DE69636328T2

DE69636328T2 - Transgene pflanzen mit veränderter blutenfarbe und verfahren zu ihrer herstellung

Info

Publication number: DE69636328T2
Application number: DE69636328T
Authority: DE
Inventors: Albert Timothy Northcote HOLTON
Original assignee: International Flower Developments Pty Ltd
Current assignee: International Flower Developments Pty Ltd
Priority date: 1995-05-16
Filing date: 1996-05-16
Publication date: 2007-08-09
Anticipated expiration: 2016-05-17
Also published as: JPH11505116A; EP0873410A4; US6080920A; HUP9802555A2; CA2202668A1; ES2265644T3; JP3585932B2; WO1996036716A1; NZ307119A; ATE332383T1; AUPN298895A0; EA199700386A1; EP0873410A1; PT873410E; DK0873410T3; DE69636328D1; EP0873410B1

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft allgemein neue Ansätze zur Erzeugung transgener Pflanzen, die eine veränderte Blütenfarbe zeigen. Insbesondere stellt die vorliegende Erfindung transgene Nelkenpflanzen und davon geschnittene Blumen bereit, die eine Blütenfarbe zeigen, die nicht von Natur aus mit Nelkenpflanzen assoziiert ist. Die vorliegende Erfindung zieht weiterhin Verfahren zur Erzeugung transgener Nelkenpflanzen mit der veränderten Blütenfarbe in Betracht.
Die bibliographischen Details der Publikationen, auf die in dieser Beschreibung Bezug genommen wird, sind am Ende der Beschreibung zusammengefasst. Sequenzidentitätsnummern (SEQ ID NOs.) für die Nukleotidsequenzen, auf die in der Beschreibung Bezug genommen wird, sind im Anschluss an die Bibliographie definiert.
In der gesamten Beschreibung sind, sofern nicht der Kontext etwas anderes erfordert, das Wort „umfassen" oder Variationen davon wie „umfasst" oder „umfassend" so zu verstehen, dass sie den Einschluss eines genannten Elementes oder einer genannten Entität oder Gruppen von Elementen oder Entitäten, aber nicht den Ausschluss irgend eines anderen Elements oder einer anderen Entität oder Gruppen von Elementen oder Entitäten bezeichnen.
Die rasch zunehmende Verfeinerung der rekombinanten DNA-Technologie erleichtert in hohem Maße ein breites Spektrum industrieller Prozesse vom Gartenbau bis zur medizinischen Industrie und den damit in Verbindung stehenden Gesundheitsindustrien. Die Gartenbau- und verwandten Ackerbauindustrien ziehen aus den Fortschritten in der rekombinanten DNA-Technologie besonderen Nutzen.
Insbesondere die Blumenzuchtindustrie bemüht sich, neue und unterschiedliche Sorten von Blütenpflanzen mit verbesserten Merkmalen, die von Krankheits- und Pathogenresistenz bis zur veränderten Blütenfarbe reichen, zu entwickeln. Obwohl klassische Zuchtverfahren mit gewissem Erfolg angewandt wurden, wird dieser Ansatz durch die Beschränkungen des Gen-Pools einer bestimmten Spezies begrenzt. Es ist z. B. selten, dass eine einzelne Spezies ein volles Spektrum farbiger Sorten besitzt. Demgemäß wurde ein erheblicher Aufwand in die Verwendung rekombinanter DNA-Technologie zur Erzeugung transgener Pflanzen mit den gewünschten Merkmalen investiert.
Die Entwicklung von Sorten der wichtigsten Schnittblumenarten wie z. B. Nelken mit Blüten mit einem Farbspektrum, das Lilafarbig, Violett, Purpur und Blau oder verschiedene Schattierungen davon abdeckt, würde eine erhebliche Chance sowohl auf dem Schnittblumen- als auch auf dem Zierblumenmarkt eröffnen.
Die Farbe von Blüten wird hauptsächlich durch zwei Arten von Pigmenten bedingt: Flavonoide und Carotinoide. Flavonoide tragen zu einem Farbspektrum von gelb über rot bis blau bei. Carotinoide vermitteln einen orangefarbigen oder gelben Farbton und sind gewöhnlich das einzige Pigment in gelben oder orangefarbigen Blüten. Die flavonoiden Moleküle, die den wesentlichen Beitrag zur Blütenfarbe leisten, sind die Anthocyane, die glycosylierte Derivate von Cyanidin, Delphinidin, Petunidin, Päonidin, Malvidin und Pelargonidin sind, und die in der Vakuole zu finden sind. Die verschiedenen Anthocyane können deutliche Farbunterschiede hervorru fen. Die Blütenfarbe wird auch durch Co-Pigmentierung mit farblosen Flavonoiden, Metallkomplexierung, Glycosylierung, Acylierung, Methylierung und den pH-Wert in der Vakuole beeinflusst (Forkmann 1991).
Der Biosyntheseweg der Flavonoidpigmente (im Nachfolgenden als Flavonoidweg bezeichnet) ist gut erforscht (Ebel und Hahlbrock, 1988; Hahlbrock und Grisebach, 1979; Wiering und de Vlaming, 1984; Schram et al., 1984; Stafford, 1990). Der erste Schlüsselschritt des Stoffwechselwegs umfasst die Kondensation von drei Malonyl-CoA-Molekülen mit einem Molekül p-Coumaryl-CoA. Diese Reaktion wird von dem Enzym Chalconsynthase katalysiert (CHS). Das Produkt dieser Reaktion, 2',4,4',6'-Tetrahydroxychalcon, wird normalernweise rasch durch das Enzym Chalcon-Flavanon-Isomerase (CHI) zu Naringenin isomerisiert. Naringenin wird im nächsten Schritt durch Flavanon-3-Hydroxylase (F3H) an der 3-Position des zentralen Rings zu Dihydrokaempferol (DHK) hydroxyliert.
Der B-Ring des Dihydrokaempferols (DHK) kann entweder an der 3'- oder sowohl an der 3'- als auch an der 5'-Position zu Dihydroquercetin (DHQ) und Dihydromyricetin (DHM) hydroxyliert werden (siehe 1). DHQ ist ein Zwischenprodukt, das zur Bildung cyanidinbasierter Anthocyane erforderlich ist, und DHM ist ein Zwischenprodukt, das zur Bildung delphinidinbasierter Anthocyane auf dem Flavonoidweg erforderlich ist. Zwei an diesem Weg beteiligte Schlüsselenzyme sind die Flavonoid-3'-hydroxylase (F3'H) und die Flavonoid-3',5'-hydroxylase (F3'5'H). Die F3'H wirkt auf DHK und bildet DHQ. Die F3'5'H ist ein Breitspektrumenzym, das die Hydroxylierung von DHK an den 3'- und 5'-Positionen und die Hydroxylierung von DHQ in der 5'-Position katalysiert (Stotz und Forkmann 1982), wobei sie in beiden Fällen DHM bildet. Das Hydroxylierungsmuster des B-Ringes der Anthocyane spielt bei der Festlegung der Blütenblattfarbe eine Schlüsselrolle.
Ein anderes Schlüsselenzym ist die Dihydroflavonol-4-Reduktase (DFR), die in Abhängigkeit von ihrer pflanzlichen Quelle unterschiedliche Substratspezifität aufweist und das Potential hat, auf ein beliebiges oder mehrere von DHK, DHQ und DHM zu wirken.
Viele der wichtigsten Schnittblumenarten besitzen keine F3'5'H und können infolgedessen den sich aus der Synthese von Delphinidin und seinen Derivaten ergebenden Farbenbereich, der ansonsten möglich wäre, nicht zeigen. Dies gilt insbesondere für Nelken, die einen großen Anteil des weltweiten Schnittblumenmarktes darstellen. Es gibt daher ein Bedürfnis, Nelkenpflanzen zur Erzeugung transgener Pflanzen zu modifizieren, die imstande sind, die F3'5'H zu bilden, dadurch ein Mittel zur Umwandlung von DHK und DHQ in DHM bereitzustellen, dadurch das Hydroxylierungsmuster der Anthocyane zu beeinflussen und die Bildung von von Delphinidin abgeleiteten Anthocyanen zu erlauben. Als Ergebnis ist die Blütenfarbe verändert, und eine einzelne Spezies ist imstande, ein breiteres Spektrum von Blütenfarben zu exprimieren. WO94/28140 beschreibt die Einführung von F3'5'H in Pflanzen ohne F3'5'H, um die Bildung von Delphinidin relativ zu nicht transgenen Pflanzen zu erhöhen. Die DFR-Enzymspiegel wurden jedoch nicht modifiziert.
In der zu der vorliegenden Erfindung führenden Arbeit versuchten die Erfinder, bei Nelkenpflanzen den Flavonoidweg genetisch zu manipulieren, um ein Spektrum von Pflanzen mit der Fähigkeit, den DHK-Metabolismus bevorzugt gegenüber oder anstelle von Pelargonidin oder Cyanidin zum Delphinidin zu leiten, hervorzubringen. Die resultierenden Pflanzen zeigen relativ zu den gegenwärtig verfügbaren Nelkenpflanzen eine veränderte Blütenfärbung. Die neuen transgenen Nelkenpflanzen und insbesondere die davon gewonnenen Schnittblumen erfüllen ein lange bestehendes Bedürfnis in der Gartenbauindustrie und insbesondere in der Blumenzucht im Vergleich zu Nelken. Die Technologie der vorliegenden Erfindung ist auch auf eine Reihe anderer Blütenpflanzen anwendbar, wie z. B. Rosen und Chrysanthemen.
Demgemäß betrachtet ein Aspekt der vorliegenden Erfindung ein Verfahren zur Erzeugung einer Pflanze, die eine veränderte Blütenfarbe zeigt, wobei dieses Verfahren es umfasst, dass man eine Pflanze auswählt, von der die besagte erste Pflanze abgeleitet wird, wobei die ausgewählte Pflanze unfähig ist, eine DFR zo synthetisieren, die auf DHK wirkt, oder im Vergleich zu einer Wildtyppflanze verringerte DFR-Spiegel bildet, oder die eine DFR mit einer verringerten Substratspezifität für DHK im Vergleich zu DHQ oder DHM bildet, und dass man in diese ausgewählte Pflanze ein oder mehrere genetische Konstrukte einführt, die Nukleotidsequenzen umfassen, die eine F3'5'H und eine DFR, die imstande ist, auf DHM zu wirken, aber die nicht imstande ist, auf DHK zu wirken, oder die eine größere Substratspezifität für DHM als für DHK oder DHQ hat, codieren.
