arten erreicht (Kubasek et. al., 1992). Aber auch andere Streßfaktoren wie Verwundung, extreme Temperaturschwankungen und Wasserstreß können die Flavonoidakkumulation und/oder Genexpression in verschiedenen Arten induzieren (Hrazdina, 1982). Bei der Interaktion von Pflanzen mit anderen Organismen wird den Flavonoiden eine doppelte Funktion zugeordnet. Zum einen besitzen die Flavonoide als phenolische Verbindungen eine Wirkung als Phytoalexin gegen verschiedene Pathogene und als Abschreckung gegen Fraßfeinde (Harborne und Grayer, 1994), zum anderen sind sie verantwortlich für die Kommunikation zwischen Pflanzen aus der Familie der Leguminosen und bestimmten Mikroorganismen. Flavonoide dienen hierbei als Signalstoffe für Stickstoff-fixierende Bakterien, in denen daraufhin Gene exprimiert werden, die für die Symbiose mit der Pflanze erforderlich sind (Redmond et. al., 1986). In Blüten, Blättern und Früchten sind Flavonoide, besonders die farbigen Anthocyane, aber auch Chalkone, Aurone, Flavone und Flavonole, für die Farbgebung und für die Muster der verschiedenen sekundären Inhaltsstoffe verantwortlich. Letzteres ist zusammen mit anderen Merkmalen, wie z. B. dem Duft, wichtig für die Erkennung durch verschiedene Tiere, aber auch für den Menschen, der die Pflanze als Schmuck oder zur Ernährung verwendet (Harborne und Grayer, 1994). Außerdem beeinflussen bestimmte Flavonoide, wie z. B. das Flavon Apigenin und das Flavonol Quercetin, den Auxin Transport innerhalb der Pflanze (Jacobs und Rubery, 1988).

Der Flavonoidbiosynthese-Weg (Abb. 1A)

Die Struktur der Flavonoide besteht aus zwei aromatischen Ringen (A und B) und einem zentralen Heterozyklus (C) (Abb. 1B). In der Pflanze werden sie ausgehend vom L-Phenylalanin über den Phenylpropanoid-Weg durch die enzymatische Reaktion der Phenylalanin-Ammonia- Lyase (PAL) und der Zimtsäure-4-Hydroxylase (4CL) gebildet. Aus dem hieraus resultierenden 4- Cumaroyl-CoA entsteht zusammen mit 3 Molekülen Malonyl-CoA Tetrahydroxychalkon. Diese Reaktion wird durch die Chalkonsynthase (CHS), dem Schlüsselenzym der Flavonoidbiosynthese, synthetisiert (Abb. 1A). Das Tetrahydroxychalkon (THC) wird normalerweise schnell zu Naringenin (NAR) durch das Enzym Chalkonisomerase (CHI) isomerisiert. In verschiedenen weiteren Reaktionen entstehen die Anthocyane. Flavone werden auf einem Nebenweg durch die FNS I, einer löslichen 2-Oxoglutarat-abhängigen Dioxygenase, oder durch die FNS II, einem membrangebundenen Cytochrom P450-Enzym, gebildet. Diese zwei Enzymklassen sind in der Natur weit verbreitet und verschiedene Gene für Dioxygenasen bzw. Cytochrom P450 Enzyme wurden aus Vertebraten, Insekten, Hefen, Pilzen, Bakterien und Pflanzen isoliert und sequenziert.

Die Flavonsynthasen verwenden verschiedene Flavanone, wie z. B. NAR oder Eriodictyol (ERI) als Substrat, um die entsprechenden Flavone Apigenin (Ap) und Luteolin (Lu) zu synthetisieren. Dabei wird, wie in Abb. 1B dargestellt, zwischen der C2- und der C3-Position eine Doppelbindung eingefügt. Flavone können in der Pflanze in glykolysierter oder auch methylierter Form vorliegen.

In vitro wurde die Bildung von Flavonen aus Flavanonen zuerst mit Enzympräparationen von UV- bestrahlten Petrosellum crispum-Zellsuspensionskulturen beobachtet. Bei dem entsprechenden Enzym handelt es sich, wie oben bereits erwähnt, um eine lösliche 2-Oxoglutarat-abhängige Dioxygenase, die Flavonsynthase I (FNS I) genannt wurde. In den Blüten von verschiedenen Flavon-produzierenden Pflanzen, z. B. Sinningia cardinalis, Antirrhinum majus, Verbena Hybrida, Columnea hybrida, Chrysanthemum morifolium, Gerbere Hybriden und osmotisch induzierten Glycine max-Zellsuspensionskulturen, wird diese Reaktion jedoch von der ebenfalls oben bereits erwähnten FNS II katalysiert, einem NADPH-abhängigen, mikrosomalen Enzym, das zur Klasse der Cytochrom P450 gehört (Heller und Forkmann, 1994). Sequenzen, die für entsprechende Proteine in Gerbera Hybriden, Antirrhinum majus und Torenia Hybriden, konnten kürzlich mit Hilfe von Differential Display unter Verwendung von chemogenetisch definiertem Pflanzenmaterial bzw. durch Genbank Screening mit CYP93B1 isoliert werden (Martens und Forkmann, 1998, 1999; Akashi et al., 1999).

Drei Typen von Pigmenten sind für die Farben in Blüten verantwortlich: Betalaine, Carotinoide und Flavonoide. Betalaine kommen nur in einigen wenigen Familien der Centrospermae vor, wo sie für gelbe, orange, rote und violette Farben verantwortlich sind. Carotinoide ergeben orange oder gelbe Töne und sind die Hauptpigmente in den meisten orangen und gelben Blüten. Flavonoide sind die wichtigsten und am weitesten verbreiteten Blüten- bzw. Pflanzenpigmente. Zu dieser Gruppe gehören die farbgebenden Anthocyane, die glykosyliert und oft acyliert in der Vakuole vorliegen. Unterschiedliche Anthocyane können dabei verschiedene Farbtöne produzieren. Die Blütenfarbe wird darüber hinaus auch vom pH-Wert der Vakuole, der Komplexierung mit Metallen und dem Glykosylierungs- bzw. Acylierungsmuster beeinflußt (Forkmann, 1991). Ein weiterer wichtiger Faktor für die Entstehung von verschiedenen Blütenfarben ist die Kopigmentierung der Anthocyane mit farblosen Flavonoiden, wie z. B. Flavonen oder Flavonolen oder auch Tanninen (Scott-Moncrieff, 1936). Anthocyane, die mit Flavonen kopigmentiert sind, können verschiedene Farben annehmen, die von der Grundstruktur des Anthocyan abhängen, und zwischen purpurrot und blau variieren können (Asen und Horowitz, 1974; Goto und Kondo, 1991). Verschiedene Flavone, wie z. B. das Isoetin, sind darüber hinaus auch als gelbe Blütenpigmente identifiziert worden (Harborne, 1978).

Ein wichtiges Ziel in der gartenbaulichen Pflanzenzüchtung ist die Entwicklung von neuen Sorten bei blühenden Zierpflanzen. Klassische Züchtungsmethoden wurden in der Vergangenheit teilweise erfolgreich zur Etablierung für eine Reihe von verschiedenen Farben bei vielen wirtschaftlich wichtigen Zierpflanzen eingesetzt. Jedoch schränkt der Genpool der einzelnen Arten die Möglichkeiten für solche Ansätze auf natürliche Art und Weise ein. Aus diesem Grund gibt es bis heute nur wenige Arten, die das gesamte Farbspektrum besitzen. Außerdem kann durch die klassischen Züchtungsmethoden keine präzise Veränderung erzielt werden. Da der ästetische Wert einer Blüte von verschiedenen Faktoren wie z. B. Form, Duft und Farbe bestimmt wird und eine Veränderung eines dieser Faktoren durch Kreuzung in der Regel nur auf Kosten von ähnlichen, anderen sichtbaren Merkmalen erzielt oder nur mit sehr hohem zeitlichen und finanziellen Aufwand erreicht werden kann, muss ein effektiverer Weg zu neuen Sorten genutzt werden. Die Möglichkeit, gezielt Blütenfarben von Pflanzen zu verändern, bringt eindeutige Vorteile gegenüber anderen Methoden. Dies ist besonders in einem Bereich wichtig, der einen hohen Produkt-Turnover besitzt und wo Neuheit ein wichtiger Marktfaktor ist. Zum Beispiel würde die Entwicklung von blaublühenden Sorten bei den Hauptschnittblumen-Arten wie Rosen, Chrysanthemen, Nelken, Lilien, Tulpen und Gerbera einen wesentlichen Marktvorteil auf dem Schnittblumenmarkt, aber auch auf dem Topfpflanzenmarkt mit sich bringen. Die Möglichkeit der Kontrolle der Synthese von Kopigmenten, z. B. Flavone, in Pflanzen ist eine nützliche Anwendung bei der gezielten Veränderung der Blütenfarben. Außerdem kann diese Anwendung neben den Blüten auch auf Früchte und andere Nutzpflanzen, z. B. auf Obst- und Gemüsepflanzen, und auf Blätter, z. B. bei Zierpflanzen, übertragen werden.

Neben ihrem Beitrag zur Blütenfarbe besitzen die Flavonoide, speziell die Flavone, noch weitere biologische Eigenschaften und Wirkungen. Sie wurden z. B. bei einigen Pflanzen als Fraßstimulanz für monophage und oligophage Insekten gefunden (Harborne und Grayer, 1994). In den meisten Fällen zeigen die Glykoside dabei eine bei weitem größere Wirkung als die entsprechenden Aglyka, was vermutlich auf die bessere Löslichkeit der Glykoside zurückzuführen ist. Außerdem können die Insekten zwischen verschiedenen Zuckerresten unterscheiden, wodurch eine weitere Differenzierung der aktiven Komponenten gegeben ist. Auch die Grundstruktur der Aglyka kann zu unterschiedlichen Wirkungen führen. Im Vergleich zu vielen anderen sekundären Pflanzeninhaltsstoffen haben die Flavonoide bzw. die Flavone offensichtlich keine sehr toxische Wirkung auf Insekten. Trotzdem gibt es einige Flavone, die schon bei geringen Konzentrationen als Abschreckung für Fraßinsekten fungieren oder das Wachstum der Tiere erheblich hemmen können. Ein Einfluß der Glykosylierungsart konnte hier nicht gezeigt werden, wohl aber der der Hydroxylierung bzw. Methoxylierung des Flavons (Harborne und Grayer, 1994).

Verschiedene Flavone stimulieren darüber hinaus auch Schmetterlinge zur Eiablage auf bestimmten Pflanzen. Es wurde gezeigt, daß die Tiere erst nach dem Erkennen des Stimulus ihre Eier ablegen. Zu solchen stimulierenden Substanzen gehören z. B. die Flavone Vicenin-2 und verschiedene Luteolin-Derivate. Unterbindet man die Synthese dieser Stoffe in den jeweiligen Wirtspflanzen, können Eiablagen der Schmetterlinge und damit Fraßschäden durch deren Raupen verhindert werden.

