WO2000065073A2 - Genetische sequenz, die für flavonsynthase ii enzyme kodiert, und deren verwendung - Google Patents

Genetische sequenz, die für flavonsynthase ii enzyme kodiert, und deren verwendung Download PDF

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    • C12P17/02—Oxygen as only ring hetero atoms
    • C12P17/06—Oxygen as only ring hetero atoms containing a six-membered hetero ring, e.g. fluorescein

Definitions

  • the present invention relates to genetic sequences which code for enzymes of the flavonoid metabolism, especially for the flavone synthase II (FNS II) or derivatives thereof and their use for the targeted change in the flower color, for changing the flavon content or pattern in leaves, flowers and other tissues of plants and other organisms and moreover the use in expression systems for the synthesis of natural, functional flavones for medical or similar applications, for example for cancer therapy or improvement of the human immune system.
  • FNS II flavone synthase II
  • Flavonoids are the most important and most widespread plant pigments that are found in various tissues such as Flowers, leaves or roots have been detected. In addition, they are among the best characterized secondary metabolites in plants. More than 3000 different flavonoids have been characterized so far. They have been divided into different subclasses (e.g. flavones, flavonols or anthocyanins) based on the degree of oxidation of the central C-ring. Each type can also be modified by hydroxylation, acylation and glycosylation (Heller and Forkmann, 1994). Due to the different physicochemical properties of the molecules, the subclasses sometimes have very different biological functions.
  • subclasses e.g. flavones, flavonols or anthocyanins
  • flavonoids The accumulation of certain flavonoids in a plant cell depends on the availability of the respective enzymes, the availability of the enzymes ultimately depending on the expression of the corresponding gene.
  • the regulation of the expression of flavonoid biosynthesis genes is essentially determined by the plant species, the stage of development and the environmental conditions.
  • Flavonoids play an important role both inside and outside the plant. For example, it has been shown that certain flavonols are required for pollen tube growth. If the accumulation of flavonols is suppressed by blocking the biosynthetic pathway, sterile pollen is obtained (Taylor and Jorgensen, 1992). Both biotic and abiotic signals can be generated during plant interaction lead to flavonoid accumulation with their environment. For example, UV radiation leads to an accumulation of flavonols and flavones. This is achieved by inducing the transcription of the respective flavonoid biosynthesis genes in different types (Kubasek et.al., 1992).
  • flavonoids When plants interact with other organisms, the flavonoids are assigned a dual function. On the one hand, the flavonoids as phenolic compounds have an effect as phytoalexin against various pathogens and as a deterrent against predators (Harborne and Grayer, 1994), and on the other hand they are responsible for the communication between plants from the legume family and certain microorganisms. Flavonoids serve as signaling substances for nitrogen-fixing bacteria, in which genes are then expressed that are required for symbiosis with the plant (Redmond et.al., 1986).
  • flavonoids In flowers, leaves and fruits, flavonoids, especially the colored anthocyanins, but also chalcones, aurones, flavones and flavonols, are responsible for the coloring and the patterns of the various secondary ingredients. The latter, together with other characteristics, such as, for example, the scent, is important for recognition by various animals, but also for the person who uses the plant as jewelry or for food (Harborne and Grayer, 1994). In addition, certain flavonoids, such as fiavon apigenin and flavonol quercetin, influence auxin transport within the plant (Jacobs and Rubery, 1988).
  • the structure of the flavonoids consists of two aromatic rings (A and B) and a central heterocycle (C) (Fig. 1 B). They are formed in the plant starting from L-phenylalanine via the phenylpropanoid pathway through the enzymatic reaction of phenylalanine ammonia lyase (PAL) and cinnamic acid 4-hydroxylase (4CL). The resulting 4-coumaroyl-CoA together with 3 molecules of malonyl-CoA results in tetrahydroxy chalcone. This reaction is synthesized by chalcon synthase (CHS), the key enzyme in flavonoid biosynthesis (Fig. 1A).
  • CHS chalcon synthase
  • the tetrahydroxy chalcone (THC) is usually quickly isomerized to naringenin (NAR) by the enzyme chalconisomerase (CHI).
  • NAR naringenin
  • CHI enzyme chalconisomerase
  • the anthocyanins are formed in various other reactions.
  • Flavones are formed on a side path through FNS I or FNS II, a cytochrome P450 enzyme. This class of enzymes is widespread and natural Various genes for cytochrome P450 enzymes have been isolated and sequenced from vertebrates, insects, yeasts, fungi, bacteria and plants.
  • the flavone synthase uses various flavanones, e.g. NAR or eriodictyol (ERI) as a substrate to synthesize the corresponding flavones apigenin (Ap) and luteolin (Lu). As shown in Figure 1 B, a double bond is inserted between the C2 and C3 positions. Flavones can be present in the plant in a glycosylated or methylated form.
  • flavanones e.g. NAR or eriodictyol (ERI)
  • flavone synthase I flavone synthase I
  • Betalaine only come in a few families
  • Centrospermae where they are responsible for yellow, orange, red and violet colors.
  • Carotenoids produce orange or yellow tones and are the main pigments in most orange and yellow flowers. Flavonoids are the main and most common
  • Flower or plant pigments This group includes the coloring anthocyanins, which are glycosylated and often acylated in the vacuole. Different anthocyanins can produce different colors. The flower color is also determined by the pH of the vacuole, the complexation with metals and the
  • Flavonols or tannins (Scott-Moncrieff, 1936). Anthocyanins made with flavones copigmented can take on different colors, depending on the basic structure of the anthocyanin, and can vary between purple and blue ( ⁇ sen and Horowitz, 1974; Goto and Kondo, 1991). Various flavones, such as isoetin, have also been identified as yellow flower pigments (Harborne, 1978).
  • the ability to specifically change the flower colors of plants brings clear advantages over other methods. This is particularly important in an area that has a high product turnover and where novelty is an important market factor. For example, the development of blue-flowering varieties for the main cut flower types such as roses, chrysanthemums, carnations, lilies, tulips and gerberas would bring a significant market advantage in the cut flower market, but also in the potted plant market.
  • copigments e.g. Flavone
  • this application can also be used on fruits and other useful plants, e.g. on fruit and vegetable plants and on leaves, e.g. for ornamental plants.
  • the flavonoids In addition to their contribution to the color of the flowers, the flavonoids, especially the flavones, have other biological properties and effects. For example, they were found in some plants as feeding stimulants for monophage and oligophage insects (Harborne and Grayer, 1994). In most cases, the glycosides show a far greater effect than the corresponding Aglyka, which is probably due to the better solubility of the glycosides. In addition, the insects can differentiate between different sugar residues, thereby further differentiating the active Components is given. The basic structure of the Aglyka can also lead to different effects. In comparison to many other phytonutrients, the flavonoids or flavones obviously do not have a very toxic effect on insects.
  • flavones that act as a deterrent to feeding insects even at low concentrations or can significantly inhibit the growth of the animals.
  • An influence of the type of glycosylation could not be shown here, but that of the hydroxylation or methoxylation of the flavone (Harborne and Grayer, 1994).
  • flavones also stimulate butterflies to lay eggs on certain plants. The animals were shown to lay their eggs only after the stimulus was recognized.
  • stimulating substances include e.g. the Flavone Vicenin-2 and various luteolin derivatives. If the synthesis of these substances in the respective host plants is prevented, the butterflies' oviposition and thus damage by eating can be prevented by their caterpillars.
  • flavonoids Another important biological property of the flavonoids concerns the activation of the nodulation genes in different Rhizobium species. These bacteria infect legumes and form nitrogen-fixing root nodules.
  • the flavonoids produced by the host plant act as a "signaling substance", whereby the bacteria initiate the infection process.
  • These plant-specific, active compounds also include various flavones, such as, for example, apigenin, luteolin and 7,4'-dihydroxyflavone (Firmin et.al., 1986; Redmond et al., 1986) If the flavone production and its release are changed by the root or the flavon pattern in this tissue, an improvement in nitrogen fixation or possibly an establishment of this mechanism can be achieved in non-leguminous plants. By using these natural symbiotic mechanisms, nitrogen fertilization and thus the pollution of the environment by leaching out the nutrients can be reduced. In addition, costs for fertilizers and their application are saved.
  • flavonoids affect the plant, e.g. the Fiavon apigenin or the flavonols Kaempferol and Quercetin, the auxin transport in different plant tissues and transport systems. They behave similarly to synthetic transport inhibitors.
  • Auxins as plant-specific growth regulators, influence cell extension, cell division, apika dominance, new root and shoot formation as well as Parthenoka ⁇ ie.
  • An induced, changed flavonoid concentration endogenous change and / or exogenous application
  • flavonoids As bioactive substances, flavonoids also have a significant role in human and animal nutrition. They occur in fruits, vegetables, nuts, seeds, stems, but also in tea and wine. Anti-allergic, anti-inflammatory, anti-viral, anti-proliferation and anti-carcinogenic properties have long been attributed to flavonoids, including various flavones. An influence on human and animal metabolism and the highly complex immune system is also described. In this context, the flavonoids or flavones influence a large number of different enzymes (e.g.
  • hyaluronidase or aldose reductase have important enzyme-inducing and antioxidative properties, can scavenge free radicals, chelate different metal cations and also influence cellular protein phosphorylation (Middleton and Kandaswami, 1994).
  • a further object of the present invention was to provide means and methods which can be used for the targeted synthesis of defined flavones. Flavones obtained in this way can be used, among other things, in cancer therapy or can contribute to the health of humans and animals in the form of drugs.
  • the invention therefore relates to a nucleic acid sequence which codes for a flavone synthase II (FNS II).
  • the invention relates to a nucleic acid sequence shown in SEQ ID NO: 1 or a part thereof.
  • the invention relates to a nucleic acid sequence with the SEQ ID NO: Nucleic acid sequence or 1 shown a portion hybridizes thereof and / or at least a 40%, better at least 45% ⁇ ge ', more preferably at least 55% or, best of all, at least 65-70% homology, or most preferably greater than 85% at the level of the nucleic acid or amino acid sequence to at least one or more regions (preferably over the entire region) of the sequence shown in SEQ ID NO: 1 .
  • the nucleic acid sequence preferably encodes a protein or polypeptide with the biological activity of a flavone synthase.
  • the invention relates to a nucleic acid sequence which is degenerate with respect to a nucleic acid sequence according to the preceding embodiments.
  • the nucleic acid sequence according to the invention is DNA or RNA and is derived from a plant containing flavones, such as, for example, from gerbera (Gerbera hybrids), aster (Callistephus chinensis), snapdragons (Antirrhinum majus), chrysanthemum (Chrysanthemum indicum), dahlia (Dahlia hybrids) ), Gloxinia (Sinningia hybrids), verbena (Verbena hybrids) and streptocarpus (S. hybrids).
  • the nucleic acid sequence according to the invention is a recombinant nucleic acid sequence.
  • the invention further relates to a nucleic acid sequence which is complementary to the sequence coding for flavone synthase II (FNS II).
  • the present invention provides an isolated nucleic acid encoding one for flavone synthase II (FNS II) or for a functional derivative of this enzyme
  • FNS II enzyme means enzymes of the flavonoid biosynthetic pathway that flavanones such as narine Use genin and eriodictyol or other compounds from this class as a substrate for the synthesis of the corresponding flavones.
  • nucleic acid according to the invention which has been isolated from the natural environment or chemically synthesized.
  • nucleic acid molecules that are formed or obtained in vitro, including genomic DNA fragments, recombinant and synthetic molecules and nucleic acids in combination with heterologous nucleic acids.
  • genomic DNA or cDNA or parts thereof which encode the FNS II or parts thereof in reverse orientation to the corresponding or another promoter.
  • Naturally occurring, closely related nucleic acid sequences are also included.
  • nucleic acid sequence encoding a flavone synthase II is used here in its most general form and encompasses each successive series of nucleotide bases which, directly or via a complementary series of bases, determines an amino acid sequence of an FNS II.
  • a polypeptide with part or all of the amino acid sequence of flavone synthase II means a full (full length) FNS II or an active, incomplete form thereof.
  • the invention relates to oligonucleotides which can be used as genetic samples or as "antisense” molecules for regulating the expression of the corresponding gene in plants or other organisms.
  • An "antisense molecule” as described herein also includes a gene construct that consists of a structural, genomic, or a cDNA gene or a portion thereof in reverse orientation with respect to his or another promoter.
  • nucleic acid sequence which codes for the FNS II or for various functional derivatives thereof is used to reduce the activity of endogenous FNS II, or alternatively a nucleic acid sequence which codes for this enzyme or various derivatives or parts thereof is used in antisense Orientation used to reduce the activity of FNS II.
  • an antisense transcript of the FNS II or a fragment or part of the FNS II for example an oligonucleotide molecule
  • the enzyme specifies such an accumulation of or prevents translation of the mRNA into the active enzyme.
  • Another possibility is the use of ribozymes to inactivate special nucleic acid sequences.
  • Changes in FNS II activity mentioned here relate to an increase or reduction in activity of up to 30% or better from 30 to 50% or even better 50 to 75% or best of all 75% or even higher or lower than normal, endogenous or existing value of the activity.
  • the level of activity can easily be tested using the method described by Martens and Forkmann (1998) (see Example 3).
  • the nucleic acid described in this invention can also be a ribonucleic acid or a deoxyribonucleic acid, which can be present as a single-stranded or double-stranded and linear or covalently closed molecule.
  • the nucleic acid molecule is usually present as a cDNA.
  • the present invention also encompasses other nucleic acid molecules which hybridize under low, better under medium and best under high-stringent conditions with nucleic acid molecules according to the invention or specifically with the sequence shown in SEQ ID NO: 1 or a part or a part thereof.
  • a particularly preferred embodiment relates to a nucleic acid molecule comprising the nucleic acid sequence shown in SEQ ID NO: 1 or a molecule which contains at least a 40%, better an at least 45%, even better an at least 55% or best at least a 65- 70% or, best of all, a similarity higher than 85% at the level of the nucleic acid sequence or amino acid sequence to at least one or more regions (preferably over the entire region) of the sequence shown in SEQ ID NO: 1 and wherein the nucleic acid is coding or complementary to is a sequence encoding an enzyme that has FNS II activity.
  • the present invention further comprises nucleic acid molecules in the form of oligonucleotide primers or competent samples for hybridization with a part of the nucleic acid molecules considered above and especially with the one shown in SEQ ID NO: 1.
  • the hybridization can take place under low, better under medium and best under highly stringent conditions.
  • the part preferably corresponds to the 5 'or 3' end of the gene.
  • the 5 'end is defined here as the region mainly between the start codon of the structural, genetic sequence and the middle region of the gene.
  • the 3 'end is considered here as the region that defines the structural genetic sequence between the central region of the gene and the stop codon.
  • oligonucleotides or samples have the 5 'end or the 3 'end or with one region together to hybridize to both the 5' or 3 'end.
  • the present invention includes all such samples. Preferred oligonucleotides are shown in Example 4.
  • the nucleic acid or its complementary form can encode the complete enzyme or a part or a derivative.
  • derivative is meant a single or multiple amino acid substitution, deletion and / or addition in relation to the naturally occurring enzyme, the flavone synthase II activity preferably being retained.
  • the nucleic acid according to the invention comprises the naturally occurring nucleotide sequence which codes for the FNS II and single or multiple nucleotide substitutions, deletions and / or additions.
  • the nucleic acid of the present invention or its complementary form can also encode part of the FNS II, either active or inactive.
  • Such a nucleic acid molecule can be used as an oligonucleotide sample, as a primer for the polymerase chain reaction, in various mutagenic techniques or for the preparation of antisense molecules.
  • the invention further relates to a recombinant DNA molecule containing a nucleic acid sequence according to the invention.
  • the recombinant DNA molecule is a vector or a vector with a promoter.
  • the promoter is capable of expressing the nucleic acid according to the invention.
  • the nucleic acid molecules according to the invention can be present in one of the two orientations in combination with a vector molecule, for example an expression vector.
  • vector molecule is used in its most general meaning to include any intermediate vehicles for the nucleic acid molecule which, for example, make it possible to transfer the nucleic acid into cells, in particular plant cells, and / or to integrate it into a genome.
  • vector molecules or parts thereof are preferably used for integration into a plant genome.
  • Such vector molecules can be replicated and / or expressed in prokaryotic cells and / or in eukaryotic cells.
  • An intermediate vehicle can be adapted, for example, for use in electroporation, in microprojectile bombardment, in transfer with the aid of agrobacteria or in the insertion via DNA or RNA viruses.
  • the intermediate vehicle and / or the nucleic acid molecule contained therein can be stably integrated into the plant genome.
  • the nucleic acid molecule can additionally also contain a promoter sequence which is used to initiate expression of the nucleic acid molecule in a cell, in particular one Plant cell, is suitable.
  • the nucleic acid molecule and promoter can also be introduced into the cell by various methods (see above).
  • the invention also relates to host cells which contain these DNA molecules according to the invention.
  • the host cells can be prokaryotic or eukaryotic cells, in particular yeast cells, insect cells, plant cells and mammalian cells.
  • the invention further relates to a polypeptide which is encoded by a nucleic acid according to the invention.
  • the invention relates to a polypeptide with the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2 or a part thereof or derivatives thereof.
  • the polypeptide is derived from a plant containing flavon, e.g. from Gerbera (Gerbera hybrids), Aster (Callistephus chinensis), Qualcomms (Antirrhinum majus), Chrysanthemum (Chrysanthemum indicum), Dahlia (Dahlia hybrids), Gloxinie (Sinningia hybrids), Verbena (Verbena hybrids) and Streptocarpus.
  • the polypeptide according to the invention has flavone synthase II activity.
  • Derivatives in the sense of this invention are amino acid insertion derivatives, deletion derivatives and / or substitution amino acid variants of the amino acid sequence from SEQ ID NO: 2.
  • Amino acid insertion derivatives of the FNS II according to the invention include both amino and carboxylene mergers as well as insertions of single or more amino acids within the sequence.
  • Insertion amino acid sequence variants are those in which one or more amino acid residues have been inserted into the protein at a predetermined position, although a random insertion with an appropriate screening of the product is also possible.
  • Deletion variants are characterized by the removal of one or more amino acids from the sequence.
  • Substitution amino acid variants are those in which at least one residue in the sequence has been removed and another residue has been inserted at this point. Typical substitutions are shown in Table 1. TABLE 1 Suitable residues for amino acid substitution
  • amino acids are replaced by amino acids with similar properties, such as hydrophobicity, hydrophilicity, electronegativity, very extensive side chains and the like.
  • Substitutions of amino acids usually affect only one residue, whereas insertions usually affect a range of 1 to 10 amino acid residues and deletions affect a range of 1 to 20 residues.
