ES2265644T3 - Plantas transgenicas que presentan color de flor alterado y metodos para producirlas. - Google Patents

Abstract

LA PRESENTE INVENCION TRATA EN GENERAL DE NUEVOS ENFOQUES PARA LA GENERACION DE PLANTAS TRANSGENICAS QUE PRESENTAN UN COLOR DE LA FLOR ALTERADO MEDIANTE LA INTRODUCCION DE UNA DIHIDROFLAVONOL - 4 - REDUCTASA (DFR) QUE PREFERIBLEMENTE ACTUA SOBRE LA DIHIDROMIRICETINA (DHM). DE FORMA MAS CONCRETA, LA PRESENTE INVENCION DESCRIBE PLANTAS DE CLAVELES TRANSGENICAS Y FLORES CORTADAS DE ESTAS QUE MUESTRAN UNA COLORACION DE LA FLOR QUE NO SE ASOCIA DE FORMA NATURAL CON LAS PLANTAS DE CLAVELES. LA PRESENTE INVENCION ADEMAS CONTEMPLA PROCEDIMIENTOS PARA PRODUCIR PLANTAS DE CLAVELES TRANSGENICAS CON EL COLOR DE LA FLOR ALTERADO.

Description

Plantas transgénicas que presentan color de flor alterado y métodos para producirlas.

El presente invento se refiere generalmente a aproximaciones nuevas para generar plantas transgénicas que exhiben un color de flor alterado. Más particularmente, el presente invento proporciona plantas de claveles transgénicos y flores cortadas de los mismos que exhiben una coloración de las flores no asociadas de modo natural con plantas de clavel. El presente invento contempla además métodos para producir plantas de claveles transgénicos con el color de las flores alterado.

Los detalles bibliográficos de las publicaciones a las que se hace referencia en esta especificación son recogidos al final de la descripción. Los números de identidad de secuencia (SEQ ID NOs.) para las secuencias nucleotídicas a las que se hace referencia en la especificación están definidas después de la bibliografía.

A lo largo de esta especificación, a menos que el contexto lo requiera de otra manera, la palabra "comprender", o las variaciones tales como "comprende" o "que comprende", se entenderá que implican la inclusión de un elemento afirmado o un número entero entero o un grupo de elementos o números enteros pero sin excluir ningún otro elemento o número entero o grupo de elementos o números enteros.

La sofisticación rápidamente creciente de la tecnología de ADN recombinante facilita enormemente un amplio espectro de procesos industriales desde la industria hortícola hasta la industria médica y asociada a la salud. Las industrias hortícolas y agrícolas relacionadas se benefician particularmente de los avances en la tecnología de ADN recombinante.

La industria de floricultura en particular se esfuerza en desarrollar nuevas y diferentes variedades de plantas florales, con características mejoradas que van desde la resistencia a enfermedades y patógenos hasta el color de la flor alterado. Aunque las técnicas de reproducción clásicas han sido usadas con algún éxito, esta aproximación ha sido limitada por las limitaciones de un grupo génico de especies particulares. Es raro por ejemplo, para una única especie tener un espectro completo de variedades de colores. Consecuentemente, el esfuerzo sustancial ha sido dirigido hacia el uso de la tecnología de ADN recombinante para generar plantas transgénicas que exhiben las características deseadas.

El desarrollo de las variedades de las especies de flores de corte principales tales como plantas de claveles, por ejemplo, que tienen flores que exhiben un intervalo de colores que cubren el lila, violeta, púrpura y azul o diversos tonalidades de los mismos, ofrecerían una oportunidad significativa tanto en mercados de flores de corte como ornamentales.

El color de las flores se debe predominantemente a dos tipos de pigmentos: los flavonoides y los carotenoides. Los flavonoides contribuyen a un intervalo de colores desde el amarillo al rojo y al azul. Los carotenoides imparten un matiz anaranjado o amarillo y son comúnmente el único pigmento en flores amarillas o naranjas. Las moléculas flavonoides que hacen la principal contribución al color de las flores son las antocianinas que son derivados glicosilados de cianidina, delfinidina, petunidina, peonidina, malvidina y pelargonidina, y están localizadas en la vacuola. Las diferentes antocianinas pueden producir marcadas diferencias en el color. El color de la flor está también influenciado por la copigmentación con flavonoides sin color, acomplejamiento de metales, glicosilación, acilación, metilación y pH vacuolar (Forkmann, 1991).

La ruta biosintética para los pigmentos flavonoides (de aquí en adelante referidas como la "ruta flavonoide") está bien establecida (Ebel y Hahlbrock, 1988; Hahlbrock y Grisebach, 1979; Wiering y de Vlaming, 1984; Schram y otros, 1984; Stafford, 1990). La primera etapa involucrada en la ruta implica la condensación de tres moléculas de malonil-CoA con una molécula de p-cumaroil-CoA. Esta reacción es catalizada por la enzima chalcona sintasa (CHS). El producto de esta reacción, 2',4,4',6'-tetrahidroxichalcona, es normalmente isomerizada rápidamente para producir naringenina mediante la enzima chalcona-flavonona isomerasa (CHI). Naringenina es subsiguientemente hidroxilada en la posición 3 del anillo central por la flavonona 3-hidroxilasa (F3H) para producir dihidrocanferol
(DHK).

El anillo B de dihidrocanferol (DHK) puede ser hidroxilado tanto en la posición 3', como en ambas posiciones 3' y 5', para producir dihidroquercetina (DHQ) y dihidromiricetina (DHM), respectivamente (véase la Figura 1). DHQ es un intermediario requerido para la producción de antocianinas basadas en cianidin-66332.624 y DHM es un intermediario requerido para la producción de antocianinas basadas en delfinidina en la ruta flavonoide. Dos enzimas claves implicadas en esta ruta son la flavonoide 3'-hidrolasa (F3'H) y la flavonoide 3',5'-hidroxilasa (F3'5'H). La F3'H actúa sobre DHK para producir DHQ. La F3'5'H es una enzima de amplio espectro que cataliza la hidroxilación de DHK en las posiciones 3' y 5' y de DHQ en la posición 5' (Stotz y Forkmann, 1982), en ambos casos produciendo DHM. El patrón de hidroxilación del anillo B de antocianinas juega un papel clave en determinar el color de los pétalos.

Otra enzima clave es el dihidroflavonol-4-reductasa (DFR) que tiene una especificidad de sustrato variable dependiendo de su fuente vegeal y tiene el potencial para actuar sobre una cualquiera de entre DHK, DHQ y DHM.

Muchas de las principales especies de flores de corte carecen de F3'5'H y por consiguiente no pueden mostrar el intervalo de colores, resultantes de la síntesis de delfinidinas y derivados de las mismas, que serían de otro modo posibles. Este es particularmente el caso para los claveles que constituyen una proporción principal del mercado mundial de flores de corte. Hay una necesidad, por lo tanto, de modificar las plantas de claveles para generar plantas transgénicas que son capaces de producir F3'5'H, proporcionando de ese modo un medio para convertir DHK y DHQ a DHM, influyendo de ese modo en el patrón de hidroxiliación de las antocianinas y permitiendo la producción de antocianinas derivadas a partir de delfinina. El color de la flor es modificado como resultado y una especie única es capaz de expresar un espectro más amplio de colores de flores. El documento de Patente WO94/28140 describe la introducción de F3'5'H en vegetales, que carecen de F3'5'H, para aumentar la producción de delfinina relativa a plantas no transgénicas. Sin embargo, los niveles de enzima DFR no fueron modificados.

En el trabajo que condujo al presente invento, los inventores buscaron manipular genéticamente la ruta flavonoide en plantas de claveles para generar un intervalo de plantas con la capacidad para dirigir el metabolismo de DHK hacia la delfinidina en preferencia a o mejor que pelargonidina o cianidina. Las plantas resultantes exhiben una coloración de la flor alterada relativa a las plantas de claveles disponibles en la actualidad. Las nuevas plantas de claveles transgénicas y más particularmente las flores cortadas de las mismas satisfacen una necesidad largamente necesitada en la industria hortícola y más particularmente florícola en relación a los claveles. La tecnología del presente invento es también aplicable a un intervalo de otras plantas de flor tales como rosas y crisantemos.

Consiguientemente, un aspecto del presente invento contempla un método para producir una planta que exhibe un color de flor alterado, comprendiendo dicho método la selección de una planta a partir de la que dicha primera planta es derivada en la que dicha planta seleccionada es incapaz de sintetizar un DFR que actúa sobre DHK, o produce niveles reducidos de DFR comparados con una planta de tipo silvestre o produce un DFR con una especificidad de sustrato reducida para DHK comparada con DHQ o DHM; y la introducción en dicha planta seleccionada de uno o más construcciones genéticas que comprenden las secuencias nucleotídicas que codifican una F3'5'H y una DFR que es capaz de actuar sobre DHM pero es incapaz de actuar sobre DHK o tiene una mayor especificidad de sustrato para DHM que para DHK o DHQ.