Durch die Ausnutzung natürlicher chemischer Abwehrmechanismen der Pflanzen können Probleme, die die Verwendung von synthetischen Insektiziden mit sich bringt, wie z. B. die Umweltbelastung, die durch Reste der eingesetzten Stoffe in der Frucht und im Boden auftreten, vermieden werden. Außerdem wird eine Resistenzbildung, wie sie bei den meisten synthetischen Pestiziden beobachtet wird, umgangen oder zumindestens verzögert werden und es werden die zum Teil erheblichen Kosten für Mittel und Ausbringung eingespart.

Eine weitere wichtige biologische Eigenschaft der Flavonoide betrifft die Aktivierung der Nodulationsgene in verschiedenen Rhizobium-Arten. Diese Bakterien infizieren Leguminosen und bilden Stickstoff-fixierende Wurzelknöllchen. Die von der Wirtspflanze produzierten Flavonoide fungieren dabei als "Signalstoff", wodurch die Bakterien den Infektionsprozeß einleiten. Zu diesen pflanzenspezifischen, aktiven Verbindungen gehören auch verschiedene Flavone, wie z. B. Apigenin, Luteolin und 7,4'-Dihydroxyflavon (Firmin et. al., 1986; Redmond et. al., 1986). Wird die Flavonproduktion und deren Abgabe durch die Wurzel bzw. das Flavonmuster in diesem Gewebe verändert, kann eine Verbesserung der Stickstoff-Fixierung oder aber eventuell eine Etablierung dieses Mechanismus bei Nicht-Leguminosen Pflanzen erreicht werden.

Durch Ausnutzung dieser natürlichen Symbiosemechanismen kann die Stickstoff-Düngung und damit die Belastung der Umwelt durch die Auswaschung der Nährstoffe reduziert werden. Zudem werden Kosten für die Düngermittel und deren Ausbringung eingespart.

Innerhalb der Pflanze beeinflussen verschiedene natürlich vorkommende Flavonoide, wie z. B. das Flavon Apigenin oder die Flavonole Kaempferol und Quercetin, den Auxin-Transport in unterschiedlichen Pflanzengeweben und Transportsystemen. Sie verhalten sich dabei ähnlich wie synthetische Transportinhibitoren. Auxine beeinflussen als pflanzeneigene Wachstumsregulatoren die Zellstreckung, Zellteilung, Apikaldominanz, Wurzel- und Sproß­ neubildung sowie die Parthenokarpie. Eine induzierte, veränderte Flavonoidkonzentration (endogene Veränderung und/oder exogene Applikation) kann somit über die Interaktion mit Auxinen das Wachstum von Pflanzen erheblich beeinflussen. Dadurch können synthetische Wuchshemmstoffe ersetzt werden.

Flavonoide besitzen als bioaktive Substanzen darüber hinaus auch eine nicht unbedeutende Rolle bei der menschlichen und tierischen Ernährung. Sie kommen in Früchten, Gemüsen, Nüssen, Samen, Stengeln, aber auch in Tee und Wein vor. Schon seit längerem werden den Flavonoiden, auch verschiedenen Flavonen, antiallergische, entzündungshemmende, antivirale, proliferationsreduzierende und anticanzerogene Eigenschaften zugesprochen. Aber auch ein Einfluß auf den menschlichen und tierischen Stoffwechsel und das hochkomplexe Immunsystem wird beschrieben. Die Flavonoide bzw. Flavone beeinflussen in diesem Zusammenhang eine große Anzahl verschiedener Enzyme (z. B. die Hyaluronidase- oder Aldose-Reduktase), sie besitzen wichtige, enzyminduzierende und antioxidative Eigenschaften, können freie Radikale abfangen, chelatisieren verschiedene Metallkationen und beeinflussen auch die zelluläre Proteinphosphorylierung (Middleton und Kandaswami, 1994).

Die Verbesserung von Nutzpflanzen, die für die Ernährung von Mensch und Tier aufgrund ihres Gehalts an gesundheitsfördernden Flavonoiden wichtig sind, durch die gezielte Veränderung des Gehalts oder Musters der entsprechenden Verbindungen, leistet einen erheblichen Beitrag zur gesunden Ernährung von Mensch und Tier.

Es war daher eine Aufgabe der vorliegenden Erfindung, weitere Mittel und Verfahren bereitzustellen (zusätzlich zur Flavonsynthase II und deren Verwendung), um gezielt die Flavonoidbiosynthese bzw. die Bildung von Flavonen in Pflanzen zu verändern und zu steuern, um z. B. die Blütenfarbe einer Pflanze zu verändern oder die Resistenzeigenschaften und Symbiosefähigkeit einer Pflanze zu verbessern.

Weiterhin war eine Aufgabe der vorliegenden Erfindung, weitere und effektivere Mittel und Verfahren bereitzustellen, die zur gezielten Synthese von definierten Flavonen verwendet werden können. Derartig gewonnene Flavone können unter anderem bei der Krebstherapie oder in Kosmetika Verwendung finden oder in Form von Medikamenten zur Gesundheit von Mensch und Tier beitragen.

Diese Aufgabe wird erfindungsgemäß durch die Patentansprüche gelöst.

Die Erfindung betrifft daher eine Nukleinsäuresequenz, die für eine Flavonsynthase I (FNS I) kodiert. In einer Ausführungsform betrifft die Erfindung eine in SEQ ID NO: 1 gezeigte Nukleinsäuresequenz oder einen Teil hiervon. In einer weiteren Ausführungsform betrifft die Erfindung eine Nukleinsäuresequenz, die mit der in SEQ ID NO: 1 gezeigten Nukleinsäure­ sequenz oder einem Teil hiervon hybridisiert und/oder mindestens eine 60%ige, besser eine mindestens 65%ige, noch besser eine mindestens 70%ige oder am besten mindestens eine 75%ige Homologie oder am besten eine Homologie größer als 80% auf der Ebene der Nukleinsäuresequenz oder Aminosäuresequenz zu mindestens einem oder mehreren Bereichen (bevorzugt über den ganzen Bereich) der in SEQ ID NO: 1 dargestellten Sequenz besitzt. Bevorzugt kodiert die Nukleinsäuresequenz ein Protein oder Polypeptid mit der biologischen Aktivität einer Flavonsynthase I. In einer weiteren Ausführungsform betrifft die Erfindung eine Nukleinsäuresequenz, die degeneriert ist bezogen auf eine Nukleinsäuresequenz gemäß der vorhergehenden Ausführungsformen. In einer bevorzugten Ausführungsform ist die erfindungsgemäße Nukleinsäuresequenz DNA oder RNA und ist abgeleitet aus einer flavonhaltigen Pflanze, z. B. der Familie der Apiaceae (Daucus carota u. a.). In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform ist die erfindungsgemäße Nukleinsäuresequenz eine rekombinante Nukleinsäuresequenz. Des weiteren betrifft die Erfindung eine Nukleinsäuresequenz, die zu der Flavonsynthase I (FNS I)-kodierenden Sequenz komplementär ist.

Folglich stellt die vorliegende Erfindung eine isolierte Nukleinsäure zur Verfügung, die eine für Flavonsynthase I (FNS I) oder für ein funktionelles Derivat dieses Enzyms kodierende Nukleinsäure oder eine komplementäre Nukleinsäure umfaßt. Mit dem Begriff "FNS I Enzym" sind Enzyme des Flavonoidbiosyntheseweges gemeint, die z. B. Flavanone wie Naringenin und Eriodictyol oder auch andere Verbindungen aus dieser Klasse als Substrat für die Synthese der entsprechenden Flavone (in diesem Fall Apigenin und Luteolin) verwenden. Bevorzugt bezeichnet "FNS I Enzym" oder "Flavonsynthase I Enzym" eine bevorzugt lösliche, 2-Oxoglutarat- abhängige Dioxygenase. Bevorzugte Flavonsynthase I Enzyme sind solche, die eine Doppelbindung zwischen dem C2 und C3 Atom von Flavanonen wie Naringenin und Eriodictyol einführen. Das erfindungsgemäße Flavonsynthase I Enzym ist weiterhin dadurch charakterisiert, dass die katalysierte Reaktion bevorzugt unabhängig von NADPH stattfindet. Das erfindungsgemäße Flavonsynthase I Enzym ist auch dadurch charakterisiert, dass es nich membrangebunden ist. Das erfindungsgemäße Flavonsynthase I Enzym ist weiterhin bevorzugt dadurch charakterisiert, dass es kein Cytochrom P450-Enzym ist.

Bevorzugt ist eine erfindungsgemäße Nukleinsäure, die aus dem natürlichen Umfeld isoliert oder chemisch synthetisiert wurde. Insbesondere bevorzugt sind Nukleinsäuremoleküle, die in vitro gebildet oder erhalten werden, einschließlich genomischer DNA-Fragmente, rekombinanter und synthetischer Moleküle und Nukleinsäuren in Kombination mit heterologen Nukleinsäuren. Dies umfaßt auch genomische DNA oder cDNA oder Teile davon, die die FNS I oder Teile davon in reverser Orientierung zum entsprechenden oder einem anderen Promotor kodieren. Weiter eingeschlossen sind natürlich vorkommende, nahe verwandte Nukleinsäuresequenzen.

Der Begriff "Nukleinsäuresequenz, kodierend eine Flavonsynthase I", wird hierbei in der allgemeinsten Form gebraucht und umfaßt jede aufeinanderfolgende Reihe von Nukleotidbasen, die direkt oder über eine komplementäre Reihe von Basen eine Aminosäuresequenz einer FNS I bestimmt.

Ein Polypeptid mit einem Teil oder der gesamten Aminosäuresequenz der Flavonsynthase I meint eine vollständige (full length) FNS I oder eine aktive, unvollständige Form derselben.

In einer weiteren Ausführungsform betrifft die Erfindung Oligonukleotide, die als genetische Proben oder als "Antisense"-Moleküle zur Regulierung der Expression des entsprechenden Gens in Pflanzen oder anderen Organismen verwendet werden können. Ein "Antisense-Molekül", wie es hier beschrieben ist, umfaßt auch ein Genkonstrukt, das aus einem strukturellen, genomischen oder einem cDNA-Gen oder einem Teil hiervon in reverser Orientierung in Bezug auf seinen oder einen anderen Promotor besteht.

In einer weiteren Ausführungsform wird die Nukleinsäuresequenz, die für die FNS I oder für verschiedene funktionelle Derivate dieser kodiert, zur Reduzierung der Aktivität von endogener FNS I verwendet, oder alternativ wird eine Nukleinsäuresequenz, die dieses Enzym oder verschiedene Derivate oder Teile davon kodiert, in Antisense-Orientierung verwendet, um die Aktivität der FNS I zu reduzieren. Darüber hinaus ist es aber auch möglich, daß ein Antisense- Transkript der FNS I oder ein Fragment oder ein Teil der FNS I (z. B. ein Oligonukleotid-Molekül) eine Duplex mit allen oder Teilen der natürlich vorkommenden mRNA, die das Enzym spezifiziert, eingeht und so eine Akkumulation von oder die Translation der mRNA in das aktive Enzym verhindert. Eine weitere Möglichkeit ist die Verwendung von Ribozymen, um spezielle Nukleinsäuresequenzen zu inaktivieren.