  • Deletions and insertions are preferably carried out on adjacent pairs, e.g. a two residue deletion or an insertion of two residues.
  • amino acid variants of derivatives according to the invention described above can easily be produced with the aid of known peptide synthesis techniques such as, for example, by solid phase synthesis and similar processes or by recombinant D ⁇ A manipulations.
  • Techniques for making substitution mutations at predetermined locations in DNA that have a known or partially known sequence are well known and include, for example, M13 mutagenesis.
  • the manipulation of DNA sequences for the production of proteins with substitutions, insertions or deletions is described, for example, in Sambrook et.al. (1989).
  • recombinant or synthetic mutants and derivatives of the FNS II according to the invention include single or multiple substitutions, deletions and / or additions of any molecules associated with the enzyme, such as carbohydrates, lipids and / or proteins or polypeptides.
  • analogs and derivatives also extend to all functional chemical equivalents of FNS II and also to all amino acid derivatives which have already been described above.
  • Another aspect of the present invention concerns recombinant forms of the FNS II.
  • the recombinant forms of the enzyme provide a way to more active for example enzymes or systems for various in 'tto production flavones for use in various fields, such as to develop human medicine.
  • the latter system can be used, among other things, in cancer research.
  • the invention relates to transgenic plants containing a nucleic acid sequence according to the invention.
  • the nucleic acid sequence is suitable for expression and can optionally be regulated or is regulated in the plant depending on development.
  • the transgenic plant is selected from the group of plants containing flavon, e.g. from Gerbera (Gerbera hybrids), Aster (Callistephus chinensis), Qualcomms (Antirrhinum majus), Chrysanthemum (Chrysanthemum indicum), Dahlia (Dahlia hybrids), Gloxinie (Sinningia hybrids), Verbena (Verbena hybrids) and Streptocarpus, S. streptocarpus carries an endogenous FNS II and also contains a non-endogenous FNS II nucleic acid sequence according to the invention.
  • a nucleic acid sequence coding for an FNS II or a derivative or a part thereof can be introduced into and expressed in a plant in one of two possible orientations and thereby offer the possibility of either naringenin (NAR) and / or other suitable substrates when synthesized in the plant cell to convert, which ultimately leads to the formation of different flavones.
  • NAR naringenin
  • the formation of these metabolites can be prevented by reducing or eliminating endogenous or existing FNS II activity.
  • the synthesis of flavones leads to a change in the color of the flowers in gerberas.
  • Flavone-containing, orange variety "Th 58" (fns * fns) could show a variation in color from dark red (flavone-free; genotype: fns fns) to various orange-red tones (containing flavone; genotype: fns * fns) to a yellow-orange (strongly flavonic; genotype) : fns * fns *) are shown.
  • This experiment can be arbitrarily transferred to other varieties heterozygous for the Locus Fns (see also Example 2).
  • the expression of the nucleic acid sequence in one of two possible orientations in the plant can be constitutive, inducible or development-related and also tissue-specific.
  • the word "expression” is used in its most general meaning to include the production of RNA or both, RNA and protein. It is also extended to partial expression of nucleic acid molecules.
  • the invention relates to a process for the production of transgenic plants which are capable of synthesizing FNS II or active mutants or derivatives.
  • This method comprises the stable transformation of a cell of a suitable plant with a nucleic acid molecule which comprises a nucleotide sequence which codes for said FNS II under conditions which induce the possible expression of said nucleic acid molecule, the regeneration of a transgenic plant from the cell and the Growth of this transgenic plant for a certain time and under conditions suitable for inducing the expression of the nucleic acid.
  • the transgenic plant may show higher values of FNS II activity compared to the value measured in comparable, non-transgenic plants or the values may be lower compared to those of comparable, non-transgenic plants.
  • One aspect of the present invention relates to a method for producing a transgenic plant with reduced, endogenous or existing FNS II activity.
  • This method involves the stable transformation of a cell of a suitable plant with a nucleic acid molecule comprising a nucleotide sequence encoding a sequence or a complementary sequence of the FNS II, the regeneration of a transgenic plant from the cell and, if necessary, the cultivation of this transgenic plant under suitable conditions to achieve expression of nucleic acids.
  • Another aspect of the invention relates to a method for producing a genetically modified plant with reduced endogenous or existing FNS II activity.
  • This procedure involves the modification of the FNS Il gene by a Modification of the endogenous sequence via homologous recombination, starting from a correspondingly modified gene of an FNS II or a derivative or a part thereof.
  • the gene is introduced into the plant cell and a genetically modified plant is regenerated from the cell.
  • Another aspect of the present invention relates to a method for producing a transgenic, flowering plant with altered flower properties.
  • This method comprises introducing the nucleic acid sequence according to the invention into a cell of a suitable flavon-free plant, regenerating a transgenic plant from the cell and cultivating a transgenic plant at a time and under conditions in order to achieve the expression of the introduced nucleic acid sequence according to the invention.
  • the transgenic plant can be selected, for example, from the group of plants containing flavones, consisting of Euphorbia (E. pulchem ' ma), Cyclamen (Cyclamen persicum), Rose (Rosa Hybrida), Pelargonium (P. spec), Begonia (ß.
  • the transgenic plant is capable of expressing an endogenous flavone synthase II.
  • a transgenic plant can be selected, for example, from the group of plants consisting of gerbera (Gerbera hybrids), aster (Callistephus chinensis), snapdragons (Antirrhinum majus), chrysanthemum (Chrysanthemum indicum), dahlia (Dahlia hybrids), gloxinia (Sinningia hybrids) , Verbena (Ve-n ena hybrids) and streptocarpus (S. hybrids).
  • this endogenous flavone synthase II is co-expressed when the introduced nucleic acid according to the invention is expressed.
  • the endogenously present flavone synthase II activity is reduced by introducing the nucleic acid sequence.
  • This method comprises the stable transformation of a cell of a suitable plant with a nucleic acid sequence according to the invention or a sequence complementary thereto, the regeneration of a transgenic plant from the cell and the cultivation of this transgenic plant at a time and under suitable conditions to the level of activity of the endogenous or to change existing FNS II.
  • the changed value is preferably less than the endogenous or existing level of FNS II activity in a comparable, non-transgenic plant.
  • expression of the introduced nucleic acid sequence or its complementary sequence is necessary for the reduction of the endogenous FNS II activity. Expression of the introduced genetic sequence or its complementary analogue may be necessary to achieve the desired effect. This essentially means a flowering plant with changed flower properties.
  • the present invention relates to a method for producing a flowering plant which exhibits different flowering properties.
  • This method involves changes in the FNS II gene by modification of the endogenous sequences via homologous recombination of a correspondingly modified gene of an FNS II or a derivative or a part thereof, the introduction into the plant cell and the regeneration of the genetically modified plant from the cell.
  • the nucleic acid molecule according to the invention can also be regulated depending on development.
  • a changed inflorescence includes the production of weakly colored flowers or other colors, depending on the physiological conditions of the recipient plant.
  • recipient plant is meant a plant that produces a measurable amount of substrate for the FNS II enzyme or the FNS II itself and has the corresponding physiological properties and genotype that are necessary for the development of the desired colors.
  • the present invention encompasses a method for producing a transgenic plant that measurably expresses a recombinant gene encoding FNS II or a portion thereof or that carries a nucleic acid sequence that is substantially complementary to all or a portion of the mRNA molecule , which, if necessary, can be easily transcribed to effect the regulation of FNS II.
  • This method comprises the stable transformation of a cell of a suitable plant with the isolated nucleic acid, comprising a nucleotide sequence coding for an FNS II or a derivative or a part thereof, or a sequence complementary to the coding nucleotide sequence, if necessary under conditions which a Allow expression of said isolated nucleic acid, and by regeneration of a transgenic plant from a cell.
  • the isolated nucleic acid comprising a nucleotide sequence coding for an FNS II or a derivative or a part thereof, or a sequence complementary to the coding nucleotide sequence, if necessary under conditions which a Allow expression of said isolated nucleic acid, and by regeneration of a transgenic plant from a cell.
  • the present invention therefore relates to all transgenic plants which contain all or part of the nucleic acid sequence according to the invention and / or which have a homologous or related form thereof or an antisense form of any of the described, and in particular those transgenic plants which differ Show flower properties.
  • the transgenic plants can contain introduced nucleic acid molecules that comprise a nucleotide sequence encoding an FNS II or a complementary sequence.
  • the nucleic acid is stably introduced into the plant genome, although the present invention also introduces an FNS II nucleotide sequence within an autonomously replicating nucleic acid sequence such as e.g. Includes DNA or RNA viruses that are capable of replicating in a plant cell.
  • the invention also includes seeds of the transgenic plant, especially if they contain flavon.
  • the flavonoid biosynthesis or the formation of flavones in plants can be specifically changed in various ways.
  • the present invention relates to an altered FNS II activity in plants and other organisms, which can be achieved both by increasing and reducing the naturally occurring FNS II activity by means of the introduction of the sequence from the present invention.
  • a reduction in the level of FNS II activity can also be described as a down-regulation.
  • the synthesis of flavones can be specifically up-regulated or down-regulated with the help of suitable methods, or switched off entirely. This has various consequences for the plant.
  • a completely new synthesis of flavones can be achieved by the targeted introduction of FNS II into plants without natural activity.
  • the flavon content and the flavon pattern can be regulated.
  • flower colors, resistance properties and the ability to symbiosis with nitrogen-fixing bacteria can be specifically changed.
  • the opening of a new biosynthetic pathway can reduce the formation of less useful flavonoids for the plant (e.g. feeding stimulants) or also establish the synthesis of biflavones that arise from flavones.
  • flavon-containing or flavon-free useful plants in their flavonoid pattern and content can be changed in such a way that their positive properties with regard to the biology of humans and animals are optimized.
  • the present invention further relates to methods for specifically changing the flake content or pattern in various plant tissues (flowers, roots, leaves, etc.) and other organisms, and thus generally changing the Flavonoid composition, especially the change of flower colors through copigmentation, resistance properties and the ability of nodulation in legumes.
  • the invention relates to the use of a polypeptide according to the invention for the synthesis of flavones.
  • the enzyme itself and ultimately natural flavones can be synthesized, starting from suitable substrates.
  • suitable expression systems for obtaining health-promoting, natural flavones.
  • These expression systems can be plant-based or consist of cell or yeast cultures.
  • the expression of the FNS II in plants or in cell cultures can be used for the direct extraction of the corresponding flavones, it being possible for the yeast expression system to be preferred for the extraction of the intact enzyme.
  • This enzyme can then be used to convert chemical or natural precursors (flavanones) to the corresponding fiavon.
  • the flavones synthesized in this way can be used, among other things, in cancer therapy or can contribute to the health of humans and animals in the form of drugs.
  • the present invention is described in detail by the following figures and examples.
  • the present invention is based on a nucleic acid sequence
  • Gerbera hybrids was derived, illustrated. It is now obvious that similar
  • FIGURE 1A-C shows a schematic representation of the general flavonoid biosynthetic pathway and chemical structure of various flavonoids.
  • CHS chalcone synthase
  • CHI chalconisomerase
  • FHT flavanone 3-hydroxylase
  • DFR dihydroflavonol 4- Reductase
  • ANS anthocyanidine synthase
  • FGT flavonoid 3-glucosyltransferase
  • FNS II flavone synthase II
  • FLS flavonol synthase
  • F3 ⁇ flavonoid 3'-hydroxylase
  • F3 ', 5'H flavonoid 3', 5'-hydroxylase.
  • the level of flavon formation is particularly marked (++++) in Figure 1A.
  • Figure 1B shows the FNS II reaction in the presence of NADPH with some common flavanones. Other important flavonoids are shown in the lower part.
  • Figure 1C describes the flavonoid biosynthetic pathway as it occurs in gerbera hybrids.
  • THC tetrahydroxy chalcone
  • PHC Pentahydroxychalkon
  • NAR naringenin
  • ERI eriodictyol
  • Ap apigenin
  • Lu luteolin
  • DHK dihydrokaempferol
  • DHQ dihydroquercetin
  • Km kaempferol
  • Qu quercetin
  • LPg leucopelargonidine
  • LCy leucocyanidin
  • Pg pelargonidine
  • Cy cyanidine.
  • FIGURE 2 shows the activity or the lack of activity of FNS II in enzyme extract from petals of different gerbera lines: "Th 58" (genotype fns + fns), "147-150” (fns + .) And “147-146” ( fns fns).
  • the lines “147-150” and “147-146” are self-progeny from “Th 58".
  • the activity of FNS II was measured by the conversion of 1 C-labeled naringenin to the corresponding fiavon of apigenin.
  • FIGURE 3 shows the FNS II activity ( ⁇ ) and the accumulation of flavones (D) in the line "Th 58" (fns + fns) over various stages of flowering.
  • the different flower stages are defined in Example 2.
  • the flavon content was determined by extraction with ethyl acetate and HPLC analysis, as described in Martens and Forkmann (1998).
  • FIGURE 4A + B shows the known structure of the cytochrome P450 sequences with areas of high sequence conservation. The proline-rich, the oxygen binding and the heme binding region are shown.
  • Fig. 4B shows the heme binding region in detail and also the primers derived from it for the DD-RT-PCR. A set of eight non-degenerate 5 'primers was created according to the possible nucleotide sequence.
  • FIGURE 5 shows a schematic representation of the various generated cytochrome P450 DNA fragments. All clones contain the labeled heme binding site.
  • pDDd7a a 358 bp fragment could be PCR by means of the Oligo's "Decamer d7" and "Oligo A" are generated with a DNA template recovered from a differentially expressed band.
  • pTABATA a 1519 bp fragment was started from cDNA from Gerbera "Th58" using a PCR-based RACE method with the oligos "GSP7", “GSP8", “GSP9” and “AAP” (GIBCO-BRL) or " backrace "isolated.
  • pCYPFNSI a 1589 bp fragment with an open reading frame was isolated by PCR using the oligo's "CypFNSI H” and "CypFNSI R". CDNA from Gerbera "Th58" was used as template.
  • FIGURES 6 and 7 are representations of the nucleic acid and the amino acid sequence of the complete clone derived therefrom. The start codon and the various stop codons are marked separately.
  • FIGURE 8 shows a diagram of the existing restriction site for standard restriction enzymes.
  • FIGURE 9 shows an FNS II test with yeast microsomes.
  • [ 14 C] Naringenin was used as substrate.
  • Microsomes were prepared from transformed (INVSd - CypFNSI) and untransformed yeast (INVSc 1).
  • the autoradiogram shows the conversion of [ 1 C] naringenin to the corresponding fiavon, the [ 1 C] apigenin, with an extract of the transformed yeast (INVSc 1 - CypFNSI). No activity was measured in the control experiment (INVSc 1).
  • the product was identified in four different eluents by co-chromatography with authentic apigenin.
  • FIGURE 10 shows an autoradiography of an RNA gel blot that was hybridized with a 32 P-labeled cDNA of the insert CypFNSI.
  • Each lane contains 20 ⁇ g total RNA, which was applied as follows: ⁇ 1 ⁇ Simm (genotype fns + .), ⁇ 2 ⁇ Delphi (fns ⁇ ), ⁇ 3 ⁇ T3 (fns fns), ⁇ 4 ⁇ 147-150 ( fns + .), ⁇ 5 ⁇ Clivia (fns fns), ⁇ 6 ⁇ 147-146 (fns fns), ⁇ 7 ⁇ Regina (fns + .), ⁇ 8 ⁇ Gerbera leaves (fns fns), ⁇ 9 ⁇ 10s Pool (fns + .), ⁇ 10 ⁇ pool of 10 (fns fns).
  • EXAMPLE 1 EXAMPLE 1
  • Naringenin, eriodictyol, apigenin and luteolin were obtained from Carl Roth (Karlsruhe, Germany).
  • [ 14 C] Naringenin was derived from [ 1 C] malonyl-CoA (ARC, St. Louis, USA) and p-coumaroyl-CoA (Dr. Werner Heller, GSF, Neuherberg, Germany) according to the method described in Britsch et.al. (1981) described method with partially purified chalcone synthase (CHS) and chalcone isomerase from parsley suspension culture. All other enzymes were obtained from commercial suppliers and used according to their description.
  • the following Escherichia coli strains were used: TOP10F 'and TOP10, both from Invitrogen (Groningen, The Netherlands). The following yeast strain was also used: INVSd (Invitrogen).
  • the cloning vectors pCR2.1 and pYES2 were obtained from Invitrogen.
  • the insert and vector pCR2.1 were ligated and the bacteria were transformed according to the manufacturer's instructions.
  • Plants of gerbera hybrids were cultivated in a greenhouse under normal conditions.
  • the day length was at least 14 hours with a light intensity of 10,000 lux and at 22 ° C.
  • Self-cultivations of the variety "Th58" were carried out within an inflorescence or between the inflorescences of the same plant. This self-experiment can be performed with any variety or line heterozygous for the Fns locus. The corresponding chemogenetic and biochemical methods are described in detail in Tyrach and Hörn (1997) and Martens and Forkmann (1998). Controlled blooming was achieved with glassine bags drawn over the flowers. The pollinations were ideally repeated up to four times a day. Further information on pollination methods and flowering in gerberas can be found in Maurer (1967).
  • Gerbera flowers were harvested at various stages of development, which were defined as follows (according to Martens and Forkmann, 1998):
  • Stage 5 Ligules of the ray flowers pigmented, 23 - 26 mm long.
  • Stage 6 ray flowers 26 - 35 mm long.
  • Stage 7 inflorescence half open, 35 - 40 mm long.
  • Stage 8 inflorescence fully open, 40 - 50 mm long.
  • Stage 9 ray flowers 50 - 55 mm long.
  • Stage 10 ray flowers 55 - 60 mm long.
  • Stage 11 senescent inflorescence, 55 - 60 mm long.
  • Flavonoids Marbry et.al., 1970; Harborne, 1967. Flavones were also detected under UV light (243 nm) before and after vaporization with ammonia. Flavanones were identified by reduction with sodium borohydride and subsequent treatment with hydrochloric acid vapors (Eigen et al., 1957). Thin layer chromatography was carried out on precoated cellulose plates G1440 from Schleicher & Schüll (Dassel, Germany).