Más particularmente, el presente invento proporciona un método para producir una planta de clavel que exhibe un color de flor alterado, comprendiendo dicho método la selección de una planta de clavel a partir de la que dicha primera planta de clavel es derivada en la que dicha planta seleccionada es incapaz de sintetizar una DFR que actúa sobre DHK, o produce niveles reducidos de DFR comparados con una planta de tipo silvestre, o produce una DFR con una especificidad de sustrato reducida para DHK comparada con DHQ o DHM en flores; y la introducción en dicha planta seleccionada de una o más construcciones genéticas que comprenden secuencias nucleotídicas que codifican una F3'5'H y una DFR que es capaz de actuar sobre DHM pero es incapaz de actuar sobre DHK o tiene una especificidad de sustrato mayor para DHM que para DHK o DHQ.

El presente invento está ejemplificado aquí usando plantas de claveles. Esto es hecho, sin embargo, con la idea de que el invento instantáneo se extiende a un intervalo de plantas de flor tales como pero no limitado a rosas y crisantemos. La referencia de aquí en adelante a los claveles debería ser tomada como referencia a otras plantas de flor adecuadas.

El método para producir la planta de clavel que exhibe un color de flor alterado, puede ser llevado a cabo mediante las etapas de:

(i)

seleccionar una planta a partir de la que dicha planta de clavel ha de ser derivada en la que dicha planta seleccionada es incapaz de sintetizar una DFR que actúa sobre DHK, o produce niveles reducidos de DFR comparados con una planta silvestre, o produce un DFR con una especificad de sustrato reducida para DHK comparada con DHQ o DHM en flores;

(ii)

transformar células de dicha planta seleccionada con una o más construcciones genéticas que comprenden secuencias nucleotídicas que codifican separadamente F3'5'H y DFR siempre que DFR sea capaz de actuar sobre DHM pero es incapaz de actuar sobre DHK o tenga una especificidad de substrato mayor para DHM que para DHK o DHQ;

(iii)

regenerar una planta transgénica a partir de dichas células transformadas de tal modo que dicha planta regenerada sea capaz de expresar dicha F3'5'H y dicha DFR de la etapa (ii); y

(iv)

crecer dicha planta en condiciones que permitan la expresión de dicha F3'5'H y dicha DFR de la etapa (ii) en flores.

Se hace aquí referencia al color de flores alterado que incluye la alteración en el color de cualquiera o todos los componentes de la flor incluyendo el pétalo, sépalo y estámen. Convenientemente, el color de flor alterado es mostrado comparando el color de flor de una planta transgénica hecha de acuerdo con el presente invento con una planta de la misma especie pero que posee un DFR que puede actuar sobre DHK. En términos prácticos, una comparación puede ser hecha entre la planta transgénica y la planta "seleccionada", es decir, la planta a partir de la cual la planta transgénica es derivada.

El presente invento se basa en parte en la manipulación genética de la ruta de antocianina en plantas de clavel para dirigir el metabolismo de DHK preferencialmente hacia DHM y delfinidina y derivados de las mismas más que a través de leucopelargonidina y derivados de pelargonidina o DHQ y leucocianidina y derivados de cianidina. Las flores de la planta de clavel carecen de F3'5'H y, por ello, DHK es incapaz de continuar el metabolismo hasta la ruta de delfinidina que es requerida para producir colores de flores en el intervalo que abarca el lila, violeta, púrpura y azul o diversas tonalidades de los mismos. Para lograr una redirección preferencial de los productos metabólicos DHK bajo la ruta de delfinidina, los inventores cribaron y localizaron líneas blancas de claveles que carecen de DFR funcional. La expresión de una molécula de ácidos nucleicos introducida tiene como resultado una F3'5'H que es capaz de dirigir el metabolismo DHK a DHM. La introducción y expresión de una molécula de ácidos nucleicos que codifica un DFR indígena que es capaz de actuar sobre DHM pero no DHK, resulta entonces en que el metabolismo de DFR es dirigido a leucodelfinidina permitiendo de ese modo la conversión subsiguiente hacia otros derivados de delfinidina. Poco o nada del metabolismo tiene lugar vía la ruta de pelargonidina o cianidina.

En una realización particularmente preferida, las flores de la planta iniciadora también carecen de F3'H.

Según una realización preferida, el presente invento contempla un método para producir una planta de clavel que exhibe propiedades de color de la flor alteradas, comprendiendo dicho método la selección de una planta de clavel a partir de la cual dicha planta de clavel primeramente mencionada ha de ser derivada, en la que dicha planta seleccionada es incapaz de sintetizar tanto un F3'H como un DFR que puede actuar sobre DHK, o produce niveles reducidos de DFR comparados con una planta de tipo silvestre, o predice un DFR con una especificidad de sustrato reducida para DHK comparada con DHQ o DHM en flores; e introduciendo en dicha planta seleccionada una o más construcciones genéticas que comprenden secuencias nucleotídicas que codifican una F3'5'H y una DFR que es capaz de actuar sobre DHM pero es incapaz de actuar sobre DHK o tiene una especificidad de sustrato superior para DHM que para DHK o DHQ.

El método para producir la planta de clavel que exhibe el color de flor alterado, puede ser llevado a cabo mediante las etapas de:

(i)

seleccionar una planta de clavel a partir de la que dicha planta de clavel primeramente mencionada ha de ser derivada, en la que dicha planta seleccionada es incapaz de sintetizar bien F3'H o DFR, que puede actuar sobre DHK, o produce niveles reducidos de DFR comparados con una planta de tipo silvestre, o preduce un DFR con una especificidad de sustrato reducida para DHK comparada con DHQ o DHM en flores;

(ii)

transformar células de dicha planta seleccionada con una o más construcciones genéticas que comprenden secuencias nucleotídicas que codifican separadamente F3'5'H y DFR siempre que dicha DFR sea capaz de actuar sobre DHM pero es incapaz de actuar sobre DHK o tiene una especificidad de sustrato superior para DHM que para DHK o DHQ;

(iii)

regenerar una planta transgénica a partir de dichas células transformadas de modo que dicha planta regenerada sea capaz de expresar dicha F3'5'H y dicha DFR o etapa (ii); y

(iv)

crecer dicha planta en condiciones que permitan la expresión de dicha F3'5'H y dicha DFR de la etapa (i) en flores.

El presente invento es ejemplificado aquí usando DFR de petunia como una enzima capaz de actuar sobre DHM pero no sobre DHK. Esto es hecho, sin embargo, con el entendimiento de que el presente invento se extiende a una enzima DFR a partir de cualquier planta siempre que sea capaz de actuar sobre DHM pero no sobre DHK. Igualmente, una F3'5'H particularmente útil es a partir de petunia pero otras fuentes de F3'5'H incluyen berenjena, lisianthus, genciana, pensamientos, áster de china, anémona, uva, iris, jacinto, delfinum y campanilla.

Se hace referencia aquí a la capacidad de una planta de producir o no producir una enzima tal como DFR, F3'H y F3'5'H se relaciona a su capacidad en flores y no necesariamente en otro lugar en la planta.

Una realización particularmente preferida del presente invento se refiere a un método para producir una planta de clavel que exhibe el color de flor alterado y tales métodos pueden ser realizados seleccionando una planta de clavel a partir de la que dicha primera planta de clavel ha de ser derivada en la que dicha planta seleccionada es incapaz de sintetizar bien F3'H o una DFR, que puede actuar sobre DHK, o produce niveles reducidos de DFR comparados con una planta silvestre, o predice un DFR con una especificidad de sustrato reducida para DHK comparado con DHQ o DHM en flores, introduciendo en células de dicha planta seleccionada una o más construcciones genéticas que comprenden secuencias nucleotídicas que codifican separadamente una F3'5'H y una DFR de petunia, regenerando una planta de dichas células, y creciendo después dicha planta en condiciones suficientes para permitir la expresión de dicha F3'5'H y dicha DFR de petunia tal que dicha planta produce flores de diferentes colores relativos a dicha planta seleccionada. Preferiblemente, el F3'5'H es de origen de petunia.

La planta seleccionada a partir de la que se deriva la planta transgénica sujeto que exhibe el color de flor alterado puede ser un mutante natural para DFR de tal modo que no produce sustancialmente DFR o produce niveles reducidos de esta enzima, o produce la enzima con especificidades de sustrato alteradas tales como una incapacidad sustancial para metabolizar la DHK. Preferiblemente, sin embargo, la planta seleccionada es un mutante doble para DFR y F3'H. Los mutantes de estos tipos tendrían generalmente flores blancas. Las mutaciones pueden ser sustituciones nucleotídicas únicas o múltiples, deleciones y/o adiciones a las secuencias nucleotídicas que definen las enzimas. Alternativamente, las mutaciones pueden ser inducidas o dirigidas mediante, por ejemplo, marcaje de transposón, mutagénesis oligonucleotídica dirigida, mutagénesis dirigida por Agrobacterium o mutagénesis dirigida por virus.