Hier erwähnte Änderungen der FNS I-Aktivität betreffen eine Erhöhung oder Reduzierung der Aktivität von bis zu 30% oder besser von 30 bis 50% oder noch besser 50 bis 75% bzw. am besten von 75% oder noch höher bzw. niedriger zum normalen, endogenen oder existierenden Wert der Aktivität. Die Höhe der Aktivität kann leicht mit der bei Martens und Forkmann (1998) beschriebenen Methode für die FNS II getestet werden (siehe Beispiel 3).

Bei der in dieser Erfindung beschriebenen Nukleinsäure kann es sich auch um eine Ribonu­ kleinsäure oder eine Desoxyribonukleinsäure handeln, die als einzelsträngiges oder doppelsträngiges und lineares oder kovalent kreisförmig geschlossenes Molekül vorliegen kann. Üblicherweise liegt das Nukleinsäuremolekül als cDNA vor. Die vorliegende Erfindung umfaßt auch andere Nukleinsäuremoleküle, die unter niedrig-, besser unter mittel- und am besten unter hoch-stringenten Bedingungen mit erfindungsgemäßen Nukleinsäuremolekülen oder speziell mit der in SEQ ID NO: 1 dargestellten Sequenz oder einem Teil oder einem Bereich davon hybridisieren. Eine besonders bevorzugte Ausführungsform betrifft ein Nukleinsäuremolekül, umfassend die in SEQ ID NO: 1 dargestellte Nukleinsäuresequenz oder ein Molekül, das mindestens eine 60%ige, besser eine mindestens 65%ige, noch besser eine mindestens 70%ige oder am besten mindestens eine 75%ige oder am besten eine Ähnlichkeit höher als 80% auf der Ebene der Nukleinsäuresequenz oder Aminosäuresequenz zu mindestens einem oder mehreren Bereichen (bevorzugt über den ganzen Bereich) der in SEQ ID NO: 1 dargestellten Sequenz besitzt und wobei die Nukleinsäure kodierend oder komplementär zu einer Sequenz ist, die ein Enzym kodiert, das FNS I-Aktivität besitzt.

Die vorliegende Erfindung umfaßt weiter Nukleinsäuremoleküle in der Form von Oligonukleotid- Primern oder kompetente Proben zur Hybridisierung mit einem Teil der oben betrachteten Nukleinsäuremoleküle und spezielle mit dem in SEQ ID NO: 1 dargestellten. Die Hybridisierung kann unter niedrig-, besser unter mittel- und am besten unter hoch-stringenten Bedingung erfolgen. Bevorzugterweise entspricht der Teil dem 5'- oder 3'-Ende des Gens. Aus Zweckmäßigkeit wird das 5'-Ende hier definiert als der Bereich hauptsächlich zwischen dem Startcodon der strukturellen, genetischen Sequenz bis zum mittleren Bereich des Gens. Das 3'- Ende wird hier betrachtet als der Bereich, der die strukturelle genetische Sequenz zwischen dem mittleren Bereich des Gens und dem Stopcodon definiert. Es ist daher klar, daß Oligonukleotide oder Proben mit dem 5'-Ende oder dem 3'-Ende oder mit einem Bereich gemeinsam zu beiden, dem 5'- oder 3'-Ende, hybridisieren können. Die vorliegende Erfindung umfaßt alle solche Proben. Bevorzugte Oligonukleotide sind in Beispiel 4 dargestellt.

Die Nukleinsäure oder ihre komplementäre Form kann das vollständige Enzym oder einen Teil oder ein Derivat kodieren. Mit "Derivat" ist eine einzelne oder multiple Aminosäuresubstitution, -deletion und/oder -addition in Bezug zum natürlich vorkommenden Enzym gemeint, wobei vorzugsweise die Flavonsynthase I-Aktivität erhalten bleibt. In diesem Zusammenhang umfaßt die erfindungsgemäße Nukleinsäure die natürlich vorkommende Nukleotidsequenz, die für die FNS I kodiert und einzelne oder multiple Nukleotidsubstitutionen, -deletionen und/oder -additionen. Die Nukleinsäure der vorliegenden Erfindung oder ihre komplementäre Form kann auch einen Teil der FNS I kodieren, entweder aktiv oder inaktiv. Solch ein Nukleinsäuremolekül kann als Oligonukleotid-Probe, als Primer für die Polymerasekettenreaktion, in verschiedenen mutagenen Techniken oder zur Erstellung von Antisense-Molekülen verwendet werden.

Die Erfindung betrifft weiterhin ein rekombinantes DNA-Molekül, enthaltend eine erfindungs­ gemäße Nukleinsäuresequenz. In einer bevorzugten Ausführungsform ist das rekombinante DNA-Molekül ein Vektor oder ein Vektor mit einem Promotor. In einer besonders bevorzugten Ausführungsform ist der Promotor zur Expression der erfindungsgemäßen Nukleinsäure fähig. Die erfindungsgemäßen Nukleinsäuremoleküle können in einer von beiden Orientierungen in Kombination mit einem Vektormolekül, z. B. einem Expressionsvektor, vorliegen. Der Begriff "Vektormolekül" wird dabei in seiner allgemeinsten Bedeutung verwendet, um jegliche intermediären Vehikel für das Nukleinsäuremolekül einzuschließen, die es z. B. ermöglichen, die Nukleinsäure in Zellen, insbesondere Pflanzenzellen, zu transferieren und/oder sie in ein Genom zu integrieren. Bevorzugt werden diese Vektormoleküle oder Teile davon zur Integration in ein Pflanzengenom verwendet. Solche Vektormoleküle können in prokaryotischen Zellen und/oder in eukaryotischen Zellen repliziert und/oder exprimiert werden. Ein intermediäres Vehikel kann z. B. für den Gebrauch bei der Elektroporation, beim Mikroprojektilbeschuß, beim Transfer mit Hilfe von Agrobakterien oder bei der Insertion über DNA- oder RNA-Viren angepaßt sein. Das intermediäre Vehikel und/oder das darin enthaltene Nukleinsäuremolekül kann stabil im Pflanzengenom integriert werden. Das Nukleinsäuremolekül kann zusätzlich auch noch eine Promotor-Sequenz beinhalten, die zur Einleitung der Expression des Nukleinsäuremoleküls in einer Zelle, insbesondere einer Pflanzenzelle, geeignet ist. Das Nukleinsäuremolekül und der Promotor können ebenfalls durch verschiedene Verfahren (siehe oben) in die Zelle eingeführt werden.

Die Erfindung betrifft auch Wirtszellen, die diese erfindungsgemäßen DNA-Moleküle enthalten. Die Wirtszellen können prokaryotische oder eukaryotische Zellen sein, insbesondere Hefezellen, Insektenzellen, Pflanzenzellen und Säugerzellen.

Die Erfindung betrifft weiterhin ein Polypeptid, das durch eine erfindungsgemäße Nukleinsäure kodiert wird. In einer bevorzugten Ausführungsform betrifft die Erfindung ein Polypeptid mit der in SEQ ID NO: 2 gezeigten Aminosäuresequenz oder einen Teil hiervon oder Derivate davon. In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform ist das Polypeptid abgeleitet aus einer flavonhaltigen Pflanze, wie z. B. aus der Familie der Apiaceae (Daucus carota u. a.). In einer besonders bevorzugten Ausführungsform besitzt das erfindungsgemäße Polypeptid Flavonsynthase I-Aktivität.

Derivate im Sinne dieser Erfindung sind Aminosäure-Insertionsderivate, Deletionsderivate und/oder Substitutionsaminosäure-Varianten der Aminosäuresequenz aus SEQ ID NO: 2.

Aminosäure-Insertionsderivate der erfindungsgemäßen FNS I umfassen sowohl Amino- und Carboxylenverschmelzungen als auch Insertionen von einzelnen oder mehreren Aminosäuren innerhalb der Sequenz. Insertionsaminosäure-Sequenzvarianten sind solche, bei denen einer oder mehrere Aminosäurereste an einer vorbestimmten Stelle in das Protein eingefügt worden sind, obgleich eine zufällige Insertion mit einem geeigneten Screening des Produkts auch möglich ist. Deletionsvarianten sind charakterisiert durch das Entfernen von einer oder mehreren Aminosäuren aus der Sequenz. Substitutionsaminosäure-Varianten sind solche, bei denen mindestens ein Rest in der Sequenz entfernt worden ist und ein anderer Rest an dieser Stelle eingefügt worden ist. Typische Substitutionen sind in Tabelle 1 dargestellt.

TABELLE 1

Geeignete Reste für eine Aminosäure Substitution

Im allgemeinen werden Aminosäuren durch Aminosäuren mit ähnlichen Eigenschaften ersetzt, wie Hydrophobizität, Hydrophilizität, Elektronegativität, sehr umfangreiche Seitenketten und ähnliches. Substitutionen von Aminosäuren betreffen in der Regel nur einen Rest, wohingegen Insertionen normalerweise einen Bereich von 1 bis 10 Aminosäureresten und Deletionen einen Bereich von 1 bis 20 Resten betreffen. Deletionen und Insertionen werden bevorzugt an nebeneinanderliegenden Paaren durchgeführt, z. B. eine Deletion von zwei Resten oder eine Insertion von zwei Resten.

Die oben beschriebenen Aminosäure-Varianten erfindungsgemäßer Derivate können leicht mit Hilfe von bekannten Peptidsynthesetechniken wie z. B. durch Solid Phase Synthesis und ähnliche Verfahren oder durch rekombinante DNA-Manipulationen hergestellt werden. Techniken, um Substitutionsmutationen an vorbestimmten Stellen in DNA durchzuführen, die eine bekannte oder teilweise bekannte Sequenz besitzt, sind gut bekannt und schließen z. B. M13-Mutagenese ein. Die Manipulation von DNA-Sequenzen zur Herstellung von Proteinen mit Substitutionen, Insertionen oder Deletionen ist z. B. in Sambrook et. al. (1989) ausführlich beschrieben.

Andere Beispiele von rekombinanten oder synthetischen Mutanten und Derivaten der erfin­ dungsgemäßen FNS I schließen einzelne oder multiple Substitutionen, Deletionen und/oder Additionen jeglicher Moleküle, die mit dem Enzym assoziert sind, wie Kohlenhydrate, Lipide und/oder Proteine oder Polypeptide, ein.

Die Begriffe "Analogon" und "Derivat" erstrecken sich auch auf alle funktionellen chemischen Äquivalente der FNS I und auch auf alle Aminosäurederivate, die oben bereits beschrieben wurden.

Ein weiterer Aspekt der vorliegenden Erfindung betrifft rekombinante Formen der FNS I. Die rekombinanten Formen des Enzyms bieten eine Möglichkeit, um z. B. aktivere Enzyme oder Systeme zur in vitro-Produktion verschiedener Flavone zur Verwendung in verschiedenen Bereichen, wie z. B. der Humanmedizin und Kosmetik, zu entwickeln. Letzteres System kann unter anderem in der Krebsforschung zur Anwendung kommen.