Insbesondere stellt die vorliegende Erfindung ein Verfahren zur Erzeugung einer Nelkenpflanze bereit, die eine veränderte Blütenfarbe zeigt, wobei dieses Verfahren es umfasst, dass man eine Nelkenpflanze auswählt, von der die besagte erste Pflanze abgeleitet wird, wobei die ausgewählte Pflanze unfähig ist, eine DFR zu synthetisieren, die auf DHK wirkt, oder im Vergleich zu einer Wildtyppflanze verringerte DFR-Spiegel bildet, oder die in den Blüten eine DFR mit einer verringerten Substratspezifität für DHK im Vergleich zu DHQ oder DHM bildet, und dass man in diese ausgewählte Pflanze ein oder mehrere genetische Konstrukte einführt, die Nukleotidsequenzen umfassen, die eine F3'5'H und eine DFR, die imstande ist, auf DHM zu wirken, aber die nicht imstande ist, auf DHK zu wirken, oder die eine größere Substratspezifität für DHM als für DHK oder DHQ hat, codieren.
Die vorliegende Erfindung wird hier am Beispiel von Nelkenpflanzen dargestellt. Hierbei ist jedoch zu verstehen, dass die vorliegende Erfindung sich auf eine Reihe von Blütenpflanzen wie z. B. Rosen und Chrysanthemen, ohne auf diese beschränkt zu sein, erstreckt. Bezüge, die nachfolgend auf Nelken genommen werden, sollten als Bezüge auf andere geeignete Blütenpflanzen verstanden werden.
Das Verfahren zur Erzeugung der Nelkenpflanze mit veränderter Blütenfarbe kann durch die folgenden Schritte durchgeführt werden:

(i) Man wählt eine Pflanze aus, von der diese Nelkenpflanze abzuleiten ist, wobei diese ausgewählte Pflanze unfähig ist, eine DFR zu bilden, die auf DHK wirkt, oder im Vergleich zu einer Wildtyppflanze verringerte DFR-Spiegel bildet oder die eine DFR mit ei ner verringerten Substratspezifität für DHK im Vergleich zu DHQ oder DHM in den Blüten bildet;
(ii) man transfonniert Zellen dieser ausgewählten Pflanze mit einem oder mehreren genetischen Konstrukten, die Nukleotidsequenzen umfassen, die getrennt voneinander F3'5'H und DFR codieren, sofern diese DFR imstande ist, auf DHM zu wirken, aber außerstande ist, auf DHK zu wirken oder eine größere Substratspezifität für DHM als für DHK oder DHQ hat;
(iii) man regeneriert eine transgene Pflanze aus diesen transformierten Zellen, so dass diese regenerierte Pflanze imstande ist, die F3'5'H und die DFR des Schrittes (ii) zu exprimieren; und
(iv) man kultiviert diese Pflanze unter Bedingungen, die die Expression der F3'5'H und der DFR des Schrittes (ii) in den Blüten erlauben.

Bezüge auf eine veränderte Blütenfarbe umfassen hier eine Veränderung oder Veränderungen in der Farbe beliebiger einzelner oder aller Bestandteile der Blüte einschließlich der Blütenblätter, Kelchblätter und Staubblätter. Bequemerweise wird eine veränderte Blütenfarbe belegt, indem man die Blütenfarbe einer transgenen Pflanze, die in Übereinstimmung mit der vorliegenden Erfindung geschaffen worden ist, mit einer Pflanze der gleichen Art, die jedoch eine DFR besitzt, die auf DHK wirken kann, vergleicht. In der praktischen Durchführung kann man einen Vergleich zwischen der transgenen Pflanze und der „ausgewählten" Pflanze, d. h. der Pflanze, von der die transgene Pflanze abgeleitet ist, anstellen.
Die vorliegende Erfindung ist teilweise auf die genetische Manipulation des Anthocyanweges bei Nelkenpflanzen zur Lenkung des DHK-Metabolismus vorzugsweise in Richtung von DHM und Delphinidin und seinen Derivaten anstelle von Leucopelargonidin und Pelargonidinderivaten oder DHQ und Leucocyanidin und Cyanidinderivaten gegründet. Die Blüten von Nelkenpflanzen besitzen keine F3'5'H, und daher kann das DHK keinen Metabolismus entlang des Delphinidinwegs durchlaufen, der zur Ausbildung von Blütenfarben im Bereich von Lilafarbig, Violett, Purpur und Blau oder verschiedenen Schattierungen davon erforderlich ist. Um eine bevorzugte Umlenkung von DHK-Stoffwechselprodukten auf den Delphinidinweg zu erreichen, suchten und lokalisierten die Erfinder weiße Linien von Nelkenpflanzen, denen eine funktionelle DFR fehlte. Die Expression eines eingeführten Nukleinsäuremoleküls führt zu einer F3'5'H, die imstande ist, den DHK-Metabolismus auf DHM zu lenken. Die Einführung und Expression eines Nukleinsäuremoleküls, das eine nicht indigene DFR codiert, die imstande ist, auf DHM, aber nicht auf DHK zu wirken, führt dann zur Lenkung des DHM-Metabolismus in die Richtung von Leucodelphinidin, was die nachfolgende Umwandlung in andere Delphinidinderivate erlaubt. Wenig oder kein Metabolismus erfolgt über den Pelargonidin- oder Cyanidin-Weg.
In einer besonders bevorzugten Ausführungsform fehlt den Blüten der Ausgangspflanze auch eine F3'H.
Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform betrachtet die vorliegende Erfindung ein Verfahren zur Erzeugung einer Nelkenpflanze, die veränderte Blütenfarbeneigenschaften zeigt, wobei dieses Verfahren es umfasst, dass man eine Nelkenpflanze auswählt, von der die ersterwähnte Nelkenpflanze abzuleiten ist, wobei die ausgewählte Pflanze außerstande ist, entweder eine F3'H oder eine DFR, die auf DHK wirken kann, zu bilden, oder die im Vergleich zu einer Wildtyppflanze reduzierte DFR-Spiegel bildet, oder die in den Blüten eine DFR mit einer verringerten Substratspezifität für DHK im Vergleich zu DHQ oder DHM bildet; und in diese Pflanze ein oder mehrere genetische Konstrukte einführt, die Nukleotidsequenzen umfassen, die eine F3'5'H und eine DFR, die imstande ist, auf DHM zu wirken, aber die außerstande ist, auf DHK zu wirken, oder die eine größere Substratspezifität für DHM als für DHK oder DHQ hat, einführt.
Das Verfahren zur Erzeugung der Nelkenpflanze mit veränderter Blütenfarbe, kann durch die folgenden Schritte durchgeführt werden:

(i) Man wählt eine Pflanze aus, von der diese Nelkenpflanze abzuleiten ist, wobei diese ausgewählte Pflanze unfähig ist, eine F3'H oder eine DFR zu bilden, die auf DHK wirkt, oder im Vergleich zu einer Wildtyppflanze verringerte DFR-Spiegel bildet, oder die in den Blüten eine DFR mit einer verringerten Substratspezifität von DHK im Vergleich zu DHQ oder DHM bildet;
(ii) man transformiert Zellen dieser ausgewählten Pflanze mit einem oder mehreren genetischen Konstrukten, die Nukleotidsequenzen umfassen, die getrennt voneinander F3'5'H und DFR codieren, sofern diese DFR imstande ist, auf DHM zu wirken, aber außerstande ist, auf DHK zu wirken, oder die eine größere Substratspezifität für DHM als für DHK oder DHQ hat;
(iii) man regeneriert eine transgene Pflanze aus diesen transformierten Zellen, so dass diese regenerierte Pflanze imstande ist, die F3'5'H und DFR des Schrittes (ii) zu exprimieren; und
(iv) man kultiviert diese Pflanze unter Bedingungen, die die Expression der F3'5'H und der DFR des Schrittes (ii) in den Blüten erlauben.

Die vorliegende Erfindung wird hier am Beispiel von Petunien-DFR als Enzym, das imstande ist, auf DHM, aber nicht auf DHK zu wirken, dargestellt. Hierbei ist jedoch zu verstehen, dass die vorliegende Erfindung sich auf ein DFR-Enzym aus einer beliebigen Pflanze erstreckt, sofern es imstande ist, auf DHM, aber nicht auf DHK zu wirken. In ähnlicher Weise ist eine besonders nützliche F3'5'H aus der Petunie, aber zu anderen Quellen für F3'5'H gehören Aubergine, Lisianthus, Enzian, Stiefmütterchen, chinesische Aster, Anemone, Traube, Iris, Hyazinth, Rittersporn und Glockenblume.
Bezugnahmen auf die Fähigkeit einer Pflanze, ein Enzym wie DFR, F3'H oder F3'5'H zu bilden oder nicht zu bilden, betreffen ihre Fähigkeit in den Blüten, aber nicht notwendigerweise an anderen Orten in der Pflanze.
Eine besonders bevorzugte Ausführungsform der vorliegenden Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung einer Nelkenpflanze, die eine veränderte Blütenfarbe zeigt, und solche Verfahren können durchgeführt werden, indem man eine Nelkenpflanze auswählt, von der die besagte erste Nelkenpflanze auszuwählen ist, wobei diese ausgewählte Pflanze außerstande ist, entweder F3'H oder eine DFR, die auf DHK wirken kann, zu bilden, oder die reduzierte DFR-Spiegel im Vergleich zu einer Wildtyppflanze bildet, oder die in den Blüten eine DFR mit einer verringerten Substratspezifität für DHK im Vergleich zu DHQ oder DHM bildet, in die Zellen dieser ausgewählten Pflanze ein oder mehrere genetische Konstrukte einführt, die Nukleotidsequenzen umfassen, die getrennt voneinander eine F3'5'H und eine Petunien-DFR codieren, eine Pflanze aus diesen Zellen regeneriert und dann diese Pflanze unter Bedingungen wachsen lässt, die geeignet sind, die Expression dieser F3'5'H und der Petunien-DFR zu erlauben, so dass diese Pflanze Blüten von im Vergleich zu der ausgewählten Pflanze unterschiedlicher Farbe hervorbringt. Vorzugsweise ist der Ursprung der F3'5'H eine Petunie.
