DE69231745T2

DE69231745T2 - Gensequenzen kodierend für Flavonoid-Stoffwechselwegenzyme und deren Verwendung

Info

Publication number: DE69231745T2
Application number: DE69231745T
Authority: DE
Inventors: Edwina Cecily Cornish; Timothy Albert Holton; Filippa Kovacic; Diane Ruth Lester; Yoshikazu Tanaka
Original assignee: International Flower Developments Pty Ltd
Current assignee: International Flower Developments Pty Ltd
Priority date: 1991-07-11
Filing date: 1992-07-10
Publication date: 2001-06-28
Anticipated expiration: 2012-07-11
Also published as: PT522880E; IL102450A0; US5349125A; GR3036011T3; WO1993001290A1; SG45187A1; CA2112373A1; CN1113960C; CN1492046A; ES2155438T3; DK0522880T3; EP0522880A2; JP3087246B2; JP2000023686A; CA2112373C; US5861487A; JPH06500239A; NZ243500A; PL298239A1; IE922272A1

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft im allgemeinen Gensequenzen, die für metabolisierende Enzyme des Flavanoidstoffwechsels codieren und deren Verwendung z. B. bei der Veränderung der Pigmentierung in Pflanzen und anderen Organismen.
Die Blumen- bzw. Blütenindustrie ist bestrebt neue und verschiedene Arten blühender Pflanzen zu entwickeln. Ein effektiver Weg, um derartige neue Arten zu entwickeln, ist durch die Veränderung der Pflanzenfarbe und klassische Zuchttechniken sind mit gewissem Erfolg verwendet worden, um einen großen Bereich von Farben für die meisten kommerziellen Blütenarten entwickeln. Dieser Ansatz ist jedoch begrenzt worden durch die Einschränkungen des Genpools einer speziellen Spezies und aufgrund dessen ist es für eine einzelne Spezies selten, daß sie das gesamte Spektrum farbiger Arten aufweist. Tatsächlich waren aufgrund der begrenzten Verfügbarkeit von blauen Blüten weniger als 5% der Schnittblumen, die in dem Auktionssystem in Holland 1988 vertrieben wurden, blau. Unter den zwölf meistverkauften Blumen bieten nur Iris und Fresien blau gefärbte Arten und diese Arten stellen weniger als 4% aller Blumenverkäufe dar. Die Entwicklung blauer Arten der Hauptschnittblumenspezies, z. B. Rose, Chrysantheme, Nelke und Gerbera würde einen deutlichen Vorteil sowohl in Schnittblumen- als auch Zierpflanzenmärkten bieten.
Die Blütenfarbe ist vorrangig zurückzuführen auf zwei Pigmenttypen: Flavonoide und Carotenide. Flavonoide bieten einen Farbenbereich von gelb über rot bis blau. Carotenide vermitteln eine orange oder gelbe Färbung und sind üblicherweise das einzige Pigment in gelben oder orangen Blüten. Die Flavonoidmoleküle, die den Hauptbeitrag zur Blütenfarbe leisten, sind die Anthocyanine, welche glykosylierte Derivate von Cyanidin, Delphinidin, Petunidin, Peonidin, Malvidin und Pelargonidin sind, und sind in der Vakuole lokalisiert. Die verschiedenen Anthocyanine können deutliche Unterschiede in der Farbe erzeugen. Die Blütenfarbe wird ebenfalls beeinflusst durch die Copigmentierung mit farblosen Flavonoiden, Metallkomplexierung, Glykosylierung, Acylierung, Methylierung und den Vakuolen-pH-Wert (Forkmann, 1991).
Der Biosyntheseweg für die Flavonoidpigmente (hier nachfolgend als der "Flavonoidstoffwechsel" bezeichnet) ist weitgehend gesichert und in Fig. 1 gezeigt (Ebel und Hahlbrock, 1988; Hahlbrock und Grisebach, 1979; Wiering und de Vlaming, 1984; Schram et al., 1984; Stafford 1990). Der erste auf diesem Weg durchgeführte Schritt umfaßt die Kondensation von drei Molekülen Malonoyl-CoA mit einem Molekül p-Coumaroyl-CoA. Diese Reaktion wird durch das Enzym Chalconsynthase (CHS) katalysiert. Das Produkt dieser Reaktion, 2',4,4',6'- Tetrahydroxychalcon, wird normalerweise schnell isomerisiert, um Naringenin durch das Enzym Chalconflavanonisomerase (CHI) zu bilden. Naringenin wird nachfolgend an der 3-Position des zentralen Ringes durch Flavanon-3-hydroxylase (F3H) hydroxyliert, um Dihydrokaempferol (DHK) zu bilden.
Der B-Ring von Dihydrokaempferol kann entweder an der 3'- oder sowohl an der 3'- als auch 5'-Position hydroxyliert werden, um Dihydroquercetin (DHQ) bzw. Dihydromyricetin (DHM) zu erzeugen. Die von diesem Weg umfaßten Schlüsselenzyme sind Flvavonoid-3'-hydroxylase (hier nachfolgend als 3'-Hydroxylase bezeichent) und Flavonoid-3',5'-hydroxylase (hier nachfolgend als 3',5'-Hydroxylase bezeichnet). Die 3'-Hydroxylase wirkt auf DHK, um DHQ zu erzeugen und auf Naringenin, um Eriodictyol zu erzeugen. Die 3',5'-Hydroxylase ist ein Breitspektrumenzym, das die Hydroxylierung von Naringenin und DHK in den 3'- und 5'-Positionen und von Eriodictyol und DHQ in der 5'-Position (Stotz und Forkmann, 1982) katalysiert, wobei in beiden Fällen Pentahydroxyflavanon bzw. DHM erzeugt wird. Das Muster der Hydroxylierung des B-Ringes spielt eine Schlüsselrolle bei der Bestimmung der Blütenblattfarbe.
Flavonoid-3'-Hydroxylierung in mikrosomalen Extrakten erfordert NADPH und O&sub2;, als auch das Aglycon von entweder Naringenin oder DHK. Das Petersilienzellkulturenzym ist gut untersucht (Hagmann et al., 1983). Inhibierung durch Kohlenmonoxid, Cytochrom c und NADP&spplus; zeigten, daß das Enzym ein Cytochrom P450-abhängiges Enzym ist. Eine ähnliche Enzymaktivität wurde in Mais gezeigt (Larson und Bussard, 1986). Die 3',5'-Hydroxylase ist ebenfalls aus der Cytochrom P450-Enzymklasse. Cytochrom P450-Enzyme sind in der Natur weit verbreitet und sind charakterisiert worden in Vertebraten, Insekten, Hefen, Pilzen, Bakterien und in einer Pflanze. Sequenzen von mindestens 154 Cytochrom P450-Genen sind bestimmt worden und die Gene wurden in 27 verschiedene Genfamilien (Nebert et al., 1991) eingeteilt. Innerhalb einer einzelnen Familie sind die P450-Proteinsequenzen im allgemeinen mit > 40% identisch, während Sequenzen innerhalb der gleichen Subfamilie um > 46% identisch sind (Nebert et al., 1991). Die Information über P450-Pflanzen-Cytochrome ist begrenzt.
Die Fähigkeit, die 3'- oder 3',5'-Hydroxylaseaktivität oder andere Enzyme, die von dem Flavonoidweg umfaßt sind, zu steuern, würde ein Mittel bereitstellen, um die Blütenblattfarbe zu verändern, wobei es möglich wird, daß eine einzelne Spezies ein breiteres Blütenfarbenspektrum exprimiert. Gemäß der vorliegenden Erfindung würden die Gensequenzen, die für die Flavonoidwegenzyme, wie etwa 3',5'- Hydroxylase, codieren, identifiziert und kloniert. Diese rekombinanten Sequenzen erlauben die Modulierung des DHK- Metabolismus als auch des Metabolismus anderer Substrate, wie etwa DHQ, Naringenin und Eriodictyol, wobei das Hydroxylierungsmuster der Anthocyanine bestimmt wird und ein Mittel zum Verändern der Blütenblattfarbe bereitgestellt wird. Die vorliegende Erfindung erstreckt sich jedoch über Blumen bishin zu Frucht- und Gemüsepflanzen und Blätter von z. B. Zierpflanzen.
Demgemäß liefert ein Aspekt der vorliegenden Erfindung ein Nukleinsäureisolat, umfassend eine Sequenz von Nukleotiden, die codiert für, oder komplementär zu einer Sequenz ist, die codiert für ein Dihydrokaempferol (DHK)-hydroxylierendes Enzym oder ein Derivat oder einen Teil davon.
Aus praktischen Gründen und in Kurzschreibweise umfaßt hier eine Bezugnahme auf "DHK-hydroxylierendes Enzym" hydroxylierende Enzmye des Flavönoidweges, die auf eines oder mehrere der folgenden wirken: DHK, DHQ, Naringenin, Eriodictyol.
Vorzugsweise ist das DHK-hydroxylierende Enzym 3',5'- Hydroxylase. Jedoch könnten die Verfahren, die verwendet werden, um die Gensequenzen zu klonieren, die für dieses Enzym codieren, verwendet werden, um andere Gensequenzen zu isolieren, die für Enzyme codieren, wie etwa die 3'- Hydroxylase. Demgemäß sollte eine hier genommene Bezugnahme auf die Isolierung und das Klonieren von 3',5'-Hydroxylase so aufgefaßt werden, daß die Bezugnahme andere Flavonoidhydroxylierende Enzyme, wie etwa 3'-Hydroxylase, umfaßt.
Der Ausdruck "Nukleinsäureisolat" bedeutet eine genetische Sequenz in einem nicht natürlich auftretenden Zustand. Im allgemeinen bedeutet dies, daß sie entfernt von ihrem natürlichen Zustand isoliert wird oder durch Verfahren gebildet wird, welche in ihrer natürlichen Umgebung nicht notwendigerweise auftreten. Im spezielleren umfaßt er Nukleinsäuremoleküle, die in vitro gebildet oder erhalten werden, rekombinante oder synthetische Moleküle und Nukleinsäuren in Kombination mit heterologen Nukleinsäuren. Er erstreckt sich auch auf natürlich auftretende Sequenzen, nachfolgend auf mindestens eine teilweise Reinigung relativ zu anderen Nukleinsäuresequenzen.
Wie hier verwendet, bedeutet "Gensequenzen" jede benachbarte Serie von Nukleotidbasen, die direkt oder über eine komplementäre Basenserie eine Sequenz von Aminosäuren in einem DHK-hydroxylierenden Enzym, z. B. 3',5'-Hydroxylase, spezifizieren. Die Nukleinsäure oder ihre komplementäre Form kann für die gesamte Enzymlänge oder ein Derivat davon codieren. "Derivat" bedeutet jede einzelne oder mehrfache Aminosäuresubstitutionen, Deletionen und/oder Additionen relativ zu dem natürlich auftretenden Enzym. In dieser Hinsicht umfaßt die Nukleinsäure die natürlich auftretende Nukleotidsequenz, die für 3',5'-Hydroxylase codiert, oder kann einzelne oder mehrere Nukleotidsubstitutionen, Deletionen und/oder Additionen zu der natürlich auftretenden Sequenz enthalten.
Aminosäureinsertionsderivate des DHK-hydroxylierenden Enzyms und im besonderen die 3',5'-Hydroxylase der vorliegenden Erfindung umfassen amino- und/oder carboxylterminale Fusionen, als auch Intra-Sequenz-Insertionen von einzelnen oder mehreren Aminosäuren. Insertionsaminosäuresequenzvarianten sind diejenigen, in welchen ein oder mehrere Aminosäurereste in eine vorbestimmte Stelle in dem Protein eingeführt werden, wenngleich statistische eine Insertion ebenfalls mittels eines geeigneten Screenings des resultierenden Produkts möglich ist. Deletionsvarianten sind gekennzeichnet durch die Entfernung einer oder mehrerer Aminosäuren aus der Sequenz. Substitutionsaminosäurevarianten sind diejenigen, worin mindestens ein Rest in der Sequenz entfernt worden ist und ein anderer Rest an seiner Stelle insertiert wurde. Typische Substitutionen sind diejenigen, die entsprechend der folgenden Tabelle 1 gemacht wurden:

TABELLE 1

Geeignete Reste für Aminosäuresubstitutionen

Ursprünglicher Rest Beispielhafte Substitution

Ala Ser
Arg Lys
Asn Gln; His
Asp Glu
Cys Ser
Gln Asn
Glu Asp
Gly Pro
His Asn; Gln
Ile Leu; Val
Leu Ile; Val
Lys Arg; Gln; Glu
Met Leu; Ile
Phe Met; Leu; Tyr
Ser Thr
Thr Ser
Trp Tyr
Tyr Trp; Phe
Val Ile; Leu
Wenn die 3',5'-Hydroxylase durch Aminosäuresubstitution derivatisiert wird, werden die Aminosäuren im allgemeinen durch andere Aminosäuren mit ähnlichen Eigenschaft ersetzt, wie etwa Hydrophobizität, Hydrophilie, Elektronegativität, sperrige Seitenketten u. dgl. Aminosäuresubstitutionen bestehen typischerweise aus Einzelresten. Aminosäureinsertionen werden typischerweise in der Größenordnung von etwa 1 bis 10 Aminosäureresten sein und Deletionen werden sich im Bereich von etwa 1 bis 20 Resten bewegen. Vorzugsweise werden Deletionen oder Insertionen in benachbarten Paaren gemacht, d. h. eine Deletion von zwei Resten oder eine Insertion von zwei Resten.
Die Aminosäurevarianten, auf die oben Bezug genommen wird, können leicht unter Verwendung von Peptidsynthesetechniken, die in der Technik allgemein bekannt sind, durchgeführt werden, wie etwa durch Festphasenpeptidsynthese (Merrifield, 1964) u. dgl. oder durch rekombinante DNA-Manipulationen. Techniken zum Herstellen von Substitutionsmutationen an vorbestimmten Stellen in DNA mit bekannter oder teilweise bekannter Sequenz sind allgemein bekannt und umfassen z. B. M13-Mutagenese. Die Manipulation einer DNA-Sequenz zum Herstellen von Variantenproteinen, welche sich als Substitutions-, Insertions- oder Deletionsvarianten zeigen, sind geeigneterweise beschrieben, z. B. in Sambrook et al. (1989).
Andere Beispiele rekombinanter oder synthetischer Mutanten und Derivate dieser 3',5'-Hydroxylase der vorliegenden Erfindung umfassen einzelne oder mehrere Substitutionen, Deletionen und/oder Additionen von einem Molekül, das mit dem Enzym verbunden ist, wie etwa Kohlehydrate, Lipide und/oder Proteine oder Polypeptide.
Die Ausdrücke "Analoge" und "Derivate" erstrecken sich ebenfalls auf jedes funktionale chemische Äquivalent der 3',5'-Hydroxylase und ebenfalls auf jedes oben beschriebene Aminosäurederivat.
Die Nukleinsäuren der vorliegenden Erfindung können Ribonukleinsäuren oder Deoxyribonukleinsäuren, einzel- oder doppelsträngige und lineare oder kovalent geschlossene ringförmige Moleküle sein. Vorzugsweise ist das Aminosäuremolekül cDNA. Die vorliegende Erfindung umfaßt auch ein Nukleinsäureisolat, umfassend eine Sequenz von Nucleotiden, die für ein Dihydrokämpferol (DHK)-hydroxylierendes Enzym oder ein Derivat davon codiert, das mindestens eines aus DHK, DHQ, Naringenin und Eriodicytol hydroxyliert, oder die Sequenz, die dazu komplementär ist, wobei die Sequenz umfaßt:
die in Fig. 9 oder 10 angegebene Nucleotidsequenz oder die dazu komplementäre Sequenz, oder
eine Nucleotidsequenz, die mit der in Fig. 9 oder 10 angegebenen Nucleotidsequenz oder der dazu komplementären Sequenz hybridisieren kann, unter stringenten Bedingungen von 20% Formamid, 6xSSC, 1% Gew./Vol. SDS bei 42ºC für 16 Stunden, gefolgt von einem Waschen in 6xSSC, 1% Gew./Vol. SDS bei 65ºC für 1 Stunde.
Die hier in Betracht gezogenen Nukleinsäuremoleküle können alleine oder in Verbindung mit einem Vektormolekül und vorzugsweise einem Expressionsvektor vorliegen. Derartige Vektormoleküle replizieren und/oder exprimieren sich in eukaryotischen und/oder prokaryotischen Zellen. Vorzugsweise ist das Vektormolekül oder Teile davon in der Lage, in das Pflanzengenom zu integrieren. Das Nukleinsäuremolekül kann zusätzlich eine Promotorsequenz enthalten, die die Expression des Nukleinsäuremoleküls in einer Pflanzenzelle steuern kann. Das Nukleinsäuremolekül und der Promotor können in die Zelle durch eine Vielzahl von Mittel eingebracht werden, wie etwa durch Elektroporation oder einen Agrobakterium vermittelten Transfer.
Die vorliegende Erfindung wird beispielhaft unter Verwendung der Nukleinsäuresequenzen dargestellt, welche aus Petunie erhalten werden, da diese zur Zeit die geeignetste und bevorzugteste Quelle des Materials ist. Jedoch wird der Fachmann sofort einschätzen können, daß ähnliche Sequenzen aus einer Vielzahl von Quellen isoliert werden können, wie etwa aus anderen Pflanzen oder bestimmten Mikroorganismen. Die Genetik der 3'-Hydroxylasen ist in Blüten von Antirrhinum, Verbene und Petunie und in Keimpflanzen und Aleuronschichten von Maissamen (Heller und Forkmann, 1988) bekannt. Das Gen eos steuert die 3'-Hydroxylase in Antirrhinum (Forkmann und Stotz, 1981), während die Ht1- und Pr-Gene ähnliche Enzyme in Petunie (Stotz et al., 1985) bzw. in der Maisaleuronschicht (Larson und Bussard, 1986) steuern. Chemogenetische Untersuchungen von z. B. Verbena hybrida haben gezeigt, daß in dieser Pflanze die Hydroxylierung des B-Ringes des Anthocyanins sowohl in der 3'- als auch 5'-Position durch ein Gen gesteuert wird (Beale, 1940). Enzymaktivität für 3',5'-Hydroxylierung liegt nur in Blütenextrakten von delphinidinerzeugenden Stämmen (Stotz und Forkmann, 1982) vor. NADPH-abhängige mikrosomale Enzymaktivität für Hydroxylierung in der 3'- und 5'-Position wurde ebenfalls in Blütenextrakten von Callistephus und Lathyrus (Forkmann, 1991) gezeigt. Wie in V. hybrida, wurde gefunden, daß Enzymaktivität für die 3',5'-Hydroxylierung von Flavanonen und Dihydroflavonolen nur in Blütenextrakten derjenigen Stämme vorliegt, welche 3',4',5'-hydroxylierte Flavonoidverbindungen (oder methylierte Derivate dieser) in den Blüten enthalten. Damit ist die Bildung des 3',4',5'- hydroxylierten Flavonoids eindeutig abhängig von der Flavonoid-3',5'-Hydroxylaseaktivität.
Die Gene, welche für 3',5'-Hydroxylase codieren, wurden in einer Vielzahl von Zierpflanzen, einschließlich Callistephus (R), Petunie (Hf1, Hf2) und Verbene (P), durch das Vorliegen der jeweiligen Mutanten, die Delphinidin nicht erzeugen können, identifiziert. Darüber hinaus wurden die jeweiligen Enzymaktivitäten gezeigt (Forkmann, 1991). Die 3',5'- Hydroxylase wurde ebenfalls als ein mikrosomales Cytochrom P450-Enzym in Betracht gezogen (Heller und Forkmann, 1988). Es gibt jedoch keine veröffentlichten Berichte über das Klonieren eines 3',5'-Hydroxylasegens aus diesen oder anderen Pflanzenspezies.
Andere Pflanzenspezies, die 3',4',5'-hydroxylierte Flavonoide oder ihre Derivate erzeugen können, umfassen Hydrangea (Takeda et al., 1985), Delphinium (Asen et al., 1975), Lisianthus (Asen et al., 1986), Tomate (von Wettstein-Knowles, 1968) und Kartoffel (Harborne und Simmonds, 1962). Diese Spezies oder andere Pflanzen, die 3',4',5'-hydroxylierte Flavonoide erzeugen können, wären ebenfalls geeignete Quellen für die Isolierung eines 3',5'-Hydroxylasegens. Alle derartigen Nukleinsäuresequenzen, die direkt oder indirekt für einen Flavonoidweg (z. B. 3',5'-Hydroxylase) codieren, sind von der vorliegenden Erfindung umfaßt, ungeachtet ihrer Quelle.
Die hier angegebene Genklonierungssequenz kann zusätzlich verwendet werden, um ein 3',5'-Hydroxylasegen aus anderen Pflanzen zu isolieren, welche 3',4',5'-hydroxylierte Flavonoide erzeugen. Klone und Oligonukleotide, die hier offenbart sind, können verwendet werden, um ähnliche Gewnsequenzen nachzuweisen, zu isolieren und zu klonieren, unter Verwendung der gleichen Technologie, wie hier beschrieben, wenngleich eine oder mehrere kleinere Modifikationen der experimentellen Verfahren erforderlich sein können. Alle derartigen kleineren Variationen sind von der vorliegenden Erfindung umfaßt. Beispiele anderer geeigneter Enzymquellen, wie etwa 3',5'-Hydroxylase, umfassen, ohne darauf begrenzt zu sein, Verbene, Delphinium, Traube, Iris, Fresie, Hydrangea, Cyclamen, Kartoffel, Stiefmütterchen und Aubergine.
Gemäß der vorliegenden Erfindung kann eine Nukleinsäuresequenz, die für ein DHK-hydroxylierendes Enzym, wie etwa 3',5'-Hydroxylase codiert, eingebracht und exprimiert in einer transgenen Pflanze werden, wobei ein Mittel bereitgestellt wird, um DHK und/oder andere geeignete Substrate, falls sie in der Pflanzenzelle synthetisiert werden, letztendlich in Anthocyaninderivate von Anthocyanidinen, wie etwa Delphinidin, Petunidin oder Malvidin, umzuwandeln. Die Herstellung dieser Anthocyanine trägt zur Herstellung einer Vielzahl von Schattierungen mit blauer Farbe oder bläulicher Farbe bei. Die Expression der Nukleinsäuresequenz in der Pflanze kann konstitutiv, induzierbar oder entwicklungsmäßig sein.
Gemäß einem anderen Aspekt liefert die vorliegende Erfindung ein Verfahren zum Erzeugen einer transgenen Pflanze, die ein rekombinantes DHK-hydroxylierendes Enzym oder aktive Mutanten davon oder Derivate davon exprimieren kann, wobei das Verfahren umfaßt das Einbringen in eine Zelle einer geeigneten Pflanze eines Nukleinsäuremoleküls, welches eine Sequenz von Nukleotiden umfaßt, die für das DHK-hydroxylierende Enzym codieren, unter Bedingungen, die die mögliche Expression des Nukleinsäuremoleküls erlauben, Regenerieren einer transgenen. Pflanze aus der Zelle und Züchten der transgenen Pflanze für eine Zeit und unter Bedingungen, die ausreichend sind, um die Expression der Nukleinsäure zu erlauben.
In einer bevorzugten Ausführungsform sieht die vorliegende Erfindung ein Verfahren zum Erzeugen einer transgenen blühenden Pflanze vor, die veränderte Infloreszenzeigenschaften zeigt, wobei das Verfahren umfaßt, daß in eine Zelle einer geeigneten Pflanze die Nukleinsäuresequenz der vorliegenden Erfindung eingebracht wird, unter Bedingungen, die die mögliche Expression der Nukleinsäuresequenz erlauben, Regenerieren einer transgenen Pflanze aus der Zelle und Züchten der transgenen Pflanze für eine Zeit und unter Bedingungen, die ausreichend sind, um die Expression der Nukleinsäuresequenz in dem DHK-hydroxylierenden Enzym zu erlauben.
Vorzugsweise ist das DHK-hydroxylierende Enzym 3',5'- Hydroxylase, wird entwicklungsmäßig gesteuert und die veränderte Infloreszenz umfaßt die Erzeugung von blauen oder roten Blüten oder anderen Farbschattierungen, in Abhängigkeit von den physiologischen Bedingungen der Rezipientenpflanze. Unter "geeignete Pflanze" ist eine Pflanze zu verstehen, die in der Lage ist, ein Substrat für das 3,5'-Hydroxylaseenzym zu erzeugen, und welche die geeigneten physiologischen Eigenschaften und den Genotyp aufweist, die erforderlich sind für die Entwicklung der gewünschten Farbe. Dies kann umfassen, ist jedoch nicht begrenzt auf, Rose, Petunie, Nelke, Chrysantheme und Gerbera. In bestimmten Pflanzenspezies kann es bevorzugt sein, eine "hohe pH-Linie" auszuwählen, wobei eine derartige als eine Abart definiert ist, die einen höheren als den mittleren Petalvakuolar-pH aufweist. Die Herkunft der rekombinanten 3',5'-Hydroxylase oder ihrer Mutanten und Derivate ist wie hier zuvor beschrieben und umfaßt Enzyme, die von Petunie, Verbene, Delphinium, Traube, Iris, Fresie, Hydrangea, Cyclamen, Kartoffel, Stiefmütterchen oder Aubergine stammen.
Der Fachmann in der Technik wird unabhängig die Variationen erkennen, die auf dieses Verfahren anwendbar sind, wie etwa Erhöhen oder Verringern der Expression des in einer Zielpflanze natürlich vorliegenden Enzyms. Dies würde zu differrierenden Farbschattierungen führen, wie etwa verschiedene Schattierungen von blau oder rot.
Um die Aktivität eines Zielenzyms, wie etwa 3',5'-Hydroxylase, zu verringern, könnte die Nukleinsäureseguenz, die für dieses Enzym oder verschiedene Teile davon codiert, in der Antisense- Orientierung verwendet werden. Wenngleich es nicht gewünscht wird, die vorliegende Erfindung auf eine Theorie zu begrenzen, ist es möglich, daß eine Antisense-Nukleinsäureseguenz ein Doppel (Duplex) mit der gesamten oder einem Teil der natürlich auftretenden mRNA bilden würde, die für das Enzym spezifiziert ist, wobei die Translation der mRNA in das aktive Enzym verhindert wird. Alternativ könnten Ribozyme verwendet werden, um die Zielnukleinsäuresequenzen zu inaktivieren.
Demgemäß erstreckt sich die vorliegende Erfindung auf ein Verfahren zum Herstellen einer transgenen Pflanze, die in der Lage ist zum Exprimieren eines rekombinanten Dihydrokaempferol (DHK)-hydroxylierenden Enzyms oder welche die Transkription einer Nukleinsäuresequenz steuert, welche im wesentlichen komplementär zu dem gesamten oder einem Teil des mRNA-Moleküls ist, das in ein DHK-hydroxylierendes Enzym translatierbar ist, wobei das Verfahre das Einbringen des Nukleinsäureisolats nach Anspruch 1 oder 6 in eine Zelle einer geeigneten Pflanze unter Bedingungen, die die mögliche Expression des Nukleinsäureisolats erlauben, Regenerieren einer transgenen Pflanze aus der Zelle und Züchten der transgenen Pflanze für eine Zeit und unter Bedingungen, die ausreichend sind, um die Expression des Nukleinsäureisolats zu erlauben, umfaßt. In dieser Ausführungsform umfassen geeignete Rezipientenpflanzen unter anderem Iris, Tulpe, Lilie, Lisianthus, Fresie, Delphinium, Limonium und Pelargonium.
Die obigen Verfahren zum Herstellen transgener Pflanzen erstrecken sich daher über die Alternative des Einführens eines Gens oder eines DNA-Fragments, das für eine AntisensemRNA oder ein Oligonukleotid codieren, das Gesamte oder einen Teil oder einen Bereich einer Sequenz von Nukleotiden, die codieren für oder komplementär sind zu einer Sequenz, die eine 3',5'-Hydroxylase codiert.
Demgemäß umfaßt die vorliegende Erfindung alle transgenen Pflanzen, die die gesamte oder ein Teil der Nukleinsäuresequenz der vorliegenden Erfindung oder Antisense- Formen davon und/oder homologe oder damit verwandte Formen davon enthalten und im besonderen diejenigen transgenen Pflanzen, welche veränderte Influoreszenzeigenschaften zeigen.
Die transgenen Pflanzen enthalten daher ein beständig eingeführtes Nukleinsäuremolekül, umfassend eine Nukleotidsequenz, die codiert für oder komplementär ist zu einer Sequenz, die für ein DHK-hydroxylierendes Enzym codiert und im besonderen Pflanzenlinien mit hohem pH-Wert, die derartige eingeführte Nukleinsäuremoleküle, auf welche oben Bezug genommen wurde, aufweisen. Die Erfindung umfaßt ebenfalls Samen aus derartigen transgenen Pflanzen. Derartige Samen, im besonderen wenn sie gefärbt sind, werden als Markenzeichen für Pflanzen geeignet sein.
Ein weiterer Aspekt der vorliegenden Erfindung richtet sich auf rekombinante Formen der DHK-hydroxylierenden Enzyme und im besonderen rekombinante 3',5'-Hydroxylase. Die rekombinanten Formen des Enzyms werden eine Quelle für Forschungsmaterial sein, um z. B. mehr aktive Enzyme zu entwickeln und können geeignet sein, um in vitro-Systeme zur Erzeugung von gefärbten Verbindungen zu entwickeln.
Ein anderer Aspekt der vorliegenden Erfindung sieht ein Verfahren zum Klonieren eines Nukleinsäuremoleküls vor, umfassend eine Sequenz von Nukleotiden, welche codiert für oder komplementär ist zu einer Sequenz, welche für ein Cytochrom P450-Molekül oder ein ähnliches Molekül aus einer Pflanze codiert, das Verfahren umfassend die Amplifikation von Cytochrom P450-Nukleotidsequenzen oder komplementären Sequenzen aus einer geeigneten Präparation von Nukleinsäuremolekülen von Zellen der Pflanze durch Polymerasekettenreaktionen, unter Verwendung von eines oder mehrerer Oligonukleotidprimer, wobei diese Primer eine Nukleotidsequenz aufweisen, die von einer oder mehreren Consensus-Sequenzen bekannter mikrosomaler Cytochrom P450- Moleküle stammen.
In einer damit verwandten Ausführungsform umfaßt das Verfahren zum Klonieren der Cytochrom P450-Nukleinsäuremoleküle oder ihrer komplementären Sequenzen das Auswählen eines Klons aus einer geeigneten cDNA-Bibliothek, der fähig ist zum Hybridisieren an einen oder mehrere Oligonukleotidprimer, die einer oder mehreren Consensus-Sequenzen oder bekannten Cytochrom P450-Molekülen entsprechen.
Vorzugsweise ist eine der Consensus-Sequenzen aus der Häm- Bindungsdomäne von Cytochrom P450-Molekülen und ist bevorzugter F(G,S) XGXRXCXG (worin X eine Aminosäure ist) oder sie ist PGFAGRRICPG. In einer bevorzugtesten Ausführungsform codieren die zu klonierenden Nukleotidsequenzen für oder sind komplementär zu Sequenzen, die codieren für ein DHKhydroxylierendes Enzym und im besonderen 3',5'-Hydroxylase. Noch bevorzugter ist die 3',5'-Hydroxylase wie hier zuvor beschrieben und im spezielleren weist sie eine Aminosäuresequenz auf oder wird codiert durch eine Sequenz von Nukleotiden, die im wesentlichen wie in den Fig. 9 oder 10 angegeben sind oder sie hat Ähnlichkeiten hierzu, wie oben definiert.
Die vorliegende Erfindung wird weiter durch Bezugnahme auf die folgenden nicht begrenzenden Figuren und Beispiele beschrieben.
Die Fig. 1(A) und (B) sind schematische Darstellungen des Biosyntheseweges für die Flavonoidpigmente. Enzyme, die in dem ersten Teil des Weges umfaßt sind, wurden wie folgt angegeben: PAL = Phenylalaninammonialyase; C4H = Cinnamat-4-hydroxylase; 4CL = 4-Coumarat: CoA-Ligase; CHS = Chalconsynthase; CHI = Chalconflavanonisomerase; F3H = Flavanon-3-hydroxylase; DFR = Dihydroflavonol-4-reduktase; UFGT = UDP-Glucose: Flavonoid-3-O-glucosyltransferase. Die späteren Schritte entsprechen Umwandlungen, die in P. hybrida Blüten auftreten und umfassen: 1 = Zugabe eines Rhamnosezuckers zu dem Glucosylrest von Cyanidin-3-glucosid und Delphinidin-3- glucosid; 2 = Acylierung und 5-O-Glucosylierung; 3 = 3'- Methylierung; 4 = 5'-Methylierung; 5 = 3',5'-Methylierung.
Fig. 2(A) zeigt 3',5'-Hydroxylaseaktivität in Petalextrakten von P. hybrida cv V23 (Hf1/Hf1, Hf2/Hf2) und das Fehlen von 3',5'-Hydroxylaseaktivität in P. hybrida cv R51 (hf1/hf1, hf2/hf2). 3',5'-Hydroxylaseaktivität wurde nachgewiesen durch Umwandlung von 3H-Naringenin in die 3'- und 3',5'- hydroxylierten Derivate Eriodictyol und Pentahydroxyflavanon. Auf der linken Seite der Figur sind die biochemischen Strukturen des Substrats Naringenin und das Produkt der 3'- Hydroxylasereaktion, Eriodictyol, und der 3',5'- Hydroxylasereaktion, Pentahydroxyflavanon, gezeigt. Die Lokalisierung des Substrats und der hydroxylierten Produkte auf der Dünnschichtplatte ist auf der rechten Seite der Figur angegeben, welche von links nach rechts die Autoradioagramme der Reaktionsprodukte, die durch Petalextrakte von Blüten von P. hybrida cv V23 und P. hybrida cv R51 erzeugt werden und die Kontrolle zeigt, welche keine Hydroxylierung von Naringenin aufweist, wenn NADPH in dem Reaktionsgemisch nicht vorliegt.
Fig. 2(B) zeigt 3',5'-Hydroxylaseaktivität in Petalextrakten von P. hybrida cv Old Glory Blue (OGB)-Blüten in verschiedenen Entwicklungsstufen. Von links nach rechts zeigen die Autoradiograme der Dünnschichtplatten (1) Stufe 1-Blüten [unpigmentiert, geschlossene Knospe (< 25 mm Länge)]: begrenzte Umwandlung von Naringenin in das 3',5'-hydroxylierte Derivat Pentahydroxyflavanon, (2) Stufe 2-Blüten [pigmentiert, geschlossene Knospe (25 bis 35 mm Länge)]: erhöhte Umwandlung in Petntahydroxyflavanon, kennzeichnend für höhere 3',5'- Hydroxylasegehalte, (3) Stufe 3-Blüten: [tief purpurfarbene Knospe mit auftretender Corolla (> 35 mm Länge)]: maximale 3',5'-Hydroxylaseaktivität, (4) Stufe 4-Blüten [tief purpurfarbene geöffnete Blüte, präanthere Dehiszenz (> 50 mm Länge)]: maximale 3',5'-Hydroxylaseaktivität, (5) Stufe 5- Blüten [vollständig geöffnete Blüte, wobei alle Anthere aufgeplatzt sind]: keine nachweisbare 3',5'- Hydroxylasegehalte.
Fig. 3(A) ist eine schematische Darstellung eines mRNA- Moleküls, das für ein Cytochrom P450 codiert. Der schattierte Bereich zeigt die relative Position von Sequenzen, die für die Häm-Bindungsdomäne codieren. Eine Consensus-Aminosäuresequenz für die am meisten konservierte Region dieser Domäne wurde gezeigt unter Verwendung eines Einbuchstabencodes. Aminosäuren, die in 100% der Cytochrom P450-Sequenzen, welche in der SWISS-PROT-Datenbank vorliegen, auftreten, wurden deingerahmt und X zeigt Positionen, worin ein geringer Sequenzkonservierungsgrad besteht.
Fig. 3(B) zeigt die PoSition von Oligos, die für die PCR- Amplifikation von Cytochrom P450-Molekülen, pCGP450 und pCGP454, aus der cDNA-Bibliothek #1 verwendet werden. Die Oligos 1 und 3 deckten Sequenzen in der konservierten Häm- Bindungsdomäne ab, während die Oligos 2 und 4 dem pBluescript (Stratagene) -20 bzw. reversen Primersequenzen entsprachen. Die Oligos 1 und 2 wurden verwendet, um den cDNA-Insert in pCGP450 zu synthetisieren; die Oligos 3 und 4 wurden verwendet um den cDNA-Insert in pCGP454 zu synthetisieren. Die Darstellung eines verallgemeinerten cDNA-Moleküls ist identisch mit der in Fig. 3A gezeigten; Vektorsequenzen wurden durch leichtes Schattieren angezeigt.
Fig. 4(A) ist eine schematische Darstellung von DNA- Fragmenten, die verwendet wurden, um die cDNA-Bibliothek #1 zu sondieren, um Cytochrom P450-Homologe, einschließlich pCG174 und pCGP175 zu identifizieren. P450: verallgemeinert Cytochrom P450-cDNA-Klon mit der Häm-Bindungsdomäne (Häm), angezeigt durch den schattierten Kasten; Fragment 1: ein 900 bp Fragment wurde erhalten durch PCR mit den Oligos 5 und 6, unter Verwendung von pCGP142-DNA als Templat; Fragment 2: ein 1,3 kb-Fragment wurde aus einem SalI-EcoRI-Verdau von pCGP147 isoliert; Fragment 3: ein 750 bp Fragment wurde durch PCR mit den Oligos 4 und 7 unter Verwendung von pCGP158-DNA als Templat erhalten; Fragment 4: ein 670 bp Fragment wurde isoliert aus einem PstI-EcoRV-Verdau von pCGP160; Fragment 5: ein 150 bp Fragment wurde erhalten durch PCR mit den Oligos 3 und 4, unter Verwendung von pCGP454-DNA als Templat. Alle gereinigten Fragmente wurden mit ³²P-dCTP, wie in Materialien und Verfahren beschrieben, markiert.
Die Fig. 4(B) bis (H) zeigen partielle Nukleotidsequenzen und die entsprechenden vorausgesagten Aminosäuretranslationsprodukte für die cDNA-Inserte von (i) pCGP142, (ii) pCGP147, (iii) pCGP158, (iv) pCGP160 und (v) pCGP454. Die Regionen, die verwendet wurden zum Sondieren der cDNA-Bibliothek #1 zum Isolieren von pCGP147 und pCGP175 wurden durch Pfeile dargestellt.
Die Fig. 5(A) und (B) sind Diagrammdarstellungen der Plasmide pCGP174 bzw. pCGP175. Die cDNA-Inserte werden angegeben als offene Kasten, wobei die Region, die für die mutmaßliche Häm-Bindungsdomäne codiert, als eine schattiert Region gezeigt ist. Eine EcoRI-Stelle ist am 5'-Ende und eine XhoI-Stelle ist am 3'-Ende beider cDNA-Inserte.
Fig. 6(A) ist ein Autoradiogramm eines RNA-Blots, der mit der 3'-Region des pCGP174 cDNA-Inserts sondiert wurde. Jede Spur enthielt eine 20 ug Probe der Gesamt-RNA, die aus den folgenden Petuniengeweben 1 bis 5 isoliert wurde: OGB- Saumgewebe von Blüten in den fünf (1 bis 5) verschiedenen Stufen der Blütenentwicklung, die in Materialien und Verfahren beschrieben ist; T: OGB-Röhrengewebe aus Stufe 3- bis 4- Blüten; L = Blattgewebe aus 6 Wochen alten OGB Sämlingen; IL: Glucose/Starklicht-behandeltes Blattgewebe von 6 Wochen alten OGB-Sämlingen; V23: V23-Saumgewebe von Stufe 3- bis 4-Blüten; R51: R51 Corollagewebe von Stufe 3- bis 4-Blüten; VR: Petalsaumgewebe von Stufe 3- bis 4-Blüten des V23xR51 F&sub1;- Hybrids; Sw63: Petalsaumgewebe von Stufe 3- bis 4-Blüten von Sw63; Th7: Petalsaumgewebe von Stufe 3- bis 4-Blüten von Th7.
Fig. 6(B) ist ein repräsentatives Autoradiogramm aus der RFLP-Analyse der V23xR51 (V/R)F&sub2;-Pflanzen. Xbal-verdaute Genom-DNA wurde mit der 3'-Region von pCGP174 sondiert. Das V23-Fragment, das stark an die Sonde hybridisierte, wurde in allen F&sub2;-Pflanzen nachgewiesen, die 3',5'-Hydroxylaseaktivität im Röhrengewebe der Pflanzen (+) aufwiesen. Die RFLP- Bezeichnung für die stark hybridisierenden Banden (RFLP#1) ist für die verschiedenen Pflanzen angegeben worden. V: V23- ähnliches RFLP, R: R51-ähnliches RFLP, H: heterozygot (VR).
Fig. 7(A) ist ein Autoradiogramm eines RNA-Blots, der mit der 3'-Region des pCGP175 cDNA-Inserts sondiert wurde. Jede Spur enthielt eine 20 ug Probe der Gesamt-RNA, die aus den folgenden Petuniengeweben 1 bis 5 isoliert wurde: OGB- Saumgewebe von Blüten in den fünf (1 bis 5) verschiedenen Stufen der Blütenentwicklung, die in Materialien und Verfahren beschrieben ist; T: OGB-Röhrengewebe aus Stufe 3- bis 4- Blüten; L = Blattgewebe aus 6 Wochen alten OGB Sämlingen; IL: Glucose/Starklicht-behandeltes Blattgewebe von 6 Wochen alten OGB-Sämlingen; V23: V23-Saumgewebe von Stufe 3- bis 4-Blüten; R51: R51 Corollagewebe von Stufe 3- bis 4-Blüten; VR: Petalsaumgewebe von Stufe 3- bis 4-Blüten des V23xR51 F&sub1;- Hybrids; Sw63: Petalsaumgewebe von Stufe 3- bis 4-Blüten von Sw63; Th7: Petalsaumgewebe von Stufe 3- bis 4-Blüten von Th7.
Fig. 7(B) ist ein repräsentatives Autoradiogramm aus der RFLP-Analyse der V23xR51 (V/R)-F&sub2;-Pflanzen. XbaI-verdaute Genom-DNA wurde mit der 3'-Region von pCGP175 sondiert. Die RFLP-Bezeichnung, die unter Verwendung der pCGP175-Sonde erhalten wurde, war identisch mit der po-Bezeichnung, die unter Verwendung der chi-A-Sonde bestimmt wurde. V: V23- ähnliches RFLP; R: R51-ähnliches RFLP; H: heterozygot (VR) RFLP.
Fig. 8 zeigt eine Dagrammdarstellung einer Restriktionsenzymkarte von pCGP602. Teillängen des cDNA- Inserts werden durch die fetteren Linien mit geschlossenen Enden (im Gegensatz zu Pfeilen) angezeigt. Diese wurden subkloniert im M13-mp18 und mp19 und sequenziert unter Verwendung von Oligonukleotidprimersequenzen, wie angegeben, um eine überlappende Sequenzinformation zu erhalten. Das Ausmaß und die Richtung der Sequenzinformation, die aus jedem subklonierten Teil erhalten wurden, sind durch die Linien mit den Halbpfeilen gezeigt. S1 = Primersequenz 1; S2 = Primersequenz 2; S3 = Primersequenz 3; ATG zeigt den Methionininitiationscodon und die Gesamtlänge des Klons in Basepaaren ist ebenfalls angegeben.
Die Fig. 9(A) bis (D) sind die Nukleotidsequenzen und vorausgesagte Aminosäuresequenzen für die cDNA-Inserte von pCGP176 und pCGP602. Das Insert von pCGP602 umfaßt die gesamte gezeigte Sequenz. Das 5'-Ende des pCGP176-Inserts ist durch eine Pfeilspitze angezeigt.
Die Fig. 10(A) bis (C) zeigen die Nukleotidsequenz und vorausgesagte Aminosäuresequenz für das cDNA-Insert von pCGP175.
Fig. 11 ist eine Diagrammdarstellung des Aufbaus von pCGP618. pCGP618 wurde aufgebaut durch Klonieren des pCGP175-cDNA- Inserts in einer Sense-Orientierung hinter dem Hefeglyceraldehyd-3-phosphatdehydrogeansepromotor (PGPD) in dem Expressionsvektor pYGA22m. Das cDNA-Insert von pCGP175 wurde als ein EcoRI-KpnI-Fragment mit dem langen Fragment ligiert, das aus einem EcoRI/KpnI-Verdau von pYGA22 m resulierte. E = EcoRI, H = HindIII K = KpnI, X = XhoI, IR = invertierte Wiederholung des 2 um Plasmids, Trp1 = Trp1-Gen, Ap = Ampicillinresistenzmarker.
Fig. 12(A) zeigt einen 3',5'-Hydroxylaseassay von Hefeextrakten unter Verwendung von ³H-Naringenin als Substrat. Die Autoradiogramme zeigen eine Umwandlung von ³H-Naringenin in das 3',5'-hydroxylierte Derivat Pentahydroxyflavanon durch Extrakte von Hefe, die mit Plasmid pCGP618 (1 und 2) transformiert ist. Es wurde keine 3',5'-Hydroxylaseaktivität in nichttransformierter Hefe (C) nachgewiesen. Die Umwandlung von Naringenin in Pentahydroxyflavanon durch OGB 3',5'- Hydroxylase ist ebenfalls gezeigt (OGB C).
Fig. 12(B) zeigt einen 3',5'-Hydroxylaseassay von Hefeextrakten unter Verwendung von ³H-Dihydroquercetin als Substrat. Die Autoradiogramme zeigen eine Umwandlung von ³H- Dihydroquercetin (DHQ) in ³H-Dihydromyricetin (DHM) durch Extrakte von Hefe, die mit dem Plasmid pCGP618 (1 und 2) transformiert ist. Es wurde keine 3',5'-Hydroxylaseaktivität in nicht transformierter Hefe (C) nachgewiesen. Die Umwandlung von DHQ in DHM durch OGB 3',5'-Hydroxylase ist ebenfalls gezeigt (OGB C).
Fig. 13 zeigt einen 3',5'-Hydroxylaseassay von Hefeextrakten unter Verwendung von ³H-Naringenin als Substrat. Das Autoradiogramm zeigt eine Umwandlung von ³-Naringenin in das 3',5'-hydroxylierte Derivat Pentahydroxyflavanon durch Extrakte von Hefe, die mit den Plasmiden pCGP618 und pCGP620 (1 bzw. 2) transformiert wurde. Die aus dem pCGP620-Extrakt erhaltenen Reaktionsprodukte enthielten auch das 3'- hydroxylierte Eriodictyol als auch etwas des Ausgangsnaringeninsubstrats, was eine unvollständige Umwandlung in das 3',5'-hydroxylierte Endprodukt anzeigt. Es wurde keine 3',5'-Hydroxylaseaktivität in nichttransformierter Hefe (C) nachgewiesen.
Fig. 14 ist eine Diagrammdarstellung des Plasmids pCGP90. Das cDNA-Insert von pCGP602 wurde in einer Sense-Orientierung hinter dem Mac-Promotor des Expressionsvektors pCGP293, wie dargestellt, kloniert.
Fig. 15 zeigt einen 3',5'-Hydroxylaseassay von Petuniepetalextrakten. Die Autoradiogramme zeigen das Vorliegen geringer 3',5'-Hydroxylaseaktivitätsgrade (Umwandlung von ³H-Naringenin in ³H-Pentahydroxyflavanon) in Petalsaumgewebe (L) von Skr4 · Sw63. Deutlich höhere Aktivitätsgrade wurden in dem Saumgewebe (L) von zwei Skr4 · Sw64/pCGP90 transgenen (T/G 1602 und T/G 1603) nachgewiesen. Es wurde keine 3',5'-Hydroxylaseaktivität in den Extrakten der Petalröhre (T) nachgewiesen, weder in dem nichttransgenen Skr4 x Sw63-Hybrid noch in den beiden pCGP90-Transgenen. Die Umwandlung von Naringenin in Pentahydroxyflavanon durch Extrakte von Saum (L)- und Röhren (T)-Petalgewebe von OGB ist ebenfalls gezeigt.
Fig. 16 ist eine photographische Darstellung eines Autoradiogramms eines RNA-Blots, der mit ³²P-markierter HflcDNA sondiert wurde. Jede Spur enthielt 20 ug Probe der Gesamt-RNA, isoliert aus (1) P. hybrida cv OGB-Petalen; (2) Stiefmütterchen-Petalen; (3) Kartoffelstengeln; (4) Auberginenhäuten; (5) Nicotiana alata-Blüten; (6) Ageratum- Blüten. Die für A und B verwendete Sonde stammte aus einem 660 bp BalI-DNA-Fragment; ein 1,4 kb EcoRI/HindIII-Fragment wurde für C-verwendet. Die verwendeten Waschbedingungen waren: (A) 6 x SSC bei 50ºC; (B) 2 · SSC bei 50ºC; (C) 0,2 · SSC bei 65 ºC.
Fig. 17 ist eine photographische Darstellung eines Autoradiogramms von Southern-Blots, die mit ³²P-markierter Hf1-cDNA sondiert wurden. Jede Spur enthielt 10 ug DNA, verdaut mit EcoRI. Die DNA-Proben wurden aus (1) Aubergine, (2) holländischer Iris, (3) Kartoffel, (4) Veilchen und (5) Anemone isoliert. Die Waschbedingungen waren: (A) 6 · SSC bei 50ºC; (B) 2 · SSC bei 65ºC.