In einer weiteren Ausführungsform betrifft die Erfindung transgene Pflanzen, enthaltend eine erfindungsgemäße Nukleinsäuresequenz. In einer bevorzugten Ausführungsform ist die Nukleinsäuresequenz zur Expression geeignet und ist gegebenenfalls regulierbar oder wird in der Pflanze entwicklungsabhängig reguliert. In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform ist die transgene Pflanze ausgewählt aus der Gruppe von flavonhaltigen Pflanzen, wie z. B. aus Petersilie (Petroselinum crispum) und Karotte (Daucus carota), trägt eine endogene FNS I oder in einer weiteren Ausführungsform aus z. B. Gerbera (Gerbera Hybriden), Aster (Callistephus chinensis), Löwenmäulchen (Antirrhinum majus), Chrysantheme (Chrysanthemum indicum), Dahlie (Dahlia Hybriden), Gloxinie (Sinningia Hybriden), Verbene (Verbena Hybriden) und Streptocarpus (S. Hybriden), trägt eine endogene FNS II und enthält weiterhin eine erfindungsgemäße, nicht-endogene FNS I-Nukleinsäuresequenz.

Entsprechend der vorliegenden Erfindung kann eine Nukleinsäuresequenz, die für eine FNS I oder ein Derivat oder einen Teil dieser kodiert, in eine Pflanze in einer von beiden möglichen Orientierungen eingeführt und dort exprimiert werden und dadurch die Möglichkeit bieten, entweder Naringenin (NAR) und/oder andere geeignete Substrate, wenn sie in der Pflanzenzelle synthetisiert werden, umzuwandeln, was letztendlich zur Bildung von verschiedenen Flavonen führt. Darüber hinaus kann die Bildung dieser Metaboliten durch Reduktion oder Eliminierung endogener oder vorhandener FNS I-Aktivität verhindert werden. Die Synthese von unterschiedlichen Mengen an Flavonen führt zu einer Veränderung der Blütenfarbe, z. B. bei Gerbera. Am Beispiel der für den Locus Fns heterozygoten, flavonhaltigen, orangen Sorte "Th 58" (fns⁺ fns) konnte in Selbstungsnachkommenschaften eine Farbvariation von dunkelrot (flavonfrei; Genotyp: fns fns) über verschiedene orangerot Töne (flavonhaltig; Genotyp: fns⁺ fns) bis zu einem gelborange (stark flavonhaltig; Genotyp: fns⁺ fns⁺) gezeigt werden. Dieses Experiment läßt sich beliebig auf andere für den Locus Fns heterozygote Gerbera Sorten übertragen (Martens, 2000). Die Expression einer weiteren Flavonsynthase in Sense-Orientierung führt, z. B. in Gerbera zu einer weiteren Reduktion der Anthocyane bzw. zu einer Erhöhung des Flavongehaltes. Beides hat einen bedeutenden Einfluss auf die Blütenfarbe (Aufhellung, Kopigmentierung). Eine weitaus wichtigere Anwendung ist die Expression der FNS I alleine oder zusammen mit einer endogenen FNS II. Dies führt zu einer deutlichen Erhöhung des Flavongehaltes und damit zu einer erhöhten Funktionalität bezüglich bioaktiver Inhaltsstoffe in Nahrungspflanzen. Die Fähigkeit und Effektivität der Kommunikation zwischen Pflanzen und verschiedenen anderen Organismen (Pilze, Bakterien, Insekten u. a.) im Zusammenhang mit Stickstofffixierung bzw. Pathogenabwehr werden verbessert bzw. können induziert und reguliert werden. Auch bezüglich der Bio- Produktion von speziellen Flavonen in unterschiedlichen pflanzlichen Geweben für eine anschliessende Extraktion und Isolierung der Substanzen bietet dieser Ansatz wesentliche neue Möglichkeiten und Vorteile. Die Expression der Nukleinsäuresequenz in einer von beiden möglichen Orientierungen in der Pflanze kann konstitutiv, induzierbar oder entwicklungsbezogen und auch gewebespezifisch sein. Das Wort "Expression" ist dabei in seiner allgemeinsten Bedeutung verwendet, um die Produktion von RNA oder von beidem, RNA und Protein, einzuschließen. Es ist auch auf eine teilweise Expression von Nukleinsäuremolekülen ausgedehnt.

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung transgener Pflanzen, die fähig sind, FNS I oder aktive Mutanten oder Derivate zu synthetisieren. Dieses Verfahren umfaßt die stabile Transformation einer Zelle einer geeigneten Pflanze mit einem Nukleinsäuremolekül, das eine Nukleotidsequenz umfaßt, die für die besagte FNS I kodiert, unter Bedingungen, die die mögliche Expression des besagten Nukleinsäuremoleküls herbeiführt, die Regeneration einer transgenen Pflanze aus der Zelle und das Wachstum dieser transgenen Pflanze für eine bestimmte Zeit und unter Bedingungen, die geeignet sind, um die Expression der Nukleinsäure herbeizuführen. Die transgene Pflanze kann höhere Werte einer FNS I-Aktivität im Vergleich zu dem Wert, der in vergleichbaren, nicht-transgenen Pflanzen gemessen wird, zeigen oder die Werte können niedriger sein im Vergleich zu denen von vergleichbaren, nicht-transgenen Pflanzen.

Ein Aspekt der vorliegenden Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung einer transgenen Pflanze mit reduzierter, endogener oder vorhandener FNS I-Aktivität. Dieses Verfahren umfaßt die stabile Transformation einer Zelle einer geeigneten Pflanze mit einem Nukleinsäuremolekül, das eine Nukleotidsequenz umfaßt, die eine Sequenz oder eine komplementäre Sequenz der FNS I kodiert, die Regeneration einer transgenen Pflanze aus der Zelle und, falls nötig, das Heranziehen dieser transgenen Pflanze unter geeigneten Bedingungen, um die Expression von Nukleinsäuren zu erreichen.

Ein weiterer erfindungsgemäßer Aspekt betrifft ein Verfahren zur Herstellung einer genetisch modifizierten Pflanze mit reduzierter endogener oder vorhandener FNS I-Aktivität. Dieses Verfahren umfaßt die Veränderung des FNS I-Gens durch eine Modifikation der endogenen Sequenz über homologe Rekombination, ausgehend von einem entsprechend veränderten Gen einer FNS I oder eines Derivats oder eines Teils davon. Das Gen wird in die Pflanzenzelle eingeführt und eine genetisch modifizierte Pflanze wird aus der Zelle regeneriert.

Ein weiterer Aspekt der vorliegenden Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung einer transgenen, blühenden Pflanze mit veränderten Blüteneigenschaften. Dieses Verfahren umfaßt das Einbringen der erfindungsgemäßen Nukleinsäuresequenz in eine Zelle einer geeigneten flavonfreien Pflanze, die Regeneration einer transgenen Pflanze aus der Zelle und das Heranziehen einer transgenen Pflanze zu einer Zeit und unter Bedingungen, um die Expression der erfindungsgemäßen, eingebrachten Nukleinsäuresequenz zu erreichen. Die transgene Pflanze kann zum Beispiel ausgewählt sein aus der Gruppe von flavonfreien Pflanzen bestehend aus Euphorbia (E. pulcherrima), Cyclamen (Cyclamen persicum), Rose (Rosa Hybrida), Pelargonium (P. spec.), Begonia (B. spec.), Nelke (Dianthus caryophyllus) und Tulpe (Tulipa Hybriden). In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform ist die transgene Pflanze zur Expression einer endogenen Flavonsynthase I fähig. Eine derartige transgene Pflanze kann z. B. ausgewählt sein aus der Familie der Apiaceae mit Petersilie (Petroselinum crispum), (Daucus carota) u. a. In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform wird diese endogene Flavonsynthase I bei Expression der eingebrachten erfindungsgemäßen Nukleinsäure koexprimiert.

In einer Ausführungsform wird die endogen vorhandene Flavonsynthase I-Aktivität durch Einbringen der Nukleinsäuresequenz reduziert. Dieses Verfahren umfaßt die stabile Trans­ formation einer Zelle einer geeigneten Pflanze mit einer erfindungsgemäßen Nukleinsäure­ sequenz oder einer dazu komplementären Sequenz, die Regeneration einer transgenen Pflanze aus der Zelle und das Heranziehen dieser transgenen Pflanze zu einer Zeit und unter geeigneten Bedingungen, um die Höhe der Aktivität der endogenen oder vorhandenen FNS I zu verändern. Bevorzugterweise ist der veränderte Wert geringer als das endogene oder vorhandene Level der FNS I-Aktivität in einer vergleichbaren, nicht-transgenen Pflanze. Gegebenenfalls ist für die Reduktion der endogenen FNS I-Aktivität die Expression der eingeführten Nukleinsäuresequenz oder deren komplementären Sequenz erforderlich. Somit kann eine Expression der eingeführten genetischen Sequenz oder ihres komplementären Analogon nötig sein, um den gewünschten Effekt zu erzielen. Dies meint im wesentlichen eine flavonhaltige Pflanze mit veränderten Gehalt und Muster an bioaktiven Flavonoiden besonders der Flavone.

In diesem Zusammenhang betrifft die vorliegende Erfindung ein Verfahren zur Herstellung einer flavonhaltigen Pflanze, die unterschiedliche Gehalte und Muster an bioaktiven Flavonoiden besonders an Flavonen zeigt. Dieses Verfahren umfaßt Veränderungen des FNS I-Gens durch Modifikation der endogenen Sequenzen über homologe Rekombination eines entsprechend veränderten Gens einer FNS I oder eines Derivats oder eines Teils davon, die Einführung in die Pflanzenzelle und die Regeneration der genetisch veränderten Pflanze aus der Zelle.

Das erfindungsgemäße Nukleinsäuremolekül kann darüber hinaus entwicklungsabhängig reguliert werden. In der Regel schließt eine veränderte Infloreszenz die Produktion von schwächer gefärbten Blüten oder auch anderen Farbtönen ein, abhängig von den physiolo­ gischen Bedingungen der Empfängerpflanze. Mit "Empfängerpflanze" ist eine Pflanze gemeint, die eine meßbare Menge Substrat für das FNS I-Enzym oder auch die FNS II produziert und die entsprechenden physiologischen Eigenschaften und Genotyp besitzt, die notwendig für die Entwicklung der gewünschten Farben sind. Dies schließt folgende Pflanzen ein, ist aber nicht auf diese begrenzt: Gloxinie (Sinningia Hybriden), Löwenmäulchen (Antirrhinum majus), Columnea (Columnea Hybriden), Dahlie (Dahlia variabilis), Gloxinie (Sinningia cardinalis), Streptocarpus (Streptocarpus Hybridus), Verbene (Verbena Hybrida), Chrysantheme (Chrysanthemum indicum), Einblatt (Spathiphyllum wallisl), Petunie (Petunie Hybrida), Cyclamen (Cyclamen persicum), Rose (Rosa Hybriden) und Pelargonie (P. spec.).