Alternativamente, las construcciones genéticas pueden ser introducidas para reducir la expresión de DFR y/o F3'H mediante, por ejemplo, métodos antisentido o de cosupresión. En este aspecto del invento, una planta puede ser elegida con una incapacidad sustancial para sintetizar una de entre DFR o F3'H y una secuencia genética introducida para reducir la expresión de la otra de dichas DFR o F3'H. Alternativamente, una planta puede ser seleccionada con una incapacidad sustancial para sintetizar una de DFR o F3'H y una mutación inducida en la otra de dichas DFR o F3'H, por cualquiera de los medios anteriormente mencionados. En cualquier caso, la planta resultante sería una planta "seleccionada" y un recipiente para una F3'5'H y una DFR capaz de actuar sobre DHM pero no sobre DHK. Una planta "seleccionada" puede también ser considerada una planta "parental" puesto que es de esta planta que una planta transgénica que exhibe el color de flor alterado es derivada según los métodos del presente invento.

El color de flor alterado contemplado mediante el presente invento incluye la capacidad de los claveles para producir un intervalo de colores incluyendo flores lila, violeta, púrpura y azules o diversas tonalidades de los mismos, por ejemplo, de malva oscuro a azul oscuro hasta un color violeta o sus diversas tonalidades o combinaciones de las mismos.

Otro aspecto del presente invento contempla una planta transgénica que exhibe el color de flor alterado, siendo dicha planta incapaz de sintetizar una DFR que actúe sobre DHK, o que produzca niveles reducidos de DFR comparados con una planta tipo silvestre, o que produzca una DFR con una especificidad de sustrato reducida para DHK comparada con DHQ o DHM; y que lleva una molécula de ácidos nucleicos que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica una F3'5'H y una DFR que es capaz de actuar sobre DHM pero es incapaz de actuar sobre DHK o tiene una especificidad de sustrato mayor por DHM que por DHK o DHQ.

Preferiblemente, la planta es un clavel, rosa, gerbera o crisantemo. De acuerdo con este aspecto del presente invento, la molécula de ácidos nucleicos puede comprender múltiples construcciones genéticas separadamente que codifican DFR y F3'5'H o una construcción genética combinada única que codifica ambas enzimas pero estando la expresión generalmente dirigida por dos promotores separados. El término "molécula de ácidos nucleicos" abarca moléculas de ácidos nucleicos únicas o múltiples.

Preferiblemente, la planta de clavel es también sustancialmente incapaz de sintetizar F3'H.

El presente invento se extiende a las flores y en particular a flores cortadas a partir de tales claveles transgénicos o de plantas producidas según los métodos aquí descritos.

Una DFR "no indígena" es una enzima que no es producida normalmente en plantas de clavel y, en una realización preferida, es de petunia. Una DFR "no indígena" puede haberse originado alternativamente a partir de una planta de clavel pero ha sufrido una mutación para restringir su especificidad de sustrato a DHM. El F3'5'H es también no indígena y en un aspecto es preferiblemente de petunia.

Las flores de clavel del invento que exhiben color de flor alterado, pueden ser obtenidas haciendo crecer una planta de clavel en flor transgénica durante un tiempo y en condiciones para que las flores se formen y después que cultiven opcionalmente dichas flores, habiendo sido dicha planta de clavel transgénica manipulada genéticamente como se describe aquí anteriormente de modo que:

(i)

es incapaz de expresar una DFR que es capaz de actuar sobre DHK, o producir niveles reducidos de DFR comparado con una planta silvestre, o producir una DFR con una especificidad de sustrato reducida para DHK comparada con DHQ o con DHM;

(ii)

es capaz de expresar una F3'5'H no indígena; y

(iii)

es capaz de expresar una DFR no indígena que es capaz de actuar sobre DHM pero es incapaz de actuar sobre DHK o tiene una mayor especificidad de sustrato para DHM que para DHK o DHQ.

Las flores que exhiben un color de flor alterado tendrán ahora la capacidad para metabolizar DHK a DHM y delfinidina y derivados de la misma de la ruta flavonoide.

Preferiblemente, la planta transgénica es también sustancialmente incapaz de expresar una F3'H.

En métodos del presente invento, las secuencias genéticas que codifican por separado un F3'5'H, un DFR que es capaz de actuar sobre DHM pero es incapaz de actuar sobre DHK o que tiene una especificidad de sustrato mayor para DHM que para DHK o DHQ y opcionalmente también una F3'H, puede ser usado en la manipulación genética de una planta de clavel incapaz de expresar o sintetizar una DFR activa capaz de actuar sobre DHK o DHM, o que produce niveles reducidos de DFR comparados con una planta silvestre, o que produce una DFR con una especificidad de sustrato para DHK comparado con DHQ o DHM; a modo de permitir la fabricación de una planta de clavel que exhiba el color de flor alterado comparado con una planta de clavel que es capaz de sintetizar una DFR capaz de actuar sobre DHK. En un aspecto relacionado, el presente invento se extiende a las flores y en particular a las flores cortadas de dichas plantas de clavel.

El presente invento es descrito adicionalmente mediante referencia a las siguientes Figuras y/o Ejemplos.

En las Figuras:

La Figura 1 es un diagrama esquemático de las rutas de conversión de dihidroflavonoles a flavonoles y antocianinas. Las abreviaciones: DHK = dihidrocanferol, DHQ = dihidroquercetina, DHM = dihidromiricetina, K = canferol, Q = quercitina, M = miricetina, F3'H = flavonoide 3'-hidroxilasa, F3'5'H = flavonoide 3',5'-hidroxilasa, FLS = flavonol sintasa, DFR = dihidroflavonol-4-reductasa, ANS = antocianidina sintasa, 3GT = flavonoide 3-glucosiltransferasa.

La Figura 2 es una representación autorradiográfica de un análisis Northern que compara los niveles de expresión de mARN de DFR y ANS en trece cultivos de clavel blanco disponibles comercialmente. Las flechas apuntan a los transcritos relevantes.

La Figura 3 es una representación diagramática del vector de expresión binario pCFP1470, construcción que está descrita en el Ejemplo 9. Resistencia a Tc = resistencia al gen de tetraciclina; LB = borde izquierdo; RB = borde derecho; surB = la región codificante y las secuencias terminadoras para el gen de acetolactato sintasa de tabaco; 35S = la región promotora del gen 35S del virus del mosaico de coliflor; CHS = la región promotora del gen de la chalcona sintasa de boca de dragón; Hf1 = la secuencia de ADN que codifica flavonoide 3',5'-hidroxilasa de petunia; D8 = secuencia terminadora de una fosfolípido transferasa de petunia; MAC = el promotor de manopina sintasa potenciado con las secuencias de gen 35S del virus del mosaico de coliflor; DFR = la secuencia de ADN que codifica dihidroflavonol-4-reductasa; mas = la secuencia terminadora del gen de manopina sintasa de Agrobacterium Tumefaciens. Los sitios de enzimas de restricción seleccionados están indicados.

La Figura 4 es una representación diagramática del vector de expresión binario pCGP1473, construcción que está descrita en el Ejemplo 10. Resistencia a Tc = resistencia al gen de tetraciclina; LB = borde izquierdo; RB = borde derecho; surB = la región codificante y las secuencias terminadoras para el gen de acetolactato sintasa de tabaco; 35S = la región promotora del gen 35S del virus del mosaico de coliflor; CHS = la región promotora del gen de la chalcona sintasa de boca de dragón; Hf1 = la secuencia de ADN que codifica flavonoide 3',5'-hidroxilasa de petunia; D8 = secuencia terminadora de una fosfolípido transferasa de petunia; DFR genómico = la secuencia de ADN genómica que codifica dihidroflavonol-4-reductasa; Los sitios de enzimas de restricción seleccionados están indicados.

La Figura 5 es una representación autorradiográfica de una hibridación Southern de ADN aislado a partir de tejido de hoja de White UNESCO, que ha sido transformada con una contrucción genética (pCGP1470) que contiene el gen de acetolactato sintasa de tabaco como un marcador seleccionable, y la molécula de ácidos nucleicos que codifica F3'5'H y DFR. El ADN genómico de clavel fue digerido con una endonucleasa de restricción XbaI y la transferencia Southern fue hibridada con un fragmento de 730 pares de bases marcados con ^{32}P de la región codificante de F3'5'H de petunia. Los filtros fueron lavados en 0,2X SSC/1% p/v de SDS a 65°C. Los carriles 1-12 representan muestras de ADN aisladas de plantas transgénicas independientes mientras que el carril 13 es de White Unesco no transformada (testigo negativo). No se detectó ninguna banda en el testigo negativo no transformado. El carril 14 representa 33 pg del ADN plasmídico pCGP1470 digerido con XbaI.

La Figura 6 es una representación autorradiográfica de una transferencia Northern de F3'5'H y ARN de DFR en pétalos. El ARN total (10 \mug/carril) fue analizado de pétalos de plantas White UNESCO transformadas con pCGP1470 (carriles 1-7), y pétalos de flores White UNESCO no transgénicas (carril 8). No se detectaron bandas en el testigo negativo no transformado en el carril 8. El carril 9 representa 10 \mug de ARN aislado de Petunia hybrida dv. Old Glory Blue. A: Transferencia Nothern fue hibridada con ADN marcado con ^{32}P de un fragmento de 730 pb de EcoRV de un clon de cADN de F3'5'H de petunia clonado y lavado en 2 x SSC/1% p/v SDS a 65ºC durante 0,5 horas. B: La tranferencia Northern fue hibridada con un fragmento de ADN SacI/SbaI de 1,2 kb marcado con ^{32}P de un cADN de DFR de petunia a partir del plásmido pCGP 1403 (véase el Ejemplo 8a).