BEISPIEL

1. MATERIALIEN UND VERFAHREN

Chemikalien, Enzyme und Radioisotope

Eriodictyol und Dihydroquercetin wurden von der Carl Roth KG erhalten und Naringenin wurde von Sigma erhalten. Dihydromyricetin wurde chemisch aus Myricetin (Extra Synthese, Frankreich) nach dem Verfahren von Vercruysse et al. (1985) synthetisiert. [³H] -Naringenin (5,7 Ci/mMol) und [³H]- Dihydroquercetin (12,4 Ci/mMol) wurden von Amersham erhalten. Alle Enzyme wurden aus kommerziellen Quellen erhalten und wurden gemäß den Vorschriften der Hersteller verwendet.

Bakterienstämme

Die verwendeten Escherichia coli-Stämme waren:
DH5αsupE44, Δ(lacZYA-ArgF)U169, φ80lacZΔM15, hsdR17(r&supmin;k, m&spplus;k), recA1, endA1, gyrA96, thi-1, relA1, deoR (Hanahan, 1983 und BRL, 1986).
XL1-BluesupE44, hsdR17 (r&supmin;k, m&spplus;k), recA1, endA1, gyrA96, thi- 1, relA1, lac&supmin;, [F'proAB, lacIq, lacZΔM15, Tn10(tetr)] (Bullock et al., 1987).
PLK-F'recA, hsdR17(r&supmin;k, m&spplus;k), mcrA&supmin;, mcrB&supmin;, lac&supmin;, supE44, galK2, galT22, metB1 [F'proAB, lacIq, lacZΔM15, Tn10(tetr)] (Stratagene).
Der unschädliche Agrobakterium tumefaciens-Stamm AGLO (Lazo et al., 1991) wurde von R. Ludwig (Department of Biology, University of California, Santa Cruz) erhalten.
Die Klonierungsvektoren pBluescript und psluescribe wurden von Stratagene erhalten.

Transformation von E. coli und A. tumefaciens

Die Transformation der DH5α-Zellen des E.coli-Stammes wurde gemäß dem Verfahren von Inoue et al. (1990) durchgeführt.
Das Plasmid pCGP90 (Fig. 14) wurde in den Agrobakterium tumefaciens-Stamm AGLO eingeführt durch Zugeben von 5 ug Plasmid-DNA zu 100 uL kompetenten AGLO-Zellen, hergestellt durch Inokulieren einer 50 ml MG/l (Garfinkel und Nester, 1980) -Kultur und Züchten für 16 Stunden unter Schütteln bei 28ºC. Die Zellen wurden dann pelletiert und resuspendiert in 0,5 ml 85% (Vol./Vol.) 100 mM CaCl&sub2;/15% (Vol./Vol.) Glycerol. Das DNA-Agrobakterium-Gemisch wurde gefroren durch Inkubieren in flüssigem N&sub2; für 2 Minuten und man ließ es dann durch Inkubation bei 37ºC für 5 Minuten tauen. Das DNA- /Bakteriengemisch wurde dann auf Eis für weitere 10 Minuten angeordnet. Die Zellen wurden dann mit 1 ml MG/L-Medium gemischt und unter Schütteln für 16 Stunden bei 28ºC inkubiert. Zellen von A. tumifaciens, die pCGP90 enthalten, wurden auf MG/L-Agarplatten selektiert, die 100 ug/ml Gentamycin enthielten. Das Vorliegen von pCGP90 wurde durch Southern-Analysen von DNA bestätigt, welche aus den Gentamycin-resistenten Transformanten isoliert wurde.
Die verwendeten Petunia hyrida-Sorten sind in Tabelle 2 gezeigt. TABELLE 2 Pflanzenmaterial TABELLE 2 Fortsetzung
Die Pflanzen wurden in speziellen Anzuchträumen mit einer Tageslänge von 14 h bei einer Lichtintensität von 10.000 Lux und einer Temperatur von 22 bis 26ºC gezüchtet. OGB-Blüten wurden bei wie folgt definierten entwicklungsmäßigen Stufen geerntet:
Stufe 1: unpigmentiert, geschlossene Knospe (< 25 mm Länge)
Stufe 2: pigmentiert, geschlossene Knospe (25 bis 35 mm Länge)
Stufe 3: dunkelpurpurfarbene Knospe mit auftretender Corolla (> 35 mm Länge)
Stüfe 4: dunkelpurpurfarbene geöffnete Blüte, präanthere Dehiszenz (> 50 mm Länge)
Stufe 5: vollständig geöffnete Blüte, bei der alle Anthere aufgeplatzt sind.
Blüten der anderen in Tabelle 2 beschriebenen Arten wurden vor der antheren Dehiszenz auf der Stufe der maximalen Pigmentakkumulation geerntet.