Entsprechend umfaßt die vorliegende Erfindung ein Verfahren zur Herstellung einer transgenen Pflanze, die meßbar ein rekombinantes Gen exprimiert, das die FNS I oder einen Teil davon kodiert oder welche eine Nukleinsäuresequenz trägt, die im wesentlichen komplementär zum gesamten oder zu einem Teil des mRNA-Moleküls ist, das, falls nötig, ohne weiteres transkribierbar ist, um die Regulation der FNS I zu bewirken. Dieses Verfahren umfaßt die stabile Transformation einer Zelle einer geeigneten Pflanze mit der isolierten Nukleinsäure, umfassend eine Nukleotidequenz, die für eine FNS I oder ein Derivat oder einen Teil davon kodiert, oder eine zu der kodierenden Nukleotidsequenz komplementäre Sequenz, falls erforderlich unter Bedingungen, die eine Expression der besagten isolierten Nukleinsäure erlauben, und durch Regeneration einer transgenen Pflanze aus einer Zelle.

Der Fachmann bemerkt sofort die Möglichkeiten der Anwendung bei der vorliegenden Erfindung, wie z. B. eine Erhöhung oder Reduzierung der Expression der Enzyme, die natürlicherweise in einer Zielpflanze vorhanden sind. Dies führt zu verschiedenen neuen Blütenfarbtönen, wie zum Beispiel verschiedenen Orange- oder Dunkelrot-Tönen, aber auch zu einer Veränderung der Gehaltes und des Musters an bioaktiven Flavonoiden besonders der Flavone.

Daher bezieht sich die vorliegende Erfindung auf alle transgenen Pflanzen, die die gesamte oder einen Teil der erfindungsgemäßen Nukleinsäuresequenz enthalten und/oder eine homologe oder verwandte Form dieser oder eine Antisense-Form von irgendeiner der beschriebenen aufweisen, und im einzelnen diejenigen transgenen Pflanzen, die unterschiedliche Blüteneigenschaften zeigen. Die transgenen Pflanzen können eingeführte Nukleinsäuremoleküle enthalten, die eine Nukleotidsequenz umfassen, die eine FNS I oder eine komplementäre Sequenz kodiert. Im allgemeinen wird die Nukleinsäure stabil in das Pflanzengenom eingeführt, obwohl die vorliegende Erfindung auch die Einführung einer FNS I Nukleotidsequenz innerhalb einer autonom-replizierenden Nukleinsäuresequenz wie z. B. DNA- oder RNA-Viren, die fähig sind, in einer Pflanzenzelle zu replizieren, einschließt. Die Erfindung schließt darüber hinaus auch Samen der transgenen Pflanze ein, besonders, wenn sie flavonhaltig sind.

Mit Hilfe des erfindungsgemäßen FNS I-Gens kann die Flavonoidbiosynthese bzw. die Bildung von Flavonen in Pflanzen auf verschiedene Art und Weise gezielt verändert werden.

Im pflanzlichen Bereich müssen vorab zwei unterschiedliche Ausgangspunkte berücksichtigt werden. Zum einen stehen Pflanzen zur Verfügung, die natürlicherweise Flavone oder deren Glykoside bilden, wie z. B. Antirrhinum und Verbena in Blüten, Clerodendron, Citrus, Petroselinum und Daucus in Blättern, Althaea und Sophora (Leguminosae) in Wurzeln und Prunus und Pinus spec. im Hartholz (Wollenweber, 1994; Williams und Harborne, 1994). Neben dieser sehr großen Gruppe gibt es aber auch einige Pflanzen, die in bestimmten Geweben keine Flavone synthetisieren. Dies ist z. B. bei einigen Blüten von wichtigen Zierpflanzen wie Pelargonium, Cyclamen und Petunia und in Apfelblättern und vielen anderen wichtigen Nutzpflanzen der Fall.

Dementsprechend betrifft die vorliegende Erfindung eine veränderte FNS I-Aktivität in Pflanzen und anderen Organismen, die sowohl durch eine Erhöhung als auch durch eine Reduzierung der natürlich vorkommenden FNS I-Aktivität mittels der Einführung der Sequenz aus der vorliegenden Erfindung erreicht werden kann. Eine Reduzierung der Höhe der FNS I-Aktivität kann auch als eine Down-Regulierung beschrieben werden.

In flavonhaltigen Pflanzen kann die Synthese von Flavonen mit Hilfe von geeigneten Methoden gezielt hoch- oder down-reguliert werden oder ganz ausgeschaltet werden. Dies hat für die Pflanze verschiedene Folgen. Grundsätzlich hat eine solche Veränderung am Biosyntheseweg Auswirkungen auf die gesamte Flavonoidbiosynthese, da eine ständige Konkurrenz mehrerer Enzyme (FNS I oder FNS II, FHT, F3'H, F3',5'H) um das Substrat (Flavanone, z. B. Naringenin) herrscht. Das bedeutet im einzelnen, daß z. B. eine Hochregulierung der FNS I die Synthese von Flavonoiden im späteren Biosyntheseweg (Abb. 1A) reduziert und dadurch z. B. blassere Blütenfarben erreicht werden können. Außerdem kann durch diese gezielte Erhöhung des Flavongehalts, die nur bestimmte Gewebe betreffen kann, die Resistenzeigenschaft und die Symbiosefähigkeit der Pflanze deutlich verbessert oder auch der entsprechende Gehalt bzw. das Muster an bioaktiven Flavonen beeinflusst werden. Demgegenüber führt eine Down Regulierung zu einer Steigerung der Synthese von anderen, eventuell für die Pflanze nützlicheren Flavonoiden. Dies kann sowohl die für den UV-Schutz wichtigen Flavonole als auch die farbgebenden Anthocyane oder resistenzinduzierenden Proanthocyanidine und Phytoalexine betreffen. Eine vollständige Unterdrückung der Flavonbildung führt zu einer Verstärkung der Wirkungen einer Down-Regulierung und kann mögliche Stimulanzien für Insekten entfernen und somit zur Resistenzbildung beitragen.

Eine völlige Neu-Synthese von Flavonen kann durch das gezielte Einführen der FNS I in Pflanzen ohne natürliche Aktivität erreicht werden. Abhängig von den vorhandenen Substraten kann so der Flavongehalt und das Flavonmuster reguliert werden. Durch Etablierung dieses Schrittes können Blütenfarben, Resistenzeigenschaften und die Fähigkeit zur Symbiose mit Stickstoff-fixierenden Bakterien gezielt verändert werden. Darüber hinaus kann durch die Öffnung eines neuen Biosyntheseweges die Bildung von für die Pflanze weniger nützlichen Flavonoiden (z. B. Fraßstimulanzien) reduziert werden oder auch die Synthese von Biflavonen, die aus Flavonen hervorgehen, etabliert werden.

Mit Hilfe dieser Ansätze können wichtige flavonhaltige oder flavonfreie Nutzpflanzen in ihrem Flavonoidmuster und -gehalt, einschließlich der Flavone, so verändert werden, daß ihre positiven Eigenschaften in Bezug auf die Biologie von Mensch und Tier optimiert werden.

Die vorliegende Erfindung betrifft weiterhin Verfahren zur gezielten Veränderung des Fla­ vongehalts bzw. -musters in verschiedenen Pflanzengeweben (Blüten, Wurzeln, Blätter u. a.) und anderen Organismen und damit allgemein die Veränderung der Flavonoidzusammensetzung, speziell die Veränderung von Blütenfarben durch Kopigmentierung, von Resistenzeigenschaften und der Fähigkeit der Nodulation bei Leguminosen und des Gehaltes bzw. Musters an bioaktiven Flavonoiden besonders der Flavone.

In einer weiteren Ausführungsform betrifft die Erfindung die Verwendung eines erfindungs­ gemäßen Polypeptids zur Synthese von Flavonen. In geeigneten Expressionssystemen können das Enzym selbst und daraus letzendlich natürliche Flavone, ausgehend von geeigneten Substraten, synthetisiert werden. Eine Möglichkeit ist die Verwendung von geeigneten Expressionssystemen zur Gewinnung von gesundheitsfördernden, natürlichen Flavonen. Diese Expressionssysteme können pflanzlicher Art sein oder aus Zell- bzw. Hefekulturen bestehen. Die Expression der FNS I in Pflanzen oder in Zellkulturen kann zur direkten Gewinnung der entsprechenden Flavone verwendet werden, wobei das Hefe-Expressionssystem zur Gewinnung des intakten Enzyms bevorzugt sein kann. Mit diesem Enzym können dann chemische oder natürliche Vorstufen (Flavanone) zum entsprechenden Flavon umgesetzt werden. Die auf diese Art synthetisierten Flavone können unter anderem bei der Krebstherapie ode in Kosmetika Verwendung finden oder in Form von Medikamenten zur Gesundheit von Mensch und Tier beitragen.

Die vorliegende Erfindung ist ausführlich beschrieben durch die folgenden Abbildungen und Beispiele. Die vorliegende Erfindung ist anhand einer Nukleinsäuresequenz, die aus Petroselinum crispum "Gigante d'Italia" abgeleitet wurde, veranschaulicht. Es liegt nun nahe, daß ähnliche Sequenzen leicht aus verschiedenen anderen Quellen, wie z. B. anderen Pflanzen oder speziellen Mikroorganismen, isoliert werden können. Beispiele für andere Flavon-produzierende Pflanzen schließen unteranderem verschiedene Vertreter aus der Familie der Apiaceae, wie z. B. die Karotte (Daucus carota) und Sellerie (Aplum graveolens) ein, sind aber nicht auf diese begrenzt. Alle diese Nukleinsäuresequenzen, die direkt oder indirekt ein Enzym des Flavonoidbiosyntheseweges und im speziellen die FNS I kodieren, ohne Rücksicht auf deren Quelle, sind von der vorliegenden Erfindung mit eingeschlossen.

Abb. 1A + B zeigt eine schematische Darstellung des allgemeinen Flavonoid-Biosyn­ theseweges und der chemischen Strukturen verschiedener Flavonoide.

Beteiligte Enzyme sind in Abb. 1A wie folgt abgekürzt: CHS = Chalkonsynthase; CHI = Chalkonisomerase; FHT = Flavanon 3-Hydroxylase; DFR = Dihydroflavonol 4-Reduktase; ANS = Anthocyanidinsynthase; FGT = Flavonoid 3-Glukosyltransferase; FNS I bzw. II = Flavonsynthase I bzw. II; FLS = Flavonolsynthase; F3'H = Flavonoid 3'-Hydroxylase; F3',5'H = Flavonoid 3',5'- Hydroxylase. Die Ebene der Flavonbildung ist in Abb. 1A besonders (++++) gekennzeichnet. In Abb. 1B ist im oberen Teil die FNS I-Reaktion in Gegenwart von 2- Oxoglutarat mit einigen üblichen Flavanonen gezeigt. Im unteren Teil sind weitere wichtige Fla­ vonoide dargestellt.

Abb. 2 zeigt die Aktivität bzw. die fehlende Aktivität der FNS I im Enzymextrakt bzw. in Mikrosomen aus Blättern von Petroselinum crispum "Gigante d'Italia" mit und ohne Zugabe von 2- Oxoglutarat. Die Aktivität der FNS I wurde durch den Umsatz von ¹⁴C-markiertem Naringenin zum entsprechenden Flavon Apigenin gemessen.