Die ausgewählte Pflanze, von der die erfindungsgemäße transgene Pflanze, die die veränderte Blütenfarbe zeigt, abgeleitet ist, kann eine natürliche DFR-Mutante sein, so dass sie im Wesentlichen keine DFR bildet oder verringerte Spiegel dieses Enzyms bildet oder das Enzym mit veränderter Substratspezifität bildet, wie z. B. einer wesentlichen Unfähigkeit, DHK zu metabolisieren. Vorzugsweise ist die ausgewählte Pflanze jedoch eine DFR- und F3'H-Doppelmutante. Mutanten dieser Typen haben im allgemeinen weiße Blüten. Die Mutationen können einzelne oder mehrfache Nukleotidsubstitutionen, Deletionen und/oder Additionen gegenüber den die Enzyme definierenden Nukleotidsequenzen sein. Alternativ können die Mutationen durch, z. B., Transposonmarkierung, Oligonukleotid-gelenkte Mutagenese, Agrobacterium-vermittelte Mutagenese oder virusvermittelte Mutagenese ausgelöst oder gesteuert sein.
Alternativ können genetische Konstrukte eingeführt werden, um die DFR- und/oder F3'H-Expression durch, z. B., Antisense- oder Co-Suppressions-Verfahren zu verringern. Gemäß diesem Aspekt der Erfindung kann eine Pflanze mit wesentlicher Unfähigkeit, entweder DFR oder F3'H zu synthetisieren, ausgewählt und eine genetische Sequenz zur Verringerung der Expression der anderen von besagter DFR oder F3'H eingeführt werden. Alternativ kann eine Pflanze mit einer wesentlichen Unfähigkeit, entweder DFR oder F3'H zu synthetisieren, ausgewählt und in der anderen von DFR oder F3'H durch eines der oben erwähnten Mittel eine Mutation eingeführt werden. In jedem Fall ist die resultierende Pflanze eine „ausgewählte" Pflanze und ein Rezipient für eine F3'5'H und eine DFR, die imstande ist, auf DHM, aber nicht auf DHK zu wirken. Eine „ausgewählte" Pflanze kann auch als „Eltern"-Pflanze betrachtet werden, da es diese Pflanze ist, vor der in Übereinstimmung mit den Verfahren der vorliegenden Erfindung eine transgene Pflanze, die veränderte Blütenfarbe zeigt, abgeleitet wird.
Die von der vorliegenden Erfindung erwogene veränderte Blütenfarbe umfasst die Fähigkeit der Nelken, ein Farbspektrum hervorzubringen, das lilafarbige, violette, purpurne und blaue Blüten oder verschiedene Schattierungen davon von, z. B., tiefer Malvenfarbe über Dun kelblau bis zu einer violetten Farbe sowie ihre verschiedenen Schattierungen oder Kombinationen davon umfasst, zu bilden.
Ein anderer Aspekt der vorliegenden Erfindung erwägt eine transgene Pflanze, die eine veränderte Blütenfarbe zeigt, wobei diese Pflanze unfähig ist, eine DFR zu synthetisieren, die auf DHK wirkt, oder die im Vergleich zu einer Wildtyppflanze verringerte DFR-Spiegel bildet, oder die eine DFR mit einer verringerten Substratspezifität für DHK im Vergleich zu DHQ oder DHM bildet; und die ein Nukleinsäuremolekül trägt, das eine Nukleotidsequenz umfasst, die eine F3'5'H und eine DFR, die imstande ist, auf DHM zu wirken, aber die außerstande ist, auf DHK zu wirken, oder die eine größere Substratspezifität für DHM als für DHK oder DHQ hat, codiert.
Vorzugsweise ist die Pflanze eine Nelke, Rose, Gerbera oder Chrysantheme. In Übereinstimmung mit diesem Aspekt der vorliegenden Erfindung kann das Nukleinsäuremolekül mehrfache genetische Konstrukte umfassen, die DFR und F3'5'H getrennt voneinander codieren, oder ein einzelnes kombiniertes genetisches Konstrukt, das beide Enzyme codiert, wobei jedoch die Expression grundsätzlich von zwei getrennten Promotoren kontrolliert wird. Der Ausdruck „Nukleinsäuremoleküle" schließt einfache oder mehrfache Nukleinsäuremoleküle ein.
Vorzugsweise ist die Nelkenpflanze auch im Wesentlichen unfähig, eine F3'H zu bilden.
Die vorliegende Erfindung erstreckt sich auf die Blüten und insbesondere auf die Schnittblumen, die von solchen Nelken oder von in Übereinstimmung mit den hier offenbarten Verfahren hergestellten Pflanzen gewonnen werden.
Eine „nicht-indigene" DFR ist ein Enzym, das in Nelkenpflanzen normalerweise nicht gebildet wird, und in einer bevorzugten Ausführungsform stammt sie aus der Petunie. Eine „nichtindigene" DFR kann alternativ aus einer Nelkenpflanze stammen, aber hat eine Mutation durchlaufen, die ihre Substratspezifität auf DHM beschränkt. Die F3'5'H ist ebenfalls nicht-indigen, in einem Aspekt stammt sie vorzugsweise aus der Petunie.
Erfindungsgemäße Nelkenblüten, die eine veränderte Blütenfarbe zeigen, können dadurch erlangt werden, dass man eine transgene blühende Nelkenpflanze über einen Zeitraum und unter Bedingungen wachsen lässt, die zur Blütenbildung führen, und dann gewünschtenfalls diese Blüten erntet, wobei die transgene Nelkenpflanze wie zuvor beschrieben genetisch manipuliert ist, so dass:

(i) sie außerstande ist, eine DFR zu exprimieren, die imstande ist, auf DHK zu wirken, oder die im Vergleich zu einer Wildtyppflanze verringerte DFR-Spiegel bildet, oder sie eine DFR mit einer verringerten Substratspezifität für DHK im Vergleich zu DHQ oder DHM bildet;
(ii) sie imstande ist, eine nicht-indigene F3'5'H zu exprimieren; und
(iii) sie imstande ist, eine nicht-indigene DFR zu exprimieren, die imstande ist, auf DHM zu wirken, aber die außerstande ist, auf DHK zu wirken, oder die eine größere Substratspezifität für DHM als für DHK oder DHQ hat.

Die Blüten, die die veränderte Blütenfarbe zeigen, haben jetzt die Fähigkeit, DHK zu DHM und Delphinidin und Derivaten davon auf dem Flavonoidweg zu metabolisieren.
Vorzugsweise ist die transgene Pflanze im Wesentlichen auch außerstande, eine F3'H zu exprimieren.
Bei den Verfahren der vorliegenden Erfindung können genetische Sequenzen, die getrennt voneinander eine F3'5'H, eine DFR, die imstande ist, auf DHM zu wirken, aber die außerstande ist, auf DHK zu wirken oder die eine größere Substratspezifität für DHM als für DHK oder DHQ hat, und optional auch eine F3'H codieren, zur genetischen Manipulation einer Nelkenpflanze verwendet werden, die außerstande ist, eine aktive DFR zu exprimieren oder zu synthetisieren, die imstande ist, auf DHK oder DHM zu wirken, oder die verringerte DFR-Spiegel im Vergleich zu einer Wildtyppflanze bildet, oder die eine DFR mit einer verringerten Substratspezifität für DHK im Vergleich zu DHQ oder DHM bildet; um die Herstellung einer Nelkenpflanze zu erlauben, die eine veränderte Blütenfarbe im Vergleich zu einer Nelkenpflanze, die imstande ist, eine DFR, die imstande ist, auf DHK zu wirken, zu bilden, zeigt. In einem verwandten Aspekt erstreckt sich die vorliegende Erfindung auf Blüten und insbesondere von diesen Nelkenpflanzen gewonnene Schnittblumen.
Die vorliegende Erfindung wird unter Bezugnahme auf die nachfolgenden Figuren und/oder Beispiele näher beschrieben.
Figuren:
1 ist eine Schemazeichnung der Wege für die Umwandlung von Dihydroflavonolen in Flavonole und Anthocyane. Abkürzungen: DHK = Dihydrokaempferol, DHQ = Dihydroquercetin, DHM = Dihydromyricetin, K = Kaempferol, Q = Quercetin, M = Myricetin, F3'H = Flavonoid 3'-Hydroxylase, F3'5'H = Flavonoid 3',5'-Hydroxylase, FLS = Flavonolsynthase, DFR = Dihydroflavonal-4-reduktase, ANS = Anthocyanidinsynthase, 3GT = Flavonoid-3-Glucosyltransferase.
2 ist eine autoradiographische Darstellung einer Northern-Analyse, die die Expressionsniveaus von DFR- und ANS-mRNA in dreizehn kommerziell verfügbaren weißen Nelkensorten vergleicht. Die Pfeile weisen auf die relevanten Transkripte.
3 ist eine Diagrammdarstellung des binären Expressionsvektors pCGP1470, dessen Konstruktion im Beispiel 9 beschrieben ist. Tc-Resistenz = Tetracyclinresistenzgen; LB = linker Rand; RB = rechter Rand; surB = Codierungsregion und Terminatorsequenzen für das Acetolactatsynthasegen des Tabaks; 35S = Promoterregion aus dem 35S-Gen des Blumenkohl-mosaikvirus; CHS = Promoterregion aus dem Chalconsynthasegen des Löwenmäulchens; Hf1 = die Flavonoid-3',5'-Hydroxylase der Petunie codierende DNA Sequenz; D8 = Terminatorsequenz aus einer Phospholipidtransferase der Petunie; MAC = mit Sequenzen des 35S-Gens des Blumenkohlmosaikvirus verstärkter Mannopinsynthasepromoter; DFR = die Dihydroflavonol-4-reduktase codierende DNA Sequenz; mas = Terminatorsequenz aus dem Mannopinsynthasegen von Agrobacterium tumefaciens. Ausgewählte Restriktionsschnittstellen sind bezeichnet.
4 ist eine Diagrammdarstellung des binären Expressionsvektors pCGP1473, dessen Konstruktion im Beispiel 10 beschrieben ist. Tc-Resistenz = Tetracyclinresistenzgen; LB = linker Rand; RB = rechter Rand; surB = Codierungsregion und Terminatorsequenzen für das Acetolactatsynthasegen des Tabaks; 35S = Promoterregion aus dem 35S-Gen des Blumenkohlmosaikvirus; CHS = Promoterregion aus dem Chalconsynthasegen des Löwenmäulchens; Hf1 = die Flavonoid-3',5'-Hydroxylase der Petunie codierende DNA Sequenz; D8 = Terminatorsequenz aus einer Phospholipidtransferase der Petunie; MAC = mit Sequenzen des 35S-Gens des Blumenkohlmosaikvirus verstärkter Mannopinsynthasepromoter; DFR = Dihydroflavonol-4-Reduktase codierende DNA Sequenz; mas = Terminatorsequenz aus dem Mannopinsynthasegen von Agrobacterium tumefaciens. Ausgewählte Restriktionsschnittstellen sind bezeichnet.