Präparation von Pflanzenextrakten für den Assay von 3',5'- Hydroxylaseaktivität

Pflanzengewebe wurde homogenisiert in einem 2- bis 5-fachen Volumen aus eiskaltem Extraktionspuffer (100 mM Kaliumphosphat (pH 7,5), 1 mM EDTA, 0,25 M Sucrose, 0,25 M Mannitol, 0,1% (Gew./Vol) BSA, 100 nM Pepstatin, 100 nM Leupeptin, 0,1 mg/ml PMSF, 20 mM 2-Mercaptoethanol und 10 mg/ml Polyclar AT). Das Homogenat wurde bei 10.000 Upm in einem JA20-Rotor (Beckmann) für 10 min bei 4ºC zentrifugiert und ein Aliquot des Überstands wurde hinsichtlich der 3',5'-Hydroxylaseaktivität untersucht.

3',5'-Hydroxylaseassay

3',5'-Hydroxylaseenzymaktivität wurde gemessen unter Verwendung einer modifizierten Version des Verfahrens, das von Stotz und Forkmann (1982) beschrieben wird. Das Assayreaktionsgemisch enthielt typischerweise 100 ul Pflanzenextrakt, 5 ul 50 mM NADPH in Assaypuffer (100 mM Kaliumphosphat (pH 8,0), 1 mM EDTA und 20 mM 2- Mercaptoethanol), 10 uCi [³H]-Naringenin oder 5 uCi [³H] - Dihydroquercetin und wurde auf ein Endvolumen von 210 ul mit dem Assaypuffer aufgefüllt. Nachfolgend auf eine Inkubation bei 23ºC für 2 bis 16 Stunden wurde das Reaktiongemisch mit 0,5 ml Ethylacetat extrahiert. Die Ethylacetatphase wurde unter Vakuum getrocknet und dann in 10 ul Ethylacetat resuspendiert. Die tritiierten Flavonoidmoleküle wurden auf Cellulosedünnschichtplatten getrennt (Merck Art. 5577, Deutschland) unter Verwendung eines Chloroform: Essigsäure: Wasser (10 : 9 : 1, Vol./Vol.)-Lösungsmittelsystems. Nach Beendigung der Chromatographie wurden die Dünnschicht-Platten mit 7% (Vol./Vol.) 2,5-Diphenyloxazol in Diethylether besprüht. Die Reaktionsprodukte wurden durch Autoradiographie lokalisiert und durch Vergleich mit nichtradioaktiven Naringenin, Eriodictyol, Dihydroquercetin- und Dihydromyricetinstandards identifiziert, welche man zum Vergleich mit den Reaktionsprodukten laufen ließ und unter UV- Licht sichtbar machte.

Glucose/Intensivlichtinduktion der Delphinidinsynthese in Blättern

Blätter wurden von P. hybrida cv. OGB geerntet und in 1 cm²- Teilstücke in sterilem Wasser geschnitten. Die Blatteilstücke wurden dann in einer 2% (Gew./Vol.)-Glucoselösung flotiert und einer Lichtintensität von 24.000 Lux für 96 Stunden ausgesetzt.

Aufbau der cDNA-Bibliothek #1

20 Gramm Stufe 3- bis 4-OGB-Blütensäume (Blütenlimben) wurden in 100 ml PEB (200 mM Tris-HCl (pH 8,6), 60 mM KCl, 30 mM MgCl&sub2;, 25 mM EGTA) homogenisiert, welches 10 mM Vanadylribonukleosidkomplexe enthielt. Zelltrümmermaterial wurde durch Filtrieren des Homogenats durch steriles Miracloth (Calbiochem.) entfernt. Das Filtrat wurde aufgeschichtet am oberen Ende eines Stufengradienten aus 6 ml PEB, enthaltend 25 (Gew./Vol.) Sucrose, 250 Einheiten InhibitAce (5-Prime 3- Prime) und 6 ml PEB, enthaltend 50% (Gew./Vol.) Sucrose und 250 Einheiten InhibitAce in Ultra-ClearTM Quick-SealTM (Beckman) -Zentrifugenröhrchen. Die Röhrchen wurden für 3,5 Stunden bei 26.000 Upm in einem 70Ti-Rotor zentrifugiert. Membran-gebundene Polysome wurden aus der 25% (Gew./Vol.) Sucrose/50% (Gew./Vol.) Sucrosezwischenschicht gesammelt und in eine 4 M Guanidiniumisothiocyanatlösung gegeben. RNA wurde aus den denaturierten Polysomen durch Pelletieren durch ein 5,7 M CsCl-Polster isoliert, wie von Turpen und Griffith (1986) beschrieben.
Ein Uni-ZAPTM XR Vektorkit (Stratagene) wurde verwendet, um eine direktionelle cDNA-Bibliothek in λZAP aufzubauen, unter Verwendung von 25 ug polysomaler RNA als Templat. Die primäre Bibliothek, welche 250.000 Plaque-bildende Einheiten (pfu) enthielt, wurde durch Züchtung über Nacht auf NZY-Platten (Sambrook et al., 1989) amplifziert und das amplifizierte Phagenausgangsmaterial wurde in PSB (100 mM NaCl, 8 mM MgSO&sub4;, 50 mM Tris-HCl (pH 7,5), 0,01% (Gew./Vol.) Gelatine), wie von Sambrook et al., (1989) beschrieben, eluiert.

Aufbau der cDNA-Bibliothek #2

Gesamt-RNA wurde isoliert aus dem Petalgewebe von P. hybrida cv. OGB Stufe 3- bis 4-Blüten, unter Verwendung des Verfahrens von Turpen und Griffith (1986). Poly(A)&spplus; RNA wurde aus der Gesamt-RNA durch drei Zyklen Oligo-dT-Cellulosechromatographie selektiert (Aviv und Leder, 1972).
Zwei Mikrogramm Poly(A)&spplus; RNA wurden in einem Volumen von 20 ul revers transkribiert, das 1 · SperscriptTM-Reaktionspuffer, 10 mlvi Dithiothreitol, 500 uM dATP, 500 uM dGTP, 500 uM dTTP, 500 uM 5-Methyl-dCTP 0,75 ug Oligonukleotid #8 und 2 ul SuperscriptTM reverse Transkriptase (BRL) enthielt. Das Reaktionsgemisch wurde bei 37ºC für 50 Minuten, 44ºC für 10 Minuten inkubiert und dann auf Eis angeordnet.
Das zweite Strangreaktionsgemisch (140 ul) wurde zu dem ersten Strangreaktionsgemisch gegeben. Das zweite Strangreaktionsgemisch bestand aus 21 mM Tris-HCl, 104 mM KCl, 5,3 mM MgCl&sub2;, 171 uM β-NAD, 11,4 mM (NH&sub4;)&sub2;SO&sub4;, 214 uM dATP, 642 uM dCTP, 214 uM dGTP, 214 uM dTTP, 4 mM DTT, 10 uCi ³²PdCTP (3000 Ci/mMol), 15 Einheiten E.coli DNA-Ligase, 40 Einheiten DNA-Polymerase (Boehringer) und 0,8 Einheiten RNAse H. Das Endgemisch wurde für 150 Minuten bei 16ºC inkubiert. Um die doppelsträngige cDNA mit glattem Ende herzustellen, wurden 10 Einheiten T4DNA-Polymerase zugegeben und die Reaktion für weitere 15 Minuten bei 16ºC fortgesetzt. Die Reaktion wurde gestoppt und die cDNA durch Phenol/Chloroformextraktion, gefolgt von einer Chloroformextraktion und Ethanolpräzipitation gereinigt.
EcoRI-Adaptoren (Promega) wurden mit der cDNA ligiert und dann unter Verwendung von Bedingungen, die laut Hersteller erforderlich sind, mit Kinase behandelt. Die Enzyme wurden durch Hitze (70ºC, 20 Minuten) denaturiert und die DNA wurde durch Phenol/Chloroformextraktion und Ethanolpräzipitation gereinigt. Die cDNA wurde mit 50 Einheiten XhoI (Boehringer) in einem Reaktionsvolumen von 100 ul unter Verwendung der laut Hersteller erforderlichen Bedingungen verdaut. Das Enzym wurde durch Hitze (70ºC, 20 Minuten) zerstört und das Gemisch durch eine 5400-Zentrifugensäule (Pharmacia) geführt, welche in STE- Puffer (Sambrook et al., 1989) äquilibriert worden war. Das Eluat wurde Phenol/Chlorform-extrahiert und mit Ethanol präzipitiert. Nach Mikrozentrifugation bei 4ºC für 30 Minuten wurde das cDNA-Pellet mit 70% (Vol./Vol.) Ethanol gespült, luftgetrocknet und in 10 ul TE-Puffer (10 mM Tris-HCl (pH 7,5), 1 mM EDTA) resuspendiert.
Eine NA-45-Membran (Schleicher und Schuell) wurde verwendet, um cDNA im Größenbereich von 1,3 bis 2,5 kb aus der 7,5 ul Probe zu isolieren, welche durch ein 1% (Gew./Vol.) Agarosegel elektrophoresiert worden war.
Die größenfraktionierte cDNA wurde mit 1 ug λZAPII EcoRI/XhoI/CIAP behandeltem Vektor (Stratagene) in 50 ul Reaktionspuffer ligiert, welcher aus 50 mM Tris-HCl (pH 7,0), 10 mM MgCl&sub2;, 10 mM Dithiothreitol, 1 mM ATP und 2 Einheiten T4-DNA-Ligase betand. Die Reaktion wurde bei 4ºC für 2 Tage durchgeführt.
Nach dem Belassen bei Raumtemperatur für zwei Stunden wurde das Ligationsreaktionsgemisch unter Verwendung des Packagene- Systems (Promega) verpackt. Die Gesamtzahl von Rekombinanten war 270.000 pfu.
Eine Menge von 150.000 pfu-verpackter cDNA wurde bei 10.000 pfu pro 15 cm Durchmesser Platte nach der Transfektion von PLK-F'-Zellen plattiert. Die Platten wurden bei 37ºC für acht Stunden inkubiert, dann über Nacht bei 4ºC aufbewahrt. Doppelte Lifts wurden auf Colonie/Plaque ScreenTM- Filter (Dupont) aufgenommen und wie laut Hersteller erforderlich, behandelt.

Synthese von Oligonukleotiden

Oligonukleotide wurden auf einem Applied Biosystems PCR-Mate DNA Synthesizer unter Verwendung der laut Hersteller erforderlichen Verfahren synthetisiert. Diese synthetisierten Oligonukleotide waren 5'-3':
Oligo 1: GGAAGCTTATICCITT(T/C)GGIGCIGG
Oligo 2: GGATGACTCAGTAAAACGACGGCCAGT
Oligo 3: CCIGG (A/G) CAIATIC (G/T) (C/T) (C/T)TICCIGCICC (A/G) AAIGG
Oligo 4: GGATGACTCAAACAGCTATGACCATG
Oligo 5: GTTACAATTCGGAATGATG
Oligo 6: GCTGCACTTAATCCATAT
Oligo 7: TGCATAGCTTTTGGG
Oligo 8: GAGAGAGAGAGAGAGAGAGATCTCGAGTTTTTTTTTTTTTTTTTT
Oligo 9: ATGTCTCCTCCAGTG
Oligo 10: CTAGACTCCAATCAC
Die Oligos 2 und 4 umfassten eine GCN4-Bindungsstelle (angegeben durch Unterstreichen), welche gezeigt wurde, um die Anreicherung von doppelsträngigen PCR-Produkten zu erleichtern (Lew und Kemp, 1989).
Die Basis zur Ausführung des Oligos 3 war wie folgt:
Aminosäuresequenzen der mutmaßlichen Häm-Bindungsdomäne eines Avocado-Cytochrom P450 (Bozak et al., 1990) und die entsprechenden Sequenzen, welche durch die beiden Petunie- Cytochrome P450-Homologen pCGP142 und pCGP147 codiert sind, wurden ausgerichtet:
Avocado P F G A G R R G C P G
pCGP142 P F G A G K R I C P G
pCGP147 P F G S G R R I C P G
Die Übereinstimmung der Aminosäuresequenz der Häm- Bindungsregion für die drei Pflanzencytochrome P450 konnten dabei erkannt werden als:
P F G A(S) G R(K) R I(G) C P G
Mögliche Permutationen der Nukleotidsequenz, die für die Aminosäuren codiert, welche in der Häm-Bindungsdomäne der drei Cytochrom P450-Moleküle gefunden werden, konnten deduziert werden:
X zeigt die Nukleotidpositionen, worin alle vier Nukleotide (A,C,G und T) verwendet werden können. Oligo 3 war so gestaltet, um komplementär zu einem Subsatz der Consensus- Sequenzen zu sein, die von den drei Pflanzencytochromen P450 stammen. Deoxyinosin (I) wurde vorrangig verwendet, wenn die Basedegeneration größer als drei war. Die resultierende Oligonukleotidsequenz war wie oben gezeigt.

PCR - Reaktionen

Helferphage R408 (Stratagene) wurde verwendet, um pBluescript Phagemide herauszuschneiden, welche Petunie cDNA-Inserts von 200.000 pfu der amplifizierten LZAP cDNA Bibliothek #1 enthielten, unter Verwendung von Verfahren, die von dem Hersteller beschrieben sind. Escherichia coli XL1-Blue wurden mit dem Phagemidgemisch transfiziert und.250.000 Kolonien wurden auf Ampicillin enthaltenden Medien plattiert. Die Zellen wurden in LB (Sambrook et al., 1989) resuspendiert und Plasmid-DNA wurde unter Verwendung eines alkalischen Lyseverfahrens (Sambrook et al., 1989) isoliert. Plasmid-DNA wurde weiter durch Bandenauftrennung auf einem CsCl-Gradienten gereinigt. Diese DNA wurde als das Templat für PCR verwendet.
PCR-Reaktionen zur Amplifikation von Petalcytochrom P450 Homologen enthielten 5 bis 100 ng geschnittene DNA, 10 mM Tris-HCl (pH 8,3), 50 mM KCl, 1,5 mlvi MgCl&sub2;, 0,01% (Gew./Vol.) Gelatine, 0,2 mlvi von jedem dNTP, 0,4 uM von jedem Primer und 1,25 Einheiten Taa-Polymerase (Cetus). Die Reaktionsgemische (50 ul) wurden 30 Minuten zwischen 94ºC, 48ºC und 72ºC für 1 Minute bei jeder Temperatur zyklisiert. Die amplifizierten Produkte wurden unter Verwendung von Geneclean (Bio 101 Inc.) gelgereinigt, reamplifiziert, um ausreichend Material zum Klonieren zu erhalten und dann unter Verwendung von T4 DNA- Polymerase wieder am Ende gepaart. Unter Verwendung der Oligos 1 und 2 amplifizierte DNA wurde mit Hindlil und XhoI vor dem Klonieren in pBluescript verdaut. Das PCR-Produkt, das durch Amplifikation zwischen den Oligos 3 und 4 erzeugt wurde, wurde direkt kloniert in den ddT-endenden pBluescript-Vektor, der von Holton und Graham (1991) beschrieben wird.

Screenen von cDNA-Bibliotheken

Doppelte Plaque-Lifts wurden hybridisiert und wie folgt gewaschen: stark stringente Bedingungen (Hybridisierung: 50% (Vol./Vol.) Formamid, 6 · SSC, 1% (Gew./Vol.) SDS bei 42ºC für 16 h und Waschen: 2 · SSC, 1% (Gew./Vol.) SDS bei 65ºC für 2 · 15 Minuten, gefolgt von 0,2 · SSC, 1% (Gew./Vol.) SDS bei 65ºC für 2 · 15 Minuten) wurden verwendet, um Nachfolgeklone nachzuweisen und wenig stringente Bedingungen (Hybridisierung: 20% (Vol./Vol.) Formamid, 6 · SSC, 1% (Gew./Vol.) SDS bei 42ºC für 16 Stunden und Waschen: 6 · SSC, 1% (Gew./Vol.) SDS bei 65ºC für 1 Stunde) wurden verwendet, um damit verwandte Sequenzen nachzuweisen.