Abb. 3 zeigt einen Ausschnitt aus einem Aminosäure Alignment von 14 verschiedenen Dioxygensesequenzen aus dem Flavonoidbiosyntheseweg. Folgende Sequenzen wurden eingeschlossen: Flavanon 3-Hydroxylasen aus Petunia Hybrida (Acc. Nr. X60512), Matthiola incana (X72594), Dendranthema x grandiflorum (U86837), Daucus carota (AF184270) und Callistephus chinensis (X72593); Flavonolsynthasen aus Petunia Hybrida (Z22543), Eustoma russellianum (AF240764), Citrus unshiu (AB011796) und Solanum tuberosum (X92178); Anthocyanidinsynthasen aus Petunia Hybrida (X70786), Matthiola incana (AF026058), Callistephus chinensis (AF015885) und Daucus carota (AF184274). Im unteren Bereiche sind zwei hochkonservierte Bereich dargestellt aus denen zwei degeneriete Dioxygenase-spezifische PCR-Primer abgeleitet wurden.

Abb. 4 zeigt eine schematische Darstellung der verschiedenen generierten Dioxygenase- DNA-Fragmente. Alle Klone enthalten mindestens einen der in Abb. 3 gezeigten hochkonservierten Sequenzbereiche. PPCdioxy3.3: ein 455 bp langes Fragment konnte über PCR mit Hilfe der Oligo's "Dioxy1H" und "Dioxy1R" mit einem DNA-Template, das aus einer cDNA Synthese mit dem Oligo(dT)-Primer und Gesamt-RNA stammte, generiert werden.
PPCrace3.8: ein 907 bp langes Fragment wurde ausgehend von cDNA aus Petroselinum crispum über eine PCR-gestützte 3'-RACE-Methode mit den Oligo's "PCrace3A", "PCrace3B, "PCrace3C" und "Oligo(dT)" (GIBCO-BRL) bzw. "PCR-Anke" isoliert.
PPCrace5.6: ein 289 bp langes Fragment wurde ausgehend von cDNA aus Petroselinum crispum über eine PCR-gestützte 5'-RACE-Methode mit den Oligo's "PCrace5A", "PCrace5B, "PCrace5C" und "AAP" (GIBCO-BRL) bzw. "backrace" isoliert.
pPCFNS-ORF: ein 1246 bp langes Fragment mit einem offenen Leserahmen wurde über PCR mit Hilfe der Oligo's "PCFNS1H" und "PCFNS1R" isoliert. Als Template wurde cDNA von Petroselinum crispum verwendet.

Abb. 5 und 6 sind Darstellungen der Nukleinsäure bzw. der daraus abgeleiteten Aminosäuresequenz des vollständigen Klons.

Abb. 7 zeigt einen FNS I-Test mit Hefe-Proteinextrakt. Als Substrat wurde [14C] Naringenin verwendet. Proteinextrakt wurde aus transformierten Hefen (INVSc 1 - pYES2.1TOPO-PCFNS-ORFsense und pYES2.1TOPO-PCFNS-ORFantisense) präpariert. Das Autoradiogramm zeigt die Umwandlung von [¹⁴C] Naringenin zum entsprechenden Flavon, dem [¹⁴C] Apigenin, mit einem Extrakt der transformierten Hefe mit dem Sense-Konstrukt (INVSc 1 - pYES2.1TOPO-PCFNS-ORFsense; A). Im Kontroll-Experiment (INVSc 1 - pYES2.1TOPO - PCFNS-ORFantisense; B) wurde keine Aktivität gemessen. Das Produkt wurde in vier verschiedenen Laufmitteln durch Co-Chromatographie mit authentischen Apigenin identifiziert.

BEISPIEL 1 Materialien Chemikalien, Enzyme und Radiochemikalien

Naringenin, Eriodictyol, Apigenin und Luteolin wurden bei Carl Roth (Karlsruhe, Deutschland) bezogen. [¹⁴C] Naringenin wurde aus [¹⁴C] Malonyl-CoA (ARC, St. Louis, USA) und p-Cumaroyl- CoA (Dr. Werner Heller, GSF, Neuherberg, Deutschland) nach der in Britsch et. al. (1981) beschriebenen Methode mit teilweise gereinigter Chalkonsynthase (CHS) und Chalkonisomerase aus Petersilie Suspensionskultur hergestellt. Alle weiteren Enzyme wurden von kommerziellen Anbietern bezogen und nach deren Beschreibung verwendet.

Bakterien- und Hefestämme

Die folgenden Escherichia coli-Stämme wurden verwendet: TOP10F' und TOP10, beide von Invitrogen (Groningen, Niederlande). Außerdem wurde folgender Hefestamm verwendet: INVSc 1 (Invitrogen).

Die Klonierungsvektoren pCR2.1 und pYES2.1-TOPO wurden von Invitrogen bezogen.

Die Ligation von Insert mit den Vektoren pCR2.1 und pYES2.1-TOPO bzw. die Transformation der Bakterien erfolgte nach Angaben des Herstellers.

Pflanzenmaterial

Es standen sowohl Freiland- als auch Gewächshauspflanzen der Petroselinum crispum Sorte "Gigante d'Italia" (Kiepenkerl, Stuttgart, Deutschland) zur Verfügung.

BEISPIEL 2 Kultivierung der Pflanzen und Entwicklungsstadien

Pflanzen von Petroselinum crispum wurden unter praxisüblichen Bedingungen in einem Gewächshaus bzw. im Freiland kultiviert.

Petroselinum Blätter wurden zu verschiedenen Entwicklungsstadien, die wie folgt definiert wur­ den, geerntet:
Stadium 1: Laub noch zusammen gefaltet; etwa bis 1 cm lang
Stadium 2: Laub entfaltet sich; etwa bis 3 cm lang
Stadium 3: Laub entfaltet; etwa bis 6 cm
Stadium 4: Laub völlig entfaltet bis 12 cm lang

BEISPIEL 3 Biochemische und enzymologische Charakterisierung des Pflanzenmaterials

Zur Extraktion und Identifizierung von Flavonoiden wurden bekannte Standardmethoden verwendet (Marbry et. al., 1970; Harborne, 1967). Flavone wurden darüber hinaus unter UV-Licht (243 nm) vor und nach Bedampfung mit Ammoniak detektiert. Flavanone wurden durch Reduktion mit Natriumborhydrid und nachfolgender Behandlung mit Salzsäuredämpfen identifiziert (Eigen et. al., 1957).

Dünnschicht Chromatographie wurde auf vorbeschichteten Cellulose Platten G1440 der Firma Schleicher & Schüll (Dassel, Deutschland) und Merck (Darmstadt, Deutschland) durchgeführt. Hierzu wurden folgende Laufmittel verwendet: (I) Chloroform - Essigsäure - Wasser (10 : 9 : 1); (2) 30% Essigsäure; (3) Essigsäure - Salzsäure - Wasser (30 : 3 : 10) und (4) tert.-Buthanol - Essigsäure - Wasser (3 : 1 : 1).

Der Flavongehalt von Blättern während der Entwicklung wurde durch Extraktion der Pigmente mit Ethylacetat aus Geweben verschiedener Stadien bestimmt. Das Verhältnis Gewebe zu Extraktionsmittel betrug 1 : 40 (g/ml) und die Extraktionsdauer 48 Stunden bei 4°C im Dunkeln. Enzymaufarbeitungen und FNS I Tests wurden, wie in Martens und Forkmann (1998) für die Flavonsynthase II beschrieben, durchgeführt. Die Aufarbeitung erfolgte mit 6.0 ml Tris-HCl Puffer (pH 7.5), der 28 mmol/l 2-Mercaptoethanol und 10 mmol/l Natriumascorbat erhielt, bei 4°C mit 1.0 g Petalen, 0.5 g Dowex (equilibriert mit Tris-HCl Puffer, pH 7.5) und 0.5 g Seesand. Nach dem homogenisieren in einem vorgekühlten Mörser wurde das Homogenat in Eppendorf Tubes überführt und zweimal für 5 min. bei 10.000 × g zentrifugiert. Der nun klare Überstand diente als Rohextrakt oder wurde zur Fällung von Mikrosomen mit MgCl₂ nach Diesperger et. al. (1974) verwendet. Der Proteingehalt der Aufarbeitungen wurde nach der Methode von Bradford (1976) bestimmt.

Der Standardtest für die FNS I enthielt in einem Gesamtvolumen von 200 µl : 175 µl Tris-HCl Puffer (pH 7.5), 0.3 nmol radioaktive markiertes Substrat (83 Bq; Naringenin), 1 µmol Natriumascorbat, 10 nmol Eisen(II)sulfat, 20 nmol 2-Oxoglutarat und 15 µl Rohextrakt. Nach einer Inkubation von 20 min. bei 25°C wurde die Reaktion durch die Zugabe von 20 µl Methanol, das eine Mischung der entsprechenden Flavonoide enthielt, gestoppt. Die Extraktion des Reaktionsgemisches erfolgte zweimal mit 100 bzw. 50 µl Ethylacetat. Die obere Phase wurde auf Cellulose Dünnschichtplatten im Laufmittel 1 (s. o.) chromatographiert. Die Radioaktivität wurde mit Hilfe eines Fuji BAS 1000 Bio-Imaging Analyser (Fuji Photo Film Co., Tokio, Japan) und des TINA Software Packets (Raytest, Straubenhardt, Deutschland) lokalisiert und quantifiziert.

In Abb. 2 sind beispielhaft die Ergebnisse der Enzymtests mit der Petroselinum Sorte "Gigante d'Italia" mit zwei verschiedenen Proteinquellen mit und ohne 2-Oxoglutarat-Zugabe gezeigt.

BEISPIEL 4

Synthese von Oliponukleotiden

BEISPIEL 5 Klonierung eines Dioxypenase-Fragments aus Petroselinum crispum Isolierung von Gesamt RNA aus Petroselinum Laub

Gesamt RNA wurde aus Petroselinum Laub von verschiedenen Entwicklungsstadien in denen die FNS I-Aktivität nachgewiesen werden konnte nach einer bei Giuliano et. al. (1993) beschriebenen Methode isoliert. 1.2 g in flüssigem Stickstoff eingefrorenes Pflanzenmaterial wurde in einem vorgekühlten Möser zu feinem Pulver gerieben und in ein ebenfalls vorgekühltes Corex-Röhrchen überführt. Das Gewebe wurde in 3 ml vorgelegtem Extraktionspuffer, bestehend aus 4 M Guanidium Thiocyanat, 0.15 M Natriumacetat (pH 5.3), 0.2% Natrium Sacrosinat und 0.7% β- Mercaptoethanol, und 2.4 ml Wasser-equilibriertem Phenol (gesättigt mit 0.1 M Citrat-Puffer, pH 4.3, Sigma, Deisenhofen, Deutschland) durch kräftiges Vortexen homogenisiert. Nach der Zugabe von 0.6 ml Chloroform wurde das gut gemischte Homogenat für 20 min auf Eis belassen und anschließend bei 15.000 × g zentrifugiert (Sorvall RC-5B plus; SS34). Die abgenommene Oberphase wurde mit 1 Vol. Isopropanol versetzt und erneut auf Eis für 60 min inkubiert. Nach 30 min Zentrifugation bei 15.000 × g (Sorvall s. o.) wurde die Oberphase verworfen und das Pellet in sterilem H₂O vorsichtig resuspendiert. Zur Entfernung der Polysaccharide wurde die Lösung mit 100% Ethanol (20% (v/v) Endkonzentration) versetzt, 20 min auf Eis inkubiert und 10 min bei 10.000 × g und 4°C zentrifugiert. Der die Nukleinsäuren enthaltende Überstand wurde mit 1/3 Vol. 8 M Lithiumchlorid versetzt. Nach 30 min Inkubation auf Eis wurde 20 min bei 15.000 × g zentrifugiert und der Überstand verworfen. Die gefällte RNA wurde zweimal mit je 1 ml 80% Ethanol gewaschen und dann in 50 µl H₂O resuspendiert und bei -70°C gelagert. Die Bestimmung der RNA-Konzentration erfolgte spektrophotometrisch bei einer Wellenlänge von 260 nm (Pharmacia Biochrom 4060).