  • the standard test for the FNS II contained in a total volume of 200 ⁇ l: 175 ⁇ l Tris-HCl buffer (pH 7.5), 0.3 nmol radioactive labeled substrate (83 Bq; Naringenin), 2.0 nmol unlabeled substrate, 10 ⁇ l 20 mmol / l NADPH and 15 ⁇ l crude extract or microsome preparation. After an incubation of 20 min. at 25 ° C the reaction was stopped by the addition of 20 ul methanol containing a mixture of the corresponding flavonoids. The reaction mixture was extracted twice with 100 or 50 ⁇ l of ethyl acetate. The upper phase was chromatographed on cellulose thin-layer plates in solvent 1 (see above). The radioactivity was localized and quantified using a Fuji BAS 1000 bio-imaging analyzer (Fuji Photo Film Co., Tokyo, Japan) and the TINA software package (Raytest, Straubenhardt, Germany).
  • Fig. 2 shows an example of the results of the enzyme tests with the Gerbera variety "Th 58" and the lines "147-150" and "147-146". The corresponding genotypes can be found in Table 2.
  • Oligonucleotides were synthesized by Metabion (Martinsried, Germany). The following oligonucleotides were used (5 '- 3'):
  • Oligo A 5'- 1 I I I I I I I I I I T (A, C, G) A-3 '(SEQ ID NO: 3)
  • Oligo C 5'- 1 I I I I I I I I I I T (A, C, G) C-3 '(SEQ ID NO: 4)
  • Oligo G 5'- 1 IIIIIIIIIT (A, C, G) G-3 '(SEQ ID NO: 5) decamer 1 5'-CGCCATTTGG-3' (SEQ ID NO: 6) decamer 2 5'-CGCCATTCGG-3 '(SEQ ID NO: 7) Decamer 3 5'-CGCCCTTTGG-3' (SEQ ID NO: 8) Decamer 4 S'-CGCCCTTCGG-S '(SEQ ID NO: 9) Decamer 5 5'-CGCCGTTTGG-3' ( SEQ ID NO: 10) Decamer 6 5'-CGCCGTTCGG-3 '(SEQ ID NO: 11) Decamer 7 5'-CGCCTTTTGG-3' (SEQ ID NO: 12) Decamer 8: 5'-CGCCTTTCGG-3 '(SEQ ID NO: 13) GSP7: S'-ATC ⁇ C AGTGTTTCCTCGTTCC-S' (SEQ ID NO: 14) GSP8: 5'-AATGGAACAC
  • RNA was obtained from gerbera petals of various defined genotypes (fns + . Or fns fns; Tab. 2) of stages 2-4, in which the FNS II activity increased (Fig. 3), according to a study by Giuliano et.al. (1993) isolated method.
  • 1.2 g of plant material frozen in liquid nitrogen was ground into fine powder in a pre-cooled Moser and transferred to a likewise pre-cooled Corex tube.
  • the tissue was placed in 3 ml of extraction buffer consisting of 4 M guanidium thiocyanate, 0.15 M sodium acetate (pH 5.3), 0.2% sodium sacrosinate and 0.7% ß-mercaptoethanol, and 2.4 ml of water-equilibrated phenol (saturated with 0.1 M citrate buffer , pH 4.3, Sigma, Deisenhofen, Germany) homogenized by vigorous vortexing. After the addition of 0.6 ml of chloroform, the well-mixed homogenate was left on ice for 20 min and then centrifuged at 15,000 xg (Sorvall RC-5B plus; SS34).
  • extraction buffer consisting of 4 M guanidium thiocyanate, 0.15 M sodium acetate (pH 5.3), 0.2% sodium sacrosinate and 0.7% ß-mercaptoethanol, and 2.4 ml of water-equilibrated phenol (saturated with 0.1 M citrate buffer , pH 4.3, Sigma, Deisenhofen
  • the removed top phase was mixed with 1 volume of isopropanol and incubated again on ice for 60 min. After centrifugation at 15,000 xg (Sorvall see above) for 30 min, the upper phase was discarded and the pellet was carefully resuspended in sterile H 2 O. To remove the polysaccharides, 100% ethanol (20% (v / v) final concentration) was added to the solution, incubated on ice for 20 min and centrifuged at 10,000 xg and 4 ° C. for 10 min. The supernatant containing the nucleic acids was mixed with 1/3 vol. 8 M lithium chloride.
  • RNA concentration was carried out spectrophotometrically at a wavelength of 260 nm (Pharmacia Biochrome 4060).
  • poly (A) + RNA was also isolated from the total RNA by two cycles of oligo (dT) cellulose chromatography (Sambrook et.al., 1989).
  • RNA 5 ⁇ g total RNA or 500 ng poly (A) + RNA, isolated from the different genotypes or flower stages described above, was in a 25 ⁇ l batch with one of the three oligo (dT) primers using reverse transcriptase (SuperScript TM II, GIBCO BRL, Paisley, UK) rewritten to cDNA. 1 ⁇ l of the respective oligo (dT) primer (1 ⁇ M final) and water up to a volume of 17 ⁇ l were added to the RNA. This approach was then at 70 ° C for 10 min. denatured and then put on ice.
  • reverse transcriptase SuperScript TM II, GIBCO BRL, Paisley, UK
  • the various cDNAs were amplified by means of PCR, a second, non-degenerate, P450-specific primer (decamer 1-8) being used in addition to the oligo (dT) anchor primer.
  • the PCR mixture contained the following components in a total volume of 20 ⁇ l: 6.2 ⁇ l water, 1 ⁇ l 20 ⁇ polymerase buffer, 2.5 mM MgCl 2 , 0.2 ⁇ M dNTP mix, 1 ⁇ l 35 S-ATP [1000 Ci / mmol] (ICN Pharmaceutics, Irvine, USA), 0.5 ⁇ M one of the eight decamer primers, 1 ⁇ M of the oligo (dT) primer corresponding to the cDNA 4 ⁇ l from the cDNA approach described above and 0.2 ⁇ l 5 U / ⁇ l replitherm polymerase (Epicenter, Madison, USA).
  • PCR parameters were used: a denaturation step at 94 ° C. for 10 minutes, then 40 cycles at 94 ° C. for 30 seconds, 40 ° C. (annealing) for 2 minutes. and 72 ° C (extension) for 30 sec. and finally a final extension at 72 ° C for 7 min. 4 ⁇ l of the PCR product were now mixed with 2 ⁇ l formamide loading buffer ⁇ 80% formamide; 10 mM EDTA (pH 8.0), 1 mg / ml Xylencyanol FF and 1 mg / ml bromophenol blue ⁇ provided, mixed, for 2 min. denatured at 95 ° C and then placed directly on ice.
  • the samples prepared in this way were loaded onto a 5% denaturing polyacrylamide gel and separated for 3 hours at a maximum of 40 W.
  • the gel on Whatman paper was then peeled off the glass plate and in fixed in a gel dryer.
  • the radioactivity or differential bands were localized using a Fuji BAS 1000 bio-imaging analyzer (Fuji) and the TINA software package (Raytest). Differently expressed bands in the order of 300 to 500 bp were cut out of the fixed gel with the Whatman paper using a sharp scalpel, transferred to an Eppendorf tube and placed in 100 ⁇ l water for 10 min. rehydrated at room temperature. The tube was then at 100 ° C for 10 min. incubated and 2 min.
  • the cDNA obtained in this way was reamplified in 50 ⁇ l PCR batches which contained the following components: 27.8 ⁇ l water, 2 ⁇ l 20 ⁇ polymerase buffer, 4 ⁇ l 25 mM MgCl 2 , 3.2 ⁇ l 500 ⁇ M dNTP mix, 4 ⁇ l 5 ⁇ M of the corresponding Decamer primer, 4 ⁇ l 25 ⁇ M of the corresponding oligo (dT) primer, 4 ⁇ l from the eluted DNA described above and 0.5 ⁇ l 5 U / ⁇ l Replitherm polymerase (Epicenter).
  • the PCR parameters correspond to those of the first amplification.
  • PCR products were separated using a 1.5% agarose gel and the corresponding amplificates were cloned into the TOPO pCR2.1 vector and then transformed into TOPO 10F 'one-shot competent cells (Invitrogen) according to the manufacturer's instructions. Plasmid isolation from transformed bacteria identified via blue-white screening was carried out using the plasmid Miniprep - Quantum Prep - Kit (Bio-Rad, Kunststoff, Germany) according to the manufacturer's instructions.
  • Denatured herring sperm DNA 100 ⁇ g / ml was added to the hybridization step together with the 32 P-labeled sample.
  • the filters were washed twice for 15 minutes. washed at 42 ° C with 2 x SSPE, 1% SDS (w / v) and then once or twice at 65 ° C with 1 x SSPE, 1% SDS (w / v).
  • the cDNA clone pDDd7a does not correspond to a full-length clone, but only the area from the heme binding site to the poly (A + ) end (3 'end) of the sequence, including several stop codons. To get the full clone of pDDd7a, one was
  • GSP7-9 gene-specific 5'-RACE primers
  • the First Strand product was then cleaned of excess nucleotides and GSP7 using the High Pure PCR Product Purification Kit (Boehringer Mannheim) according to the manufacturer's instructions.
  • the purified cDNA was provided with an oligo-dC tail by the terminal transferase (TdT).
  • the tailing approach was as follows: 6.5 ul water, 5.0 ul 5 x tailing buffer, 2.5 ul 2 mM dCTP and 10 ul cDNA. This mix was for 3 min. denatured at 94 ° C and then for 1 min. put on ice. The reaction was started by adding 1 ⁇ l of TdT and then for 10 min.
  • the PCR approach consisted of the following components: 31.5 ⁇ l water, 5.0 ⁇ l 10 ⁇ PCR buffer, 3.0 ⁇ l 25 mM MgCl 2 , 1.0 ⁇ l 10 mM dNTP, 2.0 ⁇ l 10 ⁇ M GSP8, 2.0 ⁇ l 10 ⁇ M AAP, 5.0 ⁇ l dC -tailed cDNA and 0.5 ⁇ l 5 U / ⁇ l Taqf DNA polymerase (Promega, Madison, USA). 15 ⁇ l of the ⁇ '-RACE product were analyzed on a 1.5% agarose gel using suitable length standards. Specific individual bands in the range of approximately 1.5 kb were cloned in and verified by Northern blot or sequence analysis.
  • the yeast strain INVSc 1 was plasmid pYeCYPFNSI in accordance with the Gietz et.al. (1992). Transformed yeast cells were selected using a complementation marker.
  • the yeast cells were harvested by centrifugation, once with TEK ⁇ 50 mM Tris-HCl pH 7.4, 1 mM EDTA and 0.1 M KCI ⁇ washed and resuspended in TES-B * ⁇ 50mM Tris-HCl pH 7.4, 1mM EDTA, 0.6mM sorbitol and 2mM DTT ⁇ .
  • the yeasts were digested at 4 ° C. with 15 g of glass beads (Sigma) per batch.
  • the glass beads were then washed three times with 5 ml of TES-B * and the combined supernatant was adjusted to a final concentration of 0.15 M with 4 M NaCl.
  • the microsomes were precipitated by the addition of 2.5 g PEG-4000 (Fluka) and after a washing step with 2 ml TES-B * in a Potter in 2.5 ml TEG * ⁇ 50 mM Tris-HCl pH 7.4, 1 mM EDTA, 2 mM DTT ⁇ homogenized.
  • the homogenate obtained served as a microsomal enzyme source for the FNS II tests.
  • FNS II activity was measured using the method of Martens and Forkmann (1998).
  • the standard test for flavone synthase II contained in a total volume of 200 ⁇ l: 140 ⁇ l Tris-HCl buffer (pH 7.5), 0.3 nmol radioactive labeled substrate (83 Bq; [ 14C ] naringenin), 10 ⁇ l 20 mmol / l NADPH and 50 ⁇ l the yeast microsome preparation. After an incubation of 20 min. at 25 ° C the reaction was stopped by the addition of 20 ul methanol containing a mixture of naringenin and apigenin (product). The reaction mixture was extracted twice with 100 or 50 ⁇ l of ethyl acetate.
  • the upper phase was carried out on cellulose thin-layer plates in solvent 1 to 4 (see above) chromatographed.
  • the radioactivity was localized and quantified using a Fuji BAS 1000 bio-imaging analyzer (Fuji) and the TINA software package (Raytest).
  • the enzyme extract which was prepared from INVSc 1 / pYeCYPFNS1, shows a clear FNS II activity, whereas the corresponding fraction from untransformed yeasts showed no activity (Fig. 9).
  • the results of the yeast expression confirm that the cDNA insert pCYPFNSI codes for an FNS II enzyme. Furthermore, the result shows that the expression of the enzyme which is encoded by the Gerbera cDNA clone in yeast is sufficient to achieve the direct formation of flavones.
  • GIETZ D., ST. JEAN, A., WOODS, R.A. and SCHIESTL, R.H., 1992. Improved method for high efficiency transformation of intact yeast cells. Nucleic Acids Res. 20, 1425.
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Abstract

Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf genetische Sequenzen, die für Enzyme des Flavonoidstoffwechsels kodieren, speziell für die Flavonsynthase II (FNS II) oder Derivate hiervon und deren Verwendung zur gezielten Veränderung der Blütenfarbe, zur Veränderung des Flavongehaltes bzw. -musters in Blättern, Blüten und anderen Geweben von Pflanzen und anderen Organismen und darüberhinaus die Verwendung in Expressionssystemen zur Synthese von natürlichen, funktionellen Flavonen für medizinische oder ähnliche Anwendungen, z.B. zur Krebstherapie oder Verbesserung der menschlichen Immunabwehr.

Description

GENETISCHE SEQUENZ, DIE FÜR FLAVONSYNTHASE II ENZYME KODIERT, UND DEREN VERWENDUNG
Die vorliegende Erfindung betrifft genetische Sequenzen, die für Enzyme des Flavonoid- stoffwechsels kodieren, speziell für die Flavonsynthase II (FNS II) oder Derivate hiervon und deren Verwendung zur gezielten Veränderung der Blütenfarbe, zur Veränderung des Flavongehaltes bzw. -musters in Blättern, Blüten und anderen Geweben von Pflanzen und anderen Organismen und darüberhinaus die Verwendung in Expressionssystemen zur Synthese von natürlichen, funktioneilen Flavonen für medizinische oder ähnliche Anwendungen, z.B. zur Krebstherapie oder Verbesserung der menschlichen Immunabwehr.
Flavonoide und deren Funktion in der Pflanze
Flavonoide sind die wichtigsten und am weitesten verbreiteten Pflanzenpigmente, die in verschiedenen Geweben, wie z.B. Blüten, Blättern oder Wurzeln nachgewiesen wurden. Darüber hinaus gehören sie zu den am besten charakterisierten sekundären Metaboliten in Pflanzen. Mehr als 3000 verschiedene Flavonoide sind bislang charakterisiert worden. Sie sind in verschiedene Unterklassen (z.B. Flavone, Flavonole oder Anthocyane), basierend auf dem Grad der Oxidation des zentralen C-Ringes, eingeteilt worden. Jeder Typ kann darüberhinaus durch Hydroxylierung, Acylierung und Glykosylierung modifiziert werden (Heller und Forkmann, 1994). Aufgrund der unterschiedlichen physikalischchemischen Eigenschaften der Moleküle besitzen die Unterklassen zum Teil sehr verschiedene biologische Funktionen.
Die Akkumulation bestimmter Flavonoide in einer Pflanzenzelle ist abhängig von der Verfügbarkeit der jeweiligen Enzyme, wobei die Verfügbarkeit der Enzyme letztendlich von der Expression des entsprechenden Gens abhängt. Die Regulierung der Expression von Flavonoidbiosynthese-Genen wird im wesentlichen von der Pflanzenart, dem Entwicklungsstadium und den Umweltbedingungen bestimmt.
Flavonoide spielen sowohl innerhalb als auch außerhalb der Pflanze eine wichtige Rolle. So wurde z.B. gezeigt, daß bestimmte Flavonole für das Pollenschlauchwachstum erforderlich sind. Wird die Akkumulation der Flavonole durch eine Blockierung des Biosyntheseweges unterdrückt, erhält man sterile Pollen (Taylor and Jorgensen, 1992). Sowohl biotische als auch abiotische Signale können während der Interaktion der Pflanze mit ihrer Umwelt zu einer Flavonoidakkumulation führen. So führt z.B. eine UV- Bestrahlung zu einer Akkumulation von Flavonolen und Flavonen. Dies wird durch die Induktion der Transkription der jeweiligen Flavonoidbiosynthese-Gene in verschiedenen Arten erreicht (Kubasek et.al., 1992). Aber auch andere Streßfaktoren wie Verwundung, extreme Temperaturschwankungen und Wasserstreß können die Flavonoidakkumulation und/oder Genexpression in verschiedenen Arten induzieren (Hrazdina, 1982). Bei der Interaktion von Pflanzen mit anderen Organismen wird den Flavonoiden eine doppelte Funktion zugeordnet. Zum einen besitzen die Flavonoide als phenolische Verbindungen eine Wirkung als Phytoalexin gegen verschiedene Pathogene und als Abschreckung gegen Fraßfeinde (Harborne und Grayer, 1994), zum anderen sind sie verantwortlich für die Kommunikation zwischen Pflanzen aus der Familie der Leguminosen und bestimmten Mikroorganismen. Flavonoide dienen hierbei als Signalstoffe für Stickstoff-fixierende Bakterien, in denen daraufhin Gene exprimiert werden, die für die Symbiose mit der Pflanze erforderlich sind (Redmond et.al., 1986). In Blüten, Blättern und Früchten sind Flavonoide, besonders die farbigen Anthocyane, aber auch Chalkone, Aurone, Flavone und Flavonole, für die Farbgebung und für die Muster der verschiedenen sekundären Inhaltsstoffe verantwortlich. Letzteres ist zusammen mit anderen Merkmalen, wie z.B. dem Duft, wichtig für die Erkennung durch verschiedene Tiere, aber auch für den Menschen, der die Pflanze als Schmuck oder zur Ernährung verwendet (Harborne und Grayer, 1994). Außerdem beeinflussen bestimmte Flavonoide, wie z.B. das Fiavon Apigenin und das Flavonol Quercetin, den Auxin Transport innerhalb der Pflanze (Jacobs und Rubery, 1988).