Northern Analyse

Die Gesamt-RNA wurde aus Gewebe isoliert, das in flüssigem N&sub2; gefroren worden war und zu einem feinen Pulver unter Verwendung eines Mörsers und eines Pistill zerrieben. Ein Extraktionspuffer aus 4 M Guanidiniumisothiocyanat, 50 mM Tris-HCl (pH 8,0), 20 mM EDTA, 0,1% (Vol./Vol.) Sarkosyl wurde zu dem Gewebe gegeben und das Gemisch wurde für 1 Minute unter Verwendung eines Polytrons mit maximaler Geschwindigkeit homogenisiert. Die Suspension wurde durch Miracloth (Calbiochem) filtriert und in einem JA20 Rotor für 10 Minuten bei 10.000 Upm zentrifugiert. Der Überstand wurde gesammelt und auf 0,2 g/ml CsCl (Gew./Vol.) eingeswterllt. Proben wurden dann über einem 10 ml Polster aus 5,7 M CsCl, 50 mM EDTA (pH 7,0) in 38,5 ml Quick-Seal Zentrifugenröhrchen (Beckman) aufgeschichtet und bei 42.000 Upm für 12 bis 16 Stunden bei 23 ºC in einem Ti-70 Rotor zentrifugiert. Pellets wurden resuspendiert in TE/SDS (10 mM Tris-HCl (pH 7,5), 1 mM EDTA, 0,1% (Gew./Vol.) SDS) und mit Phenol : Chloroform : Isoamylalkohol (25 : 24 : 1), gesättigt in 10 mlvi EDTA (pH 7,5) extrahiert. Nachfolgend auf eine Ethanolpräzipitation wurden die RNA-Pellets in TE/SDS resuspendiert.
RNA-Proben wurden einer Elektrophorese unterzogen durch 2,2 M Formaldehyd/1,2% (Gew./Vol.) Agarosegele, unter Verwendung von einem Laufpuffer, der 40 mM Morpholinopropansulfonsäure (pH 7,0), 5 mM Natriumacetat, 0,1 mM EDTA (pH 8,0) enthielt. Die RNA wurde auf Hybond-N-Filter (Amersham) wie vom Hersteller beschrieben übergeführt und mit ³²P-markiertem cDNA-Fragment (10&sup8; cpm/ug, 2 · 10&sup6; cpm/ml) sondiert. Prähybridisierung (1 h bei 42ºC) und Hybridisierung (16 h bei 42ºC) wurde in 50% (Vol./Vol.) Formamid, 1 M NaCl, 1 % (Gew./Vol.) SDS, 10% (Gew./Vol.) Dextransulfat durchgeführt. Abgebaute Lachssperma-DNA (100 ug/ml) wurde mit der ³²Pmarkierten Sonde für den Hybridisierungsschritt zugegeben.
Filter wurden in 2 · SSC/1 % (Gew./Vol.) SDS bei 65ºC für 1 bis 2 Stunden und dann in 0,2 · SSC/1% (Gew./Vol.) SDS bei 65 ºC für 0,1 bis 1 Stunde gewaschen. Die Filter wurden einem Kodak XAR-Film mit einem Verstärkungsschirm bei -70ºC für 48 Stunden ausgesetzt.

RFLP-Analyse

a. Isolierung von Genom-DNA

DNA wurde aus Blattgewebe im wesentlichen wie von Dellaporta et al. (1983) beschrieben, isoliert. Die DNA-Präparationen wurden weiter durch CsCl-Schwebedichtezentrifugation (Sambrook et a., 1989) gereinigt.

b. Southern Blots

Die Genom-DNA (10 ug) wurde für 16 Stunden mit 60 Einheiten XbaI verdaut und einer Elektrophorese unterzogen durch ein 0,7 % (Gew./Vol.) Agarosegel in einem Laufpuffer aus TAE (40 mM Tris-Acetat, 50 mM EDTA). Die DNA wurde dann in Denaturierungslösung (1,5 M NaCl/0,5 M NaOH) für 1 bis 1,5 Stunden denaturiert, in 0,5 M Tris-HCl (pH 7,5)/1,5 M NaCl für 2 bis 3 Stunden neutralisiert und die DNA wurde dann auf einen Hybond N (Amersham) Filter in 20 · SSC übergeführt.

c. Isolierung einer chi-A-Sonde

Ein cDNA-Klon von chi-A (von Tunen et al., 1988) wurde synthetisiert durch PCR unter Verwendung eines cDNA-Templats, hergestellt aus OGB-Stufe-3-Petal-RNA und zwei Oligonukleotidprimern: #9, welches die Nukleotide 6-20 und #10 abgedeckte, welches komplementär zu den Nukleotiden 711-725 der veröffentlichten chi-A-cDNA-Sequenz (von Tunen et al., 1988) war. Das resultierende PCR-Produkt wurde in die SmaI- Stelle von pBluescribe M13 (Stratagene) ligiert und sequenziert, um sicherzustellen, daß das klonierte Fragment der veröffentlichten Sequenz entsprach.

³²P-Markierung von DNA-Sonden

DNA-Fragmente (50 bis 100 ng) wurden radioaktiv mit 50 uCi [α- ³²P]-dCTP unter Verwendung eines Oligomarkierungskits (Bresatec) markiert. Nicht eingebautes [α-³²P]-dCTP wurde durch Chromatographie auf einer Sephadex G-50 (Fine) Säule entfernt.

DNA-Sequenzanalyse

DNA-Sequenzierung wurde im wesentlichen durchgeführt durch das Verfahren von Sanger et al. (1977) unter Verwendung des Sequenaseenzyms (USB, Version 2.1). Die vollständige Sequenz der Klone pCGP602, pCGP176 und pCGP175 wurde bestimmt durch Kompilieren der Sequenz aus verschiedenen M13 -mp18 und -mp19 (Norrander et al., 1983; Yanisch-Perron, 1985) -Subklonen, die unter Verwendung von Standardklonierungsverfahren (Sambrook et al., 1989) erhalten wurden. Für einige Bereiche war es erforderlich, spezifische Oligonukleotidprimer zu synthetisieren, um überlappende Sequenzdaten zu erhalten. Die folgenden sechs Primer wurden für diesen Zweck synthetisiert:
5'CGTGCCAATGAGCTAGG
3'Primersequenz 1
5'GATGTTGGTTGTACTGAG
3'Primersequenz 2
5'GGAAACCAGATTTTCTTG
3'Primersequenz 3
5'TTTTTTTTTTTTTTTTT(AGC)
3'Primersequenz 4
5'GTTTTCCCAGTCACGAC
3'Primer -40
5'AACAGCTATGACCATG
3'reverser Primer
Eine Restriktionskarte von pCGP602, die die Position von verschiedenen dieser Sequenzen zeigt, kann in Fig. 8 gesehen werden.
Homologiesuchen in Genbank, SWISS-PROT und EMBL-Datenbanken wurden durchgeführt unter Verwendung der FASTA und TFASTA- Programme (Pearson und Lipman, 1988).

Aufbau von pCGP293

Der Expressionsbinärvektor pCGP293 wurde erhalten aus dem Ti- Binärvektor pCGN1559 (McBride und Summerfelt, 1990). Plasmid pCGN1559 wurde verdaut mit KpnI und die überstehenden 3'-Enden wurden entfernt mit T4-DNA-Polymerase gemäß Standardprotokollen (Sambrook et al., 1989). Der Vektor wurde dann weiter mit XbaI verdaut und der resultierende 5'- Überstand wurde unter Verwendung des Klenow-Fragments von DNA- Polymerase I erneut gepaart. Der Vektor wurde dann re-ligiert, um pCGP67 zu ergeben. Ein 1,97 kb PstI-Fragment, das den Mac- Promotor, mas-Terminator und verschiedene Klonierungsstellen (Comai et al., 1990) enthielt, wurde aus pCGP40 isoliert und in die PstI-Stelle von pCGP67 insertiert, um pCGP293 zu ergeben.
Plasmid pCGP40 wurde aufgebaut durch Entfernen des GUS-Gens (Jefferson et al., 1987) als ein BamHI-SacI-Fragment von pCGN7334 und indem es ersetzt wurde durch das BamHI-SacI- Fragment von pBluescribe M13, das die Multiklonierungsstelle enthält. Plasmid pCGN7334 (erhalten von Calgene, Inc. CA, USA) wurde aufgebaut durch Insertion des Fragments, das die Mac-GUS-mas-Genfusion enthält, in die XhoI-Stelle von pCGN7329 (Comai et al., 1990).

Aufbau von pCGP90

Plasmid pCGP90 wurde aufgebaut durch Klonieren des cDNA- Inserts von pCGP602 in einer Sense-Orientierung hinter dem Mac-Promotor (Comai et al., 1990) von pCGP293. Das BamHI-KpnI- Fragment, das das cDNA-Insert enthält, wurde von pCGP602 isoliert und mit BamHI/KpnI-Verdau von pCGP293 legiert. Eine korrekte Insertion des Inserts in pCGP90 wurde geschafft durch Restriktionsanalyse von DNA, die aus gentamycinresistenen Transformanten isoliert wurde.

Aufbau des Hefeexpressionsvektors pYGA22m

M13-mp18 wurde mit EcoRI und BglII verdaut, um ein 700 bp- Fragment zu erzeugen, das eine Multiklonierungsstelle enthielt. Dieses Fragment wurde mit dem 9 kb EcoRI-BalII- Fragment von pYGA2269 (Ashikari et al., 1989) legiert. Das resultierende Konstrukt, bezeichnet als pYGA22m, enthielt eine Multiklonierungsstelle, die abströmig des Hefeglyceraldehyd-3- phosphatdehydrogenasepromotors (Fig. 11) insertiert war.

Aufbau von pCGP618

Ein 1,8 kb EcoRI-KpnI-Fragment, das das gesamte cDNA-Insert von pCGP175 enthielt, wurde mit dem 0 kb EcoRI-KpnI-Fragment von pYGA22m legiert. Das resultierende Plasmid, pCGP618, enthielt das pCGP175-cDNA-Fragment, legiert in einer Sense- Orientierung hinter dem Glyceraldehyd-3- phosphatdehydrogenasepromotor (Fig. 11).

Aufbau von pCGP620

Ein 1,8 kb EcoRI-KDnI-Fragment, das das gesamte cDNA-Insert von pCGP176 enthielt, wurde mit dem 9kb EcoRI-KpnI-Fragment von pYGA22 m (wie für den Aufbau von pCGP618 beschrieben) ligiert. Das resultierende Plasmid pCGP620 enthielt das pCGP176 cDNA-Fragment, ligiert in einer Sense-Orientierung hinter dem Hefeglyceraldehyd-3-phosphatdehydrogenasepromotor.

Hefetransformation

Der Hefestamm G-1315 (Mat α trpl) (Ashikari et al., 1989) wurde mit pCGP618 und pcgP620 gemäß Ito et al. (1983) transformiert. Die Transformanten wurden anhand ihrer Fähigkeit G-1315 zur Tryptophanprototrophie wieder aufzubauen ausgewählt.

Herstellung von Hefeextrakten für den Assay von 3',5'- Hydroxylaseaktivität

a. G-1315/pCGP618

Einzelne Isolate von G-1315/pCGP618 und ein G-1315 Revertant, der auf einem Medium ohne Tryptophan gewachsen ist, wurden verwendet, um 50 ml YNBC [1,2% (Gew./Vol.) Hefestickstoffbase ohne Aminosäure (Difco), 2% (Gew./Vol.) Glukose und 0,3% (Gew./Vol.) Casaminosäure (Difco)] zu inokulieren und wurden unter Schütteln für 2 Tage bei 30ºC inkubiert. Zellen wurden durch Zentrifugieren pelletiert und eine Mikrosomenfraktion wurde gemäß Oeda et al. (1985), ausgenommen, daß die Sphäroplasten in den Extraktionspuffer, der für den Assay von 3',5'-Hydroxylaseaktivität in Pflanzengewebe verwendet wurde, zerstört wurden, erhalten. Mikrosomenpellets wurden in 400 ul Puffer A (10 mM Tris-HCl (pH 7,5), 0,65 M Sorbitol, 0,1 mM DTT, 0,1 mM EDTA) suspendiert und eine 100 ul Probe wurde hinsichtlich 3',5'-Hydroxylaseaktivität untersucht.

b. G-1315/pCGP620

Ein einzelnes Isolat von G-1315/pCGP620 wurde verwendet, um 20 ml YNBC zu inokulieren, welches nachfolgend für 2 Tage bei 30 ºC inokubiert wurde. Zellen wurden durch Zentrifugation gesammelt, einmal mit TE, einmal mit Puffer A gewaschen und dann in Puffer B (10 mM Tris-HCl (pH 7,5), 1,2 M Sorbitol, 0,1 mM DTT, 0,1 mM EDTA), der Zymolyase (0,1 mg/ml) (Seikagakukogyo, Japan) enthielt, resuspendiert. Nachfolgend auf eine Inkubation für 1 Stunde bei 30ºC wurden die Zellen durch Zentrifugation pelletiert und in 400 ul Puffer A resuspendiert. Die Zellsuspension wurde dann mit Glaskügelchen (Durchmesser = 0,4 mm) für 2 Minuten verwirbelt und eine 100 ul Probe wurde hinsichtlich 3',5'-Hydroxylaseaktivität untersucht.

Petunie-Transformation

a. Pflanzenmaterial

Petunia hybrida (Skr4 · Sw63 und Rp57 · Rw14) -Samen wurden in 1,25% (Gew./Vol.) Natriumhypochlorid für 10 min sterilisiert und dreimal in sterilem Wasser gespült. Sterilisierte Samen wurden in 100 mg/l Gibberellinsäure (GA&sub3;)-Lösung für 16 bis 20 Stunden eingetaucht. Sie wurden dann für 2 Wochen auf 10% (Gew./Vol.) MS (Murashige und Skoog, 1962) -Medium, das zusätzlich 1% (Vol./Vol.) Sucrose und 0,8% (Gew./Vol.) Difco Bacto Agar enthielt, zum keimen gebracht. Junge Sämlinge wurden für 3 Wochen auf MS-Medium, das mit 3% (Gew./Vol.) Sucrose supplementiert war, übergeführt, bevor sie auf Jiffy Torfpellets (Jiffy Products Ltd., Norwegen) übergeführt wurden, unter leichtem Sprühregen gehalten und beleuchtet (135 uE, Quecksilberhalogenidlicht, 22ºC) für 2 bis 3 Wochen. Diese Jungpflanzen wurden dann in eine Aufzuchtkammer (68 uE kühles weißes Fluoreszenzlicht, 25ºC) übergeführt. Für die Cokultivierung wurden junge Blätter geerntet und in 1,35% (Gew./Vol.) Natriumhypochlorit für 2 min sterilisiert, gefolgt durch dreimaliges Spülen in sterilem Wasser. Blattgewebe wurde dann in 25 mm² Quadrate geschnitten und für 24 Stunden vorkultiviert auf MS Medium, das mit 0,05 mg/l Kinetin und 1,0 mg/l 2,4-Dichlorphenoxyessigsäure (2,4-D) supplementiert war.

b. Cokultivierung von Agrobakterium und Petuniengewebe

Der Agrobakterium-tumefaciens-Stamm AGLO (Lazo et al., 1991), der den binären Vektor pCGP90 (Fig. 14) enthielt, wurde bei 4 ºC auf MG/l (Garfinkel und Nester, 1980) Agarplaten mit 100 mg/l Gentamycin gehalten. Eine Einzelkolonie wurde über Nacht in Flüssigmedium, das 1% (Gew./Vol.) Bacto-Pepton, 0,5% (Gew./Vol.) Bacto-Hefeextrakt und 1% (Gew./Vol.) NaCl enthielt, gezüchtet. Eine Endkonzentration von 5 · 10&sup8; Zellen/ml wurde am nächsten Tag durch Verdünnung in flüssigem MS-Medium, das 3% (Gew./Vol.) Sucrose (BPM) enthielt, hergestellt. Blattscheiben wurden für 5 Minuten in BPM eingetaucht, das AG10/pCGP90 enthielt. Die Blattscheiben wurden dann trocken geblottet und auf Cokultivierungsmedien für 4 Tage angeordnet. Das Cokultivierungsmedium bestand aus SH- Medium (Schenk und Hildebrandt, 1972) das mit 0,05 mg/l Kinetin und 1,0 mg/l 2,4-D supplementiert war und enthielt eine Einspeisungsschicht aus einer Tabakzellsuspension, die über das Cokultivierungsmedium verteilt war, mit einem Filterpapier, das auf der oberen Seite der Tabakzellsuspension angeordnet war.

c. Gewinnung von transgenen Petunienpflanzen

Nach Cokultivierung wurden die Blattscheiben auf die folgenden Selektionsmedien übergeführt: Skr4 · Sw63 Scheiben auf frisches MS-Medium, das mit 3% (Gew./Vol.) Sucrose, 2 mg/l α- Benzylaminopurin (BAP), 100 mg/l Kanamycin, 350 mg/l Cefotaxim, 0,3% (Gew./Vol.) Gelrite Gellan Gum (Schweizerhall) supplementiert war; Rp57 · Rw14 Scheiben auf das gleiche Medium, das 0,5 mg/l BAP und α- Naphthalinessigsäure (NAA) anstelle von 2 mg/l BAP enthielt. Nach 3 Wochen wurden regenerierende Explantate auf frisches Medium übergeführt. Hinzukommende Sprößlinge, die die Kanamycinselektion überstanden, wurden isoliert und zur Wurzelinduktion auf BPM übergeführt, das 100 mg/l Kanamycin und 350 mg/l Cefotaxim enthielt. Alle Kulturen wurden unter einer 16 h Photoperiode (60 uE kühles weißes Fluoreszenzlicht) bei 23 ± 2ºC gehalten. Wenn die Wurzeln 2 bis 3 cm Länge erreichten, wurden die transgenen Petunienpflänzchen in ein autoklaviertes Debco 51410/2 Topfgemisch in 8 cm Röhrchen übergeführt. Nach 4 Wochen wurden die Pflanzen in 15 cm Töpfe unter Verwendung des gleichen Topfgemischs umgepflanzt und bei 23ºC unter einer 14-stündigen Photoperiode (300 uE Quecksilberhalogenidlicht) gehalten.