Falls erforderlich wurde zudem poly (A)⁺ RNA aus der Gesamt RNA durch zwei Zyklen Oligo (dT) Cellulose Chromatographie isoliert (Sambrook et. al., 1989).

Reverse Transkription von RNA

5 µg Gesamt RNA oder 500 ng poly (A)⁺ RNA, isoliert aus den oben beschriebenen unter­ schiedlichen Blattstadien, wurde in einem 25 µl Ansatz mit einem der späteren Verwendung entsprechendenden Primer mittels Reverse Transkriptase (SuperScript™ I, GIBCO BRL, Paisley, Großbritanien) in cDNA umgeschrieben. Zur RNA wurde 1 µl des jeweiligen Primer (1 µM final) und Wasser bis zu einem Volumen von 17 µl gegeben. Dieser Ansatz wurde anschließend bei 70°C für 10 min. denaturiert und dann auf Eis gestellt. Nach der Zugabe von 4 µl 5 × SuperScript First Strand Buffer, 2 µl 100 mM Dithiothreitol, 1 µl 10 mM dNTP Mix, wurde der Ansatz bei 42°C für 2 min. vorinkubiert. Anschließend wurde 1 µl (200 U) SuperScript™ Reverse Transkriptase direkt dazupipettiert. Die Reaktion wurde bei 42°C für 60 min. und anschließend für 15 min. bei 70°C inkubiert. Die resultierenden cDNAs wurden direkt als Template für den jeweiligen PCR Ansatz verwendet.

PCR-Amplifikation mit Dioxygenase spezifischen Primern

Die Amplifikation eines putativen FNS I Fragmentes wurde mittels PCR, mit den degenerierten Primern "Dioxy1H" und "Dioxy1R" durchgeführt. Der PCR Ansatz enthielt in einem Gesamtvolumen von 50 µl folgende Komponenten: 36.5 µl Wasser, 5 µl 10 × Polymerase Puffer, 2.5 mM MgCl₂, 0.2 µM dNTP Mix, je 1 µM der beiden Primer, 2 µl aus dem oben beschriebenen cDNA Ansatz und 0.5 µl 5 U/µl AGS-Gold Polymerase (Hybaid, Heidelberg, Deutschland). Folgende PCR-Parameter wurden verwendet: Ein Denaturierungsschritt bei 94°C für 10 min., anschließend 40 Zyklen mit 94°C für 30 sec., 50°C (Annealing) für 2 min. und 72°C (Extension) für 30 sec. und zum Abschluß eine abschließende Extension bei 72°C für 7 min. 15 µl des PCR- Produktes wurden nun mit 5 µl Ladepuffer {80% Formamid, 1 mg/ml Bromphenolblau und 40 µl Ethidiumbromidlösung pro ml} versehen und gemischt. Die so vorbereiteten Proben wurden auf ein 5%-iges Low-Melting Agarose geladen und für 3 Stunden bei maximal 80 V getrennt. Anschließend wurde das Gel auf dem UV-Schirm betrachtet und die Größe der PCR-Produkte mit Hilfe einer 50 kb Ladder (MBI, St. Leon-Roth, Deutschland) ermittelt. Amplifikate mit der erwarteten Länge wurden in den TOPO pCR2.1 Vektor einkloniert und anschließend in TOPO 10F' one-shot Kompetentezellen (Invitrogen) nach Herstellerangaben transformiert. Plasmid Isolierung aus, über blau-weiß Screening identifizierten, transformierten Bakterien wurde mit Hilfe des Plasmid Miniprep-Quantum Prep-Kits (Bio-Rad, München, Deutschland) nach Herstellerangaben durchgeführt. Die nach einem Verdau mit geeigneten Restriktionsenzymen (z. B. Eco RI; Boehringer Mannheim, Deutschland) und einer Auftrennung auf einem 3%-igem Low-Melting Agarosegel identifizierten Inserts mit einer Länge von ca. 400 bp, wurden sequenziert DNA Sequenzierung dieser und anderer Klone erfolgte durch die Firma TopLab (Martinsried, Deutschland).

BEISPIEL 6 Isolierung des full-length Klon von pPCdioxy2.6

Der cDNA Klon pPCdioxy3.3 entspricht nicht einem full-length Klon, sondern nur dem Bereich zwischen den beiden konservierten Bereichen. Das Ende (3'-Ende) der Sequenz, einschließlich eines oder mehrerer Stopkodons und der Anfang (5'-Ende) fehlen. Um den vollständigen Klon von pPCdioxy3.3 zu bekommen, wurden PCR gestütze RACE Methoden nach Frohman et. al. (1988) mit Hilfe des 3' und 5'-RACE System, Version 2.0 (GibcoBRL) verwendet.

Zuerst wurden verschiedene genspezifische 3' bzw. 5'-RACE Primer (pPCrace3A+B und pPCrace5A-C) auf der Grundlage von pPCdioxy3.3 konstruiert und zusätzlich noch der nested Amplifikationsprimer "Backrace". Für das 3'-RACE wurde mit Hilfe des Oligo(dT)-Primers Gesamt-RNA nach der in Beispiel 5 Methode in cDNA umgeschrieben. Anschließend wurde das First Strand Produkt vom Überschuß an Nukleotiden und des Primers mit dem High Pure PCR Product Purification Kit (Boehringer Mannheim) nach Herstellerangaben gereinigt. Die PCR- Amplifikation der cDNA erfolgte in 0.5 ml dünnwandigen PCR-Gefäßen nach folgendem Protokoll Einmalige Denaturierung bei 94°C für 10 min., anschließend 40 Zyklen bestehend aus 94°C für 1 min., 57°C für 1 min. und 72°C für 2 min. Abschließend wurde noch ein Extensionschritt von 7 min. durchgeführt. Der PCR-Ansatz setzte sich aus folgenden Komponenten zusammen: 36.5 µl Wasser, 5.0 µl 10 × PCR-Puffer, 3.0 µl 25 mM MgCl₂, 1.0 µl 10 mM dNTP, 1.0 µl 25 µM pPCrace3A, 1.0 µl 25 µM Oligo(dT), 2.0 µl cDNA und 0.5 µl 5 U/µl AGS-Gold Polymerase (Hybaid). 15 µl des 5'-RACE Produktes wurden auf einem 3%-igem Low-Meiting Agarosegel bei der Verwendung von geeigneten Längenstandards analysiert. Spezifische Einzelbanden im Bereich von ca. 1000 kb wurden für eine nested-PCR verwendet. Nach einer Reinigung wie bereits oben beschrieben, wurde auch der dargestellte PCR-Ansatz mit den Primern pPCrace3B und PCR-Anker und dem gereinigten und 1 : 500 verdünnten PCR-Produkt als Template wiederholt. Nach einer erneuten Analyse der Produkte wurden spezifische Fragmente in der erwarteten Länge einkloniert und über Sequenzanalyse verifiziert.

Für das 5'-RACE wurde mit Hilfe des pPCrace5A Gesamt-RNA nach der in Beispiel 5 Methode in cDNA umgeschrieben. Anschließend wurde das First Strand Produkt vom Überschuß an Nukleotiden und des Primers mit dem High Pure PCR Product Purification Kit (Boehringer Mannheim) nach Herstellerangaben gereinigt. Durch die Terminale Transferase (TdT) wurde die gereinigte cDNA mit einem Oligo-dC Tail versehen. Der Tailing Ansatz sah wie folgt aus: 6.5 µl Wasser, 5.0 µl 5 × Tailing Puffer, 2.5 µl 2 mM dCTP und 10 µl cDNA. Dieser Mix wurde für 3 min. bei 94°C denaturiert und anschließend für 1 min. auf Eis gestellt. Durch die Zugabe von 1 µl TdT wurde die Reaktion gestartet und dann für 10 min. bei 37°C inkubiert. Die Inaktivierung des Enzyms erfolgte durch Inkubation bei 65°C für 10 min. Die PCR-Amplifikation der dC-getailten cDNA erfolgte in 0.5 ml dünnwandigen PCR-Gefäßen nach folgendem Protokoll: Einmalige Denaturierung bei 94°C für 10 min., anschließend 35 Zyklen bestehend aus 94°C für 1 min., 57°C für 1 min. und 72°C für 2 min. Abschließend wurde noch ein Extensionschritt von 7 min. durchgeführt. Der PCR-Ansatz setzte sich aus folgenden Komponenten zusammen: 31.5 µl Wasser, 5.0 µl 10 × PCR-Puffer, 3.0 µl 25 mM MgCl₂, 1.0 µl 10 mM dNTP, 2.0 µl 10 µM pPCrace5B, 2.0 µl 10 µM AAP, 5.0 µl dC-tailed cDNA und 0.5 µl 5 U/µl Tag DNA Polymerase (Promega, Madison, USA). 15 µl des 5'-RACE Produktes wurden auf einem 3%-igem Low- Melting Agarosegel bei der Verwendung von geeigneten Längenstandards analysiert. Spezifische Einzelbanden im Bereich von ca. 600 kb wurden für eine nested-PCR verwendet. Nach einer Reinigung wie bereits oben beschrieben, wurde auch der dargestellte PCR-Ansatz mit den Primern pPCrace5C und backrace und dem gereinigten und 1 : 500 verdünnten PCR-Produkt als Template wiederholt. Nach einer erneuten Analyse der Produkte wurden spezifische Fragmente in der erwarteten Länge einkloniert und über Sequenzanalyse verifiziert.

Mit Hilfe der RACE-Methoden wurden ein ~900 kb langes und ein ~300 kb langes spezifisches Fragment amplifiziert. In den überlappenden Bereichen sind diese neuen Fragmente homolog zum Fragment pPCdioxy2.6. Der Gesamt-Klon (1431 bp) besitzt einen offenen Leserahmen und zeigt auf Aminosäure Ebene eine 78%-ige Homologie zur Flavanon 3-Hydroxylase aus Daucus carota.