5 ist eine autoradiographische Darstellung einer Southern-Hybridisierung von aus Blattgewebe von White Unesco, die zuvor mit einem genetischen Konstrukt (pCGP1470) transformiert worden war, das als selektierbaren Marker das Acetolactatsynthasegen des Tabaks sowie die F3'5'H und DFR codierenden Nukleinsäurenmoleküle enthielt, isolierter DNA. Genomische Nelken-DNA wurde mit der Restriktionsendonuklease Xbal verdaut, und der Southern-Blot wurde mit einem ³²P-markierten 730 Basenpaar langen Fragment der F3'5'H-codierenden Region von Petunia sondiert. Die Filter wurden in 0,2 × SSC/1 %(Gewicht/Volumen) SDS bei 65 °C gewaschen. Die Spuren 1–12 stellen aus unabhängigen transgenen Pflanzen isolierte DNA Proben dar, während die Spur 13 eine untransformierte White Unesco (Negativkontrolle) ist. In der untransformierten Negativkontrolle wurden keine Banden detektiert. Spur 14 stellt 33 pg von mit Xbal verdauten pCGP1470-Plasmid dar.
6 ist eine autoradiographische Darstellung eines Northern-Blot von F3'5'H- und DFR-RNA in den Blütenblättern. Gesamt-RNA (10 μg pro Spur) aus Blütenblättern von mit pCGP1470 transformierten (Spuren 1–7) White Unesco-Pflanzen und aus Blütenblättern von nicht transgenen White Unesco-Blüten (Spur 8) wurde analysiert. In der untransformierten Negativkontrolle in Spur 8 wurden keine Banden detektiert. Spur 9 stellt 10 μg von aus Petunia hybrida cv. Old Glory Blue isolierter RNA dar. A: Der Northern-Blot wurde mit ³²P-markierter DNA aus einem 730 Basenpaar-EcoRV-Fragment eines Petunia-F3'5'H-cDNA-Klons hybridisiert und 0,5 Stunden lang in 2 × SSC/1 %(Gewicht/Volumen) SDS auf 65 °C gewaschen. B: Der Northern-Blot wurde mit einem ³²P-markierten 1,2 Kilobasenpaar langen Sacl/Xbal-DNA Fragment eines Petunien-DFR-cDNA-Klons aus Plasmid pCGP1403 (siehe Beispiel 8a) hybridisiert.
7 ist eine schwarz-weiße Darstellung einer Farbfotographie, die eine nicht transgene White Unesco-Blüte als Kontrolle (die weiße Blüte zur Linken) und eine Blüte einer mit pCGP1470 transformierten White Unesco-Pflanze darstellt. Die transformierte Pflanze bildet eine Blüte, deren Farbe lila bis violett ist.
Originalfarbfotos zur Überprüfung sind vom Anmelder erhältlich.
BEISPIEL 1
Strategie zur Veränderung der Blütenfarbe unter Verwendung von DFR-mutierten Sorten
Die Blüten mancher Pflanzen wie z. B. Rose, Nelke und Gerbera bilden in Abhängigkeit von ihrem Genotyp zwei Arten von Anthocyanidinen – Pelargonidin und Cyanidin. In Abwesenheit von F3'H-Aktivität wird Pelargonidin gebildet; in ihrer Gegenwart wird Cyanidin gebildet. Pelargonidin wird üblicherweise von Kaempferol, einem farblosen Flavonol, begleitet. Die Cyanidinpigmente werden üblicherweise entweder von Quercetin oder sowohl von Kaempferol als auch von Quercetin begleitet. Sowohl Pelargonidin als auch Kaempferol sind von DHK abgeleitet; sowohl Pelargonidin als auch Kaempferol sind von DHK abgeleitet; sowohl Cyanidin als auch Quercetin sind von DHQ abgeleitet (1). Zur Umwandlung der Dihydroflavonole (DHK, DHQ und DHM) in die farbigen Anthocyane sind mehrere Enzyme erforderlich, darunter DFR, ANS und 3GT. Eine dritte Art von Anthocyanidin, Delphinidin, kann aufgrund der natürlichen Abwesenheit einer F3'5'H-Aktivität in den Blüten dieser Pflanzen nicht gebildet werden.
Bei Nelken ist das DFR-Enzym imstande, zwei Dihydroflavonole, DHK und DHQ, zu Leucoanthocyanidinen zu metabolisieren, die schließlich in die Anthocyanidinpigmente, die für die Blütenfarbe verantwortlich sind, umgewandelt werden. DHK wird in Leucopelargonidin umgewandelt, das rot gefärbte Nelken hervorbringt, und DHQ in Leucocyanidin, wodurch karminrote Nelken entstehen (Geissman und Mehlquist, 1947; Stich et al., 1992b) (siehe 1). Die Nelken-DFR ist auch imstande, DHM in Leucodelphinidin umzuwandeln (Forkmann et al., 1987). Jedoch enthalten in der Natur vorkommende Nelkenlinien kein Flavonoid-3',5'-Hydroxylaseenzym und bilden daher kein DHM.
Das Petunien-DFR-Enzym hat eine andere Spezifität als die Nelken-DFR. Es ist imstande, DHQ in Leucocyanidin umzuwandeln, aber es ist nicht imstande, DHK in Leucopelargonidin umzuwandeln (Forkmann et al., 1987). In das F3'5'H-Enzym enthaltenden Petunienlinien kann das Petunien-DFR-Enzym das von der Wirkung der F3'5'H gebildete DHM in Leucodelphinidin umwandeln, das weiter modifiziert wird und Delphinidin bildet – das für blau gefärbte Blüten verantwortliche Pigment (siehe 1). Obwohl die Petunien-DFR imstande ist, sowohl DHQ als auch DHM umzuwandeln, kann sie DHM wesentlich effizienter umwandeln, was die Bildung von Delphinidin begünstigt (Forkmann et al., 1987).
Nelken sind mit einem Nukleinsäuremolekül, das die Petunien-F3'5'H aus einer anderen Spezies codiert, transformierbar, was die Produktion von DHM und schließlich die Akkumulation von Delphinidin ermöglicht (International Patent Application No. PCT/AU94/00265; [WO94/28140]). Jedoch ist die Effizienz der Delphinidinbildung in vielen dieser Pflanzen in Folge der Kompetition der Nelken-DFR mit dem F3'5'H-Enzym um DHK oder DHQ als Substrat gering. Die Akkumulation signifikanter Delphinidinmengen kann daher durch die Wirkung der Nelken-DFR begrenzt sein.
Die Erfinder haben gezeigt, dass die Effizienz der Delphinidinbildung durch Transformation einer DFR-mutierten Sorte mit einem geeigneten genetischen Konstrukt erheblich gesteigert wird. In einer solchen Linie gibt es infolge des Fehlens von DFR-Enzymaktivität keine Anthocy anakkumulation. Wenn jedoch ein Nukleinsäuremolekül, das das Petunien-DFR-Enzym codiert, zusammen mit einem Nukleinsäuremolekül, das die Flavonoid-3',5'-Hydroxylase codiert, verwendet wird, um diese Linie zu transformieren, und beide Enzyme exprimiert werden, dann wird DHK durch die eingeführten Enzyme in Leucodelphinidin und schließlich durch die endogenen Enzyme der Pflanze in Delphinidinpigmente umgewandelt. Wenn die DFR-mutierte Linie auch eine F3'H-Mutante ist, gibt es wenig oder keine DHQ-Bildung, und daher sind die einzigen von den transgenen Pflanzen gebildeten Anthocyane Delphinidinderivate. In Gegenwart von F3'H können auch Cyanidinpigmente gebildet werden, aber Delphinidin ist das hauptsächlich gebildete Anthocyan, da die Petunien-DFR DHM effizienter als DHQ als Substrat verwendet. Blüten von auf diese Weise genetisch manipulierten Nelkenpflanzen bilden ein Blütenfarbenspektrum, das Violett, Purpur, Magenta und Blau oder verschiedene Schattierungen davon abdeckt. Eine Erläuterung der Anwendung dieser Strategien in Übereinstimmung mit der vorliegenden Erfindung zur Herstellung von Nelken mit veränderten Blütenfarben wird in den nachfolgenden Beispielen dargestellt.
BEISPIEL 2
Durchmusterung von Dianthus caryophyllus (Nelken)-Sorten
a. Flavonolanalyse von Nelkenblüten
Zur Identifikation von Nelkensorten mit zur Anwendung der Strategie aus Beispiel 1 geeigneten Genotypen wurden weiß blühende Sorten erhalten. Aus jeder wurden Flavonole extrahiert und durch Dünnschichtchromatographie (TLC) analysiert, wie in Beispiel 16a beschrieben. Das einzige in all diesen Sorten detektierte Flavonol war Kaempferol, was zeigt, dass in den Blüten aller Sorten die F3'H-Aktivität fehlte oder erheblich reduziert war.
b. Northern-Analyse weißer Nelkensorten
Es wurde dann eine Northern-Analyse wie in Beispiel 14 beschrieben durchgeführt. Nachdem die RNA von dem Gel auf ein Hybond-N-Filter (Amersham) transferiert worden war, wurde der Filter mit dem 290 Basenpaar BamHI/HindIII-cDNA-Fragment der ANS (in Beispiel 6 beschrieben), mit ³²P markiert, sondiert. Der 1,2 Kilobasenpaar lange Asp718/BamHI-DFR-Partialklon (in Beispiel 7 beschrieben) wurde ebenfalls mit ³²P markiert und verwendet, um Duplikatfilter zu sondieren. Die Prähybridisierung (1 Stunde bei 42 °C) und Hybridisierung (16 Stunden bei 42 °C) wurden wie in Beispiel 14 beschrieben durchgeführt. Die Filter wurden 1 bis 2 Stunden lang in 2 × SSC, 1 % (Gewicht/Volumen) SDS bei 65 °C gewaschen, dann 0,5 bis 1 Stunde lang in 0,2 × SSC, 1 % (Gewicht/Volumen) SDS bei 65 °C. Die Northern-Blots wurden über Nacht bei –70 °C autoradiographiert.