Tabaktransformation

a. Pflanzenmaterial

Nicotiana tabacum (cv. Xanthi) Ausgangspflanzen wurden auf MS- Medium, das mit 1 mg/l Indolbuttersäure (IBA) supplementiert und mit 0,25% (Gew./Vol.) Gelrite verfestigt war, gehalten. Pflanzengewebe wurde in 25 mm² Quadrate geschnitten und auf MS-Medium für 24 Stunden angeordnet, das 1 mg/l BAP und 0,5 mg/l Indolessigsäure (IAA) enthielt.

b. Cokultivierung von Agrobakterium und Tabakgewebe

Die Cokultivierung wurde wie früher für Petunie beschrieben durchgeführt.

c. Gewinnung transgener Tabakpflanzen

Nach Cokultivierung wurden Pflanzenscheiben auf MS-Medium übergeführt, das mit 1 mg/l BAP, 0,5 mg/l IAA, 100 mg/l Kanamycin und 350 mg/l Cefotaxim (Selektionsmedium) supplementiert war. Regenerierende Explantate wurden auf frisches Selektionsmedium nach 2 bis 3 Wochen übergeführt. Hinzukommende Sprößlinge, welche die Kanamycinselektion überstanden, wurden isoliert und zur Wurzelinduktion auf MS- Medium übergeführt, das 1 mg/l IBA, 100 mg/l Kanamycin und 350 mg/l Cefotaxim enthielt. Wenn die Wurzeln eine Länge von 2 bis 3 cm erreichten, wurden die transgenen Tabakpflänzchen auf Boden wie für Petunie beschrieben, umgepflanzt.

Anthocyanidinanalyse

Vor einer HPLC-Analyse wurden die in den Petalextrakten vorliegenden Antocyaninmoleküle sauer hydrolysiert um Glykosylreste aus dem Anthocyanidinkern zu entfernen. Das Hydroxylierungemuster auf dem B-Ring der Anthocyaninpigmente wurde durch HPLC-Analyse des Anthocyaninkernmoleküls bestimmt. Das verwendete HPLC-System in dieser Analyse war ein Hewlett- Packard 1050, ausgestattet mit einem Multiwellenlängendektor (MWD). Chromatographische Reversephaseauftrennungen wurden auf einer Spherisorb S5 ODS2 Kartuschensäule, 250 mm · 4 mm Innendurchmesser, durchgeführt.

a. Extraktion von Anthocyaninen und Flavonoiden

Blütenpigmente wurden aus Petalsegmenten (ca. 50 mg) mit 5 ml Methanol extrahiert, das 1% (V/) wäßrige 6M Chlorwasserstoffsäure enthielt. Die Extrakte wurden mit Wasser verdünnt (1 : 9) und vor der Injektion in das HPLC-System filtriert (Millex HV, 0,45 u).

b. Hydrolyse von Anthocyaninen

Rohe Methanolextrakte (100 ul), die in a. oben erhalten wurden, wurden zur Trockene in Pierce Reacti-Gläschen unter Verwendung eines trockenen Stickstoffstromes bei Raumtemperatur eingedampft. Die Reste wurden in 200 ul 2M HCl gelöst, die Gläschen wurden mit einem Deckel versehen und dann bei 100ºC für dreißig Minuten erhitzt. Die Hydrolysegemische wurden mit Wasser verdünnt (1 : 9) und vor einer HPLC-Analyse filtriert (Millex HV, 0,45 u).

c. Chromatographie

Eine Auftrennung der Pflanzenpigmente wurde durch Gradientenelution unter Verwendung des folgenden Systems erreicht:
Lösungsmittel A: (Triethylamin: Konz. H&sub3;PO&sub4; : H&sub2;O) (3 : 2,5 : 1000)
Lösungsmittel B: Acetonitril
Gradientenbedingungen:
5% B bis 40% B über 20 Minuten
Flußrate: 1 ml/min
Temperatur: 35ºC
Detektion: MWD mit simultaner Datenerfassung bei 280, 350 und 546 nm.
Die Anthocyanidinsignale wurden durch Referenz mit bekannten Standards identifiziert.

2. KLONIEREN UND ANALYSE VON 3',5'-HYDROXYLASE

Charakterisierung des 3',5'-Hydroxylaseenzyms

a. Entwicklungsmäßige Steuerung

Extrakte von p. hybrida cv. OGB Petalen, geerntet von Blüten bei den verschiedenen oben definierten Entwicklungsstufen, wurden hinsichtlich 3',5'-Hydroxylaseaktivität untersucht. Die 3',5'-Hydroxylaseenzymaktivität in OGB-Petalen erwies sich als entwicklungsmäßig gesteuert während der Reifung der Corolla (Fig. 2B). Dieses entwicklungsmäßige Profil war parallel zur Expression anderer Gene, die in der Flavonoidbiosynthese involviert sind. Die Aktivität des 3',5'- Hydroxylaseenzyms und die Expression der Chalconsynthase (CHS)-, Chalconflavanonisomerase (CHI)-, Dihydroflavonolreduktase (DFR)-Gene hat ihr Maximum um die Stufen 3 bis 4 der Pflanzenentwicklung.

b. Induktion von 3',5,-Hydroxylaseaktivität in Pflanzengewebe

Gene des Flavonoidpigmentbiosyntheseweges werden normalerweise nicht in Pflanzengewebe exprimiert. Jedoch die Synthese von Delphinidinpigmenten wurde in OGB-Blättern induziert durch Inkubation in einer 2% (Gew./Vol.)-Glucoselösung unter Intensivlicht. Unter diesen Bedingungen kann die 3',5'- Hydroxylaseenzymaktivität in OGB-Blattgewebe nachgewiesen werden. Es wurde gezeigt, daß eine maximale Induktion von Enyzmaktivität nach 96 Stunden der Glucose/Intensivlichtbehandlung auftritt. Unter diesen Bedingungen wurde ebenfalls die Expression von verschiedenen anderen Pigmentbiosynthesegenen auf Ausmaße induziert, die vergleichbar mit denjenigen waren, die in aufgehenden Petalen beobachtet wurden. Es wurde aus diesen Ergebnissen geschlossen, daß die Hf1- und/oder Hf2- Gene in Glukose/Intensivlicht behandeltem Blattgewebe induziert werden.

c. Nachweis, daß die 3',5'-Hydroxylase zu der Cytochrom P450- Klasse von Enzymen gehört

Die 3',5'-Hydroxylaseaktivität in OGB-Petalen erwies sich äls verbunden mit der Mikrosomenfraktion und als abhängig von dem Vorliegen von NADPH. Die Aktivität könnte inhibiert werden durch die Behandlung der Mikrosomen mit Kohlenmonoxid und durch zwei Inhibitoren, die spezifisch Cytochrom P450 Enzyme inaktivieren: Tetcyclasis und 1-Aminobenzotriazin (Taton et al., 1988; Matthews et al., 1985; Rademacher et al., 1987).

Aufbau von einer cDNA-Bibliothek, die Cytochrom P450 sequenzangereichert ist

Die Translation von Cytochrom P450-mRNA tritt auf Membrangebundenen Polysomen auf (Takemori und Kominami, 1989). Daher wurde zum Anreichern von Cytochrom P450-Sequenzen (einschließlich 3',5'-Hydroxylasesequenzen) einer cDNA- Bibliothek aufgebaut, unter Verwendung membrangebundener polysomaler RNA, die aus OGB-Petalen von Blüten der Stufe 3 bis 4 isoliert wurde. Die Isolierung der Petal-RNA aus Stufe 3- bis 4-Blüten stellte sicher, daß 3',5'-Hydroxylasesequenzen maximal in der Bibliothek vertreten waren, da 3',5'- Hydroxylaseaktivität sich als maximal in dieser Entwicklungsstufe erwies (siehe oben und Fig. 2B). Die resultierende Bibliothek, bezeichnet als cDNA-Bibliothek #1, enthielt 250.000 primäre Rekombinanten.

PCR-Amplifikation einer Petunie Petalcytochrom P450-cDNA

Eine große Anzahl Cytochrome P450 ist sequenziert worden, aus verschiedensten Organismen, wie Vertebraten, Pilzen, Insekten, Bakterien und einer Pflanze (Nebert et al., 1991, Bozak et al., 1990). Eine Charakteristik all dieser Enzyme ist das Vorliegen einer Vielzahl von kleinen Bereichen mit Sequenzkonservierung, im besonderen um den Cysteinrest, der in die Häm-Bindung involviert ist. Die Aminosäuresequenz F(G,S)XGXRXCXG liegt in der Häm-Bindungsdomäne nahezu aller mikrosomaler Cytochrome P450, die bis heute sequenziert sind, vor, worin X jede Aminosäure sein kann (Fig. 3). Diese Konsensussequenz wurde verglichen mit der NBRF- Proteindatenbank unter Verwendung des FASTA-Programms (Pearson und Lipman, 1988), um die Frequenz des Auftretens von Aminosäuren um diesen Bereich für alle mikrosomale Cytochrom P450 Sequenzen in der Datenbank zu bestimmen. Diese Analyse zeigte, daß die häufigste Aminosäuresequenz für jede Position um die Häm-Bindungsstelle war:
FMPFGAGXRXCLG
Ein Oligonukleotid wurde aufgebaut, um an ein Gen zu hybridisieren, das für die unterstrichene Sequenz und ähnliche Sequenzen codiert. Dieses Oligonukleotid, bezeichnet als Oligo 1, ist nachstehend gezeigt:
5'-GGAAGCTTATICCITT(T/C)GGIGCIGG-3'
Der unterstrichene Teil ist eine zusätzliche Sequenz, welche eine HindIII-Erkennungsstelle enthält, um das gerichtete Klonieren von PCR-Produkten zu erleichtern. Die Einbeziehung von Deoxyinosin (I) deckte die verschiedenen Möglichkeiten zur Codonverwendung ab, worin mehr als zwei Codons für die gleiche Aminosäure codieren könnten. Deoxyinosinbasepaare mit ähnlicher Effizienz für A, T, G und C (Martin et al., 1985; Ohtsuka et al., 1985).
Aus der cDNA-Bibliothek 41, wie in Materialen und Verfahren beschrieben, erhaltene Plasmid-DNA wurde verwendet als ein Templat für die Amplifikation einer 360 bp mit Cytochrom P450 verwandten Sequenz, unter Verwendung der Oligos 1 und 2 (Fig. 3). Oligo 2 entsprach dem -20 Primer (Stratagene) plus einer GCN4-Bindungsstelle (Lew und Kemp, 1989) am 5'-Ende. Das PCR- Fragment wurde in pBluescript kloniert und das resultierende Plasmid wurde als pCGP450 bezeichnet. Die 5'-Region von pCGP450 codierte für eine Polypeptidsequenz mit signifikahter Homologie zu früher sequenzierten Cytochrom P450-Molekülen.

Isolierung von Cytochrom P450 Homologen aus einer Petunienpetal-cDNA-Bibliothek

Das Plasmid pCGP450 wurde verwendet, um die cDNA-Bibliothek #1 (60.000 Plaques) auf damit verwandte Klone zu untersuchen. Zwei aufeinanderfolgende Hybridisierungen unter Bedingungen hoher und geringer Stringenz wurden verwendet, um beide Sämlingklone von pCGP450 und eine zweite Gruppe von Cytochrom P450-cDNAs nachzuweisen. Ein repräsentativer cDNA-Klon jeder der Sämlinggruppen wurde für nachfolgende Analysen ausgewählt. Der pCGP450-Sämling wurde pCGP142 bezeichnet und der Vertreter der zweiten Gruppe wurde als pCGP147 bezeichnet. Ein SalI- EcoRI-Fragment, das nur die Codierungssequenzen von pCGP147 enthielt, wurde dann verwendet, um 16.000 Plaques aus der cDNA-Bibliothek #1 bei geringer Strigenz erneut zu sondieren. Insgesamt 20 Klone, die an die Sonde. hybridisierten, wurden sequenziert, wobei es möglich wurde, zwei weitere Cytochrom P450-Homologe zu identifizieren: pCGP158 und pCGP160 (Fig. 4A).

Isolierung eines zusätzlichen Petalcytochrom P450-Homologen durch PCR

Eine Sequenzinformation aus dem Bereich um die mutmaßliche Häm-Bindungsdomäne der Petunienklone pCGP142, pCGP147 und eine früher sequenzierte Avocado-Cytochrom P450-Sequenz (O'Keefe und Leto, 1989; Bozak et al., 1990) wurden verwendet, wie in Materialien und Verfahren beschrieben, um ein zweites Degenerationsoligonukleotid (Oligo 3) zu entwickeln, welches Aminosäuresequenzen abdeckte, die durch mindestens zwei der drei Cytochrom P450-Klone codiert werden. Dieses Oligonukleotid wurde verwendet, um damit verwandte Sequenzen durch PCR unter Verwendung der cDNA-Bibliothek #1 als das Templat und Oligo 4 als den zweiten Primer (Fig. 3B) zu amplifizieren. Reaktionsprodukte im Größenbereich von 250 bis 500 bp wurden wie in Materialien und Verfahren beschrieben isoliert und in dem pBluescript-Vektor mit dem ddT-Schwanz, der von Holton und Graham (1991) beschrieben ist, kloniert. Die klonierten PCR-Fragmente wurden sequenziert und es erwies sich, daß sie für ein fünftes Cytochrom P450-Homologes codierten. Ein Klon, bezeichnet als pCGP454, wurde für eine weitere Analyse ausgewählt.

Isolierung weiterer Cytochrom P450-Homologen aus der cDNA- Bibliothek #1

Eine gemischte Sonde ³²P-markierter DNA-Fragmente, die die Codierungsbereiche der Cytochrom P450-Homologen pCGP142, pCGP147, pCGP158 und pCGP160 und das cDNA-Insert von pCGP454 (Fig. 4B bis 4H) enthielten, wurden verwendet, um 50.000 Rekombinanten der cDNA Bibliothek #1 auf verwandte Sequenzen zu untersuchen. Insgesamt 152 hybridisierende Klone wurden unter Hybridisierungs- und Waschbedingungen mit geringer Stringenz nachgewiesen. Weitere dreizehn verschiedene Cytochrom P450-Homologe wurden identifiziert durch Sequenzanalyse von DNA, die aus den hybridisierenden Klonen isoliert wurde. Zwei eng verwandte Sämlingsgruppen wurden unter diesen Klonen unterschieden. Die codierenden Regionen der beiden Gruppen zeigten 94% Homologie oder Ähnlichkeit im DNA-Gehalt. Zwei Vertreter einer Sämlingsgruppe, pCGP174 (Fig. 5A) und pCGP176, und ein Vertreter der anderen Sämlingsgruppe, pCGP175 (Fig. 5B), wurden für eine weitere Untersuchung ausgewählt.

Northern- und RFLP-Analyse der Cytochrom P450-Homologen

Northern- und RFLP-Analysen wurden verwendet, um zu unterscheiden, welche Cytochrom P450-Homologen die molekularen Charakeristika einer für 3',5'-Hydroxylase codierenden cDNA aufwiesen. Es gibt zwei genetische Loci in P. hybrida, Hf1 und Hf2, die die 3',5'-Hydroxylaseaktivität steuern (de Vlaming et al., 1984; Wiering, 1974). Hf1 wird sowohl im Saum als auch in der Röhre von P. hybrida-Blüten exprimiert und ergibt einen Anstieg auf viel höhere 3, 5'-Hydroxylaseaktivitätsgrade als HF2, welches nur in dem Saum exprimiert wird. Petunie-3',5'- Hydroxylaseaktivität wird ebenfalls entwicklungsmäßig und räumlich gesteuert. Unter normalen Wachstumsbedingungen kann das Enzym nür in Petalgeweben nachgewiesen werden, wobei es auf maximale Gehalte um die Stufen 3 bis 4 der Pflanzenentwicklung ansteigt und dann in der vollständig geöffneten Blüte (Stufe 5; siehe Fig. 2(B)) abfällt. Die Aktivität kann auch in Blattgewebe unter bestimmten Streßbedingungen, wie etwa die Glukose/Intensivlichtbehandlung, die oben beschrieben ist, induziert werden. Demgemäß wurde erwartet, daß ein cDNA-Klon, der für eine 3',5'-Hydroxylase codiert, ein Expressionsprofil auf RNA-Blots aufweist, das mit dem Enzymaktivitätsprofil parallel läuft. Es wurde ebenfalls erwartet, daß ein cDNA- Klon, der für eine P. hybrida-3',5'-Hydroxylase codiert, entweder im Hf1- oder Hf2-Locus zu verzeichnen ist. Hf1 wurde im Chromosom I des P. hybrida-Genoms verzeichnet und ist an den Ph1-Lokus gebunden (Cornu, 1984; Cornu et al., 1990), während Hf2 eng mit dem Po auf Chromosom V (Wallroth et al., 1986) verbunden ist. RFLP-Analyse von DNA die aus einer F&sub2;- Population von Pflanzen isoliert wurde, welche aus einer Kreuzung zwischen den Inzuchtlinien V23 (Hf1/Hf1, Hf2/Hf2) und R51 (hf1/hf1, hf2/hf2) stammte, wurde verwendet, um Verknüpfungsdaten für die verschiedenen Cytochrom P450- Homologen zu erhalten. Ein Hf1/-Genotyp wurde F2-Pflanzen zugeordnet, die 3',5'-Hydroxylaseaktivität in der Blütenröhre aufwiesen. Zusätzlich war es möglich, einen Hf1/Hf1- Genotyppflanzen in der F&sub2;-Population zuzuordnen, basierend auf einer Verknüpfung an das plil-Gen, welches den pH der Petalvakuole beeinflußt (Wiering und de Vlaming, 1984). Die V23-Elternlinie (Hf1/Hf1) hatte auch einen plil/plil- Genotyp, welcher zu einem Petalhomogenat-pH-Wert von ungefähr 6,2 führt. Da Ph1/-Pflanzen einen Petalhomogenat-pH-Wert von 5,3 aufweisen, war es möglich ph1/ph1 (Hf1/Hf1)-Pflanzen innerhalb der R51·V23-F&sub2;-Population durch Untersuchen des pH- Wertes des Petalhomogenates zu unterscheiden.
Die Verknüpfung zwischen den Hf2- und Po-Loci wurde verwendet, um Kandidaten-Hf2-Klone zu unterscheiden. Der Po-Lokus erwies sich als entsprechend dem P. hybrida-chiA-Gen, welches für das Enzym Chalconflavanonisomerase codiert (von Tunen et al., 1991). Ein cDNA-Klon von chiA könnte daher in der RFLP-Analyse verwendet werden, um einen Po- oder p.q-Genotyp Individuen in der F&sub2;-Population zuzuweisen. Da V23 einen Hf2/Hf2, P. Q/PQ- Genotyp aufweist, war es möglich, die Verknüpfung an den Hf2- Lokus durch Cosegregation der V23-ähnlichen und R51-ähnlichen RFLP-Muster mit den po- und Po-Mustern, nachgewiesen durch die chi-A-Sonde, zu bestimmen.
Die cDNA-Fragmente, die der nicht translatierten 3-Region der Cytochrom P450-Homologen entsprach, wurde verwendet, um RNA- Blots und Southern-Blots von Genom-DNA zu sondieren, welche aus einzelnen Pflanzen in der V23 · R51 F&sub2;-Population isoliert wurde. Durch diese Analyse wurde gezeigt, daß die Gene, die den cDNA-Klonen pCGP174 und pCGP175 entsprachen, auf eine Art exprimiert wurden, die parallel zur 3',5'-Hydroxylaseaktivität lief. Darüber hinaus wurde gezeigt, daß das Gen, das pCGP174 entspricht, eng verknüpft mit dem Hf1-Lokus ist und pCGP175 war an den Hf2-Lokus gebunden.