La Figura 7 es una representación en blanco y negro de una placa fotográfica en color que representa una flor White Unesco no transgénica testigo (la de color blanco en la izquierda) y una flor de una plantra de White Unesco transformada con pCGP1470. La planta transformada produce una flor que es de color lila/violeta.

Las placas a color originales están disponibles para su inspección por el solicitante.

Ejemplo 1 Estrategia para alterar el color de la flor usando cultivos de DFR mutante

Las flores de alguna plantas tales como, por ejemplo, rosa, clavel y gerbera, producen dos tipos de antocianidinas, dependiendo de su genotipo-pelargonidina y cianidina. En ausencia de actividad F3’H, se produce pelargonidina; en su presencia, se produce cianidina. La pelargonidina está normalmente acompañada por canferol, un flavonol incoloro. Los pigmentos de cianidina están normalmente acompañados bien por quercetina o bien por ambos canferol y quercetina. Ambos pelargonidina y canferol se derivan de DHK; ambas cianidina y quercetina se derivan de DHQ (Figura 1). Un número de enzimas, incluyendo DFR, ANS y 3GT se requieren para la conversión de dihidroflavonoles (DHK, DHQ y DHM) a las antocianinas coloreadas. Un tercer tipo de antocianidina, la delfinidina, no puede ser producida en flores de estas plantas, debido a la ausencia natural de actividad F3'5'H.

En claveles, la enzima DFR es capaz de metabolizar dos dihidroflavonoles, DHK y DHQ, a leucoantocianidinas que se convierten finalmente a pigmentos de antocianidina que son responsables para el color de la flor. DHK es convertida a leucopelargonidina que da lugar a los claveles de color rojo y DHQ a leucocianidina que producen claveles de color púrpura (Geissman y Mehlquies, 1947; Stich y otros, 1992b) (véase Figura 1). La DFR de clavel es también capaz de convertir DHM a leucodelfinidina (Forkmann y otros, 1987). Sin embargo, la líneas de clavel presente de manera natural no contienen una enzima flavonoide 3',5'-hidroxilasa y por lo tanto no sintetizan DHM.

La enzima DFR de petunia tiene una especificidad diferente a la de DFR de clavel. Es capaz de convertir DHQ a través de leucocianidina, pero no es capaz de convertir DHK a leucopelargonidina (Forkmann y otros, 1987). En las líneas de petunia que contiene la enzima F3'5'H, la enzima DFR de petunia puede convertir laa DHM producida por la acción de F3'5'H a leucodelfinidina, que es modificada adicionalmente dando lugar a delfinidina- el pigmento responsable para las flores de color azul (véase la Figura 1). Aún cuando la DFR de petunia es capaz de convertir ambas DHQ y DHM, es capaz de convertir DHM aún más eficientemente, favoreciendo la producción de delfinidina (Forkmann y otros, 1987).

El clavel es transformable con una molécula de ácidos nucleicos que codifica la F3'5'H de petunia de otra especie, permitiendo de ese modo la producción de DHM y finalmente la acumulación de delfinidina (Solicitud de Patente Internacional Nº. PCT/AU94/00265; [documento de Patente WO94/28140]). Sin embargo, la eficacia de la producción de delfinidina en muchas de estas plantas es baja debido a la competición de DFR de clavel con la enzima F3'5'H por DHK o DHQ como sustrato. La acumulación de cantidades significativas de delfinidina puede, por tanto, estar limitada por la acción de la DFR de clavel.

Los inventores han demostrado que la eficacia de la producción de delfinidina es notablemente aumentada mediante la transformación de un mutante DFR de cultivo con una construcción genética apropiada. En tal línea no hay una acumulación de antocianina, debido a la ausencia de actividad de la enzima DFR. Sin embargo, cuando una molécula de ácidos nucleicos que codifica una enzima DFR de petunia es usada para transformar esta línea, junto con una molécula de ácidos nucleicos que codifica flavonoide 3',5'-hidroxilasa y ambas enzimas son expresadas, DHK es entonces convertida a leucodelfinidina por las enzimas introducidas y finalmente a pigmentos de delfinidina por las enzimas endógenas de la planta. Si la línea mutante en DFR es también mutante en F3'H, hay poca o nula producción de DHQ y por lo tanto las únicas antocianinas producidas por las plantas transgénicas son derivadas de delfinidina. En presencia de F3'H, los pigmentos de cianidina pueden ser también producidos, pero la delfinidina es la principal antocianina ya que la DFR de petunia es más eficaz utilizando DHM que DHQ como sustrato. Las flores de las plantas de clavel manipuladas genéticamente en esta manera producen un intervalo de color de flor que cubre el lila, violeta, púrpura y azul o diversas tonalidades de los mismos. Una ejemplificación de la aplicación de esta estrategia de acuerdo con el presente invento en la producción de claveles con color de flor alterado es proporcionada mediante los siguientes Ejemplos.

Ejemplo 2 Cribado de cultivos de Dianthus caryophyllus (claveles) a. Análisis de flavonol de plantas de clavel

Para identificar cultivos de clavel que tienen genotipos adecuados para la aplicación de la estrategia del Ejemplo 1, se obtuvieron cultivos de flores blancas. Los flavonoles fueron extraídos a partir de cada uno y analizados mediante cromatografía en capa fina (TLC), como se describe en el ejemplo 16A. El único flanovol detectado en todos estos cultivos fue el canferol, indicando que la actividad F3’H estaba ausente, o sustancialmente reducida, en las flores de todos los cultivos.

b. Análisis Northern de cultivos de plantas blancas

Los análisis Northern fueron entonces realizados, como se describe en el Ejemplo 14. Después de que el ARN fue transferido del gel a un filtro Hybond-N (Amersham), el filtro fue hibridado con el fragmento de cADN BamHI/HindIII de 290 pb de ANS (descritos en el Ejemplo 6) marcados con ^{32}P. El clon DFR parcial de Asp718/BamHI de 1,2 kpb (descrito en el Ejemplo 7) fue también marcado con ^{32}P y usado para hibridar filtros duplicados. La prehibridación (1 hora a 42ºC) y la hibridación (16 horas a 42ºC) fueron llevados a cabo como se describe en el Ejemplo 14. Los filtros fueron lavados en 2x SSC, 1% p/v SDS a 65ºC durante 1 a 2 horas y después en 0,2 x SSC, 1% p/v SDS a 65ºC durante 0,5 hasta 1 hora. Los Northerns fueron autorradiografiados durante toda la noche a -70ºC.

Este análisis indicó que dos de los cultivos de planta ensayados no tuvieron mensajero DFR, mientras que aún producían niveles significativos de mARN de ANS (véase la Figura 2). Estas dos plantas de cultivos de claveles, White Unesco y White Diana, pareció entonces que eran del genotipo correcto para la aplicación de esta estrategia.

c. Experimentos de suministro de leucoantocianidina

Para confirmar que White Diana y White Unesco no estaban mutados en ninguno de los genes necesarios para la conversión de leucoantocianidina a antocianina, experimentos de suministro del precursor fueron llevados a cabo. Los segmentos de los pétalos de White Unesco y White Diana fueron colocados en disoluciones de 1 mg/ml de leucopelargonidina y leucocianidina e incubados durante 16 horas a temperatura ambiente. La síntesis de antocianina tuvo lugar cerca de los extremos del corte de los pétalos en cada caso.

El suministro de leucopelargonidina condujo a la síntesis de pelargonidina, y leucocianidina condujo a la síntesis de cianidina. La identidad de antocianidina fue determinada mediante análisis de TLC (véase el Ejemplo 16b). Cualquiera de estos dos cultivos por lo tanto se mostró que eran candidatos adecuados para manipulación genética utilizando la estrategia del mutante DFR. Una ejemplificación adicional es proporcionada con cv. White Unesco.

Ejemplo 3 Reactivos biológicos

Todas las enzimas de restricción y otros reactivos fueron obtenidos a partir de fuentes comerciales y usados generalmente según las recomendaciones del fabricante

El vector de clonación pBluescript II (KS+) fue obtenido de Stratagene. El vector de clonación pUC18 cortado con SmaI fue obtenido de Pharmacia.

Ejemplo 4 Cepas bacterianas

Las cepas bacterianas usadas en los siguientes ejemplos fueron:

Escherichia coli:

Xl1-Blue

supE44, hsdR17(r_{k}-,m_{k}+), recA1, endA1, gyrA96 (Nal^{r}), thi-1, relA1, lac-, [F'proAB, lacI, lacZ\DeltaM15, Tn10 (tet^{r})(Bullock y otros, 1987).

DH5\alpha

supE44, \Delta(lacZYA-ArgF), U169, \diameter80lacZ\DeltaM, hsdR17(r_{k}-,m_{k} +), recA1, endA1, gyrA96(Nal^{r}), thi-1, relA1, deoR (Hanahan, 1983; BRL, 1986).