Der Flavonoidbiosynthese-Weq (Abb. 1A)
Die Struktur der Flavonoide besteht aus zwei aromatischen Ringen (A und B) und einem zentralen Heterozyklus (C) (Abb. 1 B). In der Pflanze werden sie ausgehend vom L- Phenylalanin über den Phenylpropanoid-Weg durch die enzymatische Reaktion der Phenylalanin-Ammonia-Lyase (PAL) und der Zimtsäure-4-Hydroxylase (4CL) gebildet. Aus dem hieraus resultierenden 4-Cumaroyl-CoA entsteht zusammen mit 3 Molekülen Malonyl- CoA Tetrahydroxychalkon. Diese Reaktion wird durch die Chalkonsynthase (CHS), dem Schlüsselenzym der Flavonoidbiosynthese, synthetisiert (Abb. 1A). Das Tetrahydroxychalkon (THC) wird normalerweise schnell zu Naringenin (NAR) durch das Enzym Chalkoniso- merase (CHI) isomerisiert. In verschiedenen weiteren Reaktionen entstehen die Anthocyane. Flavone werden auf einem Nebenweg durch die FNS I oder die FNS II, einem Cytochrom P450-Enzym, gebildet. Diese Enzymklasse ist in der Natur weit verbreitet und verschiedene Gene für Cytochrome P450 Enzyme wurden aus Vertebraten, Insekten, Hefen, Pilzen, Bakterien und Pflanzen isoliert und sequenziert.
Die Flavonsynthase verwendet verschiedene Flavanone, wie z.B. NAR oder Eriodictyol (ERI) als Substrat, um die entsprechenden Flavone Apigenin (Ap) und Luteolin (Lu) zu synthetisieren. Dabei wird, wie in Abbildung 1 B dargestellt, zwischen der C2- und der C3- Position eine Doppelbindung eingefügt. Flavone können in der Pflanze in glykolysierter oder auch methylierter Form vorliegen.
In vitro wurde die Bildung von Flavonen aus Flavanonen zuerst mit Enzympräparationen von UV-bestrahlten Petroselium crispt-zm-Zellsuspensionskulturen beobachtet. Bei dem entsprechenden Enzym handelt es sich um eine lösliche 2-Oxoglutarat-abhängige Dioxygenase, die Flavonsynthase I (FNS I) genannt wurde. In den Blüten von verschiedenen Flavon-produzierenden Pflanzen, z.B. Sinningia cardinalis, Antirrhinum majus, Verbena Hybrida, Columnea hybrida, Chrysanthemum morifolium, Gerbera Hybriden und osmotisch induzierten Glycine max-Zellsuspensionskulturen, wird diese Reaktion jedoch von der oben bereits erwähnten FNS II katalysiert, einem NADPH- abhängigen, mikrosomalen Enzym, das zur Klasse der Cytochrom P450 gehört (Heller und Forkmann, 1994). In den Blüten von Gerbera Hybriden kontrolliert der Locus Fns die Bildung der Flavone. Eine Synthese von Flavonen kann nur in Linien mit dominantem Allel nachgewiesen werden, in homozygot rezessiven Linien ist keine FNS Il-Aktivität nachweisbar (Abb. 2; Martens und Forkmann, 1998).
Drei Typen von Pigmenten sind für die Farben in Blüten verantwortlich: Betalaine, Caro- tinoide und Flavonoide. Betalaine kommen nur in einigen wenigen Familien der
Centrospermae vor, wo sie für gelbe, orange, rote und violette Farben verantwortlich sind.
Carotinoide ergeben orange oder gelbe Töne und sind die Hauptpigmente in den meisten orangen und gelben Blüten. Flavonoide sind die wichtigsten und am weitesten verbreiteten
Blüten- bzw. Pflanzenpigmente. Zu dieser Gruppe gehören die farbgebenden Anthocyane, die glykosyliert und oft acyliert in der Vakuole vorliegen. Unterschiedliche Anthocyane können dabei verschiedene Farbtöne produzieren. Die Blütenfarbe wird darüber hinaus auch vom pH-Wert der Vakuole, der Komplexierung mit Metallen und dem
Glykosylierungs- bzw. Acylierungsmuster beeinflußt (Forkmann, 1991). Ein weiterer wichtiger Faktor für die Entstehung von verschiedenen Blütenfarben ist die Kopigmentierung der Anthocyane mit farblosen Flavonoiden, wie z.B. Flavonen oder
Flavonolen oder auch Tanninen (Scott-Moncrieff, 1936). Anthocyane, die mit Flavonen kopigmentiert sind, können verschiedene Farben annehmen, die von der Grundstruktur des Anthocyan abhängen, und zwischen purpurrot und blau variieren können (Äsen und Horowitz, 1974; Goto und Kondo, 1991). Verschiedene Flavone, wie z.B. das Isoetin, sind darüber hinaus auch als gelbe Blütenpigmente identifiziert worden (Harborne, 1978).
Ein wichtiges Ziel in der gartenbaulichen Pflanzenzüchtung ist die Entwicklung von neuen Sorten bei blühenden Zierpflanzen. Klassische Züchtungsmethoden wurden in der Vergangenheit teilweise erfolgreich zur Etablierung für eine Reihe von verschiedenen Farben bei vielen wirtschaftlich wichtigen Zierpflanzen eingesetzt. Jedoch schränkt der Genpool der einzelnen Arten die Möglichkeiten für solche Ansätze auf natürliche Art und Weise ein. Aus diesem Grund gibt es bis heute nur wenige Arten, die das gesamte Farbspektrum besitzen. Außerdem kann durch die klassischen Züchtungsmethoden keine präzise Veränderung erzielt werden. Da der ästhetische Wert einer Blüte von verschiedenen Faktoren wie z.B. Form, Duft und Farbe bestimmt wird und eine Veränderung eines dieser Faktoren durch Kreuzung in der Regel nur auf Kosten von ähnlichen, anderen sichtbaren Merkmalen erzielt oder nur mit sehr hohem zeitlichen und finanziellen Aufwand erreicht werden kann, muß ein effektiverer Weg zu neuen Sorten genutzt werden. Die Möglichkeit, gezielt Blütenfarben von Pflanzen zu verändern, bringt eindeutige Vorteile gegenüber anderen Methoden. Dies ist besonders in einem Bereich wichtig, der einen hohen Produkt-Turnover besitzt und wo Neuheit ein wichtiger Marktfaktor ist. Zum Beispiel würde die Entwicklung von blaublühenden Sorten bei den Hauptschnittblumen-Arten wie Rosen, Chrysanthemen, Nelken, Lilien, Tulpen und Gerbera einen wesentlichen Marktvorteil auf dem Schnittblumenmarkt, aber auch auf dem Topfpflanzenmarkt mit sich bringen. Die Möglichkeit der Kontrolle der Synthese von Kopigmenten, z.B. Flavone, in Pflanzen ist eine nützliche Anwendung bei der gezielten Veränderung der Blütenfarben. Außerdem kann diese Anwendung neben den Blüten auch auf Früchte und andere Nutzpflanzen, z.B. auf Obst- und Gemüsepflanzen, und auf Blätter, z.B. bei Zierpflanzen, übertragen werden.
Neben ihrem Beitrag zur Blütenfarbe besitzen die Flavonoide, speziell die Flavone, noch weitere biologische Eigenschaften und Wirkungen. Sie wurden z.B. bei einigen Pflanzen als Fraßstimulanz für monophage und oligophage Insekten gefunden (Harborne und Grayer, 1994). In den meisten Fällen zeigen die Glykoside dabei eine bei weitem größere Wirkung als die entsprechenden Aglyka, was vermutlich auf die bessere Löslichkeit der Glykoside zurückzuführen ist. Außerdem können die Insekten zwischen verschiedenen Zuckerresten unterscheiden, wodurch eine weitere Differenzierung der aktiven Komponenten gegeben ist. Auch die Grundstruktur der Aglyka kann zu unterschiedlichen Wirkungen führen. Im Vergleich zu vielen anderen sekundären Pflanzeninhaltsstoffen haben die Flavonoide bzw. die Flavone offensichtlich keine sehr toxische Wirkung auf Insekten. Trotzdem gibt es einige Flavone, die schon bei geringen Konzentrationen als Abschreckung für Fraßinsekten fungieren oder das Wachstum der Tiere erheblich hemmen können. Ein Einfluß der Glykosylierungsart konnte hier nicht gezeigt werden, wohl aber der der Hydroxylierung bzw. Methoxylierung des Flavons (Harborne und Grayer, 1994).
Verschiedene Flavone stimulieren darüber hinaus auch Schmetterlinge zur Eiablage auf bestimmten Pflanzen. Es wurde gezeigt, daß die Tiere erst nach dem Erkennen des Stimulus ihre Eier ablegen. Zu solchen stimulierenden Substanzen gehören z.B. die Flavone Vicenin-2 und verschiedene Luteolin-Derivate. Unterbindet man die Synthese dieser Stoffe in den jeweiligen Wirtspflanzen, können Eiablagen der Schmetterlinge und damit Fraßschäden durch deren Raupen verhindert werden.
Durch die Ausnutzung natürlicher chemischer Abwehrmechanismen der Pflanzen können Probleme, die die Verwendung von synthetischen Insektiziden mit sich bringt, wie z.B. die Umweltbelastung, die durch Reste der eingesetzten .Stoffe in der Frucht und im Boden auftreten, vermieden werden. Außerdem wird eine Resistenzbildung, wie sie bei den meisten synthetischen Pestiziden beobachtet wird, umgangen oder zumindestens verzögert und es werden die zum Teil erheblichen Kosten für Mittel und Ausbringung eingespart.
Eine weitere wichtige biologische Eigenschaft der Flavonoide betrifft die Aktivierung der Nodulationsgene in verschiedenen Rhizobium-Arten. Diese Bakterien infizieren Leguminosen und bilden Stickstoff-fixierende Wurzelknöllchen. Die von der Wirtspflanze produzierten Flavonoide fungieren dabei als "Signalstoff', wodurch die Bakterien den Infektionsprozeß einleiten. Zu diesen pflanzenspezifischen, aktiven Verbindungen gehören auch verschiedene Flavone, wie z.B. Apigenin, Luteolin und 7,4'-Dihydroxyflavon (Firmin et.al., 1986; Redmond etal., 1986). Wird die Flavonproduktion und deren Abgabe durch die Wurzel bzw. das Flavonmuster in diesem Gewebe verändert, kann eine Verbesserung der Stickstoff-Fixierung oder aber eventuell eine Etablierung dieses Mechanismus bei nicht Leguminosen Pflanzen erreicht werden. Durch Ausnutzung dieser natürlichen Symbiosemechanismen kann die Stickstoff-Düngung und damit die Belastung der Umwelt durch die Auswaschung der Nährstoffe reduziert werden. Zudem werden Kosten für die Düngermittel und deren Ausbringung eingespart.
Innerhalb der Pflanze beeinflussen verschiedene natürlich vorkommende Flavonoide, wie z.B. das Fiavon Apigenin oder die Flavonole Kaempferol und Quercetin, den Auxin-Trans- port in unterschiedlichen Pflanzengeweben und Transportsystemen. Sie verhalten sich dabei ähnlich wie synthetische Transportinhibitoren. Auxine beeinflussen als pflanzeneigene Wachstumsregulatoren die Zellstreckung, Zellteilung, Apikaidominanz, Wurzel- und Sproßneubildung sowie die Parthenokaφie. Eine induzierte, veränderte Flavonoidkonzentration (endogene Veränderung und/oder exogene Applikation) kann somit über die Interaktion mit Auxinen das Wachstum von Pflanzen erheblich beeinflussen. Dadurch können synthetische Wuchshemmstoffe ersetzt werden.
Flavonoide besitzen als bioaktive Substanzen darüber hinaus auch eine nicht unbedeutende Rolle bei der menschlichen und tierischen Ernährung. Sie kommen in Früchten, Gemüsen, Nüssen, Samen, Stengeln, aber auch in Tee und Wein vor. Schon seit längerem werden den Flavonoiden, auch verschiedenen Flavonen, antiallergische, entzündungshemmende, antivirale, proliferationsreduzierende und anticanzerogene Eigenschaften zugesprochen. Aber auch ein Einfluß auf den menschlichen und tierischen Stoffwechsel und das hochkomplexe Immunsystem wird beschrieben. Die Flavonoide bzw. Flavone beeinflussen in diesem Zusammenhang eine große Anzahl verschiedener Enzyme (z.B. die Hyaluronidase- oder Aldose-Reduktase), sie besitzen wichtige, enzyminduzierende und antioxidative Eigenschaften, können freie Radikale abfangen, chelatieren verschiedene Metallkationen und beeinflussen auch die zelluläre Proteinphosphorylierung (Middleton und Kandaswami, 1994).
Die Verbesserung von Nutzpflanzen, die für die Ernährung von Mensch und Tier aufgrund ihres Gehalts an gesundheitsfördernden Flavonoiden wichtig sind, durch die gezielte Veränderung des Gehalts oder Musters der entsprechenden Verbindungen, leistet einen erheblichen Beitrag zur gesunden Ernährung von Mensch und Tier.
Es war daher eine Aufgabe der vorliegenden Erfindung, Mittel und Verfahren bereitzustellen, um gezielt die Flavonoidbiosynthese bzw. die Bildung von Flavonen in Pflanzen zu verändern und zu steuern, um z.B. die Blütenfarbe einer Pflanze zu verändern oder die Resistenzeigenschaften und Symbiosefähigkeit einer Pflanze zu verbessern. Weiterhin war eine Aufgabe der vorliegenden Erfindung, Mittel und Verfahren bereitzustellen, die zur gezielten Synthese von definierten Flavonen verwendet werden können. Derartig gewonnene Flavone können unter anderem bei der Krebstherapie Verwendung finden oder in Form von Medikamenten zur Gesundheit von Mensch und Tier beitragen.
Diese Aufgabe wird erfindungsgemäß durch die Patentansprüche gelöst.
Die Erfindung betrifft daher eine Nukleinsäuresequenz, die für eine Flavonsynthase II (FNS II) kodiert. In einer Ausführungsform betrifft die Erfindung eine in SEQ ID NO:1 gezeigte Nukleinsäuresequenz oder einen Teil hiervon. In einer weiteren Ausführungsform betrifft die Erfindung eine Nukleinsäuresequenz, die mit der in SEQ ID NO:1 gezeigten Nukleinsäuresequenz oder einem Teil hiervon hybridisiert und/oder mindestens eine 40%ige, besser eine mindestens 45%'ιge, noch besser eine mindestens 55%ige oder am besten mindestens eine 65-70%ige Homologie oder am besten eine Homologie größer als 85% auf der Ebene der Nukleinsäuresequenz oder Aminosäuresequenz zu mindestens einem oder mehreren Bereichen (bevorzugt über den ganzen Bereich) der in SEQ ID NO:1 dargestellten Sequenz besitzt. Bevorzugt kodiert die Nukleinsäuresequenz ein Protein oder Polypeptid mit der biologischen Aktivität einer Flavonsynthase. In einer weiteren Ausführungsform betrifft die Erfindung eine Nukleinsäuresequenz, die degeneriert ist bezogen auf eine Nukleinsäuresequenz gemäß der vorhergehenden Ausführungsformen. In einer bevorzugten Ausführungsform ist die erfindungsgemäße Nukleinsäuresequenz DNA oder RNA und ist abgeleitet aus einer flavonhaltigen Pflanze, wie z.B. aus Gerbera (Gerbera Hybriden), Aster (Callistephus chinensis), Löwenmäulchen (Antirrhinum majus), Chrysantheme (Chrysanthemum indicum), Dahlie (Dahlia Hybriden), Gloxinie (Sinningia Hybriden), Verbene (Verbena Hybriden) und Streptocarpus (S. Hybriden). In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform ist die erfindungsgemäße Nukleinsäuresequenz eine rekombinante Nukleinsäuresequenz. Des weiteren betrifft die Erfindung eine Nukleinsäuresequenz, die zu der Flavonsynthase II (FNS ll)-kodierenden Sequenz komplementär ist.
Folglich stellt die vorliegende Erfindung eine isolierte Nukleinsäure zur Verfügung, die eine für Flavonsynthase II (FNS II) oder für ein funktionelles Derivat dieses Enzyms kodierende
Nukleinsäure oder eine komplementäre Nukleinsäure umfaßt. Mit dem Begriff "FNS II Enzym" sind Enzyme des Flavonoidbiosyntheseweges gemeint, die Flavanone wie Narin- genin und Eriodictyol oder auch andere Verbindungen aus dieser Klasse als Substrat für die Synthese der entsprechenden Flavone verwenden.
Bevorzugt ist eine erfindungsgemäße Nukleinsäure, die aus dem natürlichen Umfeld isoliert oder chemisch synthetisiert wurde. Insbesondere bevorzugt sind Nukleinsäuremoleküle, die in vitro gebildet oder erhalten werden, einschließlich genomischer DNA-Fragmente, rekombinanter und synthetischer Moleküle und Nukleinsäuren in Kombination mit heterologen Nukleinsäuren. Dies umfaßt auch genomische DNA oder cDNA oder Teile davon, die die FNS II oder Teile davon in reverser Orientierung zum entsprechenden oder einem anderen Promotor kodieren. Weiter eingeschlossen sind natürlich vorkommende, nahe verwandte Nukleinsäuresequenzen.
Der Begriff "Nukleinsäuresequenz, kodierend eine Flavonsynthase II", wird hierbei in der allgemeinsten Form gebraucht und umfaßt jede aufeinanderfolgende Reihe von Nukleotid- basen, die direkt oder über eine komplementäre Reihe von Basen eine Aminosäuresequenz einer FNS II bestimmt.
Ein Polypeptid mit einem Teil oder der gesamten Aminosäuresequenz der Flavonsynthase II meint eine vollständige (füll length) FNS II oder eine aktive, unvollständige Form derselben.
In einer weiteren Ausführungsform betrifft die Erfindung Oligonukleotide, die als genetische Proben oder als "Antisense"-Moleküle zur Regulierung der Expression des entsprechenden Gens in Pflanzen oder anderen Organismen verwendet werden können. Ein "Antisense-Molekül", wie es hier beschrieben ist, umfaßt auch ein Genkonstrukt, das aus einem strukturellen, genomischen oder einem cDNA-Gen oder einem Teil hiervon in reverser Orientierung in Bezug auf seinen oder einen anderen Promotor besteht.
In einer weiteren Ausführungsform wird die Nukleinsäuresequenz, die für die FNS II oder für verschiedene funktionelle Derivate dieser kodiert, zur Reduzierung der Aktivität von endogener FNS II verwendet, oder alternativ wird eine Nukleinsäuresequenz, die dieses Enzym oder verschiedene Derivate oder Teile davon kodiert, in Antisense-Orientierung verwendet, um die Aktivität der FNS II zu reduzieren. Darüber hinaus ist es aber auch möglich, daß ein Antisense-Transkript der FNS II oder ein Fragment oder ein Teil der FNS II (z.B. ein Oligonukleotid-Molekül) eine Duplex mit allen oder Teilen der natürlich vorkommenden mRNA, die das Enzym spezifiziert, eingeht und so eine Akkumulation von oder die Translation der mRNA in das aktive Enzym verhindert. Eine weitere Möglichkeit ist die Verwendung von Ribozymen, um spezielle Nukleinsäuresequenzen zu inaktivieren.