a. pCGP 174

Ein 330 bp HindIII- KpnI-3'-Fragment des Klons pCGP174 (Fig. 5A) ergab ein Hybridisierungsmuster sowohl auf den RNA- als auch DNA-Blots, das nahelegte, daß dieser Klon dem Hf1-Lokus (Fig. 6) entsprach. Das Gen wurde sowohl in Saum- als auch Röhrengewebe exprimiert und hatte ein entwicklungsmäßiges Profil, das parallel zur 3',5'-Hydroxylaseaktivität verlief, wobei der Maximalpunkt in den Petalsäumen der Stufe 3 erreicht war. Es wurde im Blatt keine Expression nachgewiesen, es wurde jedoch eine in diesem Gewebe durch die Glukose/Intensivlichtbehandlung induziert. Darüber hinaus wurde keine Expression des Gens in dem Petalgewebe der hf1/hf1-Mutantenlinien R51 oder Sw63 nachgewiesen. Im Gegensatz wurden relativ hohe Expressionsgrade in den Hf1/Hf1-Linien V23 und Th7 und dem V23 · R51-Hybrid (Fig. 6A) nachgewiesen.
Auf Southern-Blots von Genom-DNA, verdaut mit XbaI, erfasste das 330 bp-HindIII-KpnI- 3'-Fragment von pCGP174 zwei RFLP, die unabhängig in der V23 · R51-F2-Population segregierten. RFLP #1 entsprach stark hybridisierenden DNA-Banden, während RFLP #2 schwach hybridisierenden Banden (siehe Fig. 6B) entsprach. Elf der zwölf Pflanzen, die einem ph1/ph1-Genotyp zugeordnet wurden, hatten ein V23-ähnliches Muster für RFLP #1 und 49 von 49 Pflanzen, die 3',5'-Hydroxylaseaktivität in der Röhre zeigten, hatten entweder V23- oder VR-ähnliche Muster für RFLP #1. Zusätzlich bestand für insgesamt 32 Pflanzen eine vollständige Cosegregation der V23-, VR- und R51-RFLP-Muster für chi-A (po) mit den entsprechenden Mustern von RFLP #2.
Diese Daten lieferten einen starken Nachweis dafür, daß pCGP174 für eine 3',5'-Hydroxylase codierte und dem Hf1-Lokus (RFLP#1) entsprach und daß die 3'-Sonde an den Hf2-Lokus (RFLP #2) kreuzhybridisierte.

b. pCGP175

Ein 320 bp HindIII/XhoI-3'-Fragment des Klons pCGP175 (Fig. 5B) ergab ein Hybridisierungsmuster sowohl auf den RNA- als auch DNA-Blots, das nahelegte, daß dieser Klon dem Hf2-Locus (Fig. 7) entsprach. Die Northern-Analyse zeigte, daß das Gen entwicklungsmäßig auf eine ähnliche Art wie pCGP174 gesteuert wurde, mit maximaler Expression in OGB-Petalsäumen der Stufe 3, jedoch keine Expression wurde in OGB-Röhrengewebe nachgewiesen. Das Gen wurde ebenfalls in dem Petalgewebe von V23 (Hf2/Hf2), Th7 (Hf2/Hf2) und in dem V23 · R51-Hybrid (Fig. 7A) exprimiert.
Auf Southern Blots hybridisierte das 320 bp HindIII/XhoI- Fragment von pCGP175 an die gleichen Genomfragmente, die durch XbaI-Verdau von V23 und R51 Genom-DNA erzeugt wurden, die schwach an die pCGP174-3'-Sonde (RFLP #2) hybridisierte. Es bestand keine Cosegregation von V23-, VR- und R51-ähnlichen RFLP-Mustern, die durch die pCGP175-3'-Sonde nachgewiesen wurden und die entsprechenden Muster für chi-A (Po) (Fig. 7B).
Hefeexpressionsexperimente (siehe nachstehend) bestätigen nachfolgend, daß sowohl pCGP175 als auch ein Sämling von pCGP174 (pCGP176) für eine 3',5'-Hydroxylase codierten. Zusätzlich führte eine Expression einer Vollängenversion von pCGP174 in einer hf1/hf1-, hf2/hf2-Petuniemutante zu erhöhter 3',5'-Hydroxylaseaktivität um zu der Erzeugung von 3',5'- hydroxylierten Anthocyaninen überhalb der geringen Basalgehalten, die normalerweise in den nicht transgenen Pflanzen gefunden werden. Zusammengenommen mit den RFLP- Ergebnissen wurde aus diesen Daten geschlossen, daß pCGP174 dem Hf1-Lokus entspricht und pCGP175 dem Hf2-Lokus entspricht.

Isolierung von Vollängen-Hf1-cDNA-Klonen und Sequenzanalyse

Mit vorhergehenden Sequenzanalysen wird gezeigt, daß pCGP174 einen Vollängenklon des entsprechenden Transkripts darstellt, während pCGP175 einen mutmaßlichen Initiationscodon enthielt und vermutlich eine Vollängen-DNA war. Eine Sequenzanalyse zeigte auch, daß pCGP176 eine längere Version von pCGP174 war und ein ATG-Codon 17 bp von dem 5-Ende enthielt. Jedoch aus dieser Analyse allein war es nicht möglich, zuverlässig vorauszusagen, ob pCGP176 die vollständige Codierungsregion dieses Gens beinhaltete. Demgemäß wurde die cDNA-Bibliothek #2 hinsichtlich längerer Klone der pCGP174/pCGP176-Sämlingsgruppe untersucht. Ungefähr 1,5 · 10&sup5; Rekombinanten der cDNA- Bibliothek #2 wurden hinsichtlich Klone, die an das 0,33 kb HindIII-KpnI-3'-Fragment von pCGP175 hybridisierten, untersucht. Zwei hybridisierende Klone, bezeichnet als pCGP601 und pCGP602, wurden für weitere Analysen ausgewählt. Sowohl pCGP601 als auch pCGP602 umfaßten vermutliche Translationinitiationscodons, jedoch pCGP602 codierte für eine längere untranslatierte 5'-Region.
Eine Restriktionsenzymkarte von pCGP602, die die zum sequenzieren des Klons abgestimmte Methologie anzeigte und die Oligonukleötidprimersequenzen, die verwendet wurden, um die überlappende Sequenzinformation zu erhalten, ist in Fig. 8 gezeigt.
Die Nukleotidsequenz und deduzierte Aminosäuresequenz der Sämlingklone pCGP176 und pCGP602 sind in Fig. 9 gezeigt. Ähnlich zeigt Fig. 10 die Nukleotidsequenz und das deduzierte Translationsprodukt von pCGP175.
Unter Verwendung einer Ausrichtung, erzeugt durch das LFASTA- Programm (Pearson und Lipman, 1988), erwies es sich, daß die Aminosäuresequenzen, die durch die Petunie-3',5'- Hydroxylasegene codiert werden, 94% Positionsidentität teilen. Die Nukleotidsequenzen sind 94% identisch. Basierend auf dem Klassifikationsschema für Cytochrom P450 würde diese Sequenzähnlichkeit beider Gene in der gleichen Familie/Subfamilie einordnen. Da die 3',5'-Hydroxylase- Aminosäuresequenzen weniger als 40% Identität mit jedem früher charakterisierten Mitglied der Cytochrom P450- Überfamilie teilen, gehören die entsprechenden Gene zu einer neuen P450-Familie, getrennt von allen anderen P450-Genen.

Expression von pCGP175-cDNA in Hefe

Das cDNA-Insert von pCGP175 wurde in einer Sense-Orientierung hinter dem Glycerinaldehyd-3-phosphatdehydrogenase-Promotor in dem Hefevektor pYGA22m ligiert. Das resultierende Konstrukt, bezeichnet als pCGP618 (Fig. 11) wurde in den Hefestamm G- 1315 (Ashikari et al., 1989) transformiert. Ein Einzeltransformant wurde in 50 ml YNBC bei 30ºC für zwei Tage gezüchtet. Eine aus dieser Kultur hergestellte Mikrosomenfraktion zeigte eine 3',5'-Hydroxylaseaktivität während eine äquivalente Fraktion, hergestellt aus nichttransformierter Hefe, keine Aktivität hatte (Fig. 12). Daraus wurde geschlossen, daß das cDNA-Insert von pCGP175 eine 3',5'- Hydroxylase codierte.

Expression von pCGP176-cDNA in Hefe

Das cDNA-Insert von pCGP176 wurde in einer Sense-Orientierung hinter dem Glyceraldehyd-3-phoshatdehydrogenase-Promotor in dem Hefevektor pYGA22 m ligiert. Das resultierende Konstrukt, bezeichnet als pCGP620, wurde in den Hefestamm G-1315 transformiert. Ein aus der transformierten Hefe hergestellter Extrakt zeigt 3',5'-Hydroxylaseaktivität während eine äquivalente Fraktion, hergestellt aus nichttransformierter Hefe keine Aktivität aufwies (Fig. 13). Daraus wurde geschlossen, daß das cDNA-Insert von pCGP176 für eine 3',5'- Hydroxylase codierte.

Expression einer Hf1-cDNA

a. Expression im hf1/hf1-, hf2/hf2-P. hybrida F&sub1;-Hybrid Skr4 · Sw63.

Das pCGP620-cDNA-Insert wurde hinter dem Mac-Promotor des binären Ti-Vektors pCGP293 ligiert. Das resultierende Konstrukt, bezeichnet als pCGP90 (Fig. 14), wurde in das F&sub1; Petunie Hybrid Skr4 · Sw63 unter Verwendung eines durch Agrobakterium vermittelten Gentransfers eingeführt. Blattscheiben von Skr4 · Sw63 wurden cokultiviert mit AGLO/pCGP90 und eine Integration des pCGP602-cDNA-Inserts in das Skr4 · Sw63 Genom wurde durch Southern-Analyse von Pflanzen nach Kanamycin-Selektion erhalten.
Die transgenen Pflanzen hatten deutlich höhere Grade von sowohl 3',5'-Hydroxylaseenzymaktivität (Fig. 15) als auch 3',5'-hydroxylierter Anthocyanine (Tabelle 3A) als das nicht transgene Skr4 · Sw63 Hybrid. Wenngleich Skr4 · Sw63 homozygot rezessiv sowohl für das Hf1- als auch Hf2-Gen ist, blockieren diese Mutationen nicht vollständig die Enzymproduktion, da geringe Grade von 3',5'-Hydroxylaseaktivität in Skr4 · Sw63 Petalextrakten gefunden wurden (Fig. 15). Zusätzlich wurden geringe Gehalte (100 ug/g) Malvidin in sauer hydrolysierten Skr4 · Sw63-Petalextrakten (Tabelle 3A) nachgewiesen. Die Einführung der Hf1-cDNA erhöhte deutlich den Grad der 3',5'- Hydroxylaseäktivität in Petalsaumgewebe (Fig. 15) und sauer hydrolysierte Petalextrakte der transgenen Pflanzen wiesen das vierfache des Malvidingehaltes auf, der in nicht transgenen Kontrollen nachgewiesen wurde (Tabelle 3A).

b. Expression in Nicotiana tabacum kultivar Xanthi

Tabak (N. tabacum cv Xanthi) -Blüten erzeugen Cyanidin als das einzige Anthocyanidin. Transformation von Tabak mit pCGP90 führte zu der Akkumulation deutlicher Menge Delphinidin in den Blüten zusätzlich zu Cyanidin (gezeigt in Tabelle 3A). TABELLE 3A Pigmentanalyse In sauer hydrolysierten Petalextrakten gefundene Anthocyanidingehalte
¹nicht nachgewiesen

c. Expression in dem hf1/hf1-, hf2/hf2-P. hybrida F&sub1; Hybrid Rp57 · Rw14

Die Petunienlinie Rp57 · Rw14 wurde unter Verwendung von pCGP90 und einem Verfahren ähnlich demjenigen, das für Skr4 · Sw63 verwendet wurde, transformiert. Transgene Blüten erzeugten beachtliche Mengen Petunidin und Malvidin, welche in nicht transformierten Pflanzen (Tabelle 3B) nicht nachweisbar waren. Sowohl Petunidin als auch Malvidin sind methylierte Derivate von Delphinidin. TABELLE 3B Pigmentanalyse der Linie Rp57xRW14 mit hohem pH-Wert Prozentanteile in sauer hydrolysierten Petalextrakten gefundener Anthocyanidine
Die Expression der eingeführten Hf1-cDNA in dem Skr4 · Sw63- Hybrid hatte einen deutlichen Einfluß auf die Blütenfarbe. Das Karpell- und Stamen-Gewebe der nicht-transgenen Blüten sind weiß, während die gleichen Gewebe in den transgenen Pflanzen eine blaue/Purpurfarbe hatten. Zusätzlich vermittelte die Expression der HF1-cDNA in dem Skr4 · Sw63 Hybrid eine tiefrosa/violette Farbe der Korolla, welche normalerweise sehr blaßrosa ist. Im Falle von Tabak führte die Produktion von Delphinidin zu einem geringen Blauwerden der alternden Blüten. Expression der Hf1-cDNA in dem Rp57 · Rw14-Hybrid hatte wieder einen deutlichen Einfluß auf die Blütenfarbe. Nicht transgene Rp57 · Rw14-Blüten sind rosa, wobei Peonidin das hauptsächlich vorliegende Anthocyanidin ist (siehe Tabelle 3B). Die Transformation mit Hf1 cDNA führte zu einem deutlichen Blauwerden der Blütenfarbe.
Die beobachteten Farbänderungen können ebenfalls beschrieben werden in Zahlentermen aus der Royal Horticultural Society Colour Chart. Im allgemeinen können die Veränderungen als Veränderung der Farbe von den blassen zu den mittleren Rosa- Farben von 60C/D bis 65C/D, zu den dunkler blauen/stärker purpur Farben beschrieben werden, welche durch viele, aber nicht alle, Farbquadrate zwischen 70 und 85 beschrieben werden. Wenngleich es nicht gewünscht ist, sich auf die möglichen Farbänderungen, welche erreicht werden können, zu begrenzen, könnten einige der Farben, die in dem Skr4 · Sw63 Hybrid beobachtet werden, so beschrieben werden, daß sie sich von 65B (nicht transformiert) nach 70B und nach 74B (beide transformiert) änderten. Ähnlich kann einiges in dem Rp57 · Rw14-Hybrid beschrieben werden als Veränderung von 64C nach 72B nach 77B und nach 82B. Man sollte sich erinnern, daß andere biochemische und physiologische Bedingungen das individuele Auftreten beeinflussen und das Auftreten spezifischer Farben, das erreicht wird, sollte nicht als definierend des möglichen Bereichs interpretiert werden.

Nachweis mutmaßlicher 3',5'-Hydroxylase-Gensequenzen in anderen Pflanzenspezies

Das Vorliegen 3',4',5'-hydroxylierter Flavonoide korreliert mit dem Vorliegen von 3',5'-Hydroxylaseaktivität und daher mit dem 3',5'-Hydroxylasegen. Man würde erwarten, daß diese Gene von anderen Spezies mit dem Petunie-3',5'-Hydroxylasegen unter Bedingungen geringer Stringenz hybridisieren würden. RNA (Fig. 16) und/oder DNA (Fig. 17) wurden aus mehreren Delphinidin-erzeugenden Pflanzen isoliert, sondiert mit ³²Pmarkierter Hf1-cDNA und unter Bedingungen verschiedener Stringenz gewaschen. Hybridisierungsbanden wurden in jedem Beispiel nachgewiesen. Daher sollte die Isolierung von 3',5'- Hydroxylasegenen aus anderen Delphinidin-erzeugenden Pflanzen unter Verwendung eines Petunie-3',5'-Hydroxylasegens als eine Sonde möglich sein.
Der Fachmann in der Technik wird einzuschätzen wissen, daß die hier beschriebene Erfindung für Variationen und Modifikationen, die von den spezifisch beschriebenen verschieden sind, zugänglich ist. Es versteht sich, daß die Erfindung alle derartigen Variationen und Modifikationen umfaßt. Die Erfindung umfaßt auch alle Schritte, Merkmale, Zusammensetzungen und Verbindungen, auf die Bezug genommen wird oder die in dieser Beschreibung angegeben sind, einzeln oder zusammen und jede und alle Kombinationen aus zwei oder mehreren der Schritte oder Merkmale.