Diese Analyse zeigte, dass zwei der getesteten Nelkensorten keine DFR-Message besaßen, während sie immer noch erhebliche Mengen an ANS-mRNA bildeten (siehe 2). Diese beiden Nelkensorten, White Unesco und White Diana, schienen somit den richtigen Genotyp für die Anwendung dieser Strategie zu besitzen.
c. Leucoanthocyanidineinspeisungsexperimente
Um zu bestätigen, dass White Diana und White Unesco in keinem der für die Umwandlung von Leucoanthocyanidin in Anthocyanidin notwendigen Gene mutiert waren, wurden Vorstufeneinspeisungsexperimente durchgeführt. Blütenblattstücke von White Unesco und White Diana wurden in Lösungen von Leucopelargonidin und Leucocyanidin (1 mg/ml) platziert und 16 Stunden lang bei Zimmertemperatur inkubiert. In beiden Fällen erfolgte in der Nähe der Schnittränder der Blütenblätter Anthocyansynthese. Leucopelargonidineinspeisung führte zu der Synthese von Pelargonidin, und Leucocyanidin führte zu der Synthese von Cyanidin. Die Identität der Anthocyanidine wurde durch TLC-Analyse bestimmt (siehe Beispiel 16b). Es wurde somit gezeigt, dass beide dieser beiden Sorten geeignete Kandidaten für genetische Manipulation unter Verwendung der DFR-Mutanten-Strategie waren. Weitere Erläuterungen werden mit der Sorte White Unesco dargestellt.
BEISPIEL 3
Biologische Reagenzien
Alle Restriktionsenzyme und anderen Reagenzien wurden aus kommerziellen Quellen enthalten und grundsätzlich in Übereinstimmung mit den Empfehlungen des Herstellers angewandt.
Der Klonierungsvektor pBluescript II (KS⁺) wurde von Stratagene erhalten. Der Smal-geschnittene pUC18-Klonierungsvektor wurde von Pharmacia erhalten.
BEISPIEL 4
Bakterienstämme
Die in den folgenden Beispielen verwendeten Bakterienstämme waren:
BEISPIEL 5
Pflanzenwachstumsbedingungen
Sofern nicht anders angegeben, wuchsen die Pflanzen in speziellen Wachstumsräumen bei einer Tageslänge von 14 Stunden mit einer Lichtintensität von mindestens 10'000 Lux und einer Temperatur von 22 °C bis 26 °C.
BEISPIEL 6
Isolierung eines Nelken-Anthocyanidinsynthase-DNA-Klons
a. Polymerasekettenreaktionsprimer
Ein Polymerasekettenreaktions(PCR)-Verfahren wurde eingesetzt, um ein die Nelken-Anthocyanidinsynthase (ANS) darstellendes DNA-Fragment zu isolieren. Degenerierte Oligonukleotide für konservierte Regionen von Sequenzen der 2-Oxoglutarat-abhängigen Dioxygenase aus Pflanzen wurden entworfen. Die Oligonukleotide wurden unter Verwendung von Phosphoramiditchemie auf einem Applied Biosystems PCR-Mate DNA-Synthesizer synthetisiert. Die synthetisierten Oligonukleotide waren:
5' AC(A,G)TC(A,G)GT(A,G)TGIGC(T,C)TCIACICC 3' SEQ ID NO:1
5' TGGGA(A,G)GA(T,C)TA(T,C)ITITT(T,C)CA 3' SEQ ID NO:2
b. Isolation eines ANS-Fragmentes aus Nelken-Blütenblättern
Gesamt-RNA wurde aus Blütenblättern von Nelken der Sorte Laguna in der Phase 1 (Stich et al. 1992a) unter Verwendung des Verfahrens von Turpen und Griffith (1986) extrahiert. Mit Oligo dT (12–18) geprimte cDNA wurde durch Superscript^TM (BRL) gemäß den Anweisungen des Herstellers aus 50 μg Gesamt-RNA synthetisiert. Die cDNA wurde durch Chromatographie auf S200 Zentrifugationssäulchen (Pharmacia), von Ethanolfällung gefolgt, gereinigt. Die PCR-Amplifikation wurde mit 50 ng cDNA in Gegenwart von 10 mM Tris-HCl (pH 8,3), 50 mM KCl, 2 mM MgCl₂, 0,01 % Gelatine, 0,2 mM dATP, 0,2 mM dCTP, 0,2 mM dGTP, 0,2 mM dTTP, 0,4 μM jedes Primers und 1,25 Einheiten Taq-Polymerase (Cetus) durchgeführt. Das Reaktionsgemisch (50 μl) durchlief einmal 3 Minuten lang 95 °C; 1 Minute lang 48 °C; 1 Minute lang 72 °C; und dann 39 Zyklen von jeweils 1 Minute bei 95 °C; 1 Minute bei 48 °C und 1 Minute bei 72 °C. Ein DNA-Fragment von 290 Basenpaar (bp) entstand.
c. Sequenzanalysen des Nelken-ANS-Fragmentes
Das 290-Basenpaar-Fragment wurde durch Elektrophorese mit Sea Plaque^TM-Agarose mit niedriger Gelierungstemperatur (FMC) in einen TAE-Laufpuffer (40 mM Tris, 50 mM Essigsäure, 50 mM EDTA) isoliert. Die DNA wurde aus der Agarose durch Erhitzen auf 65 °C, Phenolextraktion und Ethanolfällung extrahiert. Das Fragment wurde dann in einen Vektor mit ddT-Schwanz ligiert, hergestellt wie von Holton und Graham (1991) beschrieben. Die Sequenzierung der Plasmidklone erfolgte unter Verwendung von Prism^TM Ready Reaction Dye Primer-Chemie und eines DNA Sequence System 373A (Applied Biosystems). Beim Vergleich mit der Petunien-ANS-cDNA (Weiss et al., 1993) unter Verwendung von FASTA (Pearson und Lipman, 1988) zeigte die Nelkensequenz 83 % Homologie auf dem Aminosäurenniveau. Dieses 290-Basenpaar-cDNA-Fragment wurde zur Northern-Analyse einer Reihe von weißen Nelkensorten verwendet (wie in Beispiel 2b beschrieben).
BEISPIEL 7
Isolation eines Nelken-Dihydroflavonol-4-Reduktase (DFR)-cDNA-Klons
a. Konstruktion einer cDNA-Bibliothek
Gesamt-RNA wurde aus Blütenblättern von Nelken der Sorte Laguna in der Phase 9 extrahiert (Stich et al., 1992a). Polyadenylierte RNA wurde unter Verwendung des Oligotex-Reinigungssystems (Qiagen) gemäß den Anweisungen des Herstellers selektiert. Eine gerichtete cDNA-Bibliothek wurde unter Verwendung von 2 μg Poly(A)⁺-RNA als Template für die cDNA-Synthese und Superscript^TM (BRL) gemäß den Anweisungen des Herstellers konstruiert. DNA Polymerase I (Klenow-Fragment) wurde zur Synthese des zweiten Stranges der cDNA, die abgestumpft und mit EcoRI-Adaptern ligiert wurde, verwendet. Nach Verdau mit Xhol wurde die cDNA auf einer S200-Säule (Pharmacia) größenfraktioniert. Ein Drittel der cDNA wurde mit 1 μg Uni-Zap^TMXR Vektor (Stratagene) ligiert. Die Ligation wurde vier Tage lang bei 4 °C durchgeführt und dann unter Verwendung von Packagene^TM (Promega) verpackt. Die resultierende Bibliothek enthielt 1,5 × 10⁵ plaquebildende Einheiten („plaque forming units", p.f.u.) und wurde amplifiziert, indem man den Bakteriophagen von den Agarplatten in Phagenlagerungspuffer (100 mM NaCl, 10 mM MgCl₂, 10 mM Tris-HCl (pH 7,4), 0,05% (Gewicht/Volumen) Gelatine) eluierte.
b. Durchmusterung der cDNA-Bibliothek
Ungefähr 100.000 p.f.u. wurden (mit 10.000 pfu/Platte) auf NZY-Platten ausplattiert und 8 Stunden lang bei 37 °C, dann 1 Stunde lang bei 4 °C inkubiert. Danach wurden Kolonienabklatsche auf Colony/Plaque Screen^TM-Filter (DuPont) im Duplikat vorgenommen und wie vom Hersteller empfohlen behandelt. Vor der Hybridisierung wurden die Duplikatfilter 30 Minuten lang in einer Lösung aus 50 mM Tris-HCl pH 8,0, 1 M NaCl, 1 mM EDTA, 0,1 % (Gewicht/Volumen) Sarcosin (Vorwaschlösung) bei 42 °C vorgewaschen, gefolgt von ähnlichen Waschungen in 0,4 M NaOH und in Neutralisierungslösung (0,5 M Tris-HCl pH 8,0, 1,5 M NaCl). Nach Spülen in 2 × SSC wurden die Kolonienabklatsche prähybridisiert (42 °C, 1 Stunde) und in einer Lösung von 6 × SSC (0,6 M NaCl, 0,06 M Natriumzitrat), 0,5 % (Gewicht/Volumen) Natriumdodecylsulfat (SDS), 0,1 % Polyvinylpyrrolidon (PVP), 0,1 % (Gewicht/Volumen) Rinderserumalbumin (BSA), 0,1 % Ficoll, 0,01 M Ethylendiaminotetraessigsäure (EDTA) und 100 mg/ml denaturierter Heringssperma DNA hybridisiert (42 °C, über Nacht). Der ³²P-markierte Petunien-Dihydroflavonol 4-Reduktase(DFR)-cDNA-Klon mit voller Länge aus pCGP1403 (Beispiel 8) wurde zur Hybridisierung verwendet. Die Filter wurden bei 65 °C in 2 × SSC/1 % (Gewicht/Volumen) SDS gewaschen und 16 Stunden lang bei –70 °C mit einem Verstärkerschirm einem Kodak XAR-Film aufgelegt.
c. Sequenzanalyse des Nelken-DFR-cDNA-Klons
Die isolierten Klone wurden unter Verwendung von Prism^TM Ready Reaction Cye Primer-Chemie und eines DNA Sequencing System 373A (Applied Biosystems) sequenziert. Es wurde gefunden, dass ein Klon Homologie mit der Petunien-DFR besaß. Dieser Klon enthielt ein 1,2 Kilobasenpaar (kbp) langes cDNA-Insert und schien ein nur teilweiser DFR-Klon zu sein.