Hier erwähnte Änderungen der FNS Il-Aktivität betreffen eine Erhöhung oder Reduzierung der Aktivität von bis zu 30% oder besser von 30 bis 50% oder noch besser 50 bis 75% bzw. am besten von 75% oder noch höher bzw. niedriger zum normalen, endogenen oder existierenden Wert der Aktivität. Die Höhe der Aktivität kann leicht mit der bei Martens und Forkmann (1998) beschriebenen Methode getestet werden (siehe Beispiel 3).
Bei der in dieser Erfindung beschriebenen Nukleinsäure kann es sich auch um eine Ribonukleinsäure oder eine Desoxyribonukleinsäure handeln, die als einzelsträngiges oder doppelsträngiges und lineares oder kovalent kreisförmig geschlossenes Molekül vorliegen kann. Üblicherweise liegt das Nukleinsäuremoiekül als cDNA vor. Die vorliegende Erfindung umfaßt auch andere Nukleinsäuremoleküle, die unter niedrig-, besser unter mittel- und am besten unter hoch-stringenten Bedingungen mit erfindungsgemäßen Nukleinsäuremolekülen oder speziell mit der in SEQ ID NO:1 dargestellten Sequenz oder einem Teil oder einem Bereich davon hybridisieren. Eine besonders bevorzugte Ausführungsform betrifft ein Nukleinsäuremoiekül, umfassend die in SEQ ID NO:1 dargestellte Nukleinsäuresequenz oder ein Molekül, das mindestens eine 40%ige, besser eine mindestens 45%ige, noch besser eine mindestens 55%ige oder am besten mindestens eine 65-70%ige oder am besten eine Ähnlichkeit höher als 85% auf der Ebene der Nukleinsäuresequenz oder Aminosäuresequenz zu mindestens einem oder mehreren Bereichen (bevorzugt über den ganzen Bereich) der in SEQ ID NO:1 dargestellten Sequenz besitzt und wobei die Nukleinsäure kodierend oder komplementär zu einer Sequenz ist, die ein Enzym kodiert, das FNS Il-Aktivität besitzt.
Die vorliegende Erfindung umfaßt weiter Nukleinsäuremoleküle in der Form von Oligo- nukleotid-Primem oder kompetente Proben zur Hybridisierung mit einem Teil der oben betrachteten Nukleinsäuremoleküle und spezielle mit dem in SEQ ID NO:1 dargestellten. Die Hybridisierung kann unter niedrig-, besser unter mittel- und am besten unter hoch- stringenten Bedingung erfolgen. Bevorzugterweise entspricht der Teil dem 5'- oder 3'- Ende des Gens. Aus Zweckmäßigkeit wird das 5'-Ende hier definiert als der Bereich hauptsächlich zwischen dem Startcodon der strukturellen, genetischen Sequenz bis zum mittleren Bereich des Gens. Das 3'-Ende wird hier betrachtet als der Bereich, der die strukturelle genetische Sequenz zwischen dem mittleren Bereich des Gens und dem Stopcodon definiert. Es ist daher klar, daß Oligonukleotide oder Proben mit dem 5'-Ende oder dem 3'-Ende oder mit einem Bereich gemeinsam zu beiden, dem 5'- oder 3'-Ende, hybridisieren können. Die vorliegende Erfindung umfaßt alle solche Proben. Bevorzugte Oligonukleotide sind in Beispiel 4 dargestellt.
Die Nukleinsäure oder ihre komplementäre Form kann das vollständige Enzym oder einen Teil oder ein Derivat kodieren. Mit "Derivat" ist eine einzelne oder multiple Aminosäuresubstitution, -deletion und/oder -addition in Bezug zum natürlich vorkommenden Enzym gemeint, wobei vorzugsweise die Flavonsynthase Il-Aktivität erhalten bleibt. In diesem Zusammenhang umfaßt die erfindungsgemäße Nukleinsäure die natürlich vorkommende Nukleotidsequenz, die für die FNS II kodiert und einzelne oder multiple Nukleotidsubstitutionen, -deletionen und/oder -additionen. Die Nukleinsäure der vorliegenden Erfindung oder ihre komplementäre Form kann auch einen Teil der FNS II kodieren, entweder aktiv oder inaktiv. Solch ein Nukleinsäuremoiekül kann als Oligonukleotid-Probe, als Primer für die Polymerasekettenreaktion, in verschiedenen mutagenen Techniken oder zur Erstellung von Antisense-Molekülen verwendet werden.
Die Erfindung betrifft weiterhin ein rekombinantes DNA-Molekül, enthaltend eine erfindungsgemäße Nukleinsäuresequenz. In einer bevorzugten Ausführungsform ist das rekombinante DNA-Molekül ein Vektor oder ein Vektor mit einem Promotor. In einer besonders bevorzugten Ausführungsform ist der Promotor zur Expression der erfindungsgemäßen Nukleinsäure fähig. Die erfindungsgemäßen Nukleinsäuremoleküle können in einer von beiden Orientierungen in Kombination mit einem Vektormolekül, z.B. einem Expressionsvektor, vorliegen. Der Begriff "Vektormolekül" wird dabei in seiner allgemeinsten Bedeutung verwendet, um jegliche intermediären Vehikel für das Nukleinsäuremoiekül einzuschließen, die es z.B. ermöglichen, die Nukleinsäure in Zellen, insbesondere Pflanzenzellen, zu transferieren und/oder sie in ein Genom zu integrieren. Bevorzugt werden diese Vektormoleküle oder Teile davon zur Integration in ein Pflanzengenom verwendet. Solche Vektormoleküle können in prokaryotischen Zellen und/oder in eukaryotischen Zellen repliziert und/oder exprimiert werden. Ein intermediäres Vehikel kann z.B. für den Gebrauch bei der Elektroporation, beim Mikroprojektilbeschuß, beim Transfer mit Hilfe von Agrobakterien oder bei der Insertion über DNA- oder RNA- Viren angepaßt sein. Das intermediäre Vehikel und/oder das darin enthaltene Nukleinsäuremoiekül kann stabil im Pflanzengenom integriert werden. Das Nukleinsäuremoiekül kann zusätzlich auch noch eine Promotor-Sequenz beinhalten, die zur Einleitung der Expression des Nukleinsäuremoleküls in einer Zelle, insbesondere einer Pflanzenzelle, geeignet ist. Das Nukleinsäuremoiekül und der Promotor können ebenfalls durch verschiedene Verfahren (siehe oben) in die Zelle eingeführt werden.
Die Erfindung betrifft auch Wirtszellen, die diese erfindungsgemäßen DNA-Moleküle enthalten. Die Wirtszellen können prokaryotische oder eukaryotische Zellen sein, insbesondere Hefezellen, Insektenzellen, Pflanzenzellen und Säugerzellen.
Die Erfindung betrifft weiterhin ein Polypeptid, das durch eine erfindungsgemäße Nukleinsäure kodiert wird. In einer bevorzugten Ausführungsform betrifft die Erfindung ein Polypeptid mit der in SEQ ID NO:2 gezeigten Aminosäuresequenz oder einen Teil hiervon oder Derivate davon. In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform ist das Polypeptid abgeleitet aus einer flavonhaltigen Pflanze, wie z.B. aus Gerbera (Gerbera Hybriden), Aster (Callistephus chinensis), Löwenmäulchen (Antirrhinum majus), Chrysantheme (Chrysanthemum indicum), Dahlie (Dahlia Hybriden), Gloxinie (Sinningia Hybriden), Verbene (Verbena Hybriden) und Streptocarpus (S. Hybriden). In einer besonders bevorzugten Ausführungsform besitzt das erfindungsgemäße Polypeptid Flavonsynthase Il-Aktivität.
Derivate im Sinne dieser Erfindung sind Aminosäure-Insertionsderivate, Deletionsderivate und/oder Substitutionsaminosäure-Varianten der Aminosäuresequenz aus SEQ ID NO:2.
Aminosäure-Insertionsderivate der erfindungsgemäßen FNS II umfassen sowohl Amino- und Carboxylenverschmelzungen als auch Insertionen von einzelnen oder mehreren Aminosäuren innerhalb der Sequenz. Insertionsaminosäure-Sequenzvarianten sind solche, bei denen einer oder mehrere Aminosäurereste an einer vorbestimmten Stelle in das Protein eingefügt worden sind, obgleich eine zufällige Insertion mit einem geeigneten Screening des Produkts auch möglich ist. Deletionsvarianten sind charakterisiert durch das Entfernen von einer oder mehreren Aminosäuren aus der Sequenz. Substitutionsaminosäure-Varianten sind solche, bei denen mindestens ein Rest in der Sequenz entfernt worden ist und ein anderer Rest an dieser Stelle eingefügt worden ist. Typische Substitutionen sind in Tabelle 1 dargestellt. TABELLE 1 Geeignete Reste für eine Aminosäure Substitution
Original Aminosäure Exemplarische Substitution durch
Aln Ser
Arg Lys
Asn Gin; His
Asp Glu
Cys Ser
Gin Asn
Glu Asp
Gly Pro
His Asn; Gin
Ue Leu; Nal
Leu Ile; Nal
Lys Arg; Gin; Glu
Met Leu; Ile
Phe Met; Leu; Tyr
Ser Thr
Thr Ser
Trp Tyr
Tyr Trp; Phe
Val Ile; Leu
Im allgemeinen werden Aminosäuren durch Aminosäuren mit ähnlichen Eigenschaften ersetzt, wie Hydrophobizität, Hydrophilizität, Elektronegativität, sehr umfangreiche Seitenketten und ähnliches. Substitutionen von Aminosäuren betreffen in der Regel nur einen Rest, wohingegen Insertionen normalerweise einen Bereich von 1 bis 10 Aminosäureresten und Deletionen einen Bereich von 1 bis 20 Resten betreffen. Deletionen und Insertionen werden bevorzugt an nebeneinanderiiegenden Paaren durchgeführt, z.B. eine Deletion von zwei Resten oder eine Insertion von zwei Resten.
Die oben beschriebenen Aminosäure-Varianten erfindungsgemäßer Derivate können leicht mit Hilfe von bekannten Peptidsynthesetechniken wie z.B. durch Solid Phase Synthesis und ähnliche Verfahren oder durch rekombinante DΝA-Manipulationen hergestellt werden. Techniken, um Substitutionsmutationen an vorbestimmten Stellen in DNA durchzuführen, die eine bekannte oder teilweise bekannte Sequenz besitzt, sind gut bekannt und schließen z.B. M13-Mutagenese ein. Die Manipulation von DNA-Sequenzen zur Herstellung von Proteinen mit Substitutionen, Insertionen oder Deletionen ist z.B. in Sambrook et.al. (1989) ausführlich beschrieben. Andere Beispiele von rekombinanten oder synthetischen Mutanten und Derivaten der erfindungsgemäßen FNS II schließen einzelne oder multiple Substitutionen, Deletionen und/oder Additionen jeglicher Moleküle, die mit dem Enzym assoziiert sind, wie Kohlenhydrate, Lipide und/oder Proteine oder Polypeptide, ein.
Die Begriffe "Analogon" und "Derivat" erstrecken sich auch auf alle funktioneilen chemischen Äquivalente der FNS II und auch auf alle Aminosäurederivate, die oben bereits beschrieben wurden.
Ein weiterer Aspekt der vorliegenden Erfindung betrifft rekombinante Formen der FNS II. Die rekombinanten Formen des Enzyms bieten eine Möglichkeit, um z.B. aktivere Enzyme oder Systeme zur in 'tto-Produktion verschiedener Flavone zur Verwendung in verschiedenen Bereichen, wie z.B. der Humanmedizin, zu entwickeln. Letzteres System kann unter anderem in der Krebsforschung zur Anwendung kommen.
In einer weiteren Ausführungsform betrifft die Erfindung transgene Pflanzen, enthaltend eine erfindungsgemäße Nukleinsäuresequenz. In einer bevorzugten Ausführungsform ist die Nukleinsäuresequenz zur Expression geeignet und ist gegebenenfalls regulierbar oder wird in der Pflanze entwicklungsabhängig reguliert. In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform ist die transgene Pflanze ausgewählt aus der Gruppe von flavonhaltigen Pflanzen, wie z.B. aus Gerbera (Gerbera Hybriden), Aster (Callistephus chinensis), Löwenmäulchen (Antirrhinum majus), Chrysantheme (Chrysanthemum indicum), Dahlie (Dahlia Hybriden), Gloxinie (Sinningia Hybriden), Verbene (Verbena Hybriden) und Streptocarpus (S. Hybriden), trägt eine endogene FNS II und enthält weiterhin eine erfindungsgemäße, nicht-endogene FNS Il-Nukleinsäuresequenz.
Entsprechend der vorliegenden Erfindung kann eine Nukleinsäuresequenz, die für eine FNS II oder ein Derivat oder einen Teil dieser kodiert, in eine Pflanze in einer von beiden möglichen Orientierungen eingeführt und dort exprimiert werden und dadurch die Möglichkeit bieten, entweder Naringenin (NAR) und/oder andere geeignete Substrate, wenn sie in der Pflanzenzelle synthetisiert werden, umzuwandeln, was letztendlich zur Bildung von verschiedenen Flavonen führt. Darüber hinaus kann die Bildung dieser Metaboliten durch Reduktion oder Eliminierung endogener oder vorhandener FNS II- Aktivität verhindert werden. Die Synthese von Flavonen führt zu einer Veränderung der Blütenfarbe, bei Gerbera. Am Beispiel der f den Locus Fns heterozygoten, flavonhaltigen, orangen Sorte "Th 58" (fns* fns) konnte in Selbstungsnachkommenschaften eine Farbvariation von dunkelrot (flavonfrei; Genotyp: fns fns) über verschiedene orangerot Töne (flavonhaltig; Genotyp: fns* fns) bis zu einem gelborange (stark flavonhaltig; Genotyp: fns* fns*) gezeigt werden. Dieses Experiment läßt sich beliebig auf andere für den Locus Fns heterozygote Gerbera Sorten übertragen (siehe auch Beispiel 2). Die -Expression der Nukleinsäuresequenz in einer von beiden möglichen Orientierungen in der Pflanze kann konstitutiv, induzierbar oder ent- wicklungsbezogen und auch gewebespezifisch sein. Das Wort "Expression" ist dabei in seiner allgemeinsten Bedeutung verwendet, um die Produktion von RNA oder von beidem, RNA und Protein, einzuschließen. Es ist auch auf eine teilweise Expression von Nukleinsäuremolekülen ausgedehnt.
Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung transgener Pflanzen, die fähig sind, FNS II oder aktive Mutanten oder Derivate zu synthetisieren. Dieses Verfahren umfaßt die stabile Transformation einer Zelle einer geeigneten Pflanze mit einem Nukleinsäuremoiekül, das eine Nukleotidsequenz umfaßt, die für die besagte FNS II kodiert, unter Bedingungen, die die mögliche Expression des besagten Nukleinsäuremoleküls herbeiführt, die Regeneration einer transgenen Pflanze aus der Zelle und das Wachstum dieser transgenen Pflanze für eine bestimmte Zeit und unter Bedingungen, die geeignet sind, um die Expression der Nukleinsäure herbeizuführen. Die transgene Pflanze kann höhere Werte einer FNS Il-Aktivität im Vergleich zu dem Wert, der in vergleichbaren, nicht-transgenen Pflanzen gemessen wird, zeigen oder die Werte können niedriger sein im Vergleich zu denen von vergleichbaren, nicht-transgenen Pflanzen.
Ein Aspekt der vorliegenden Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung einer transgenen Pflanze mit reduzierter, endogener oder vorhandener FNS Il-Aktivität. Dieses Verfahren umfaßt die stabile Transformation einer Zelle einer geeigneten Pflanze mit einem Nukleinsäuremoiekül, das eine Nukleotidsequenz umfaßt, die eine Sequenz oder eine komplementäre Sequenz der FNS II kodiert, die Regeneration einer transgenen Pflanze aus der Zelle und, falls nötig, das Heranziehen dieser transgenen Pflanze unter geeigneten Bedingungen, um die Expression von Nukleinsäuren zu erreichen.
Ein weiterer erfindungsgemäßer Aspekt betrifft ein Verfahren zur Herstellung einer genetisch modifizierten Pflanze mit reduzierter endogener oder vorhandener FNS Il- Aktivität. Dieses Verfahren umfaßt die Veränderung des FNS Il-Gens durch eine Modifikation der endogenen Sequenz über homologe Rekombination, ausgehend von einem entsprechend veränderten Gen einer FNS II oder eines Derivats oder eines Teils davon. Das Gen wird in die Pflanzenzelle eingeführt und eine genetisch modifizierte Pflanze wird aus der Zelle regeneriert.
Ein weiterer Aspekt der vorliegenden Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung einer transgenen, blühenden Pflanze mit veränderten Blüteneigenschaften. Dieses Verfahren umfaßt das Einbringen der erfindungsgemäßen Nukleinsäuresequenz in eine Zelle einer geeigneten flavonfreien Pflanze, die Regeneration einer transgenen Pflanze aus der Zelle und das Heranziehen einer transgenen Pflanze zu einer Zeit und unter Bedingungen, um die Expression der erfindungsgemäßen, eingebrachten Nukleinsäuresequenz zu erreichen. Die transgene Pflanze kann zum Beispiel ausgewählt sein aus der Gruppe von flavonhaltigen Pflanzen bestehend aus Euphorbia (E. pulchem'ma), Cyclamen (Cyclamen persicum), Rose (Rosa Hybrida), Pelargonium (P. spec), Begonia (ß. spec), Nelke (Dianthus caryophyllus) und Tulpe (Tulipa Hybriden). In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform ist die transgene Pflanze zur Expression einer endogenen Flavonsynthase II fähig. Eine derartige transgene Pflanze kann z.B. ausgewählt sein aus der Gruppe von Pflanzen bestehend aus Gerbera (Gerbera Hybriden), Aster (Callistephus chinensis), Löwenmäulchen (Antirrhinum majus), Chrysantheme (Chrysanthemum indicum), Dahlie (Dahlia Hybriden), Gloxinie (Sinningia Hybriden), Verbene (Ve-n ena Hybriden) und Streptocarpus (S. Hybriden). In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform wird diese endogene Flavonsynthase II bei Expression der eingebrachten erfindungsgemäßen Nukleinsäure coexprimiert.