\vskip1.000000\baselineskip

Agrobacterium tumefaciens:

AGL0 Lazo y otros (1991)

Ejemplo 5 Condiciones de crecimiento vegetal

A menos que se diga de otro modo, las plantas fueron hechas crecer en cámaras de crecimiento especializadas con un período de 14 horas al día de intensidad de luz de 10.000 lux mínimo y una temperatura de 22ºC hasta 26ºC.

Ejemplo 6 Aislamiento de un clon de cADN de antocianidina sintasa de clavel a. Cebadores de reaccion en cadena de polimerasa

Un método de reacción en cadena de polimerasa (PCR) fue empleado para aislar un fragmento de ADN que representa una antocianidina sintasa de clavel (ANS). Los oligonucleótidos degenerados fueron diseñados para regiones conservadas de secuencias de dioxigenasa dependientes de 2-oxoglutarato a partir de plantas. Los oligonucleótidos fueron sintetizados sobre un sintetizador de ADN PCR-Mate de Applied Biosystems usando la química de la fosforamidina. Los oligonucleótidos sintetizados fueron:

\newpage

5' AC(A,G)TC(A,G)GT(A,G)TGIGC(T,C)TCIACICC 3'	SEQ ID NO:1
5' TGGGA(A,G)GA(T,C)TA(T,C)ITITT(T,C)CA 3'	SEQ ID NO:2

b. Aislamiento de un fragmento de ANS de pétalos de clavel

El ARN total fue extraído de pétalos de clavel cv. Laguna flowers en el estadío 1 (Stich y otros, 1992) usando el método de Turpen y Griffith (1986). El cADN hibridado con Oligo dT (12-18 fue sintetizado desde 50 \mug de ARN total por Superscritp (BRL) según las instrucciones del fabricante. El cADN fue purificado por cromatografía en columna centrifugada S200 (Pharmacia) seguida por precipitación en etanol. La amplificación por PCR fue llevada a cabo en 50 ng de cADN en presencia de Tris-HCl 10 mM (pH 8,3), KCl 50 mM, MgCl_{2} 2 mM, gelatina 0,01%, dATP 0,2 mM, dCTP 0,2 mM, dGTP 0,2 mM, dTTP 0,2 mM, 0,4 \muM de cada cebador y 1,25 unidades de Taq polimerasa (Cetus). La mezcla de reacción (50 \muL) fue puesta en ciclo una vez a cada una de las temperaturas 95ºC durante 3 min; 48ºC durante 1 min; 72ºC durante 1 min; y después 39 veces a cada temperatura de 95ºC durante 1 min; 48ºC durante 1 min; 72ºC durante 1 min. Un fragmento de ADN de 290 pares de bases (pb) fue producido.

c. Análisis de secuencias de fragmento de ANS de clavel

El fragmento de 290 pb fue aislado por electroforesis en agarosa Sea Plaque TM (FMC) de temperatura de gelidificación baja en un tampón de corrida TAE (Tris 40 mM, ácido acético 50 mM, EDTA 50 mM). El ADN fue extraído de la agarosa calentándola a 65ºC, haciendo una extracción en fenol y una precipitación con etanol. El fragmento fue entonces ligado en un vector con cola ddT preparada como se describe por Holton y Graham (1991). La secuencia de los clones plasmídicos fue realizada usando la química de cebador de la reaccion de tinción Prism TM Ready Reaction Dye Primer y un sistema de secuenciación DNA Sequencing System 373A (Applied Biosystems). Cuando se comparó con el cADN de ANS de petunia (Weiss y otros, 1993) usando FASTA (Pearson y Lipman, 1988) la secuencia de clavel mostró una homología del 83% a nivel de aminoácidos. Este fragmento de cADN de 290 pb fue usado en análisis Northern de un intervalo de cultivos de claveles blancos (como se describe en el Ejemplo 2b).

Ejemplo 7 Aislamiento de un clon de cADN de dihidroflavonol-4-reductasa (DFR) de clavel a. Construcción de una librería de cADN

El ARN total fue extraido de clavel cv. Laguna petals en el estadío 9 (Stich y otros, 1992a). El ARN poliadenilado fue seleccionado usando el sistema de purificación Oligotex (Qiagen) según las instrucciones del fabricante. Una librería de cADN direccional fue construida usando 2 \mug de ARN poli(A)+, como un molde para la síntesis de cADN, y SuperscriptTM (BRL) según las instrucciones del fabricante. La ADN polimerasa I (fragmento Klenow) fue usada para sintetizar una segunda hebra de cADN que fue hecha roma y ligada a los adaptadores EcoRI. Tras la digestión con XhoI, el cADN fue fraccionado por tamaño en una columna S200 (Pharmacia). Un tercio del cADN fue ligado con 1 \mug de vector Uni-Zap^{TM}XR (Stratagene). La ligación fue llevada a cabo a 4ºC durante 4 días y después empaquetada usando Packagene TM (Promega). La librería resultante contuvo 1,5 x 10^{5} unidades formadoras de placas (p.f.u.) y fue amplificada eluyendo el bacteriófago a partir de las placas de agar en tampón de almacenamiento de fagos (NaCl 100 mM, MgCl_{2} 10 mM, Tris-HCl 10 mM (pH 7,4), 0,05% p/v gelatina).

b. Cribado de la librería de cADN

Aproximadamente 100.000 p.f.u. fueron puestas en placas (a 10.000 pfu/placa) en placas NZY e incubadas a 37ºC durante 8 horas y después a 4ºC durante 1 hora. A continuación, capas de colonias duplicadas fueron tomadas y puestas sobre filtros Colony/Plaque Screen^{TM} (DuPont) y tratadas como está recomendado por el fabricante. Previo a la hibridación, los filtros duplicados fueron prelavados en una disolución de Tris-HCl 50 mM pH 8,0 NaCl 1M, EDTA 1 mM, 0,1% p/v sarcosina (disolución de prelavado) a 42ºC durante 30 minutos seguido por lavados similares en NaOH 0,4 M y en disoluciones neutralizantes (Tris-HCl 0,5 M pH 8,0, NaCl 1,5 M). Tras lavar en 2 x SSC, las capas de colonias fueron prehibridadas (42ºC, 1 hora) e hibridadas (42ºC, durante toda la noche) en una disolución de 6 x SSC (NaCl 0,6 M, citrato sódico 0,06 M), dodecilsulfato sódico (SDS) 0,5% p/v, polivinilpirrolidona (PVP) 0,1%, albúmina de suero bovina (BSA) 0,1%, ficoll 0,1% p/v, ácido etilendiaminotetraacético (EDTA) 0,01 M, y 100 mg/ml de ADN de esperma de arenque desnaturalizado. El clon de cADN de dihidroflavonol 4-reductasa (DFR) de longitud completa de petunia de pCGP1403 marcado con ^{32}P (Ejemplo 8) fue usado para hibridación. Los filtros fueron lavados a 65ºC en 2 x SSC /1% p/v de SDS y expuestos a películas Kodak XAR con una pantalla intensificadora a -70ºC durante 16 horas.

c. Análisis de secuencia del clon de cADN de DFR de clavel

Los clones aislados fueron secuenciados usando la reacción química de Prism TM Ready Reaction Dye Primer y un sistema de secuenciación DNA Sequencing system 373A (Applied Biosystems). Se encontró que un clon tenía homología con la DFR de petunia. Este clon contenía un inserto de cADN de 1,2 kilopares de bases (kpb) y pareció que era sólo un clon DFR parcial.

La secuencia del ADN de hebra doble del inserto de cADN entero fue obtenida usando una estrategia de secuenciación de clon por disparo de pistola. El fragmento de cADN de DFR fue purificado, autoligado y roto mediante ultrasonidos (cuatro descargas de siete segundos a 20 vatios de un sonicador Branson con una microsonda unida). Los extremos del fragmento fueron reparados usando ADN polimerasa T4 y fraccionados por tamaño en el intervalo de 350 a 600 pb usando electroforesis en gel de agarosa en tampón de corrida TAE. Los fragmentos fueron purificados usando Geneclean (Bio101), ligados en pUC18 cortado con SmaI y clones individuales fueron secuenciados. La comparación de la secuencia de claveles con la base de datos de proteínas Swissprot usando el programa FASTA (Pearson y Lipman, 1988) mostraron que había un 66,9% de identidad y el nivel de aminoácidos con el cADN de DFR de petunia y un 65,7% con la DFR de boca de dragón. Este clon DFR parcial de 1,2 kpb fue usado en análisis Northern de un intervalo de cultivos de claveles blancos (como se describe en el Ejemplo 2b).

Ejemplo 8 Aislamiento de secuencias genéticas de DFR de petunia a. Aislamiento de un clon de cADN de DFR de petunia

Para aislar el cADN de DFR de longitud completa de petunia, 200.000 clones de una librería de cADN de petunia hybrida cv. Old Glory Blue \lambdaZAP (Holton y otros, 1993) fueron cribados usando un fragmento de 1 kb de un clon de cADN de DFR de petunia marcado con ^{32}P descrito previamente (Brugliera y otros, 1994). Veinte clones hibridaron fuertemente con esta sonda. Estos clones fueron recogidos y los plásmidos fueron cortados in vitro. Los análisis de secuencia de ADN revelaron que otro de eso clones contenían la región codificante de la proteína entera de DFR, cuando se compararon con secuencias publicadas (Beld y otros, 1989; Huits y otros, 1994).