Die doppelsträngige DNA-Sequenz des gesamten cDNA-Inserts wurde unter Verwendung einer Shotgun-Klonierungs-Sequenzierungs-Strategie erhalten. Das DFR-cDNA-Fragment wurde gereinigt, mit sich selbst ligiert und durch Ultraschall geschert (vier Pulse von jeweils sieben Sekunden mit 20 Watt eines Branson-Sonicators mit angeschlossener Mikrosonde) Die Fragmentenden wurden unter Verwendung von T4-DNA-Polymerase repariert und im Größenbereich von 350 bis 600 Basenpaaren unter Verwendung von Agarosegelelektrophorese in TAE-Laufpuffer größenfraktioniert. Die Fragmente wurden unter Verwendung von Geneclean (Bio101) gereinigt und in den Smal-geschnittenen pUC18 ligiert, und individuelle Klone wurden sequenziert. Ein Vergleich der Nelkensequenz mit der Swissprot-Proteindatenbank unter Verwendung des FASTA-Programms (Pearson und Lipman, 1988) zeigte, dass 66,9% Identität auf dem Aminosäurenniveau mit der Petunien-DFR-cDNA und 65,7 % mit der Löwenmaulchen-DFR existierten. Dieser 1,2 Kilobasenpaar-DFR-Partialklon wurde zur Northern-Analyse einer Reihe weißer Nelkensorten verwendet (wie in Beispiel 1 b beschrieben).
BEISPIEL 8
Isolation genetischer Petunien-DFR-Sequenzen
a. Isolation eines funktionellen DFR-cDNA-Klons
Um eine Petunien-DFR-cDNA mit voller Länge zu erhalten, wurden 200.000 Klone einer Petunia hybrida cv. Old Glory Blue λZAP-cDNA-Bibliothek (Holton et al., 1993) unter Verwendung eines ³²P-markierten 1-Kilobasenpaar-Fragmentes eines zuvor beschriebenen Petunien-DFR-cDNA-Klons (Brugliera et al., 1994) durchmustert. Zwanzig Klone hybridisierten stark mit dieser Sonde. Diese Klone wurden gepickt, und die Plasmide wurden in vitro ausgeschnitten. Die DNA-Sequenzanalyse zeigte beim Vergleich mit publizierten Sequenzen (Beld et al., 1989; Huits et al., 1994), dass acht dieser Klone die gesamte proteincodierende Region von DFR enthielten.
Einer der acht Petunien DFR cDNA-Klone mit voller Länge, in Plasmid pCGP 1403 enthalten, wurde verwendet, um eine Nelken-cDNA-Bibliothek zu durchmustern, wie in Beispiel 7 beschrieben. Dieser Klon mit voller Länge wurde weiter in einen Pflanzenexpressions vektor umkloniert, um ihn auf seine Funktion zu testen, wie folgt. Ein 1,5 Kilobasenpaar langes AsP718/BamHI-Fragment von pCGP1403, das die DFR-cDNA enthielt, wurde mit einem Asp718/BamHI-Verdau des Vektors pCGP40 (International Patent Application No. PCT/AU92/00334 [WO 93/01290] ligiert. Das resultierende Plasmid (pCGP1406) enthielt die Petunien-DFR-cDNA zwischen dem MAC-Promoter (Comai et al., 1990) und dem Mannopinsyntha se(mas)-Terminator (Comai et al., 1990). Ein BglII-Verdau dieses Plasmids wurde zur Konstruktion von pCGP1470 verwendet, wie in Beispiel 9 beschrieben.
Es wurde gezeigt, dass der cDNA-Klon in Plasmid pCGP1406 funktional war, indem Petunia hybrida cv. Br140-Blütenblätter bombardiert wurden. Br140 besitzt infolge einer Mutation im an6-Genlokus keine DFR-Aktivität, so dass die Blüten weiß sind und keine Anthocyane bilden. Jedoch wurden nach Bombardierung der Blütenblätter mit pCGP1406 infolge von Anthocyansynthese farbige Zellen gebildet, was zeigte, dass das in diesem Plasmid vorliegende DFR-Genfragment funktional war.
b. Isolation eines funktionalen genomischen DFR-Klons
Eine genomische Bibliothek wurde aus Petunia hybrida cv. Old Glory Blue-DNA in dem Vektor λ2001 (Holton, 1992) hergestellt. Ungefähr 200.000 p.f.u. wurden auf NZY-Platten ausplattiert, Abklatsche wurden auf NEN-Filtern vorgenommen, und die Filter wurden mit 400.000 cpm/ml des ³²P-markierten 1-Kilobasenpaar-Petunien-DFR cDNA-Fragmentes hybridisiert (siehe 8a, oben). Die hybridisierenden Klone wurden aufgereinigt, aus jedem wurde die DNA isoliert und durch Verdauen mit Restriktionsenzymen kartiert. Ein 13 Kilobasenpaar langes SacI-Fragment aus einem dieser Klone wurde isoliert und mit SacI-geschnittenem pBluescriptII ligiert, um pCGP1472 herzustellen. Durch Bombardierung von Petunia hybrida cv. Br140-Blütenblättern wurde gezeigt, dass der genomische Klon im Plasmid pCGP1472 ebenfalls funktional war. Nach der Bombardierung der Blütenblätter mit pCGP1472 wurden infolge von Anthocyansynthese farbige Zellen gebildet. Eine feinere Kartierung zeigte, dass ein 5 Kilobasenpaar langes BglII-Fragment das gesamte DFR-Gen enthielt. Dieses 5-Kilobasenpaar-Fragment wurde zur Konstruktion von pCGP1473 verwendet, wie in Beispiel 10 beschrieben.
BEISPIEL 9
Konstruktion von pCGP1470
Das Plasmid pCGP485 (International Patent Application PCT/AU94/00265 [WO94/28140] wurde mit PstI verdaut, um ein 3,5 Kilobasenpaar langes genetisches Konstrukt freizusetzen, das aus einer Löwenmäulchen-CHS-Promotersequenz, einem Petunien-Hf1-cDNA-Fragment und einer Petunien-Phospholipidtransferproteinterminatorsequenz (International Patent Application PCT/AU92/00334 [WO93/01290]) bestand. Die überhängenden 3'-Enden des Fragments wurden mit T4-DNA-Polymerase gemäß Standardprotokollen (Sambrook et al., 1989) vor der Ligation in die Smal-Stelle des binären Vektors pWTT2132 (DNAP) entfernt. Der resultierende Klon wurde als pCGP1452 bezeichnet.
Ein 3,4 Kilobasenpaar großes genetisches Konstrukt, enthaltend den MAC-Promoter (Comai et al., 1990), eine Petunien-DFR-cDNA (Beispiel 15) und den Mannopinsynthese(mas)-Terminator (Comai et al., 1990), wurde als BglII-Fragment aus pCGP1406 isoliert (siehe Beispiel 8a). Der resultierende 5'-Überhang wurde unter Verwendung von DNA-Polymerase I (Klenow-Fragment) gemäß Standardprotokollen (Sambrook et al., 1989) „aufgefüllt". Das Fragment wurde dann zur Herstellung von pCGP1470 in den mit PstI geöffneten und mit T4 DNA-Polymerase behandelten pCGP1452 ligiert. Eine Karte von pCGP1470 ist in 3 dargestellt.
BEISPIEL 10
Konstruktion von pCGP1473
Ein 5 Kilobasenpaar langes BglII-Fragment eines genomischen Petunien-DFR-Klons, pCGP1472 (in Beispiel 8b beschrieben), wurde isoliert, und der resultierende 5'-Überhang wurde unter Verwendung von DNA-Polymerase I (Klenow-Fragment) "aufgefüllt". Das Fragment wurde in den mit PstI geöffneten, mit T4 DNA Polymerase behandelten pCGP1452 legiert, um pCGP1473 herzustellen. Eine Karte von pCGP1473 ist in 4 dargestellt.
BEISPIEL 11
Transformation von E. coli und A. tumefaciens
Die Escherichia coli-Stämme DH5α und XL1-Blue, für routinemäßige Manipulationen verwendet, wurden nach der Methode von Inoue et al. (1990) transformiert.
Die Plasmide pCGP1470 und pCGP1473 wurden in Agrobacterium tumefaciens Stamm AGL0 eingeführt, indem man 5 μg Plasmid DNA zu 100 μl kompetenter Agrobacterium tumefaciens-Zellen, hergestellt durch Beimpfung einer 50 ml MG/L-Kultur (Garfinkel und Nester, 1980) und Wachstum über 16 Stunden unter Schütteln bei 28 °C, zusetzte. Die Zellen wurden dann pelletiert und in 1 ml 20 mM CaCl₂ resuspendiert. Das DNA-Agrobacterium-Gemisch wurde eingefroren, indem man es 2 Minuten lang in flüssigem Stickstoff inkubierte, dann ließ man es durch 5-minütige Inkubation bei 37 °C auftauen. Die Zellen wurden dann mit 1 ml MG/1-Medium gemischt und 4 Stunden lang bei 28 °C unter Schütteln inkubiert. pCGP1470 oder pCGP1473 tragende A. tumefaciens-Zellen wurden auf MG/I-Agarplatten, die 50 μg/ml Tetracyclin enthielten, selektiert. Die Anwesenheit des Plasmids wurde durch Southern-Analyse von aus den tetracyclinresistenten Transformanten isolierter DNA bestätigt.
BEISPIEL 12
Transformation von Dianthus caryophyllus (Nelke), Sorte White Unesco, mit DFR und F3'5'H codierenden Nukleinsäuremolekülen
a. Pflanzenmaterial
Schnittmaterial von Nelken der Sorte White Unesco wurde von Van Wyk and Son Flower Supply, Victoria, Australien, erhalten. Die äußeren Blätter wurden entfernt, und das Schnittmaterial wurde kurz in 70 Vol.-% Ethanol gefolgt von 1,25 % (Gewicht/Volumen) Natriumhypochlorit (mit Tween 20) über 6 Minuten sterilisiert und dreimal mit sterilem Wasser gewaschen. Alle sichtbaren Blätter und Achselknospen wurden vor der Co-Kultivation unter dem Sektionsmikroskop entfernt.
b. Co-Kultivation von Agrobacterium und Nelkengewebe
Agrobacterium tumefaciens Stamm AGL0 (Lazo et al., 1991), den binären Vektor pCGP1470 oder pCGP1473 enthaltend, wurde bei 4 °C auf LB-Agarplatten mit 50 mg/l Tetracyclin gehalten. Eine einzelne Kolonie wurde über Nacht in Flüssig-LB-Bouillon, enthaltend 50 mg/l Tetracyclin, herangezogen und am nächsten Tag vor der Beimpfung auf 5 × 10⁸ Zellen/ml verdünnt. Nelkenstammgewebe wurde fünf Tage lang auf MS-Medium, ergänzt mit 3 % (Gewicht/Volumen) Saccharose, 0,5 mg/l Benzylaminopurin, 0,5 mg/l 2,4-Dichlorphenoxyessigsäure (2,4-D), 100 μM Acetosyringon und 0,25 % (Gewicht/Volumen) Gelrite (pH 5,7), mit Agrobacterium co-kultiviert.