In einer Ausführungsform wird die endogen vorhandene Flavonsynthase Il-Aktivität durch Einbringen der Nukleinsäuresequenz reduziert. Dieses Verfahren umfaßt die stabile Transformation einer Zelle einer geeigneten Pflanze mit einer erfindungsgemäßen Nukleinsäuresequenz oder einer dazu komplementären Sequenz, die Regeneration einer transgenen Pflanze aus der Zelle und das Heranziehen dieser transgenen Pflanze zu einer Zeit und unter geeigneten Bedingungen, um die Höhe der Aktivität der endogenen oder vorhandenen FNS II zu verändern. Bevorzugterweise ist der veränderte Wert geringer als das endogene oder vorhandene Level der FNS Il-Aktivität in einer vergleichbaren, nicht-transgenen Pflanze. Gegebenenfalls ist für die Reduktion der endogenen FNS Il-Aktivität die Expression der eingeführten Nukleinsäuresequenz oder deren komplementären Sequenz erforderlich. Somit kann eine Expression der eingeführten genetischen Sequenz oder ihres komplementären Analogon nötig sein, um den gewünschten Effekt zu erzielen. Dies meint im wesentlichen eine blühende Pflanze mit veränderten Blüteneigenschaften.
In diesem Zusammenhang betrifft die vorliegende Erfindung ein Verfahren zur Herstellung einer blühenden Pflanze, die unterschiedliche Blüteneigenschaften zeigt. Dieses Verfahren umfaßt Veränderungen des FNS Il-Gens durch Modifikation der endogenen Sequenzen über homologe Rekombination eines entsprechend veränderten Gens einer FNS II oder eines Derivats oder eines Teils davon, die Einführung in die Pflanzenzelle und die Regeneration der genetisch veränderten Pflanze aus der Zelle.
Das erfindungsgemäße Nukleinsäuremoiekül kann darüber hinaus entwicklungsabhängig reguliert werden. In der Regel schließt eine veränderte Infloreszenz die Produktion yon schwächer gefärbten Blüten oder auch anderen Farbtönen ein, abhängig von den physiologischen Bedingungen der Empfängeφflanze. Mit "Empfängeφflanze" ist eine Pflanze gemeint, die eine meßbare Menge Substrat für das FNS Il-Enzym oder die FNS II selbst produziert und die entsprechenden physiologischen Eigenschaften und Genotyp besitzt, die notwendig für die Entwicklung der gewünschten Farben sind. Dies schließt folgende Pflanzen ein, ist aber nicht auf diese begrenzt : Gloxinie (Sinningia Hybriden), Löwenmäulchen (Antirrhinum majus), Columnea (Columnea Hybriden), Dahlie (Dahlia variabilis), Gloxinie (Sinningia cardinalis), Streptocarpus (Streptocarpus Hybridus), Verbene (Verbena Hybrida), Chrysantheme (Chrysanthemum indicum), Einblatt (Spathiphyllum wallisii), Petunie (Petunia Hybrida), Cyclamen (Cyclamen persicum), Rose (Rosa Hybriden) und Pelargonie (P. spec).
Entsprechend umfaßt die vorliegende Erfindung ein Verfahren zur Herstellung einer transgenen Pflanze, die meßbar ein rekombinantes Gen exprimiert, das die FNS II oder einen Teil davon kodiert oder welche eine Nukleinsäuresequenz trägt, die im wesentlichen komplementär zum gesamten oder zu einem Teil des mRNA-Moleküls ist, das, falls nötig, ohne weiteres transkribierbar ist, um die Regulation der FNS II zu bewirken. Dieses Verfahren umfaßt die stabile Transformation einer Zelle einer geeigneten Pflanze mit der isolierten Nukleinsäure, umfassend eine Nukleotidequenz, die für eine FNS II oder ein Derivat oder einen Teil davon kodiert, oder eine zu der kodierenden Nukleotidsequenz komplementäre Sequenz, falls erforderlich unter Bedingungen, die eine Expression der besagten isolierten Nukleinsäure erlauben, und durch Regeneration einer transgenen Pflanze aus einer Zelle. Der Fachmann bemerkt sofort die Möglichkeiten der Anwendung bei der vorliegenden Erfindung, wie z.B. eine Erhöhung oder Reduzierung der Expression der Enzyme, die natürlicherweise in einer Zielpflanze vorhanden sind. Dies führt zu verschiedenen neuen Blütenfarbtönen, wie zum Beispiel verschiedenen Orange- oder Dunkelrot-Tönen.
Daher bezieht sich die vorliegende Erfindung auf alle transgenen Pflanzen, die die gesamte oder einen Teil der erfindungsgemäßen Nukleinsäuresequenz enthalten und/oder eine homologe oder verwandte Form dieser oder eine Antisense-Form von irgendeiner der beschriebenen aufweisen, und im einzelnen diejenigen transgenen Pflanzen, die unterschiedliche Blüteneigenschaften zeigen. Die transgenen Pflanzen können eingeführte Nukleinsäuremoleküle enthalten, die eine Nukleotidsequenz umfassen, die eine FNS II oder eine komplementäre Sequenz kodiert. Im allgemeinen wird die Nukleinsäure stabil in das Pflanzengenom eingeführt, obwohl die vorliegende Erfindung auch die Einführung einer FNS II Nukleotidsequenz innerhalb einer autonom-replizierenden Nukleinsäuresequenz wie z.B. DNA- oder RNA-Viren, die fähig sind, in einer Pflanzenzelle zu replizieren, einschließt. Die Erfindung schließt darüber hinaus auch Samen der transgenen Pflanze ein, besonders, wenn sie flavonhaltig sind.
Mit Hilfe des erfindungsgemäßen FNS Il-Gens kann die Flavonoidbiosynthese bzw. die Bildung von Flavonen in Pflanzen auf verschiedene Art und Weise gezielt verändert werden.
Im pflanzlichen Bereich müssen vorab zwei unterschiedliche Ausgangspunkte berücksichtigt werden. Zum einen stehen Pflanzen zur Verfügung, die natürlicherweise Flavone oder deren Glykoside bilden, wie z.B. Antirrhinum und Verbena in Blüten, Clerodendron und Citrus in Blättern, Althaea und Sophora (Leguminosae) in Wurzeln und Prunus und Pinus spec. im Hartholz (Wollenweber, 1994; Williams und Harborne, 1994). Neben dieser sehr großen Gruppe gibt es aber auch einige Pflanzen, die in bestimmten Geweben keine Flavone synthetisieren. Dies ist z.B. bei einigen Blüten von wichtigen Zieφflanzen wie Pelargonium, Cyclamen und Petunia und in Apfelblättern der Fall.
Dementsprechend betrifft die vorliegende Erfindung eine veränderte FNS Il-Aktivität in Pflanzen und anderen Organismen, die sowohl durch eine Erhöhung als auch durch eine Reduzierung der natürlich vorkommenden FNS Il-Aktivität mittels der Einführung der Sequenz aus der vorliegenden Erfindung erreicht werden kann. Eine Reduzierung der Höhe der FNS Il-Aktivität kann auch als eine Down-Regulierung beschrieben werden. In flavonhaltigen Pflanzen kann die Synthese von Flavonen mit Hilfe von geeigneten Methoden gezielt hoch- oder down-reguliert werden oder ganz ausgeschaltet werden. Dies hat für die Pflanze verschiedene Folgen. Grundsätzlich hat eine solche Veränderung am Biosyntheseweg Auswirkungen auf die gesamte Flavonoidbiosynthese, da eine ständige Konkurrenz mehrerer Enzyme (FNS II, FHT, F3'H, F3',5'H) um das Substrat (Flavanone, z.B. Naringenin) herrscht. Das bedeutet im einzelnen, daß z.B. eine Hochregulierung der FNS II die Synthese von Flavonoiden im späteren Biosyntheseweg (Abb. 1A) reduziert und dadurch z.B. blassere Blütenfarben erreicht werden können. Außerdem kann durch diese gezielte Erhöhung des Flavongehalts, die nur bestimmte Gewebe betreffen kann, die Resistenzeigenschaft und die Symbiosefähigkeit der Pflanze deutlich verbessert werden. Demgegenüber führt eine Down Regulierung zu einer Steigerung der Synthese von anderen, eventuell für die Pflanze nützlicheren Flavonoiden. Dies kann sowohl die für den UV-Schutz wichtigen Flavonole als auch die farbgebenden Anthocyane oder resistenzinduzierenden Proanthocyanidine und Phytoalexine betreffen. Eine vollständige Unterdrückung der Flavonbildung führt zu einer Verstärkung der Wirkungen einer Down- Regulierung und kann mögliche Stimulanzien für Insekten entfernen und somit zur Resistenzbildung beitragen.
Eine völlige Neu-Synthese von Flavonen kann durch das gezielte Einführen der FNS II in Pflanzen ohne natürliche Aktivität erreicht werden. Abhängig von den vorhandenen Substraten kann so der Flavongehalt und das Flavonmuster reguliert werden. Durch Etablierung dieses Schrittes können Blütenfarben, Resistenzeigenschaften und die Fähigkeit zur Symbiose mit Stickstoff-fixierenden Bakterien gezielt verändert werden. Darüber hinaus kann durch die Öffnung eines neuen Biosyntheseweges die Bildung von für die Pflanze weniger nützlichen Flavonoiden (z.B. Fraßstimulanzien) reduziert werden oder auch die Synthese von Biflavonen, die aus Flavonen hervorgehen, etabliert werden.
Mit Hilfe dieser Ansätze können wichtige flavonhaltige oder flavonfreie Nutzpflanzen in ihrem Flavonoidmuster und -gehalt, einschließlich der Flavone, so verändert werden, daß ihre positiven Eigenschaften in Bezug auf die Biologie von Mensch und Tier optimiert werden.
Die vorliegende Erfindung betrifft weiterhin Verfahren zur gezielten Veränderung des Fla- vongehalts bzw. -musters in verschiedenen Pflanzengeweben (Blüten, Wurzeln, Blätter u.a.) und anderen Organismen und damit allgemein die Veränderung der Flavonoidzusammensetzung, speziell die Veränderung von Blütenfarben durch Kopigmentierung, von Resistenzeigenschaften und der Fähigkeit der Nodulation bei Leguminosen.
In einer weiteren Ausführungsform betrifft die Erfindung die Verwendung eines erfindungsgemäßen Polypeptids zur Synthese von Flavonen. In geeigneten Expressionssystemen können das Enzym selbst und daraus letzendlich natürliche Flavone, ausgehend von geeigneten Substraten, synthetisiert werden. Eine Möglichkeit ist die Verwendung von geeigneten Expressionssystemen zur Gewinnung von gesundheitsfördernden, natürlichen Flavonen. Diese Expressionssysteme können pflanzlicher Art sein oder aus Zeil- bzw. Hefekulturen bestehen. Die Expression der FNS II in Pflanzen oder in Zellkulturen kann zur direkten Gewinnung der entsprechenden Flavone verwendet werden, wobei das Hefe- Expressionssystem zur Gewinnung des intakten Enzyms bevorzugt sein kann. Mit diesem Enzym können dann chemische oder natürliche Vorstufen (Flavanone) zum entsprechenden Fiavon umgesetzt werden. Die auf diese Art synthetisierten Flavone können unter anderem bei der Krebstherapie Verwendung finden oder in Form von Medikamenten zur Gesundheit von Mensch und Tier beitragen.
Die vorliegende Erfindung ist ausführlich beschrieben durch die folgenden Abbildungen und Beispiele. Die vorliegende Erfindung ist anhand einer Nukleinsäuresequenz, die aus
Gerbera Hybriden abgeleitet wurde, veranschaulicht. Es liegt nun nahe, daß ähnliche
Sequenzen leicht aus verschiedenen anderen Quellen, wie z.B. anderen Pflanzen oder speziellen Mikroorganismen, isoliert werden können. Beispiele für andere Flavon- produzierende Pflanzen schließen Gloxinie (Sinningia Hybriden), Löwenmäulchen (Antirrhinum majus), Columnea (Columnea Hybriden), Dahlie (Dahlia variabilis), Gloxinie
(Sinningia ca dinalis), Streptocaφus (Streptocarpus Hybridus), Verbene (Verbena
Hybrida), Chrysantheme (Chrysanthemum indicum), Einblatt (Spathiphyllum wallisii) ein, sind aber nicht auf diese begrenzt. Alle diese Nukleinsäuresequenzen, die direkt oder indirekt ein Enzym des Flavonoidbiosyntheseweges und im speziellen die FNS II kodieren, ohne Rücksicht auf deren Quelle, sind von der vorliegenden Erfindung mit eingeschlossen.
ABBILDUNG 1A-C zeigt eine schematische Darstellung des allgemeinen Flavonoid- Biosyntheseweges und der chemischen Strukturen verschiedener Flavonoide.
Beteiligte Enzyme sind in Abb. 1A und 1C wie folgt abgekürzt : CHS = Chalkonsynthase; CHI = Chalkonisomerase; FHT = Flavanon 3-Hydroxylase; DFR = Dihydroflavonol 4- Reduktase; ANS = Anthocyanidinsynthase; FGT = Flavonoid 3-Glukosyltransferase; FNS II = Flavonsynthase II; FLS = Flavonolsynthase; F3Η = Flavonoid 3'-Hydroxylase; F3',5'H = Flavonoid 3',5'-Hydroxylase. Die Ebene der Flavonbildung ist in Abbildung 1A besonders (++++) gekennzeichnet. In Abbildung 1B ist im oberen Teil die FNS Il-Reaktion in Gegenwart von NADPH mit einigen üblichen Flavanonen gezeigt. Im unteren Teil sind weitere wichtige Flavonoide dargestellt. Die Abbildung 1C beschreibt den Flavonoidbiosyntheseweg, wie er in Gerbera Hybriden vorkommt. Folgende Abkürzungen sind für die verschiedenen Flavonoide verwendet worden : THC = Tetrahydroxychalkon; PHC = Pentahydroxychalkon; NAR = Naringenin; ERI = Eriodictyol; Ap = Apigenin; Lu = Luteolin; DHK = Dihydrokaempferol; DHQ = Dihydroquercetin; Km = Kaempferol; Qu = Quercetin; LPg = Leucopelargonidin; LCy = Leucocyanidin; Pg = Pelargonidin; Cy = Cyanidin.
ABBILDUNG 2 zeigt die Aktivität bzw. die fehlende Aktivität der FNS II in Enzymextrakt aus Petalen verschiedener Gerbera-Linien : "Th 58" (Genotyp fns+ fns), "147-150" (fns+ .) und "147-146" (fns fns). Die Linien "147-150" und "147-146" sind Selbstungsnachkommenschaften aus "Th 58". Die Aktivität der FNS II wurde durch den Umsatz von 1 C-markiertem Naringenin zum entsprechenden Fiavon Apigenin gemessen.
ABBILDUNG 3 zeigt die FNS Il-Aktivität ( ■ ) und die Akkumulation von Flavonen ( D ) in der Linie "Th 58" (fns+ fns) über verschiedene Entwicklungsstadien der Blüte. Die verschiedenen Blütenstadien sind im Beispiel 2 definiert. Der Flavongehalt wurde durch Extraktion mit Ethylacetat und HPLC-Untersuchung, wie in Martens und Forkmann (1998) beschrieben, ermittelt.
ABBILDUNG 4A+B (nach Schopfer und Ebel, 1998) zeigt die bekannte Struktur der Cyto- chrom P450-Sequenzen mit Bereichen von hoher Sequenzkonservierung. Angezeigt ist die Prolin-reiche, die Sauerstoffbindungs- und die Häm-Bindungsregion. In Abb. 4B ist die Häm-Bindungsregion im Detail dargestellt und außerdem die daraus abgeleiteten Primer für die DD-RT-PCR. Ein Satz von acht nicht-degenerierten 5'-Primem wurde entsprechend der möglichen Nucleotidsequenz erstellt.
ABBILDUNG 5 zeigt eine schematische Darstellung der verschiedenen generierten Cyto- chrome P450-DNA-Fragmente. Alle Klone enthalten die markierte Häm-Bindungsstelle. pDDd7a : ein 358 bp langes Fragment konnte über PCR mit Hilfe der Oligo's "Decamer d7" und "Oligo A" mit einem DNA-Template, das aus einer differentiell exprimierten Bande wiedergewonnen wurde, generiert werden.
pTABATA : ein 1519 bp langes Fragment wurde ausgehend von cDNA aus Gerbera "Th58" über eine PCR-gestützte RACE-Methode mit den Oligo's "GSP7", "GSP8", "GSP9" und "AAP" (GIBCO-BRL) bzw. "backrace" isoliert.
pCYPFNSI : ein 1589 bp langes Fragment mit einem offenen Leserahmen wurde über PCR mit Hilfe der Oligo's "CypFNSI H" und "CypFNSI R" isoliert. Als Template wurde cDNA der Gerbera "Th58" verwendet.
ABBILDUNG 6 und 7 sind Darstellungen der Nukleinsäure bzw. der daraus abgeleiteten Aminosäuresequenz des vollständigen Klons. Das Startkodon und die verschiedenen Stopkodons sind gesondert markiert.
ABBILDUNG 8 zeigt ein Diagramm der vorhandenen Restriktionsstelle für Standard- Restriktionsenzyme.
ABBILDUNG 9 zeigt einen FNS Il-Test mit Hefe-Mikrosomen. Als Substrat wurde [14C] Naringenin verwendet. Mikrosomen wurden aus transformierten (INVSd - CypFNSI) und untransformierten Hefen (INVSc 1) präpariert. Das Autoradiogramm zeigt die Umwandlung von [1 C] Naringenin zum entsprechenden Fiavon, dem [1 C] Apigenin, mit einem Extrakt der transformierten Hefe (INVSc 1 - CypFNSI). Im Kontroll-Experiment (INVSc 1) wurde keine Aktivität gemessen. Das Produkt wurde in vier verschiedenen Laufmitteln durch Co- Chromatographie mit authentischen Apigenin identifiziert.
ABBILDUNG 10 zeigt eine Autoradiographie eines RNA Gel Blots, der mit einer 32P- markierten cDNA des Inserts CypFNSI hybridisiert wurde. Jede Spur enthält 20 μg Gesamt RNA, die wie folgt aufgetragen wurde : {1} Simm (Genotyp fns+.), {2} Delphi (fns\), {3} T3 (fns fns), {4} 147-150 (fns+.), {5} Clivia (fns fns), {6} 147-146 (fns fns), {7} Regina (fns+.), {8} Gerbera-Laub (fns fns), {9} 10er Pool (fns+.), {10} 10er Pool (fns fns). BEISPIEL 1
Materialien
Chemikalien, Enzyme und Radiochemikalien
Naringenin, Eriodictyol, Apigenin und Luteolin wurden bei Carl Roth (Karlsruhe, Deutschland) bezogen. [14C] Naringenin wurde aus [1 C] Malonyl-CoA (ARC, St. Louis, USA) und p-Cumaroyl-CoA (Dr. Werner Heller, GSF, Neuherberg, Deutschland) nach der in Britsch et.al. (1981) beschriebenen Methode mit teilweise gereinigter Chalkonsynthase (CHS) und Chalkonisomerase aus Petersilie Suspensionskultur hergestellt. Alle weiteren Enzyme wurden von kommerziellen Anbietern bezogen und nach deren Beschreibung verwendet.