BEISPIEL 8 Expression von pPCFNS-ORF in Hefe Konstruktion von pYes2.1TOPOPCYFNSsense und pYes2.1TOPOPCYFNSantisense

Ein 1246 kb PCR Fragment, entsprechend pPCFNS-ORF, wurde direkt in den Hefe Expressionsvektor pYES2.1TOP0 ligiert. Die entstandenen Plasmide wurden mit Hilfe der interner Restriktionsschnittstellen des Fragmentes pPCFNS-ORF hinsichtlich des vorhandenen Insert und der jeweiligen Orientierung überprüft, Die so charakterisierten Fragmente wurden als pYes2.1TOPOPCYFNSsense und pYes2.1TOPOPCYFNSantisense bezeichnet

Hefe Transformation

Der Hefe Stamm INVSc 1 wurde mit den Plasmiden pYes2.1TOPOPCYFNSsense und pYes2.1TOPOPCYFNSantisense entspechend dem Protokoll nach Gietz et. al. (1992) transformiert. Die Selektion transformierter Hefezellen erfolgte über einen Komplementationsmarker.

Präparation von Hefe Proteinextrakt für Flavonsynthase I Tests

Einzelne Kolonien von INVSc 1/pYes2.1TOPOPCYFNSsense und INV/Sc 1 pYes2.1TOPOPCYFNSantisense, die auf Selektionsmedium SGI {20 g Glucose (w/v), 1 g Pepton (Fluka), 6.7 g Yeast Nitrogen Base without amino acids (Difco) und 20 mg L-Tryptophan (Fluka) pro Liter} herangezogen wurden, wurden anschließend in 5 × 5 ml SGI-broth inokuliert und bei 200 rpm und 30°C für 24 Stunden inkubiert. Bei einer OD₆₀₀ von 0.2-0.4 der 1 : 10 verdünnten Vorkultur erfolgte ein vollständiges Überimpfen in 250 ml YPGE {5 g Glucose, 10 g Pepton, 10 g Yeast Extract (Fluka) und 3 Vol. % Ethanol pro Liter}. Die Hauptkultur wurde bei 30°C und 120 rpm bebrütet. Bei einer OD₆₀₀ von 0.8 bis 1.2 erfolgte die Induktion durch Zufütterung von 27 ml 200 g/l, steriler Galaktose Lösung.

Nach 12 bis 15 Stunden, bei einer OD₆₀₀ von etwa 0.6 bis 1.2 der 1 : 10 verdünnten Hauptkultur, wurden die Hefezellen durch Zentrifugation geerntet, einmal mit TEK {50 mM Tris-HCl pH 7.4, 1 mM EDTA und 0.1 M KCl} gewaschen und in Tris-HCl, pH 7.5 resuspendiert. Der Aufschluß der Hefen erfolgte bei 4°C mit 15 g Glassbeads (Sigma) je Ansatz. Die Glassbeads wurden anschließend zweimal mit 5 ml Tris-HCl, pH 7.5 gewaschen und der vereinigte Überstand diente als Enyzmquelle für die FNS I Tests.

FNS I-Aktivität wurde, wie für die FNS II bei Martens und Forkmann (1998) beschrieben, gemessen. Der Standardtest für die Flavonsynthase I enthielt in einem Gesamtvolumen von 200 µl : 120 µl Tris-HCl Puffer (pH 7.5), 0.3 nmol radioaktive markiertes Substrat (83 Bq; [^14C] Naringenin), 1 µmol Natriumascorbat, 10 nmol Eisen (II) sulfat, 20 nmol 2-Oxoglutarat und 50 µl der Hefe Proteinpräparation. Nach einer Inkubation von 20 min. bei 25°C wurde die Reaktion durch die Zugabe von 20 µl Methanol, das eine Mischung von Naringenin und Apigenin (Produkt) enthielt, gestoppt. Die Extraktion des Reaktionsgemisches erfolgte zweimal mit 100 bzw. 50 µl Ethylacetat. Die obere Phase wurde auf Cellulose Dünnschichtplatten im Laufmittel 1 bis 4 (s. o.) chromatographiert. Die Radioaktivität wurde mit Hilfe eines Fuji BAS 1000 Bio-Imaging Analyser (Fuji) und des TINA Software Packets (Raytest) lokalisiert und quantifiziert.

Der Enzymextrakt, der aus INVSc 1/pYes2.1TOPOPCYFNSsense hergestellt wurde, zeigt eine deutliche FNS I-Aktivität, wohingegen die entsprechende Fraktion aus INVSc 1/­ pYes2.1TOPOPCYFNSantisense keine Aktivität zeigte (Abb. 7). Die Ergebnisse der Hefeexpression bestätigen, daß das cDNA Insert pPCYFNS-ORF für ein FNS I Enzym kodiert. Darüberhinaus zeigt das Ergebnis, daß die Expression des Enzyms, das durch den Petroselinum cDNA Klon kodiert wird, in Hefe ausreichend ist, um die direkte Bildung von Flavonen zu erreichen. Dies legt nahe, daß nur ein einziges Enzym für die Einführung der Doppelbindung zwischen C2 und C3 erforderlich ist (Abb. 1B).

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SEQUENZPROTOKOLL

Claims (25)

1. Eine Nukleinsäuresequenz kodierend eine Flavonsynthase I (FNS I), ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus:

• a) der Nukleinsäuresequenz von SEQ ID NO: 1 oder einem Teil hiervon,
• b) einer Nukleinsäuresequenz, die zu der Nukleinsäuresequenz (a) hybridisiert und/oder mindestens 60% Homologie zu dieser aufweist und die ein Protein oder Polypeptid mit der biologischen Aktivität einer Flavonsynthase I kodiert,
• c) einer Nukleinsäuresequenz, die degeneriert ist, bezogen auf eine Nukleinsäuresequenz gemäß (a) oder (b).

2. Nukleinsäuresequenz, die zu der Nukleinsäuresequenz aus Anspruch 1 komplementär ist.

3. Eine Nukleinsäuresequenz gemäß Anspruch 1 oder 2, wobei die Nukleinsäuresequenz DNA oder RNA ist.

4. Eine Nukleinsäuresequenz gemäß Anspruch 1, wobei die Nukleinsäuresequenz abgeleitet ist aus einer Pflanze aus der Gruppe von Pflanzen, bestehend aus Gerbera (Gerbera Hybriden), Aster (Callistephus chinensis), Löwenmäulchen (Antirrhinum majus), Chrysantheme (Chrysanthemum indicum), Dahlie (Dahlia Hybriden), Gloxinie (Sinningie Hybriden), Verbene (Verbena Hybriden) und Streptocarpus (S. Hybriden).

5. Ein rekombinantes DNA-Molekül, enthaltend eine Nukleinsäuresequenz gemäß einem der Ansprüche 1 bis 4.

6. Rekombinantes DNA Molekül gemäß Anspruch 5, wobei das rekombinante DNA-Molekül ein Vektor ist oder ein Vektor mit einem Promotor.

7. Eine Wirtszelle, enthaltend ein DNA-Molekül gemäß Anspruch 6.

8. Wirtszelle gemäß Anspruch 7, die eine bakterielle Zelle, eine Hefezelle, eine Insek­ tenzelle, eine Pflanzenzelle oder eine Säugerzelle ist.

9. Polypeptid, kodiert durch eine Nukleinsäuresequenz gemäß einem der Ansprüche 1 bis 4.

10. Polypeptid mit einem Teil oder der gesamten Aminosäuresequenz aus SEQ ID NO: 2 oder Derivate hiervon.

11. Polypeptid gemäß Anspruch 10, wobei das Polypeptid Flavonsynthase I-Aktivität besitzt.

12. Polypeptid gemäß Anspruch 11, wobei das Polypeptid abgeleitet ist aus einer Pflanze aus der Gruppe von Pflanzen, bestehend aus Gerbera (Gerbera Hybriden), Aster (Callistephus chinensis), Löwenmäulchen (Antirrhinum majus), Chrysantheme (Chrysanthemum indicum), Dahlie (Dahlia Hybriden), Gloxinie (Sinningia Hybriden), Verbene (Verbena Hybriden) und Streptocarpus (S. Hybriden).

13. Transgene Pflanze, enthaltend eine Nukleinsäuresequenz gemäß einem der Ansprüche 1 bis 4.

14. Transgene Pflanze gemäß Anspruch 13, wobei die Nukleinsäuresequenz zur Expression geeignet ist und diese Expression gegebenenfalls regulierbar ist oder entwicklungsbedingt reguliert wird.

15. Transgene Pflanze gemäß einem der Ansprüche 13 oder 14, ausgewählt aus der Gruppe von Pflanzen bestehend aus Gerbera (Gerbera Hybriden), Aster (Callistephus chinensis), Löwenmäulchen (Antirrhinum majus), Chrysantheme (Chrysanthemum indicum), Dahlie (Dahlia Hybriden), Gloxinie (Sinningia Hybriden), Verbene (Verbena Hybriden) und Streptocarpus (S. Hybriden).

16. Verfahren zur Herstellung einer transgenen Pflanze mit einer veränderten Blütenfarbe, umfassend das Einbringen einer Nukleinsäuresequenz gemäß einem der Ansprüche 1 bis 4 in eine Zelle einer geeigneten Pflanze und der Regeneration einer transgenen Pflanze aus dieser Zelle und das Heranziehen dieser transgenen Pflanze über einen geeigneten Zeitraum und unter Bedingungen, die geeignet für die Expression der eingebrachten Nukleinsäuresequenz sind.

17. Verfahren gemäß Anspruch 16, wobei die eingebrachte Nukleinsäuresequenz in der Pflanze exprimiert wird.

18. Verfahren gemäß Anspruch 16 oder 17, wobei die transgene Pflanze ausgewählt ist aus der Gruppe von Pflanzen bestehend aus Euphorbia (E. pulcherrima), Cyclamen (Cyclamen persicum), Rose (Rosa Hybrida), Pelargonium (P. spec.), Begonia (B. spec.), Nelke (Dianthus caryophyllus) und Tulpe (Tulipa Hybriden).

19. Verfahren gemäß Anspruch 16 oder 17, wobei die Pflanze zur Expression einer endogenen Flavonsynthase I (FNS I) fähig ist und diese bei Expression der eingebrachten Nukleinsäuresequenz coexprimiert wird.

20. Verfahren gemäß Anspruch 19, wobei die transgene Pflanze ausgewählt ist aus der Gruppe von Pflanzen bestehend aus Gerbera (Gerbera Hybriden), Aster (Callistephus chinensis), Löwenmäulchen (Antirrhinum majus), Chrysantheme (Chrysanthemum indicum), Dahlie (Dahlia Hybriden), Gloxinie (Sinningia Hybriden), Verbene (Verbena Hybriden) und Streptocarpus (S. Hybriden).

21. Verfahren gemäß Anspruch 19 oder 20, wobei die endogen vorhandene Flavonsynthase I (FNS I)-Aktivität durch Einbringen der Nukleinsäuresequenz reduziert wird.

22. Verwendung eines Polypeptids gemäß einem der Ansprüche 9 bis 12 zur Synthese von Flavonen.

23. Verwendung gemäß Anspruch 22, wobei die Flavone als Medikament eingesetzt werden.

24. Verwendung gemäß Anspruch 23, wobei die Flavone in der Krebstherapie eingesetzt werden.

25. Verwendung gemäß Anspruch 22, wobei die Flavone als bioaktive Substanzen eingesetzt werden.