Uno de los clones de cADN de DFR de longitud completa de petunia, contuvieron un plásmido pCGP1403, fue usado para cribar una librería de cADN de claveles, como se describe en el Ejemplo 7. Este clon de longitud completa fue subclonado adicionalmente en un vector de expresión vegetal para ensayar la función, como sigue. Un fragmento Asp718/BamHI de 1,5 kb de pCGP1403, que contenía el cADN de DFR, fue ligado con un digerido de Asp718/BamHI del vector pCGP40 (Solicitud de Patente Internacional Nº PCT/AU92/00334 [documento de Patente WO 93/01290]. El plásmido resultante (CGP1406) contenía el cADN de DFR de petunia entre el promotor MAC (Comai y otros, 1990) y el terminador de la manopina sintasa (mas) (Comai y otros, 1990). Un digerido BglII de este plásmido fue usado en la construcción de pCGP1470, como se describe en el Ejemplo 9.

El clón de cADN en el plásmido pCGP1406 se mostró que era funcional mediante el bombardeo de pétalos de Petunia hybrida cv. Br140. El Br140 carece de actividad DFR debido a una mutación en el locus genético an6, así las flores son blancas y no producen antocianinas. Sin embargo, después del bombardeo de pétalos con pCGP1406, se produjeron células coloreadas debido a la síntesis de antocianina, indicando que el fragmento del gen DFR presente en este plásmido era funcional.

b. Aislamiento de un clon genómico de DFR funcional

Una librería genómica fue hecha a partir de ADN de Petunia hybrida cv. Old Glory Blue en el vector \lambda2001 (Holton, 1992). Aproximadamente 200.000 p.f.u. fueron puestas en placas sobre placas NZY, se colocaron capas sobre filtros NEN y los filtros fueron hibridados con 400.000 cpm/ml del fragmento de cADN de DFR de petunia de 1 kb marcado con ^{32}P (véase 8a, anterior). Clones hibridantes fueron purificados, el ADN fue aislado a partir de cada uno y mapeados mediante digestión con enzimas de restricción. Un fragemento SacI de 13 kb de uno de estos clones fue aislado y ligado con pBluescriptII cortado con SacI para crear pCGP1472. El clón genómico en el plásmido pCGP1472 también se mostró que era funcional mediante bombardeo de pétalos de Petunia hybrida cv. Br140. Tras el bombardeo de los pétalos con pCGP1472, se produjeron las células coloreadas, debido a la síntesis de antocianinas. Un mapeo más fino indicó que un fragmento de 5 kb de BglII contenía el gen DFR entero. Este fragmento de 5 kb fue usado en la construcción de pCGP1473, como se describe en el Ejemplo 10.

Ejemplo 9 Construcción de pCGP1470

El plásmido pCGP485 (Solicitud de Patente Internacional PCT/AU94/00265 [documento de Patente WO94/28140]) fue digerido con PstI para liberar una construcción genética de 3,5 kb que consistía en la secuencia promotora CHS de boca de dragon, un fragmento de cADN de Hf1 de petunia y una secuencia terminadora de proteína de transferencia de fosfolípidos de petunia (Solicitud de Patente Internacional PCT/AU92/00334 [documento de Patente WO 93/01290]). Los extremos 3' protuberantes del fragmento fueron eliminados con ADN polimerasa T4 según los protocolos estándar (Sambrook y otros, 1989) antes de la ligación en el sitio SmaI del vector binario pWTT2132 (DNAP).El clon resultante fue designado pCGP1452.

Una construcción genética de 3,4 kb que contiene el promotor MAC (Comai y otros, 1990), un cADN de DFR de petunia (Ejemplo 15) y el terminador de la manopina sintasa (mas) (Comai y otros, 1990), fue aislado de pCGP1406 como un fragmento BglII (véase el Ejemplo 8a). El extremo 5' protuberante resultante fue "rellenado" usando la ADN polimerasa I (fragmento Klenow) según protocolos estándar (Sambrook y otros, 1989). El fragmento fue entonces ligado en el pCGP1452 tratado con ADN polimerasa T4 restringido para PstI para crear pCGP1470. Un mapa de pCGP1470 es presentado en la Figura 3.

Ejemplo 10 Construcción de pCGP1473

Un fragmento de BglII de 5kb de un clon genómico de DFR de petunia, pCGP1472 (descrito en el Ejemplo 8b), fue aislado y el extremo 5' protuberante resultante fue "rellenado" usando ADN polimerasa I (fragmento Klenow). El fragmento fue entonces ligado en, el pCGP1452 tratado con ADN polimerasa T4 restringido para PstI para crear pCGP1473. Un mapa de pCGP1473 es presentado en la Figura 4.

Ejemplo 11 Transformación de E. coli y A. tumefaciens

Cepas de Escherichia coli DH5\alpha y XL1-Blue, usadas para manipulaciones rutinarias, fueron transformadas usando el método de Inoue y otros (1990).

Los plásmidos pCGP1470 y pCGP1473 fueron introducidos en la cepa AGL0 de Agrobacterium tumefaciens añadiendo 5 \mug de ADN plasmídico a 100 \mul de células de Agrobacterium tumefaciens competentes preparadas inoculando un cultivo de 50 ml de MG/L (Garfinkel y Nester, 1980) y haciéndolas crecer durante 16 horas con agitación a 28ºC. Las células fueron entonces precipitadas y resuspendidas en 1 ml de CaCl_{2} 20 mM. La mezcla de ADN-Agrobacterium fue congelada mediante incubación en nitrógeno líquido durante 2 min y después dejada descongelar mediante incubación a 37ºC durante 5 min. Las células fueron entonces mezcladas con 1 ml de medio MG/L e incubadas con agitación durante 4 horas a 28ºC. Las células de A. tumefaciens que llevan pCGP1470 o pCGP1473 fueron seleccionadas sobre placas de agar MG/L que contenína 50 \mug/ml de tetraciclina. La presencia del plásmido fue confirmada mediante análisis Southern de ADN aislado a partir de transformantes resistentes a tetraciclina.

Ejemplo 12 Transformación de Dianthus caryophyllus (clavel) cv. White Unesco con moléculas de ácidos nucleicos que codifican DFR y F3'5'H a. Material Vegetal

Cortes de clavel cv. White Unesco fueron obtenidos de Van Wyk and Son Flower Supply, Victoria, Australia. Las hojas externas fueron eliminadas y los cortes fueron brevemente esterilizados en etanol 70% v/v seguido por hipoclorito sódico 1,25% p/v (con Tween 20) durante 6 min y lavados tres veces con agua estéril. Todas las hojas visibles y brotes auxiliares fueron eliminados bajo el microscopio antes del cocultivo.

b. Co-cultivo de Agrobacterium y tejido de clavel

La cepa AGL0 de Agrobacterium tumefaciens (Lazo y otros, 1991), que contenía el vector binario pCGP1470 o pCGP1473, fue mantenida a 4ºC en placas de agar LB con tetraciclina 50 mg/L. Una colonia única fue hecha crecer durante toda la noche en cultivo LB líquido que contenía tetraciclina 50 mg/L y diluida hasta 5 x 10^{3} células/ml al siguiente día antes de la inoculación. El tejido de tallo del clavel fue cocultivado con Agrobacterium durante 5 días sobre medio MS suplementado con sacarosa 3% p/v, benziaminopurina 0,5 mg/L, ácido 2,4-diclorofenoxiacético (2,4-D) 0,5 mg/L, acetosiringona 100 \muM y Gelrita 0,25% p/v (pH 5,7).

c. Recuperación de plantas de clavel transgénicas

Para la selección de tejido de tallo transformado, la parte superior de 6,8 mm de cada tallo cocultivado fue cortado en segmentos de 3-4 mm, que fueron entonces transferido a medio MS (Murashige y Skoog, 1962) suplementado con sacarosa 0,3% p/v, BAP 0,5 mg/L, 2,4-D 0,5 mg/L, clorosulfuro 1 \mug/L, ticarcilina 500 mg/L y Gelrita 0,25% p/v. Después de dos a tres semanas, los explantes fueron transferidos a medio MS fresco que contenía sacarosa 0,3%, thidiazuron (TDZ 0,16 mg/L, ácido indol-3-butírico 0,5 mg/L (IBA), clorosulfuro 2 \mug/L), ticarcilina 500 mg/L y Gelrita 0,25% p/v y se tuvo cuidado en esta etapa de eliminar los brotes axilares de los explantes de tallo. Tras 3 semanas, los brotes sanos adventicios fueron transferidos a medio MS libre de hormonas que contenía sacarosa 3% p/v, clorosulfuro 3 \mug/L, ticarcilina 500 mg/L, Gelrita 0,25% p/v. Los brotes que sobrevivieron a clorosulfuro 3 \mug/L fueron transferidos a medio MS suplementado con sacarosa 3% p/v, ticarcilina 500 mg/L, clorosulfuro 5 \mug/L y Gelrita 0,25% p/v para la elongación de los brotes.