Bakterien- und Hefestämme
Die folgenden Escherichia coli-Stämme wurden verwendet : TOP10F' und TOP10, beide von Invitrogen (Groningen, Niederlande). Außerdem wurde folgender Hefestamm verwendet: INVSd (Invitrogen).
Die Klonierungsvektoren pCR2.1 und pYES2 wurden von Invitrogen bezogen.
Die Ligation von Insert und Vektor pCR2.1 bzw. die Transformation der Bakterien erfolgte nach Angaben des Herstellers.
Pflanzenmaterial
Es standen chemogenetisch definierte Ge-nbera-Klonsorten (Tyrach und Hörn, 1997) und
Selbstungsnachkommenschaften der Linie "Th58" zur Verfügung. Zusätzlich wurden die aktuellen Schnittgerbera Sorten "Regina" der Firma Terra Nigra (DeKwakel, Niederiande) und "Delphi" der Firma Florist (DeKwakel, Niederlande) miteinbezogen. Eine detailierte
Beschreibung des Pflanzenmaterials ist in Tabelle 2 zu finden.
TABELLE 2
Verwendetes Pflanzenmaterial
Gerbera Linie Genotyp Herkunft
Th58 fhs+ fhs Tyrach und Hörn, 1997
Delphi fhs+ fhs Florist, Tyrach und Hörn, 1997
Simm fhs+ fhs Tyrach und Hörn, 1997
T3 fhs fhs Tyrach und Hörn, 1997
147-150 fhs+ fns Th 58 x S
Clivia fhs fiis Tyrach und Hörn, 1997
147-146 fhs fhs Th 58 x S
Regina fhs+ . Terra Nigra
Laub Regina fhs fhs Terra Nigra
10er Pool (147-. ••) fhs+ . Th 58 x S
10er Pool (147-. ..) fhs fhs Th 58 x S
BEISPIEL 2
Kultivierung der Pflanzen, Kreuzunαsmethoden und Blütenstadien
Pflanzen von Gerbera Hybriden wurden unter praxisüblichen Bedingungen in einem Gewächshaus kultiviert. Die Tageslänge betrug mindestens 14 h bei einer Lichtintensität von 10.000 lux und bei 22°C.
Selbstungen der Sorte "Th58" (Genotyp fns* fns) wurden innerhalb eines Blütenstandes oder zwischen den Blütenständen der gleichen Pflanze durchgeführt. Dieses Selbstungsexperiment läßt sich mit jeder beliebigen für den Locus Fns heterozygoten Sorte oder Linie durchführen. Die entsprechenden chemogenetischen und biochemischen Methoden sind in Tyrach und Hörn (1997) und Martens und Forkmann (1998) im Detail beschrieben. Ein kontrolliertes Abblühen wurde durch über die Blüten gezogene Pergamintüten erreicht. Die Bestäubungen wurden im Idealfall bis zu viermal in täglichen Abständen wiederholt. Weitere Hinweise zu Bestäubungsmethoden und Blütenbau bei Gerbera sind bei Maurer (1967) zu finden.
Gerbera Blüten wurden zu verschiedenen Entwicklungsstadien, die wie folgt definiert wurden, geerntet (nach Martens and Forkmann, 1998) :
Stadium 1 Knospe geschlossen, Petalen kleiner als 5 mm. Stadium 2 Strahlenblüten sichtbar, 5 - 10 mm lang. Stadium 3 Strahlenblüten 10 - 15 mm lang. Stadium 4 : Beginn der Pigmentierung, Länge 15 -23 mm.
Stadium 5 : Ligula der Strahlenblüten pigmentiert, 23 - 26 mm lang.
Stadium 6 : Strahlenblüten 26 - 35 mm lang.
Stadium 7 : Infloreszenz halb geöffnet, 35 - 40 mm lang. Stadium 8 : Infloreszenz vollständig geöffnet, 40 - 50 mm lang.
Stadium 9 : Strahlenblüten 50 - 55 mm lang.
Stadium 10 : Strahlenblüten 55 - 60 mm lang.
Stadium 11 : seneszente Infloreszenz, 55 - 60 mm lang.
BEISPIEL 3
Biochemische und enzvmologische Charakterisierung der Selbstungsnachkommenschaften
Zur Extraktion und Identifizierung von Flavonoiden wurden bekannte Standardmethoden verwendet (Marbry et.al., 1970; Harborne, 1967). Flavone wurden darüber hinaus unter UV-Licht (243 nm) vor und nach Bedampfung mit Ammoniak detektiert. Flavanone wurden durch Reduktion mit Natriumborhydrid und nachfolgender Behandlung mit Salzsäuredämpfen identifiziert (Eigen etal., 1957). Dünnschicht Chromatographie wurde auf vorbeschichteten Cellulose Platten G1440 der Firma Schleicher & Schüll (Dassel, Deutschland) durchgeführt. Hierzu wurden folgende Laufmittel verwendet : (1) Chloroform - Essigsäure - Wasser (10 : 9 : 1); (2) 30 % Essigsäure; (3) Essigsäure - Salzsäure - Wasser (30 : 3 : 10) und (4) tert.-Buthanol - Essigsäure - Wasser (3 : 1 : 1). Der Flavongehalt von Knospen und Blüten während der Entwicklung wurde durch Extraktion der Pigmente mit Ethylacetat aus Petalen verschiedener Stadien bestimmt. Das Verhältnis Gewebe zu Extraktionsmittel betrug 1 : 40 (g/ml) und die Extraktionsdauer 48 Stunden bei 4°C im Dunkeln. Charakterisierung und Quantifizierung wurde mit Hilfe einer HPLC durchgeführt. 10 μl 75% Methanol Extrakt wurden auf eine Spherisorb ODS II Säule (Partikelgröße 5 μm, 250 x 4.6 mm, Bischoff, Leonberg, Deutschland) aufgegeben und aufgetrennt (Lange et.al., 1994). Die Detektion erfolgte mit einem Dioden Array Detektor Model 168 (Beckmann, München, Deutschland).
Enzymaufarbeitungen und FNS II Tests wurden, wie in Martens und Forkmann (1998) beschrieben, durchgeführt. Die Aufarbeitung erfolgte mit 6.0 ml Tris-HCI Puffer (pH 7.5), der 28 mmol/l 2-Mercaptoethanol und 10 mmol/l Natriumascorbat erhielt, bei 4°C mit 1.0 g Petalen, 0.5 g Dowex (equilibriert mit Tris-HCI Puffer, pH 7.5) und 0.5 g Seesand. Nach „-.
25 dem homogenisieren in einem vorgekühlten Mörser wurde das Homogenat in Eppendorf Tubes überführt und zweimal für 5 min. bei 10.000 x g zentrifugiert. Der nun klare Überstand diente als Rohextrakt oder wurde zur Fällung von Mikrosomen mit MgCI2 nach Diesperger et.al. (1974) verwendet. Der Proteingehalt der Aufarbeitungen wurde nach der Methode von Bradford (1976) bestimmt.
Der Standardtest für die FNS II enthielt in einem Gesamtvolumen von 200 μl : 175 μl Tris- HCI Puffer (pH 7.5), 0.3 nmol radioaktive markiertes Substrat (83 Bq; Naringenin), 2.0 nmol unmarkiertes Substrat, 10 μl 20 mmol/l NADPH und 15 μl Rohextrakt oder Mikrosomen Präparation. Nach einer Inkubation von 20 min. bei 25°C wurde die Reaktion durch die Zugabe von 20 μl Methanol, das eine Mischung der entsprechenden Flavonoide enthielt, gestoppt. Die Extraktion des Reaktionsgemisches erfolgte zweimal mit 100 bzw. 50 μl Ethylacetat. Die obere Phase wurde auf Cellulose Dünnschichtplatten im Laufmittel 1 (s.o.) chromatographiert. Die Radioaktivität wurde mit Hilfe eines Fuji BAS 1000 Bio- Imaging Analyser (Fuji Photo Film Co., Tokio, Japan) und des TINA Software Packets (Raytest, Straubenhardt, Deutschland) lokalisiert und quantifiziert.
In Abb. 2 sind beispielhaft die Ergebnisse der Enzymtests mit der Gerbera Sorte "Th 58" und den Linien "147-150" und "147-146" dargestellt. Die entsprechenden Genotypen sind der Tabelle 2 zu entnehmen.
BEISPIEL 4
Synthese von Oligonukleotiden
Oligonukleotide wurden bei der Firma Metabion (Martinsried, Deutschland) synthetisiert. Folgende Oligonukleotide wurden verwendet (5' - 3') :
Oligo A : 5'- 1 I I I I I I I I I T(A,C,G)A-3' (SEQ ID NO:3)
Oligo C : 5'- 1 I I I I I I I I I T(A,C,G)C-3' (SEQ ID NO:4)
Oligo G : 5'- 1 I I I I I I I I I T(A,C,G)G-3' (SEQ ID NO:5) Decamer 1 5'-CGCCATTTGG-3' (SEQ ID NO:6) Decamer 2 5'-CGCCATTCGG-3' (SEQ ID NO:7) Decamer 3 5'-CGCCCTTTGG-3' (SEQ ID NO:8) Decamer 4 S'-CGCCCTTCGG-S' (SEQ ID NO:9) Decamer 5 5'-CGCCGTTTGG-3' (SEQ ID NO: 10) Decamer 6 5'-CGCCGTTCGG-3' (SEQ ID NO:11) Decamer 7 5'-CGCCTTTTGG-3' (SEQ ID NO:12) Decamer 8 : 5'-CGCCTTTCGG-3' (SEQ ID NO: 13) GSP7 : S'-ATCπC AGTGTTTCCTCGTTCC-S' (SEQ ID NO: 14) GSP8 : 5'-AATGGAACACACACAAAATCTACC-3' (SEQ ID NO: 15) GSP9 : 5'-TCACCACTGAGAGTTCTCTCATGG-3' (SEQ ID NO:16) AAP : 5'-GGCCACGCGTCGACTAGTACGGGIIGGGIIGGGIIG-3' (SEQ ID NO:17) Backrace : 5'-GCCACGCGTCGACTAGTACG-3' (SEQ ID NO: 18) CypFNSI H : δ'-CAAAGGATCCCAACACCATGAATACACTCC-S' (SEQ ID NO: 19) CypFNSI R : 5'-AGATAGACCGACTGCCATCAAGAAAGC-3' (SEQ ID NO:20) Die drei Oligo's und acht Decamere wurden nach Schopfer und Ebel (1998) synthetisiert.
BEISPIEL 5
Klonierung eines P450-Fragments aus Gerbera Hybriden
Isolierung von Gesamt RNA aus Gerbera Petalen
Gesamt RNA wurde aus Gerbera Petalen von verschiedenen definierten Genotypen (fns+ . oder fns fns; Tab. 2) der Stadien 2 - 4, in denen die FNS Il-Aktivität ansteigt (Abb. 3), nach einer bei Giuliano et.al. (1993) beschriebenen Methode isoliert. 1.2 g in flüssigem Stickstoff eingefrorenes Pflanzenmaterial wurde in einem vorgekühlten Moser zu feinem Pulver gerieben und in ein ebenfalls vorgekühltes Corex-Röhrchen überführt. Das Gewebe wurde in 3 ml vorgelegtem Extraktionspuffer, bestehend aus 4 M Guanidium Thiocyanat, 0.15 M Natriumacetat (pH 5.3), 0.2 % Natrium Sacrosinat und 0.7 % ß-Mercaptoethanol, und 2.4 ml Wasser-equilibriertem Phenol (gesättigt mit 0.1 M Citrat-Puffer, pH 4.3, Sigma, Deisenhofen, Deutschland) durch kräftiges Vortexen homogenisiert. Nach der Zugabe von 0.6 ml Chloroform wurde das gut gemischte Homogenat für 20 min auf Eis belassen und anschließend bei 15.000 x g zentrifugiert (Sorvall RC-5B plus; SS34). Die abgenommene Obeφhase wurde mit 1 Vol. Isopropanol versetzt und erneut auf Eis für 60 min inkubiert. Nach 30 min Zentrifugation bei 15.000 x g (Sorvall s.o.) wurde die Obeφhase verworfen und das Pellet in sterilem H2O vorsichtig resuspendiert. Zur Entfernung der Polysaccharide wurde die Lösung mit 100% Ethanol (20% (v/v) Endkonzentration) versetzt, 20 min auf Eis inkubiert und 10 min bei 10.000 x g und 4°C zentrifugiert. Der die Nukleinsäuren enthaltende Überstand wurde mit 1/3 Vol. 8 M Lithiumchlorid versetzt. Nach 30 min Inkubation auf Eis wurde 20 min bei 15.000 x g zentrifugiert und der Überstand verworfen. Die gefällte RNA wurde zweimal mit je 1 ml 80% Ethanol gewaschen und dann in 50 μl H2O resuspendiert und bei -70°C gelagert. Die Bestimmung der RNA-Konzentration erfolgte spektrophotometrisch bei einer Wellenlänge von 260 nm (Pharmacia Biochrome 4060).
Falls erforderlich wurde zudem poly (A)+ RNA aus der Gesamt RNA durch zwei Zyklen Oligo (dT) Cellulose Chromatographie isoliert (Sambrook et.al., 1989).
Reverse Transkription von RNA
5 μg Gesamt RNA oder 500 ng poly (A)+ RNA, isoliert aus den oben beschriebenen unterschiedlichen Genotypen bzw. Blütenstadium, wurde in einem 25 μl Ansatz mit jeweils einem der drei Oligo (dT) Primer mittels Reverse Transkriptase (SuperScript™ II, GIBCO BRL, Paisley, Großbritanien) in cDNA umgeschrieben. Zur RNA wurde 1 μl des jeweiligen Oligo (dT) Primer (1 μM final) und Wasser bis zu einem Volumen von 17 μl gegeben. Dieser Ansatz wurde anschließend bei 70°C für 10 min. denaturiert und dann auf Eis gestellt. Nach der Zugabe von 4 μl 5 x SuperScript First Strand Buffer, 2 μl 100 mM Dithiothreitol, 1 μl 10 mM dNTP Mix, wurde der Ansatz bei 42°C für 2 min. vorinkubiert. Anschließend wurde 1 μl (200 U) SuperScript™ Reverse Transkriptase direkt dazupipettiert. Die Reaktion wurde bei 42°C für 60 min. und anschließend für 15 min. bei 70CC inkubiert. Folgende cDNA's standen somit zur Verfügung : fns+ A, C oder G und entsprechend für die rezessive Linie fns" A, C oder G. Diese cDNA's wurden direkt als Template für den PCR Ansatz verwendet. PCR-Amplifikation mit P450 spezifischen Primern
Die Amplifikation der verschiedenen cDNA's erfolgte mittels PCR, wobei neben dem Oligo (dT) Anchor Primer ein zweiter, nicht-degenerierter, P450 spezifischer Primer (Decamer 1 - 8) verwendet wurde. Der PCR Ansatz enthielt in einem Gesamtvolumen von 20 μl folgende Komponenten : 6.2 μl Wasser, 1 μl 20 x Polymerase Puffer, 2.5 mM MgCI2, 0.2 μM dNTP Mix, 1 μl 35S-ATP [1000 Ci/mmol] (ICN Pharmaceutics, Irvine, USA), 0.5 μM einen der acht Decamer Primer, 1 μM des der cDNA entsprechenden Oligo (dT) Primer 4 μl aus dem oben beschriebenen cDNA Ansatz und 0.2 μl 5 U/μl Replitherm Polymerase (Epicentre, Madison, USA). Folgende PCR-Parameter wurden verwendet : Ein Denaturierungsschritt bei 94°C für 10 min., anschließend 40 Zyklen mit 94°C für 30 sec, 40°C (Annealing) für 2 min. und 72°C (Extension) für 30 sec. und zum Abschluß eine abschließende Extension bei 72°C für 7 min. 4 μl des PCR-Produktes wurden nun mit 2 μl Formamid Ladepuffer {80% Formamid; 10 mM EDTA (pH 8.0), 1 mg/ml Xylencyanol FF und 1 mg/ml Bromphenolblau} versehen, gemischt, für 2 min. bei 95°C denaturiert und dann direkt auf Eis gestellt. Die so vorbereiteten Proben wurden auf ein 5%-iges denaturierendes Polyacrylamid Gel geladen und für 3 Stunden bei maximal 40 W getrennt. Anschließend wurde das Gel auf Whatman Papier von der Glasplatte abgezogen und in einem Geltrockner fixiert. Die Radioaktivität bzw. differenzielle Banden wurde mit Hilfe eines Fuji BAS 1000 Bio-Imaging Analyser (Fuji) und des TINA Software Packets (Raytest) lokalisiert. Differentiell expremierte Banden in einer Größenordnung von 300 bis 500 bp wurden mit einem scharfen Skalpell aus dem fixierten Gel mit samt dem Whatman Papier herausgeschnitten, in ein Eppendorf Tube überführt und in 100 μl Wasser für 10 min. bei Raumtemperatur rehydriert. Anschließend wurde das Tube bei 100°C für 10 min. inkubiert und 2 min. bei füll speed in der Tischzentrifuge zentrifugiert, um Gelreste und Papier zu trennen. Der Supernatant wurde in ein neues Eppendorf Tube überführt. Nach der Zugabe von 10 μl 3 M Natriumacetat, 5 μl 10 mg/ml Glycogen als Carrier und 400 μl 100% Ethanol wurde die DNA für 60 min. bei -70°C gefällt. Die gefällte DNA wurde dann durch Zentrifugation bei 4°C und 14.000 φm pelletiert, zweimal mit 85% eiskaltem Ethanol gewaschen, an der Luft getrocknet und in 10 μl Wasser resuspendiert. Die Reamplifizierung der so gewonnen cDNA erfolgte in 50 μl PCR-Ansätzen, die folgende Komponenten enthielten : 27.8 μl Wasser, 2 μl 20 x Polymerase Puffer, 4 μl 25 mM MgCI2, 3.2 μl 500 μM dNTP Mix, 4 μl 5 μM des entsprechenden Decamer Primer, 4 μl 25 μM des entsprechenden Oligo (dT) Primer, 4 μl aus der oben beschriebenen eluierten DNA und 0.5 μl 5 U/μl Replitherm Polymerase (Epicentre). Die PCR-Parameter entsprechen denen der ersten Amplifikation. Die PCR-Produkte wurden mit Hilfe eines 1.5%-igen Agarose Gels aufgetrennt und die entsprechenden Amplifikate in den TOPO pCR2.1 Vektor einkloniert und anschließend in TOPO 10F' one-shot Kompetentezellen (Invitrogen) nach Herstellerangaben transformiert. Plasmid Isolierung aus, über blau-weiß Screening identifizierten, transformierten Bakterien wurde mit Hilfe des Plasmid Miniprep - Quantum Prep - Kits (Bio-Rad, München, Deutschland) nach Herstellerangaben durchgeführt. Die nach einem Verdau mit geeigneten Restriktionsenzymen (z.B. Eco Rl; Boehringer Mannheim, Deutschland) und einer Auftrennung auf einem 1.5%-igem Agarosegel identifizierten Inserts mit einer Länge zwischen 300 und 500 bp, wurden mit dem QIAEX II Gelelutions KIT (QIAGEN, Hilden, Deutschland) aus dem Gel eluiert. Diese DNA Fragmente wurde mit dem Rediprime Labelling Kit (Amersham, Braunschweig, Deutschland) 32P-markiert und für Northern Blot Analysen verwendet. DNA Sequenzierung dieser und anderer Klone erfolgte im wesentlichen nach der von Sanger etal (1977) beschriebenen Methode mit Hilfe des Sequenase Enzyms Version 2.1 (Amersham, Braunschweig, Deutschland). BEISPIEL 6
Northern Blot Analyse
Gesamt-RNA wurde wie in Beispiel 5 beschrieben isoliert. 10 μg verschiedener Gesamt- RNA Proben wurden auf einem 2.2 M Formaldehyd / 1.2% (w/v) Agarosegel elektrophore- tisch getrennt. Der Laufpuffer enthielt 20 mM MOPS (pH 7.0), 5 mM Natriumacetat und 1 mM EDTA (pH 7.0). Die RNA wurde nach Herstellerangaben auf Hybond-NX Membran (Amersham) übertragen und mit einem 32P-markierten Eco Rl-Eco Rl pDDd7a cDNA Frag- ment hybridisiert. Prehybridisierung (1 bis 3 Stunden bei 42°C) und Hybridisierung (16 bis 24 Stunden bei 42°C) wurde in 50% deionisertem Formamid, 5 x SSPE, 5 x Denhardt's, 0.5 % SDS durchgeführt. Denaturierte Heringsperma DNA (100 μg/ml) wurde zusammen mit der 32P-markierten Probe zum Hybridisierungsschritt zugegeben. Die Filter wurden zweimal 15 min. bei 42°C mit 2 x SSPE, 1 % SDS (w/v) und dann ein- bis zweimal bei 65°C mit 1 x SSPE, 1 % SDS (w/v) gewaschen. Die Radioaktivität wurde mit Hilfe eines Fuji BAS 1000 Bio-Imaging Analyser (Fuji) und des TINA Software Packets (Raytest) lokalisiert und quantifiziert.