Literaturstellen:

Asen, S., Stewart, R. N. und Norris, K. H. Phytochemistry 14: 2677-2682, 1975.
Asen, S., Griesbach, R. J., Norris, K. H. und Leonhardt, B. A. Phytochemistry 25: 2509-2513, 1986.
Ashikari, T., Kiuchi-Goto, N., Tanaka, Y., Shibano, Y., Amachi, T., und Yoshizumi, H. Appl. Microbiol. Biotechnol. 30: 515-520, 1989.
Aviv, H. aud Leder, P., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 69: 1408- 1412, 1972.
Beale, G. H. Journal of Genetics 40(3): 337-358, 1940.
Bethesda Research Laboratories. BRL pUC-host: E. coli DHSaTMcompetent cells. Bethesda Res. Lab. Focus. 8t2): 9, 1986.
Bozak, K. R., Yu, H., Sirevag, R. und Christoffersen, R. E., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87: 3904-3908, 1990.
Bullock, W. O., Fernandez, J. M. und Short, J. M. Biotechniques 5: 376, 1987.
Comai, L., Moran, P. und Maslyar, D., PZant Molecular Biology 15: 373-381, 1990.
Cornu, A., Genetics. In: Petunia Sink, K. C. (Hrs.). Springer- Verlag, Berlin, Deutschland, S. 35-47, 1984.
Cornu, A., Farcy, E., Maizonnier, D., Haring, M., Veerman, W. und Gerats, A. G. M. In Genetic maps - Locus maps of complex genomes 5. Ausgabe, Stephen J. O'Brien (Hrs.), Cold Spring Harbor Laboratory Press, USA, 1990.
Dellaporta, S. J., Wood, J. und Hick, J. B. Plant Mol. Biol. Rep. 1: 19-21, 1983.
De Vlaming, P. Gerats, A. G. M., Wiering, H. und Wijsman, H. J. W. Plant Mol. Biol. Rep. 2(2): 21-42, 1984.
Doodeman, M., Gerats, A. G. M., Schram, A. W., de Vlaming, P. und Bianchi, F., Theor. Appl. Genet. 67: 357-366, 1984.
Ebel, J. und Hahlbrock, K., In The Flavonolds: Advances in Resecvch Since 1980. Harborne, J. B. (Hrs.), Academic Press, New York, USA, 641-679, 1988.
Forkmann, G. Plant Breeding 106: 1-26, 1991.
Forkmann, G. und Stotz, G. Z. Naturforsch 36c: 411-416, 1981.
Garfinkel, D. J. und Nester, E. W. J. Bacteriol. 144: 732-743, 1980.
Hagmann, M., Heller, W. und Grisebach, H. Ew. J. Biochem. 134: 547-554, 1983.
Hahlbrock, K. und Grisebach, H. Annu. Rev. Plant Physiol. 30 105-130, 1979.
Hanahan, D. J. Mol. Biol. 166: 557, 1983.
Harborne, J. B. und Simmonds, N. W. Annu. Rep. John Innes Inst. 53: 29-30, 1962.
Heller, W. und Forkmann, G. In: The Flavonoids, Advances in Research Since 1980. Harborne, J. B. (Hrs.), Academic Press, New York, 1988.
Holton, T. A. und Graham, M. W. Nucleic Acids Research 19: 1156, 1991.
Inoue, H., Nojima, H. und Okayama, H. Gene 96: 23-28, 1990.
Ito, H., Fukuda, Y., Murata, K. und Kimura, A. J. Bacteriol., 153: 163-168, 1983.
Jefferson, R. A., Kavanagh, T. A. und Bevan, M. W. EMBO J. 6(13): 3901-3907, 1987.
Koes, R. E., Spelt, C. E., Reif, H. J.; von den Elzen, P. J. M., Veltkamp, E. und Mol, J. N. M. Nucl. Acids Res. 14(13): 5229- 5239, 1986.
Larson, R. L. und Bussard, J. B. Plant Physiol. 80 483-486, 1986.
Lazo, G. R., Pascal, A. S. und Ludwig, R. A. Bio/technology 9: 963-967, 1991.
Lew, A. M. und Kemp, D. J. Nucl. Acids Res. 17(14) 5859-5860, 1989.
McBride, K. E. und Summerfelt, K. R. Plant Molecular Biology 14: 269-276 1990.
Martin, F. M., Castro, N. M., Aboula-ela, F., Tinoco, I. Nucl. Acids Res. 13: 8927-8938, 1985.
Matthews, J. M., Dostal, L. A. und Bend, J. R. J. Pharmacology and Erperimental Therapeutics 235(1): 186-190, 1985.
Merrifield, J. Am. Chem. Soc. 85: 2149, 1964.
Murashige, T. und Skoog, F. Physiol. Plant 15: 73-97, 1962.
Nebert, D. W., Nelson, D. R., Coon, M. J., Estabrook, R,W., Feyereisen, R., Fujii-Kutiyama, Y., Gonzalez, F. J., Guengerich, F. P., Gunsalus, I. C. Johnson, E. F., Loper, J. C., Sato, R., Waterman, M. R., Waxman, D. J. DNA and Cell Biology 10: 1-14, 1991.
Norrander, J., Kemp, T. und Messing, J. Gene 26: 101, 1983.
Oeda, K., Sakaki, T., und Ohkawa, H. DNA 4: 203-210, 1985.
C'Keefe, D. P. und Leto, K. J. Plant Physial. 89: 1141-1149, 1989.
Ohtsuka, E., Matsuki, S., Ikehara, M., Takahashi, Y. und Matsubara, K. J. Biol. Chem. 260(5): 2605-2608, 1985.
Pearson, W. R. und Lipman, D. J. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85: 2444-2448, 1988.
Rademacher, W., Fritsch, H., Graebe, J. E., Sauter, H und Jung, J. Pesticide Science 21: 241-252, 1987.
Sambrook, J., Fritsch, E. F. und Maniatis, T. Molecular Cloning: A Laboratory Manual (2. Ausgabe). Cold Spring Harbor Laboratory Press, USA, 1989.
Sanger, F., Nicklen, 5. und Coulson, A. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 74: 5463-5467, 1977.
Schenk, R. U. und Hilderbrandt, A. C. Can. J. Bot. 50: 199-204, 1972.
Schram, A. W., Jonsson, L. M, V. und Bennink, G. J. H. Biochemistry of flavonoidsynthesis in Petunia hybrida. In: Petunia Sink, K. C. (Hrs.) Springer-Verlag, Berlin, Deutschland, Seiten 68- 75, 1984.
Stafford, H. A. Flavonoid Metabolism CRC Press, Inc. Boca Raton, Florida, USA, 1990.
Stotz, G. und Forkmann, G. Z. Naturforsch 37c: 19-23, 1982.
Stotz, G., de Vlaming, P., Wiering, H. und Forkmann, G. Theor. Appl. Genet. 70, 300, 1985.
Takeda, K., Kubota, R. und Yagioka, C. Phytochemistry 24: 1207, 1985.
Takemori, S. und Kominami, 5. Cytochrome P450. Tokyo University Press, Japan, 1989.
Taton, M., Ullman, P., Beneveniste, P. und Rahier, A. Pesticide Biochemistry and Physiology 30: 178-189, 1988.
Turpen, T. H. und Griffith, O. M. BioTechniques 4: 11-15, 1986.
von Tunen, A. J., Gerats, A. G. M. und Mol, J. N. M. Plant Mol. 3101. Rep. 8: 50-59, 1990.
von Tunen, A. J., Koes, R. E., Spelt, C. E. von der Krol, A. R., Stuitje, A. R. und Mol., J. N. M. EMBO J. 7(5): 1257-1263, 1988.
von Tunen, A. J., Mur, L. A., Recourt, K., Gerats, A. G. M. und Mol., J. N. M. The Plant Cell 3: 39-48, 1991.
von Wettstein-Knowles, P. Hereditas 60: 317-346, 1968.
Vercruysse, S. A. R., Delcour, J. A. und Dondeyne, P. J. Chromatography 324: 495-497, 1985.
Wallroth, M., Gerats, A. G. M., Rogers, S. G., Fraley, R. T. und Horsch, R. B., Mol. Gen, Genet. 202: 6-15, 1986.
Wiering, H. und De Vlaming, P. Inheritance and Biochemistry of Pigments. In: Petunia Sink, K. C. (Hrs.), Springer-Verlag, Berlin, Deutschland S. 49-65, 1984.
Wiering, H. Genen Phaenen 17(1-2) 117-134, 1974
Yanisch-Perron, C., Vieira, J. und Messing, J. Gene 33: 103, 1985.

Claims

1. Nucleinsäureisolat, umfassend eine Sequenz von Nucleotiden, die für ein Dihydrokämpferol (DHK)-hydroxylierendes Enzym oder ein Derivat davon codiert, das mindestens eines aus DHK, DHQ, Naringenin und Eriodicytol hydroxyliert, oder die Sequenz die dazu komplementär ist, wobei die Sequenz umfaßt:

die in Fig. 9 oder 10 angegebene Nucleotidsequenz oder die dazu komplementäre Sequenz, oder

eine Nucleotidsequenz, die mit der in Fig. 9 oder 10 angegebenen Nucleotidsequenz oder der dazu komplementären Sequenz hybridisieren kann, unter stringenten Bedingungen von 20% Formamid, 6xSSC, 1% Gew./Vol. SDS bei 42ºC für 16 Stunden, gefolgt von einem Waschen in 6xSSC, 1% Gew./Vol. SDS bei 65ºC für 1 Stunde.

2. Nucleinsäureisolat nach Anspruch 1, worin die Aminosäuresequenz des DHK-hydroxylierenden Enzyms oder Derivats davon die Aminosäuresequenz FGA/SGRRICAG umfaßt und worin das Nucleinsäureisolat aus Pflanzen erhältlich ist.

3. Nucleinsäureisolat nach Anspruch 2, worin die Aminosäuresequenz des DHK-hydroxylierenden Enzyms oder Derivats davon FGAGRRICAG umfaßt.

4. Nucleinsäureisolat nach einem der Ansprüche 1 bis 3, worin das Enzym eine Flavonpid-3',5'-Hydroxylase ist.

5. Nucleinsäureisolat nach einem der Ansprüche 1 bis 4, worin die Nucloeotidsequenz wie in Fig. 9 oder 10 angegeben ist.

6. Nucleinsäureisolat nach Anspruch 4, worin die Flavonoid- 3',5'-hydroxylase aus Petunie, Verben, Delphinium, Traube, Iris, Freesie, Hydrangea, Zyklamen, Kartoffel, Stiefmütterchen oder Aubergine stammt.

7. Nucleinsäureisolat nach Anspruch 6, worin die Flavonoid- 3',5-hydroxylase aus Petunie stammt.

8. Nucleinsäureisolat nach einem der Ansprüche 1 bis 7, wenn es in einer transgenen Pflanzenzelle vorliegt.

9. Nucleinsäureisolat nach Anspruch 8, worin die transgene Pflanze eine Rose, Petunie, Chrysantheme, Nelke, Gerbera, Geranium oder Alstroemerie ist.

10. Nucleinsäureisolat nach Anspruch 9, worin die transgene Pflanze eine Rose oder eine Petunie ist.

11. Nucleinsäureisolat nach einem der Ansprüche 1 bis 7, das in einem Vektormolekül enthalten ist, das das Nucleinsäureisolat in eine Pflanzenzelle oder -gewebe übertragen kann.

12. Nucleinsäureisolat nach Anspruch 11, worin die Übertragung eine Co-Kultivierung mit einem Agrobakterium erfordert.

13. Nucleinsäureisolat nach Anspruch 11, worin der Vektor und das Nucleinsäureisolat pCGP90 ist, wie in Fig. 14 gezeigt.

14. Verfahren zum Herstellen einer transgenen Pflanze, die ein rekombinantes Dihydrokämpferol (DHK)-hydroylierendes Enzym exprimieren kann oder welche die Transkription einer Nucleinsäuresequenz steuert, die im wesentlichen komplementär ist mit dem gesamten oder einem Teil eines mRNA-Moleküls, das in ein DHK-hydroxylierendes Enzym translatierbar ist, wobei das Verfahren das Einbringen des Nucleinsäureisolats nach einem der Ansprüche 1 bis 13 in eine Zelle einer geeigneten Pflanze unter Bedingungen, die die mögliche Expression des Nucleinsäureisolats erlauben, Regenerieren einer transgenen Pflanze aus der Zelle und Züchten der transgenen Pflanze für eine Zeit und unter Bedingungen, die ausreichend sind, um die Expression des Nucleinsäureisolats zu erlauben, umfaßt, worin die transgene Pflanze veränderte Infloreszenzeigenschaften als ein Ergebnis der Einbringung des Nucleinsäureisolats zeigt.

15. Verfahren nach Anspruch 14, worin das rekombinante Enzym Flavonoid-3',5'-Hydroxylase ist.

16. Verfahren nach Anspruch 14 oder 15, worin die Expression von Nucleinsäureisolat durch die Entwicklung gesteuert wird.

17. Verfahren nach Anspruch 16, worin das rekombinante Enzym aus Petunie, Verben, Delphinium, Traube, Iris, Freesie, Hydrangea, Zyklamen, Kartoffel, Stiefmütterchen oder Aubergine stammt.

18. Verfahren nach Anspruch 17, worin das rekombinante Enzym aus Petunie stammt.

19. Verfahren nach einem der Ansprüche 14 bis 18, worin die transgene Pflanze eine Rose, Petunie, Chrysantheme, Nelke, Gerbera oder Tabak ist.

20. Verfahren nach Anspruch 19, worin die transgene Pflanze eine Rose oder Petunie ist.

21. Transgene Pflanzenzelle, die ein beständig eingebrachtes Nucleinsäuremolekül aufweist, umfassend eine Nucleotidsequenz nach einem der Ansprüche 1 bis 13, worin die Pflanze veränderte Infloreszenzseigenschaften als ein Ergebnis der Einbringung der Nucleotidsequenz zeigt.

22. Transgene Pflanzenzelle nach Anspruch 21, worin, die Pflanzenzelle eine Rose, Petunie, Chrysantheme, Nelke, Gerbera, Tris, Tulpe, Lilie, Lisiantus, Freesie, Delphinium, Limonium oder Pelargonie ist.

23. Transgene Pflanzenzelle nach Anspruch 22, worin die transgene Pflanze eine Rose oder Petunie ist.

24. Verfahren zum Klonen eines Nucleinsäuremoleküls, umfassend eine Sequenz von Nukleotiden, die für ein Dihydrokämpferol (DHK)-hydroxylierendes Enzym oder ein Derivat davon codieren, das mindestens eines aus DHK, DHQ, Naringenin und Eriodicytol hydroxyliert, oder die Sequenz die dazu komplementär ist, wobei die Sequenz umfaßt:

eine Nucleotidsequenz, die mit der in Fig. 9 oder 10 angegebenen Nucleotidsequenz oder der dazu komplementären Sequenz hybridisieren kann, unter stringenten Bedingungen von 20% Formamid, 6xSSC, 1% Gew./Vol. SDS bei 42ºC für 16 Stunden, gefolgt von einem Waschen in 6xSSC, 1% Gew./Vol. SDS bei 65ºC für 1 Stunde, wobei das Verfahren die Amplifikation von Nucleotidsequenzen DHK-hydroxylierender Enzyme oder komplementärer Sequenzen aus einer geeigneten Präparation von Nucleinsäuremolekülen aus Zellen der Pflanze durch eine oder mehrere Polymerasekettenreaktionen unter Verwendung von mindestens einem Oligonucleotidprimer basierend auf der Aminosäuresequenz FGA/SGRRICAG umfaßt.

25. Verfahren nach Anspruch 24, worin die Aminosäuresequenz FGAGRRICAG ist.

26. Verfahren nach einem der Ansprüche 24 bis 25, worin das DHK-hydroxylierende Enzym eine Flavonoid-3',5'-Hydroxylase ist.

27. Transgene Pflanzenzelle, erhältlich durch das Verfahren nach einem der Ansprüche 14 bis 20.

28. Verwendung eines Nucleinsäuremoleküls nach einem der Ansprüche 1 bis 13 bei der Herstellung einer Pflanze mit veränderter Pflanzenfarbe.

29. Transgene Pflanze umfassend die Pflanzenzellen nach einem der Ansprüche 21 bis 23.

30. Transgene Pflanze, erhältlich durch das Verfahren nach einem der Ansprüche 14 bis 20.

31. Transgene Pflanze, die ein beständig eingebrachtes Nucleinsäuremolekül aufweist, umfassend eine Nucleotidsequenz nach einem der Ansprüche 1 bis 13, worin die Pflanze veränderte Infloreszenzeigenschaften als ein Ergebnis der Einbringung der Nucleotidsequenz zeigt.

32. Transgene Blüte einer transgenen Pflanze nach einem der Ansprüche 29 bis 31.

33. Transgene reproduktive Teile einer transgenen Pflanze nach einem der Ansprüche 29 bis 31.

34. Transgene vegetative Teile einer transgenen Pflanze nach einem der Ansprüche 29 bis 31.

35. Verfahren zum Herstellen einer transgenen Pflanzenzelle, die rekombinantes Dihydrokämpferol (DHK)-hydroylierendes Enzym exprimieren kann oder welche die Transkription einer Nucleinsäuresequenz steuert, die im wesentlichen komplementär ist mit dem gesamten oder einem Teil eines mRNA-Moleküls, das in ein DHK-hydroxylierendes Enzym translatierbar ist, wobei das Verfahren das Einbringen des Nucleinsäureisolats nach einem der Ansprüche 1 bis 13 in eine Zelle einer geeigneten Pflanze unter Bedingungen, die die mögliche Expression des Nucleinsäureisolats erlauben, umfaßt.

36. Verfahren nach Anspruch 14, worin das Verfahren weiterhin den Schritt des Erhaltens einer transgenen Blüte der transgenen Pflanze umfaßt.

37. Verfahren nach Anspruch 14, worin das Verfahren weiterhin den Schritt des Erhaltens transgener reproduktiver Teile von der transgenen Pflanze umfaßt.

38. Verfahren nach Anspruch 14, worin das Verfahren weiterhin den Schritt des Erhaltens transgener vegetativer Teile von der transgenen Pflanze umfaßt.

39. Verfahren nach Anspruch 24, worin das Verfahren weiterhin den Schritt des Isolierens des Nucleinsäuremoleküls umfaßt.