c. Wiederherstellung transgener Nelkenpflanzen
Zur Selektion transformierten Stammgewebes wurden die obersten 6–8 mm jedes cokultivierten Stammes in 3–4 mm Stücke geschnitten, die dann in mit 0,3 % (Gewicht/Volumen) Saccharose, 0,5 mg/l BAP, 0,5 mg/l 2,4-D, 1 μg/l Chlorsulfuron, 500 mg/l Ticarcillin und 0,25 % (Gewicht/Volumen) Gelrite ergänztes MS-Medium (Murashige und Skoog, 1962) transferiert wurden. Nach zwei bis drei Wochen wurden die Explantate auf frisches MS-Medium, enthaltend 0,3 % Saccharose, 0,16 mg/l Thidiazuron (TDZ), 0,5 mg/l Indol-3-buttersäure (IBA), 2 μg/l Chlorsulfuron, 500 mg/l Ticarcillin und 0,25 % (Gewicht/Volumen) Gelrite, übertragen, und es wurde an diesem Punkt darauf geachtet, die Achselsprosse von den Stammexplantaten zu entfernen. Nach 3 Wochen wurden gesunde Adventivsprosse auf hormonfreies MS-Medium, enthaltend 3 % (Gewicht/Volumen) Saccharose, 3 μg/l Chlorsulfuron, 500 mg/l Ticarcillin und 0,25 % (Gewicht/Volumen) Gelrite, übertragen. Sprosse, die 3 μg/l Chlorsulfuron überlebten, wurden auf mit 3 % (Gewicht/Volumen) Saccharose, 500 mg/l Ticarcillin, 5 μg/l Chlorsulfuron und 0,25 % Gewicht/Volumen) Gelrite ergänztes MS-Medium zur Spross-Elongation übertragen.
Nach 2–3 Wochen wurden von den Sprossen, die die Selektion überlebt hatten, Blätter abgezogen, und sie wurden auf Regenerationsmedium platziert, bestehend aus MS-Medium ergänzt mit 0,22 mg/l TDZ, 0,5 mg/l IBA, 3 μg/l Chlorsulfuron, 500 mg/l Ticarcillin und 0,25 % (Gewicht/Volumen) Gelrite, um Sprossregeneration in Gegenwart der Selektion zu erreichen. Die regenerierten Sprosse wurden über einen Zeitraum von 2 – 4 Wochen auf hormonfreies MS-Medium, enthaltend 5 μg/l Chlorsulfuron, 500 mg/l Ticarcillin und 0,25 % (Gewicht/Volumen) Gelrite, übertragen, und dann zur Normalisierung auf hormonfreies MS-Medium, enthaltend 200 mg/l Ticarcillin und 0,4 % (Gewicht/Volumen) Gelrite in Glaskrügen. Suncaps (Sigma) wurden auf den Glaskrügen platziert, um die Normalisierung der Sprosse zu beschleunigen. Alle Kulturen wurden bei 23°C ± 2°C unter einer 16-stündigen Photoperiode (120 μE/m²/s kühles weißes Fluoreszenzlicht) gehalten. Normalisierte Sprosse mit einer Höhe von ungefähr 1,5 – 2,0 cm wurden auf 3 g/kg IBA-Wurzelbildungspulver eingewurzelt und unter Nebel akklimatisiert. Ein Bodengemisch, enthaltend 75 % Perlite und 25 % Torf, wurde zur Akklimatisierung verwendet, die bei 23 °C unter einer 14-stündigen Photoperiode (200 μE/m²/s Quecksilberhalogenlicht) durchgeführt wurde und typischerweise 3–4 Wochen andauerte. Die Pflanzen wurden mit einem Nelkengemisch gedüngt, enthaltend 1 g/l CaNO₃ und 0,75 g/l eines Mikroelementgemischs plus N : P : K 4,7 : 3,5 : 29,2.
BEISPIEL 13
Southern Analyse
a. Isolation genomischer DNA aus Nelken
DNA wurde unter Verwendung des Verfahrens von Lassner et al. (1989) aus 0,3–0,5 Gramm Blattgewebe isoliert.
b. Southern-Blots
Ungefähr 1 μg genomischer DNA wurde mit Xbal verdaut und durch ein 1 % (Gewicht/Volumen) Agarosegel in einem TAE-Laufpuffer elektrophoretisch aufgetrennt. Die DNA wurde dann 0,5 bis 1,0 Stunden lang in Denaturierungslösung (1,5 M NaCl/0,5 M NaOH) denaturiert, 0,5 bis 1,0 Stunden lang in 0,5 M Tris-HCl(pH 7,5)/1,5 M NaCl neutralisiert, und die DNA wurde dann auf einen Hybond-N (Amersham)-Filter in 20 × SSC transferiert.
Die Filter wurden mit ³²P-markierter DNA (10⁸ cpm/μg, 2 × 10⁶ cpm/ml) eines 730-Basenpaar EcoRV-Fragments eines Petunien Hf1-cDNA-Klons hybridisiert. Die Filter wurden 1 Stunde lang in 2 × SSC/1 % (Gewicht/Volumen) SDS bei 65 °C, dann 1 Stunde lang in 0,2 × SSC/1 % (Gewicht/Volumen) SDS bei 65 °C gewaschen.
Die Southern-Analyse mutmaßlich transgener Nelkenpfanzen, nach Selektion auf Chlorsulfuron enthalten, bestätigte die Integration des genetischen Konstrukts, das das F3'5'H codierende Nukleinsäuremolekül enthielt, in das Genom, wie in 5 gezeigt. Die Northern-Analyse von Blüten mit von pCGP1470 transformierten Nelkenpflanzen, wie in Beispiel 14 (unten) beschrieben durchgeführt, bestätigte, dass die eingeführten Moleküle, die F3'5'H und DFR definierten, beide exprimiert wurden (siehe 6).
BEISPIEL 14
Northern-Analyse
Gesamt-RNA wurde aus Gewebe isoliert, das in flüssigem Stickstoff eingefroren und unter Verwendung von Mörser und Pistill zu einem feinen Pulver zermahlen worden war. Ein Extraktionspuffer aus 4 M Guanidinisothiocyanat, 50 mM Tris-HCl (pH 8,0), 20 mM EDTA und 0,1 % (Volumen/Volumen) Sarkosyl wurde dem Gewebe zugesetzt, und das Gemisch wurde unter Verwendung eines Polytron mit Höchstgeschwindigkeit 1 Minute lang homogenisiert. Nach Filtration der Suspension durch Miracloth wurde sie in einem JA20-Rotor 10 Minuten lang bei 10.000 rpm zentrifugiert. Der Überstand wurde in ein frisches Gefäß übertragen, und pro ml Überstand wurden jeweils 0,2 Gramm CsCl zugesetzt. Das CsCl wurde durch Mischen aufgelöst, und die Proben wurden einem 10 ml-Kissen aus 5,7 M CsCl und 50 mM EDTA (pH 7,0) in 38,5 ml Quick-seal-Zentrifugenröhrchen (Beckman) überschichtet und 12–16 Stunden lang bei 23 °C in einem Ti-70-Rotor bei 42,000 rpm zentrifugiert. Die Pellets wurden in TE/SDS (10 mM Tris-HCl (pH 7,5), 1 mM EDTA, 0,1 % (Gewicht/Volumen) SDS) resuspendiert und mit Phenol-Chloroform (1 : 1), mit 10 mM EDTA (pH 7,5) gesättigt, extrahiert. Nach der Ethanolfällung wurden die RNA-Pellets in TE/SDS resuspendiert.
Die RNA-Proben wurden durch 2,2 M Formaldehyd/1,2 % (Gewicht/Volumen) Agarose-Gele unter Verwendung eines 40 mM Morpholino-Propansulfonsäure (pH 7,0), 5 mM Natriumacetat, 0,1 mM EDTA (pH 8,0) enthaltenden Laufpuffers elektrophoretisch aufgetrennt. Die RNA wurde auf Hybond-N Filter (Amersham), wie vom Hersteller beschrieben, transferiert und mit dem passenden ³²P-markierten cDNA-Fragment (10⁸ cpm/μg, 2 × 10⁸ cpm/ml) sondiert. Die Prähybridisierung (1 Stunde bei 42 °C) und Hybridisierung (16 Stunden bei 42 °C) wurden in 50 Vol.-% Formamid, 1 M NaCl, 1 % (Gewicht/Volumen) SDS, 10 % (Gewicht/Volumen) Dextransulfat durchgeführt. Für den Hybridisierungsschritt wurde abgebaute Heringssperma-DNA (100 μg/ml) zusammen mit der ³²P-markierten Probe zugesetzt.
Die Filter wurden 1 Stunde lang bei 65 °C in 2 × SSC/1 % (Gewicht/Volumen) SDS gewaschen, dann 1 Stunde lang in 0,2 × SSC /1 % (Gewicht/Volumen) bei 65 °C. Alle Filter wurden 48 Stunden lang bei –70°C mit einem Verstärkerschirm einem Kodak XAR-Film aufgelegt.
BEISPIEL 15
Veränderter Blütenphänotyp
Die Expression der eingeführten Nukleinsäuremoleküle, die F3'5'H und DFR repräsentieren, in die in DFR und F3'H mutierte Nelkensorte White Unesco hatte eine ausgeprägte Wirkung auf die Blütenfarbe. Die Blüten der nicht transgenen Pflanzen sind weiß, wohingegen die transgenen Pflanzen Blüten hervorbrachten, die von einer lilavioletten Farbe waren. Die beobachteten Farbänderungen können auch durch die Zahlen aus der Farbtafel der Royal Horticultural Society ausgedrückt werden. Allgemein können die Veränderungen dahingehend beschrieben werden, dass sie die Farbe von Weiß zu den blauen, violetten und purpurnen Farbtönen verschieben, die durch viele, aber nicht alle der Farbfelder zwischen 80 und 98 repräsentiert werden.
Ohne Beschränkung der möglichen Farbänderungen, die erreicht werden können, können einige der an Blüten von transformierten White Unesco-Pflanzen beobachteten Farben ungefähr beschrieben werden als von Weiß (untransformiert) zu 84B/C (transformiert) umgewandelt. Weiterhin kann die Verwendung eines stärkeren Promoters zur Steuerung der Expression der eingeführten Nukleinsäuremoleküle die Bildung noch größerer Mengen an Delphinidinpigment erlauben und dadurch die Entwicklung stärker blauer Farbtöne verursachen. Es sollte nicht vergessen werden, dass auch andere biochemische und physiologische Zustände wie der pH-Wert in den Blütenblättern, das Ausmaß der Co-Pigmentierung und der Acylierungsgrad der Anthocyane das Ergebnis im Einzelfall beeinflussen. Diese Zustände können durch Transformation anderer geeigneter Sorten oder durch Co-Transformationen mit Nukleinsäuremolekülen, die den pH-Wert, die Co-Pigmentierung oder die Acylierung beeinflussen, manipuliert werden. Dies kann die Entwicklung stärker blauer Farbtöne ermöglichen. Die Erwähnung erreichter spezifischer Farbtöne sollte nicht als Definition oder Begrenzung des möglichen Spektrums verstanden werden.