Northern Blot Analysen zeigten, daß das Gen, welches dem cDNA Klon pDDd7a entspricht nur in Linien mit dem Genotyp fns+ . expremiert wird. In Linien mit dem rezessiven Genotyp fns fns konnte keine Hybndisierungssignal nachgewiesen werden (Abb. 10). Darüberhinaus verläuft das Expressionsmuster über die verschiedenen Blütenstadien parallel zu der in den Blüten gemessenen Enzymaktivität bzw. der Fiavon Akkumulation (Martens und Forkmann, 1998).
BEISPIEL 7
Isolierung des full-length Klon von pDDd7a
Der cDNA Klon pDDd7a entspricht nicht einem full-length Klon, sondern nur dem Bereich von der Häm-Bindungsstelle bis zum poly (A+) Ende (3'-Ende) der Sequenz, einschließlich mehrerer Stopkodons. Um den vollständigen Klon von pDDd7a zu bekommen, wurde eine
PCR gestütze RACE Methode nach Frohman et.al. (1988) mit Hilfe des 5'-RACE System,
Version 2.0 (GibcoBRL) verwendet.
Zuerst wurden verschiedene genspezifische 5'-RACE Primer (GSP7-9) auf der Grundlage von pDDd7a konstruiert und zusätzlich noch der nested Amplifikationsprimer "Backrace".
Mit Hilfe des GSP7 wurde Gesamt-RNA nach der in Beispiel 5 Methode in cDNA umgeschrieben. Anschließend wurde das First Strand Produkt vom Überschuß an Nukleotiden und GSP7 mit dem High Pure PCR Product Purification Kit (Boehringer Mannheim) nach Herstellerangaben gereinigt. Durch die Terminale Transferase (TdT) wurden die gereinigte cDNA mit einem Oligo-dC Tail versehen. Der Tailing Ansatz sah wie folgt aus : 6.5 μl Wasser, 5.0 μl 5 x Tailing Puffer, 2.5 μl 2 mM dCTP und 10 μl cDNA. Dieser Mix wurde für 3 min. bei 94°C denaturiert und anschließend für 1 min. auf Eis gestellt. Durch die Zugabe von 1 μl TdT wurde die Reaktion gestartet und dann für 10 min. bei 37°C inkubiert. Die Inaktivierung des Enzyms erfolgte durch Inkubation bei 65°C für 10 min. Die PCR-Amplifikation der dC-getailten cDNA erfolgte in 0.5 ml dünnwandigen PCR- Gefäßen nach folgendem Protokoll : Einmalige Denaturierung bei 94°C für 2 min., anschließend 35 Zyklen bestehend aus 94°C für 1 min., 57°C für 1 min. und 72°C für 2 min. Abschließend wurde noch ein abschließender Extensionschritt von 7 min. durchgeführt. Der PCR-Ansatz setzte sich aus folgenden Komponenten zusammen : 31.5 μl Wasser, 5.0 μl 10 x PCR-Puffer, 3.0 μl 25 mM MgCI2, 1.0 μl 10 mM dNTP, 2.0 μl 10 μM GSP8, 2.0 μl 10μM AAP, 5.0 μl dC-tailed cDNA und 0.5 μl 5 U/μl Taqf DNA Polymerase (Promega, Madison, USA). 15 μl des δ'-RACE Produktes wurden auf einem 1.5%-igem Agarosegel bei der Verwendung von geeigneten Längenstandards analysiert. Spezifische Einzelbanden im Bereich von ca. 1.5 kb wurden einkloniert und über Northern Blot bzw. Sequenzanalyse verifiziert. Mit Hilfe des 5'-RACE wurde ein 1.5 kb langes spezifisches Fragment (pTABATA) amplifi- ziert, das nur mit Gesamt-RNA aus Gerbera-Linien mit dem Genotyp fns*. hybridisiert, nicht mit RNA aus rezessiven Genotypen. Im Bereich vom genspezifischen Primer (GSP8) bis zur Häm-Bindungsstelle ist dieses neue Fragment homolog zum Fragment pDDd7a. Der Gesamt-Klon (1698 bp) besitzt einen offenen Leserahmen und zeigt auf Aminosäure Ebene eine 58%-ige Homologie zum Cytochrom P450 Klon CYP93B1 (Akashi etal., 1998).
BEISPIEL 8
Expression von pCYPFNSI in Hefe
Konstruktion von pYeCYPFNSI
Ein 1.5 kb Barn Hl - Eco Rl Fragment, entsprechend pCYPFNSI, wurde in den mit Barn Hl - Eco Rl geöffneten Hefe Expressionsvektor pYES2 ligiert. Das entstandene, als pYeCYPFNSI bezeichnete Plasmid, enthielt das pCYPFNSI cDNA Fragment in Sense- Orientierung als Insert. Hefe Transformation
Der Hefe Stamm INVSc 1 wurde mit dem Plasmid pYeCYPFNSI entspechend dem Protokoll nach Gietz et.al. (1992) transformiert. Die Selektion transformierter Hefezellen erfolgte über einen Komplementationsmarker.
Präparation von Hefemikrosomen für Flavonsynthase II Tests
Einzelne Kolonien von INVSc 1/pYeCYPFNS1 und INVSc 1, die auf Selektionsmedium
SGI {20 g Glucose (w/v), 1 g Pepton (Fluka), 6.7 g Yeast Nitrogen Base without amino acids (Difco) und 20 mg L-Tryptophan (Fluka) pro Liter} herangezogen wurden, wurden anschließend in 5 x 5 ml SGI-broth inokuliert und bei 200 φ und 30°C für 24 Stunden inkubiert. Bei einer OD60o von 0.2 - 0.4 der 1 : 10 verdünnten Vorkultur erfolgte ein vollständiges Überimpfen in 250 ml YPGE {5 g Glucose, 10 g Pepton, 10 g Yeast Extract (Fluka) und 3 Vol. % Ethanol pro Liter}. Die Hauptkultur wurde bei 30°C und 120 φm bebrütet. Bei einer OD60o von 0.8 bis 1.2 erfolgte die Induktion durch Zufütterung von 27 ml 200 g/l steriler Galaktose Lösung.
Nach 12 bis 15 Stunden, bei einer OD60o von etwa 0.6 bis 1.2 der 1 : 10 verdünnten Hauptkultur, wurden die Hefezellen durch Zentrifugation geerntet, einmal mit TEK {50 mM Tris- HCI pH 7.4, 1 mM EDTA und 0.1 M KCI} gewaschen und in TES-B* {50 mM Tris-HCI pH 7.4, 1 mM EDTA, 0.6 mM Sorbitol und 2 mM DTT} resuspendiert. Der Aufschluß der Hefen erfolgte bei 4°C mit 15 g Glassbeads (Sigma) je Ansatz. Die Glassbeads wurden anschließend dreimal mit 5 ml TES-B* gewaschen und der vereinigte Überstand mit 4 M NaCI auf eine Endkonzentration von 0.15 M eingestellt. Die Mikrosomen wurden durch die Zugabe von 2.5 g PEG-4000 (Fluka) gefällt und nach einem Waschschritt mit 2 ml TES-B* in einem Potter in 2.5 ml TEG* {50 mM Tris-HCI pH 7.4, 1 mM EDTA, 2 mM DTT} homogenisiert. Das erhaltene Homogenat diente als mikrosomale Enyzmquelle für die FNS II Tests.
FNS Il-Aktivität wurde nach der Methode von Martens und Forkmann (1998) gemessen. Der Standardtest für die Flavonsynthase II enthielt in einem Gesamtvolumen von 200 μl : 140 μl Tris-HCI Puffer (pH 7.5), 0.3 nmol radioaktive markiertes Substrat (83 Bq; [14C] Naringenin), 10 μl 20 mmol/l NADPH und 50 μl der Hefe Mikrosomen Präparation. Nach einer Inkubation von 20 min. bei 25°C wurde die Reaktion durch die Zugabe von 20 μl Methanol, das eine Mischung von Naringenin und Apigenin (Produkt) enthielt, gestoppt. Die Extraktion des Reaktionsgemisches erfolgte zweimal mit 100 bzw. 50 μl Ethylacetat. Die obere Phase wurde auf Cellulose Dünnschichtplatten im Laufmittel 1 bis 4 (s.o.) chromatographiert. Die Radioaktivität wurde mit Hilfe eines Fuji BAS 1000 Bio-Imaging Analyser (Fuji) und des TINA Software Packets (Raytest) lokalisiert und quantifiziert. Der Enzymextrakt, der aus INVSc 1/pYeCYPFNS1 hergestellt wurde, zeigt eine deutliche FNS Il-Aktivität, wohingegen die entsprechende Fraktion aus nicht transformierten Hefen keine Aktivität zeigte (Abb. 9). Die Ergebnisse der Hefeexpression bestätigen, daß das cDNA Insert pCYPFNSI für ein FNS II Enzym kodiert. Darüberhinaus zeigt das Ergebnis, daß die Expression des Enzyms, das durch den Gerbera cDNA Klon kodiert wird, in Hefe ausreichend ist, um die direkte Bildung von Flavonen zu erreichen. Dies legt nahe, daß nur ein einziges Enzym für die Einführung der Doppelbindung zwischen C2 und C3 erforderlich ist (Abb. 1B) und daß der cDNA Klon, der von Akashi etal. (1998) beschrieben worden ist, keine FNS II repräsentiert, sondern vielmehr eine Flavanon 2-Hydroxylase darstellt.
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Claims

PATENTANSPRÜCHE
1. Eine Nukleinsäuresequenz kodierend eine Flavonsynthase II (FNS II), ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus:
(a) der Nukleinsäuresequenz von SEQ ID NO:1 oder einem Teil hiervon,
(b) einer Nukleinsäuresequenz, die zu der Nukleinsäuresequenz (a) hybridisiert und/oder mindestens 40% Homologie zu dieser aufweist und die ein Protein oder Polypeptid mit der biologischen Aktivität einer Flavonsynthase II kodiert,
(c) einer Nukleinsäuresequenz, die degeneriert ist, bezogen auf eine Nukleinsäuresequenz gemäß (a) oder (b).
2. Nukleinsäuresequenz, die zu der Nukleinsäuresequenz aus Anspruch 1 komplementär ist.
3. Eine Nukleinsäuresequenz gemäß Anspruch 1 oder 2, wobei die Nukleinsäuresequenz DNA oder RNA ist.
4. Eine Nukleinsäuresequenz gemäß Anspruch 1 , wobei die Nukleinsäuresequenz abgeleitet ist aus einer Pflanze aus der Gruppe von Pflanzen, bestehend aus Gerbera (Gerbera Hybriden), Aster (Callistephus chinensis), Löwenmäulchen (Antirrhinum majus), Chrysantheme (Chrysanthemum indicum), Dahlie (Dahlia Hybriden), Gloxinie (Sinningia Hybriden), Verbene (Verbena Hybriden) und Streptocarpus (S. Hybriden).
5. Ein rekombinantes DNA-Molekül, enthaltend eine Nukleinsäuresequenz gemäß einem der Ansprüche 1 bis 4.
6. Rekombinantes DNA Molekül gemäß Anspruch 5, wobei das rekombinante DNA-
Molekül ein Vektor ist oder ein Vektor mit einem Promotor.
7. Eine Wirtszelle, enthaltend ein DNA-Molekül gemäß Anspruch 6.
8. Wirtszelle gemäß Anspruch 7, die eine bakterielle Zelle, eine Hefezelle, eine Insektenzelle, eine Pflanzenzelle oder eine Säugerzelle ist.
9. Polypeptid, kodiert durch eine Nukleinsäuresequenz gemäß einem der Ansprüche 1 bis 4.
10. Polypeptid mit einem Teil oder der gesamten Aminosäuresequenz aus SEQ ID NO:2 oder Derivate hiervon.
11. Polypeptid gemäß Anspruch 10, wobei das Polypeptid Flavonsynthase Il-Aktivität besitzt.
12. Polypeptid gemäß Anspruch 11 , wobei das Polypeptid abgeleitet ist aus einer Pflanze aus der Gruppe von Pflanzen, bestehend aus Gerbera (Genbera Hybriden), Aster (Callistephus chinensis), Löwenmäulchen (Antirrhinum majus), Chrysantheme (Chrysanthemum indicum), Dahlie (Dahlia Hybriden), Gloxinie (Sinningia Hybriden), Verbene (Verbena Hybriden) und Streptocarpus (S. Hybriden).
13. Transgene Pflanze, enthaltend eine Nukleinsäuresequenz gemäß einem der Ansprüche 1 bis 4.
14. Transgene Pflanze gemäß Anspruch 13, wobei die Nukleinsäuresequenz zur Expression geeignet ist und diese Expression gegebenenfalls regulierbar ist oder entwicklungsbedingt reguliert wird.
15. Transgene Pflanze gemäß einem der Ansprüche 13 oder 14, ausgewählt aus der Gruppe von Pflanzen bestehend aus Gerbera (Gerbera Hybriden), Aster (Callistephus chinensis), Löwenmäulchen (Antirrhinum majus), Chrysantheme (Chrysanthemum indicum), Dahlie (Dahlia Hybriden), Gloxinie (Sinningia Hybriden), Verbene (Ve ena Hybriden) und Streptocaφus (S. Hybriden).
16. Verfahren zur Herstellung einer transgenen Pflanze mit einer veränderten Blütenfarbe, umfassend das Einbringen einer Nukleinsäuresequenz gemäß einem der Ansprüche 1 bis 4 in eine Zelle einer geeigneten Pflanze und der Regeneration einer transgenen Pflanze aus dieser Zelle und das Heranziehen dieser transgenen Pflanze über einen geeigneten Zeitraum und unter Bedingungen, die geeignet für die Expression der eingebrachten Nukleinsäuresequenz sind.
17. Verfahren gemäß Anspruch 16, wobei die eingebrachte Nukleinsäuresequenz in der Pflanze exprimiert wird.
18. Verfahren gemäß Anspruch 16 oder 17, wobei die transgene Pflanze ausgewählt ist aus der Gruppe von Pflanzen bestehend aus Euphorbia (E. pulcherrima), Cyclamen (Cyclamen persicum), Rose (Rosa Hybrida), Pelargonium (P. spec), Begonia (ß. spec), Nelke (Dianthus caryophyllus) und Tulpe (Tulipa Hybriden).
19. Verfahren gemäß Anspruch 16 oder 17, wobei die Pflanze zur Expression einer endogenen Flavonsynthase II (FNS II) fähig ist und diese bei Expression der eingebrachten Nukleinsäuresequenz coexprimiert wird.
20. Verfahren gemäß Anspruch 19, wobei die transgene Pflanze ausgewählt ist aus der Gruppe von Pflanzen bestehend aus Gerbera (Gerbera Hybriden), Aster (Callistephus chinensis), Löwenmäulchen (Antirrhinum majus), Chrysantheme (Chrysanthemum indicum), Dahlie (Dahlia Hybriden), Gloxinie (Sinningia Hybriden), Verbene (Verbena Hybriden) und Streptocarpus (S. Hybriden).
21. Verfahren gemäß Anspruch 19 oder 20, wobei die endogen vorhandene Flavonsynthase II (FNS Il)-Aktivität durch Einbringen der Nukleinsäuresequenz reduziert wird.
22. Verwendung eines Polypeptids gemäß einem der Ansprüche 9 bis 12 zur Synthese von Flavonen.
23. Verwendung gemäß Anspruch 22, wobei die Flavone als Medikament eingesetzt werden.
24. Verwendung gemäß Anspruch 23, wobei die Flavone in der Krebstherapie eingesetzt werden.
25. Verwendung gemäß Anspruch 22, wobei die Flavone als bioaktive Substanzen eingesetzt werden.
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