Después de 2-3 semanas, se recogieron las hojas de los brotes que habían sobrevivido a la selección y fueron colocadas sobre un medio de regeneración que consiste en medio MS suplementado con TDZ 0,22 mg/L, IBA 0,5 mg/L, clorosulfuro 3 \mug/L, ticarcilina 500 mg/L y Gelrita 0,25% p/v, para obtener la regeneración de los brotes en presencia de selección. Los brotes regenerados fueron transferidos a medio MS libre de hormonas que contenían clorosulfuro 5 \mug/L, ticarcilina 500 mg/L y Gelrita 0,25% p/v durante 2-4 semanas, después a un medio MS libre de hormonas que contenía ticarcilina 200 mg/L y Gelrita 0,4% p/v, en jarras de cristal, para su normalización. Las tapaderas solares (Sigma) fueron colocadas sobre las jarras de cristal para acelerar la normalización de los brotes. Todos los cultivos fueron mantenidos en un fotoperíodo de 16 horas (120 \muE/m^{2}/s de luz fluorescente blanca fría) a 23ºC \pm 2ºC. Los brotes normalizados, aproximadamente 1,5-2,0 cm de altos, fueron sembrados en polvo de siembra IBA 3 g/kg y aclimatados en ambiente húmedo. Una mezcla de suelo que contenía perlita 75%/turba 25% fue usada para la aclimatación, que fue llevada a cabo a 23ºC en un fotoperíodo de 14 horas (200 \muE/m^{2}/s de luz halógena de mercurio) y típicamente duró entre 3-4 semanas. Las plantas fueron fertilizadas con una mezcla de clavel que contenía CaNO_{3} 1g/L y 0,75 g/L de una mezcla de microelementos mas N:P:K en la relación 4,7:3,5:29,2.

Ejemplo 13 Análisis Southern a. Aislamiento de ADN genómico de clavel

El ADN fue aislado de 0,3-0,5 gramos de tejido de hoja usando el método de Lassner y otros, (1989).

b. Transferencia Southern

Aproximadamente 1 \mug de ADN genómico fue digerido con XbaI y sometido a electroforesis a través de un gel de agarosa 1% p/v en un tampón de corrida de TAE. El ADN fue entonces desnaturalizado en una disolución de desnaturalización (NaCl 1,5 M/NaOH 0,5 M) durante 0,5 a 1,0 h, neutralizado en Tris-HCl 0,5 M (pH 7,5)/ NaCl 1,5 M durante 0,5 a 1,0 y el ADN fue transferido a un filtro Hybond-N (Amersham) en 20x SSC.

Los filtros fueron hibridados con ADN marcado con ^{32}P (10^{3} cpm/\mug, 2 x 10^{4} cpm/ml) de un fragmento EcoRV de 730 pb de un clon de cADN de Hf1 de petunia. Los filtros fueron lavados en 2x SSC/ SDS 1% p/v a 65ºC durante 1 hora y después en 0,2x SSC/ SDS 1% p/v a 65ºC durante 1 hora.

El análisis Southern de las plantas de clavel transgénicas putativas obtenidas tras la selección sobre clorosulfuro confirmó la integración de la construcción genética que comprende la molécula de ácidos nucleicos que codifica F3'5'H en el genoma, como se muestra en la Figura 5. Los análisis Northern de flores de plantas de clavel transformadas con pCGP 1470, realizadas como se describe en el Ejemplo 14, a continuación, confirmó que las moléculas de ácidos nucleicos introducidas que definen F3'5'H y DFR fueron ambas expresadas (véase la Figura 6).

Ejemplo 14 Análisis Northern

El ARN total fue aislado de tejido que había sido congelado en nitrógeno líquido y molido en polvo fino usando mano y mortero. Un tampón de extracción de isotiocianato de guanidinio 4 M, Tris-HCl 50 mM (pH 8,0), EDTA 20 mM, Sarkosyl 0,1% v/v, fue añadido al tejido y la mezcla fue homogenizada durante 1 minuto usando un politrón a velocidad máxima. Después de que la suspensión fuera filtrada a través de Miracloth, se centrifugó en un rotor JA20 durante 10 minutos a 10.000 rpm. El sobrenadante fue transferido a un tubo limpio y 0,2 gramos de CsCl fueron añadidos por cada ml de sobrenadante. El CsCl fue disuelto mezclando y las muestras fueron entonces puestas en capas sobre un colchón de CsCl 5,7 M, EDTA 50 mM (pH 7,0) en 38,5 mL de tubos de centrífuga Quick-seal (Beckman) y centrifugadas a 42.000 rpm durante 12-16 horas a 23ºC en un rotor Ti-70. Los precipitados fueron resuspendidos en TE/SDS (Tris-HCl 10 mM (pH 7,5), EDTA 1 mM, SDS 0,15 p/v) y extraídos con fenol:cloroformo (1:1) saturados en EDTA 10 mM (pH 7,5). Tras la precipitación en etanol los precipitados de ARN fueron resuspendidos en TE/SDS.

Las muestras de ARN fueron sometidas a electroforesis a través de geles de formaldehído 2,2 M/agarosa 1,2% p/v usando tampón de corrida que contenía ácido morfolinopropanosulfónico 40 mM (pH 7,0), acetato sódico 5 mM, EDTA 0,1 mM (pH 8,0). El ARN fue transferido a filtros Hybond-N (Amersham) como se describe por el fabricante e hibridados con el fragmento de cADN adecuado marcado con ^{32}P (10^{3} cmp/\mug, 2 x 10^{6} cpm/mL). La prehibridación (1 hora a 42ºC) y la hibridación (16 horas a 42ºC) fueron llevadas a cabo en formamida 50% v/v, NaCl 1 M, SDS 1% p/v, dextrán sulfato 10% p/v. ADN de esperma de arenque degradado (100 \mug /ml) fue añadido con la sonda marcada de ^{32}P para la etapa de hibridación.

Los filtros fueron lavados en 2 x SSC/1%p/v SDS a 65ºC durante 1 hora y después en 0,2 x SSC /1% p/v SDS a 65°C durante 1 hora. Todos los filtros fueron expuesto a una película Kodak XAR con una pantalla intensificadora a -70ºC durante 48 horas.

Ejemplo 15 Fenotipo de flor alterado

La expresión de las moléculas de ácidos nucleicos introducidas que representan F3'5'H y DFR en el cultivo White Unesco de clavel mutante DFR/F3'H tuvieron un marcado efecto en el color de la flor. Las flores de las plantas no transgénicas son blancas, mientras que las plantas transgénicas produjeron flores que fueron de color lila/violeta. Los cambios de color observado pueden también ser descrito en términos de números a partir de la tabla de color de la Real Sociedad Horticultural. En general, los cambios pueden ser descritos como un desplazamiento de color desde el blanco a las tonalidades púrpura/violeta/azules representadas por muchos, pero no todos, los cuadrados de color entre 80 y 98.

Aunque no queriendo limitar el posible cambio de color que pueda lograrse, algunos de los colores observados en las flores de las plantas White Unesco transformadas podrían describirse, aproximadamente, como que han cambiado desde el blanco (no transformadas) hasta 84B/C (transformadas). Además, el uso de un promotor fuerte para dirigir la expresión de las molécula de ácidos nucleicos introducidas pueden permitir la producción de cantidades aún superiores de pigmento de delfinidina, de modo que causen el desarrollo de colores de matiz azul. Debería recordarse que otras condiciones bioquímicas y fisiológicas tales como el pH del pétalo, extensión de la copigmentación y el grado de acilación de antocianinas afectaría al resultado individual. Éstas pueden ser manipuladas mediante transformación de otros cultivos adecuados, o mediante la contransformación con moléculas de ácidos nucleicos que afectan al pH de la copigmentación o acilación. Esto puede permitir el desarrollo de los colores de matiz azul. El citar los colores específicos logrados no debería ser interpretado como que define o limita el intervalo de posibilidades.