BEISPIEL 16
Flavonoidanalysen
a. TLC-Analyse von Flavonolen
Ungefähr 0,5 Gramm an frischem Nelken-Blütenblattgewebe wurden zu 1 ml 2 M HCl in einem 1,5 ml-Mikrozentrifugenröhrchen (Eppendorf) zugesetzt und 30 Minuten lang in einem kochenden Wasserbad erhitzt. Der Zellschutt wurde durch 5-minütige Zentrifugation bei 14,000 rpm pelletiert, und 500 μl des Überstandes wurden in ein frisches Mikrozentrifugenröhrchen übertragen. Die Flavonoide wurden mit 200 μl Ethylacetat extrahiert und zur Phasentrennung kurz zentrifugiert. Die obere Phase (Ethylacetat) wurde in ein neues Mikrozentrifugenröhrchen übertragen, unter Vakuum in einen SpeedVac-Konzentrator (Savant) eingetrocknet und in 15 μl Ethylacetat resuspendiert, und ein Aliquot von 2 μl wurde auf eine Zellulose-TLC-Platte (20 cm × 20 cm, Merck) aufgetropft und ungefähr 3–4 Stunden lang in Forestal-Lösung (30 Teile Essigsäure : 3 Teile HCl : 10 Teile Wasser) chromatographiert. Man ließ die chromatographische Platte dann an der Luft trocknen, und die Flavonole wurden unter ultraviolettem Licht sichtbar gemacht.
b. TLC-Analyse von Anthocyanidinen
Zwei Nelkenblütenblätter wurden zu 1 ml 2 M HCl in einem 1,5 ml Mikrozentrifugenröhrchen (Eppendorf) zugesetzt und in einem kochenden Wasserbad 30 Minuten lang erhitzt. Der Zellschutt wurde durch 5-minütige Zentrifugation bei 14,000 rpm pelletiert, und 500 μl des Überstandes wurden in ein sauberes Mikrozentrifugenröhrchen übertragen. Die Anthocyanidine wurden mit 200 μl Isoamylalkohol (IAA) extrahiert und zur Phasentrennung kurz zentrifugiert. Die obere Phase (IAA) wurde in ein neues Röhrchen übertragen, unter Vakuum eingetrocknet und in 20 μl IAA resuspendiert, und ein 1-μl-Aliquot wurde auf eine Zellulose-TLC-Platte (20 cm × 20 cm, Merck) aufgetropft und ungefähr 3–4 Stunden lang in Forestal-Lösung chromatographiert. Man ließ die TLC-Platte an der Luft trocknen, und die Anthocyanidine konnten unter normalem Licht betrachtet werden.
c. HPLC-Analyse von Anthocyanidinen
Die Anthocyane wurden extrahiert und hydrolysiert, indem man ungefähr 0,5 g an Nelkenblütenblättern 30 Minuten lang mit 1 ml 2 M HCl bei 100°C inkubierte. Die Anthocyanidine wur den mit 200 μl IAA extrahiert. Ein Viertel dieses Gemisches wurde unter Vakuum eingetrocknet und in 200 μl 50% Acetonitril und 0,5 % TFA (Trifluoressigsäure) resuspendiert. Ein 5 μl-Aliquot wurde durch HPLC mittels Gradientenelution unter Verwendung von Gradientenbedingungen von 50 % B auf 60 % B im Verlauf von 10 Minuten, dann 10 Minuten lang 60 % B und schließlich im Verlauf von 5 Minuten 60 % B auf 100 % B analysiert, wobei das Laufmittel A aus TFA Wasser (5 : 995) und das Laufmittel B aus Acetonitril : TFA : Wasser (500 : 5 : 495) bestand. Eine Asahi Pac ODP-50 Kartuschensäule (250 mm × 4,6 mm Innendurchmesser) wurde für die Reversphasen-Chromatographietrennungen verwendet. Die Durchflussrate war 1 ml/Minute, und die Temperatur war 40 °C. Die Detektion der Anthocyanidine wurde unter Verwendung eines dreidimensionalen Shimadzu SPD-M6A Detektors bei 400–650 nm durchgeführt.
BEISPIEL 17
Bombardierung von Blütenblättern mit DNA-beschichteten Mikroprojektilen
Eine Partikelbombardierung unter Verwendung von 1 μm-Goldpartikeln wurde im Wesentlichen wie von Sanford et al. (1993) beschrieben durchgeführt. Die heliumbetriebene Biolistic Bio-Rad PDS-100-Kanone mit 1100 psi Platzscheiben wurde für alle Bombardierungen verwendet. Blütenblätter wurden von sich öffnenden Nelkenblütenknospen abgetrennt und vor der Bombardierung auf eine Platte MS-Medium (+ 0,25 Gelrite) aufgelegt. Jede Platte wurde zwei Mal mit unabhängig voneinander hergestellten Chargen DNA-beschichteter Goldpartikel bombardiert. Die für die Bombardierung verwendete Plasmid-DNA wurde unter Verwendung entweder eines CsCl-Gradientenverfahrens (Sambrook et. al., 1989) oder einer Qiagensäule (Qiagen) aufgereinigt. Pro Schuss wurde ein Mikrogramm DNA verwendet.
BEISPIEL 18
³²P-Markierung von DNA-Sonden
DNA-Fragmente (50 bis 100 ng) wurden unter Verwendung eines Oligolabelling Kit (Bresatec) mit 50 μCi [α ³²P]-dCTP radioaktiv markiert. Nicht eingebautes [α ³²P]-dCTP wurde durch Chromatographie über eine Sephadex G-50 (Fine)-Säule, wie von Sambrook et al. (1989) beschrieben, entfernt.
Der Fachmann erkennt, dass die hier beschriebene Erfindung anderen Variationen und Modifikationen als den hier spezifisch beschriebenen offen steht. Die Erfindung ist als alle solche Variationen und Modifikationen einschließend zu betrachten. Die Erfindung umfasst auch alle Schritte, Merkmale, Zusammensetzungen und Verbindungen, die in dieser Beschreibung bezeichnet werden oder auf die Bezug genommen wird, einzeln oder gesamt, sowie jede und alle Kombinationen von zwei oder mehr der besagten Schritte oder Merkmale.
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SEQUENZPROTOKOLL

Claims

Verfahren zur Erzeugung einer Pflanze, die eine veränderte Blütenfarbe aufweist, wobei man eine Pflanze auswählt, von der die erste Pflanze abstammt, wobei die ausgewählte Pflanze nicht in der Lage ist, ein auf DHK wirkendes DFR zu synthetisieren, oder DFR-Mengen produziert, die im Vergleich zu einer Wildtyp-Pflanze geringer sind, oder ein DFR mit einer Substratspezifität produziert, die für DHK vergleichsweise geringer ist als für DHQ oder DHM; und wobei man in die ausgewählte Pflanze ein oder mehrere genetische Konstrukte einbringt, die Nukleotidsequenzen beinhalten, die ein F3'5'H und ein DFR kodieren, das in der Lage ist, auf DHM zu wirken, nicht aber in der Lage ist, auf DHK zu wirken, oder eine Substratspezifität aufweist, die für DHM größer ist als für DHK oder DHQ.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei die Pflanze eine Nelke, Rose, Gerbera oder Chrysantheme ist.
Verfahren nach Anspruch 2, wobei die Pflanze eine Nelke ist.
Verfahren nach Anspruch 1, 2 oder 3, wobei die ausgewählte Pflanze ebenfalls nicht in der Lage ist, ein F3'H zu synthetisieren.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 4, wobei die in die ausgewählte Pflanze eingebrachte, ein DFR kodierende Nukleotidsequenz von einer Petunie abstammt.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 5, wobei die ein F3'5'H kodierende Nukleotidsequenz die einer Petunie, Aubergine, Bauchblume, eines Enzians, Stiefmütterchens, einer chinesischen Aster, Anemone, Traube, Iris, Hyazinthe, eines Rittersporns oder einer Glockenblume ist.
Verfahren nach Anspruch 6, wobei die F3'5'H kodierende Nukleotidsequenz die einer Petunie ist.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 7, wobei die veränderte Blütenfarbe lilafarbig, violett, Purpur oder blau oder ein Ton davon ist.
Eine veränderte Blütenfarbe aufweisende, transgene Pflanze wie in einem der Ansprüche 1 bis 3 und 8 definiert, wobei die Pflanze nicht in der Lage ist, ein auf DHK wirkendes DFR zu synthetisieren, oder DFR-Mengen produziert, die im Vergleich zu einer Wildtyp-Pflanze geringer sind, oder ein DFR mit einer Substratspezifität produziert, die für DHK vergleichsweise geringer ist als für DHQ oder DHM; und die ein Nukleinsäuremolekül trägt, das eine Nukleotidsequenz beinhaltet, die ein F3'5'H und ein DFR kodiert, das in der Lage ist, auf DHM zu wirken, jedoch nicht in der Lage ist, auf DHK zu wirken, oder eine Substratspezifität aufweist, die für DHM größer ist als für DHK oder DHQ.
Transgene Pflanze nach Anspruch 9, wobei die Pflanze ebenfalls nicht in der Lage ist, ein F3'5'H zu synthetisieren.
Transgene Pflanze nach Anspruch 9 oder 10, wobei das das DFR kodierende Nukleinsäuremolekül von einer Petunie abstammt.
Transgene Pflanze nach einem der Ansprüche 9 bis 11, wobei das das F3'5'H kodierende Nukleinsäuremolekül das einer Petunie, Aubergine, Bauchblume, eines Enzians, Stiefmütterchens, einer chinesischen Aster, Anemone, Traube, Iris, Hyazinthe, eines Rittersporns oder einer Glockenblume ist.
Transgene Pflanze nach Anspruch 12, wobei das das F3'5'H kodierende Nukleinsäuremolekül von einer Petunie abstammt.
Blüte, die von einer wie in einem der Ansprüche 9 bis 13 definierten transgenen Pflanze oder einem Teil dieser Pflanze abgetrennt ist.