Ejemplo 16 Análisis de flavonoides a. Análisis de TLC de flavonoles

Aproximadamente 0,5 gramos de tejido de pétalos de clavel fresco fueron añadidos a 1 mL de HCl 2 M en un tubo de microcentrífuga de 1,5 mL (Eppendorf) y calentados en un baño de agua hirviendo durante 30 minutos. Los restos celulares fueron precipitados mediante centrifugación a 14.000 rpm durante 5 minutos y 500 \muL de sobrenadante fueron transferidos a un tubo de microcentrífuga limpios. Los flavonoides fueron extraídos con 200 \muL de etilacetato y centrifugados brevemente para separar las fases. La fase superior (etilacetato) fue transferida a un tubo de microcentrífuga nuevo, secada al vacío en un concentrador SpeedVac (Savant) y resuspendida en 15 \muL de etil-acetato, y una alícuota de 2 \muL fue colocada sobre una lámina de TLC (cromatografía en capa fina) de celulosa (20 cm x 20 cm, Merck) y corrida durante aproximadamente 3-4 horas en disolvente Forestal (30 partes de ácidos acético: 3 partes de HCl: 10 partes de agua). Se permitió entonces que la placa de TLC se secara al aire y los flavonoles fueron vistos bajo luz ultravioleta.

b. Análisis de TLC de antocianidinas

Dos pétalos de clavel fueron añadidos a 1 mL de HCl 2 M en un tubo de microcentrífuga de 1,5 mL (Eppendorf) y calentados en un baño de agua hirviendo durante 30 minutos. Los restos celulares fueron precipitados mediante centrifugación a 14.000 rpm durante 5 minutos y 500 \muL de sobrenadante fueron transferidos a tubos de microcentrífuga limpios. Las antocianidinas fueron extraídas con 200 \muL de isoamilalcohol (IAA) y centrifugados brevemente para separar las fases. La fase superior (IAA) fue transferida a un tubo nuevo, secada al vacío y resuspendida en 20 \muL de IAA y una alícuota de 1 \muL fue colocada en una lámina de TLC de celulosa (20 x 20 cm, Merck) y corrida durante aproximadamente 3-4 horas en disolvente Forestal. Se permitió que la placa de TLC se secara al aire y las antocianidinas pudieron verse bajo la luz normal.

c. Análisis por HPLC de antocianidinas

Las antocianinas fueron extraídas e hidrolizadas incubando aproximadamente 0,5 g de pétalos de clavel con 1 mL de HCl 2 M a 100ºC durante 30 minutos. Las antocianidinas fueron extraídas con 200 \muL de IAA. Un cuarto de esta mezcla fue secado al vacío y resuspendido en 200 \muL de acetonitrilo 50% y 0,5% TFA (ácido trifluoroacético). Una alícuota de 5 \muL fue analizada mediante HPLC vía gradiente de elución usando unas condiciones de gradiente de 50% B a 60% B a lo largo de 10 minutos, después 60% B durante 10 minutos y finalmente 60% B a 100% B a lo largo de 5 minutos, en las que el disolvente A consistía en TFA: agua (5:995) y el disolvente B consistía en acetonitrilo:TFA:agua (500:5:495). Una columna de Asahi Pac ODP-50 cartridge (250 mm x 4,6 mm, diámetro interno) fue usada para las separaciones cromatográficas en fase inversa. El caudal fue de 1 mL/minuto y la temperatura fue de 40ºC. La detección de antocianidinas fue llevada a cabo usando un detector tridimensional Shimadzu SPD-M6A a 400-650 nm.

Ejemplo 17 Bombardeo de pétalos con microproyectiles recubiertos de ADN

El bombardeo de partículas usando partículas de oro de 1 \mum fue realizado esencialmente como se describe por Sanford y otros (1993). La pistola biolística Bio-Rad PDS-100 dirigida por helio con discos de ruptura de 1100 psi fue usada para todos los bombardeos. Los pétalos fueron diseccionados de los brotes de flores de clavel recién abiertos y colocados sobre una placa de medio MS (+gelrita 0,25%) antes del bombardeo. Cada placa fue bombardeada dos veces con un lote preparado independientemente de partículas de oro recubiertas con ADN. El ADN plasmídico usado para el bombardeo fue purificado usando bien un método de gradiente de CsCl (Sambrook y otros, 1989) o una columna Qiagen (Qiagen). Un microgramo de ADN fue usado por disparo.

Ejemplo 18 ^{32}P-Marcaje de sondas de ADN

Fragmentos de ADN (50 a 100 ng) fueron marcados radioactivamente con 50 \muCi de [\alpha-^{32}P]-dCTP usando un kit de oligomarcaje (Bresatec). El [\alpha-^{32}P]-dCTP no incorporado fue eliminado mediante cromatografía en columna de Sephadex G-50 (Fina) como se describe por Sambrook y otros (1989).

Aquellos con experiencia en la técnica apreciarán que el invento descrito aquí es susceptible de variaciones y modificaciones distintas de las específicamente descritas. Se ha de entender que el invento incluye todas tales variaciones y modificaciones. El invento también incluye todos las etapas, características, composiciones y compuestos que se refieren o indican en esta especificación, individualmente o colectivamente, y cualquiera y todas las combinaciones de cualesquiera dos o más de dichas etapas o características.

Referencias

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(1) INFORMACIÓN GENERAL

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(i)

SOLICITANTE:

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(A)

NOMBRE: Internacional Flower Development Pty Ltd

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(B)

CALLE: 16 Gipps Street

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(C)

CIUDAD: Collingwood

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(D)

ESTADO: Victoria

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(E)

PAÍS: Australia

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(F)

CÓDIGO POSTAL (ZIP): 3066

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(ii)

TÍTULO DEL INVENTO: Plantas transgénicas que exhiben el color de flor alterado y métodos para producir las mismas

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(iii)

NÚMERO DE SECUENCIAS: 2

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(iv)

FORMA LEGIBLE COMPUTERIZADA:

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(A)

TIPO DE MEDIO: Disquete

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(B)

ORDENADOR: IBM PC compatible

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(C)

SISTEMA OPERATIVO: PC-DOS/MS-DOS

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(D)

SOFTWARE: PatentIn Release #1.0, Version #1.30 (EPO)

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(vi)

DATOS DE LA SOLICITUD ANTERIOR:

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(A)

NÚMERO DE SOLICITUD: AU PN 2988

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(B)

FECHA DE PRESENTACIÓN: 16-MAYO-1995

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(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 1:

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(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

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(A)

LONGITUD: 23 pares de bases

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(B)

TIPO: ácido nucleico

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(C)

CATENARIEDAD: sencilla

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(D)

TOPOLOGÍA: lineal

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(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: otro ácido nucleico

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(A)

DESCRIPCIÓN: /desc: "Oligonucleótido sintetizado"

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO 1:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

ACRTCRGTRT GNGCYTCNAC NCC

\hfill

23

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID Nº: 2:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 20 pares de bases

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(B)

TIPO: ácido nucleico

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(C)

CATENARIEDAD: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

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(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: otro ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

DESCRIPCIÓN: /desc: "Oligonucleótido sintetizado"

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(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 2:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

TGGGARGAYT AYNTNTTYCA

\hfill

20

Claims (14)

1. Un método para producir una planta que exhibe un color de flor alterado, dicho método comprende seleccionar una planta a partir de la cual dicha primera planta es derivada en la que dicha planta seleccionada es incapaz de sintetizar una DFR que actúe sobre DHK, o produce niveles reducidos de DFR comparado con una planta silvestre, o produce una DFR con una especificidad de sustrato reducida para DHK comparada con DHQ o DHM; e introducir en dicha planta seleccionada una o más construcciones genéticas que comprenden secuencias nucleotídicas que codifican una F3'5'H y una DFR que es capaz de actuar sobre DHM pero es incapaz de actuar sobre DHK o tiene una especificidad de sustrato mayor para DHM que para DHK o DHQ.

2. Un método como se reivindica en la reivindicación 1, en el que la planta es un clavel, una rosa, una gerbera o un crisantemo.

3. Un método como se reivindica en la reivindicación 2, en el que la planta es un clavel.

4. Un método como se reivindica en la reivindicación 1, 2 ó 3, en el que la planta seleccionada es también capaz de sintetizar una F3'H.

5. Un método como se reivindica en una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en la que la secuencia de ácidos nucleicos que codifican una DFR introducidos en dicha planta seleccionada es de origen de petunia.

6. Un método como se reivindica en una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en el que la secuencia nucleotídica que codifica una F3'5'H es de petunia, berenjena, lisiantus, genciana, pensamientos, aster de china, anémona, uva, iris, jacinto, delfinium o campanilla.

7. Un método como se reivindica en la reivindicación 6, en la que la secuencia nucleotídica que codifica F3'5'H es de petunia.

8. Un método como se reivindica en una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, en el que el color de flor alterado es lila, violeta, púrpura o azul o una tonalidad de los mismos.

9. Una planta transgénica que exhibe un color de flor alterado como se define en una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3 y 8, siendo dicha planta incapaz de sintetizar una DFR que actúe sobre DHK, o produce niveles reducidos de DFR comparados con una planta silvestre, o produce una DFR con una especificidad de sustrato reducida para DHK comparada con DHQ o DHM; y que lleva una molécula de ácidos nucleicos que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica una F3'5'H y una DFR que es capaz de actuar sobre DHM pero es incapaz de actuar sobre DHK o tiene una especificidad de sustrato mayor para DHM que para DHK o DHQ.

10. Una planta transgénica como se reivindica en la reivindicación 9, en la que la planta es también incapaz de sintetizar una F3'H.

11. Una planta transgénica como se reivindica en la reivindicación 9 ó 10, en la que la molécula de ácidos nucleicos que codifica la DFR es de origen de petunia.

12. Una planta transgénica como se reivindica en una cualquiera de las reivindicaciones 9 a 11, en la que la molécula de ácidos nucleicos que codifica la F3'5'H es de petunia, berenjena, lisiantus, genciana, pensamientos, aster de china, anémona, uva, iris, jacinto, delfinium o campanilla.

13. Una planta transgénica como se reivindica en la reivindicación 12, en la que la molécula de ácidos nucleicos que codifica la F3'5'H es de origen de petunia.

14. Una flor cortada de una planta transgénica como se define en una cualquiera de las reivindicaciones 9 a 13 o una parte de dicha planta.