AT508554A4 - Chalkon-hydroxylase - Google Patents
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Description
Die vorliegende Erfindung betrifft Nukleinsäuremoleküle, umfassend eine Nukleotidsequenz, welche für ein Polypeptid mit Chalkon 3-Hydroxylase-Aktivität kodiert.
Die Blütenfarbe ist eine der auffallendsten Eigenschaften von Zierpflanzen und ist daher ein bedeutender Faktor für ihren Marktwert. Neben der traditionellen Züchtung gewinnen gentechnische Ansätze zur Schaffung neuer Sorten immer mehr an Bedeutung. Beispiele dafür sind die Erzeugung blauer Nelken sowie die der so genannten blauen Rose, welche bereits weltweit in sehr vielen Ländern kommerziell erhältlich sind.
Die Ausprägung der Blütenfarben basiert hauptsächlich auf •der Anwesenheit von zwei verschiedenen Pigmentgruppen, den Carotinoiden und den Flavonoiden. Für die Bildung der roten, blauen und lila Blütenfarbe ist hauptsächlich die Flavonoidklasse der Anthocyane verantwortlich, während gelbe Blütenfarbe in den meisten Fällen durch die Akkumulation von Carotinoiden entsteht. In einigen Pflanzenarten wird die gelbe Pflanzenfarbe jedoch von gelben Flavonoiden und deren biosynthetisch verwandten anthoch-loren Pigmenten (Chalkone und Aurone) gebildet. Daher kann eine Modifikation des Chalkon- bzw. Flavonoidstoffwechsels entscheidend zur Veränderung von Blütenfarben beitragen. Neben der Züchtung von Pflanzen mit blauen Blüten ist die Einführung der gelben Blütenfarbe in Zierpflanzen, von denen keine oder nur vereinzelte gelbe Sorten erhältlich sind, von besonderem Interesse. Oft führen nur kleine Änderungen in der Pigmentstruktur zu drastischen Farbveränderungen. Dies gilt vor allem für die Anzahl der Hydroxylgruppen in den Grundstrukturen.
Obwohl viele Flavonoide in chemisch reiner Form eine blassgelbe Farbe aufweisen, führt ihre Anwesenheit in Petalen nicht zur Ausprägung von gelber Blütenfarbe. Die sogenannten „gelben Flavonole" weisen neben dem gewöhnlichen 5,7-
Hydroxylierungsmuster des A-Rings eine zusätzliche Hydroxylgruppe in Position 6 oder 8 auf, die eine Absorptionsverschiebung in den längerwelligen Bereich und damit eine Verstärkung der gelben Farbe bewirkt. Die Anwesenheit solcher höher hydroxylierten Verbindungen führt zur Ausprägung gelber Blütenfarbe. Quercetagetin wurde zuerst als gelbes Pigment in verschiedenen Tagetes-Arten identifiziert und kommt auch in den Blüten von Rudbeckia hirta vor.
Gelbe Flavone stellen die Hauptpigmente in einigen Blüten von Asteraceaen dar. Während die gewöhnlichen verbreiteten Fla-vone nicht zur Ausprägung von gelben Blütenfarben führen, bewirkt die Anwesenheit einer zusätzlichen Hydroxylgruppe an der Position 2' des B-Rings von Luteolin eine Gelbfärbung des Pigments. Isoetin (2'-Hydroxyluteolin) wurde als gelbes Hauptpigment von Heywoodiella oligocephala identifiziert. Die Einführung einer Hydroxylase, welche die 2'-Hydroxylierung katalysiert, könnte zur Bildung von gelb gefärbten Flavonen in den Blüten transgener Pflanzen führen, die generell nur gewöhnliche Flavo.ne produzieren.
Im Gegensatz zu den gelben Flavonolen, bei denen die Anwesenheit einer zusätzlichen Hydroxylgruppe zur Ausprägung gelber Blütenfarbe führt, ist der Verlust einer Hydroxylgruppe an der Position 3 von Anthocyanen bzw. Anthocyanidinen für eine Verschiebung der Absorption in den kürzerwelligen Bereich und damit für die orange und gelbe Farbe der sogenannten 3-Deoxyanthocyane verantwortlich. 3-Deoxyanthocyane sind seltene pflanzliche Pigmente, die als solche nur in einigen wenigen Pflanzen wie Gesne-riaceen, Zea mays (Mais) und in Sorghum-Arten (Hirse) Vorkommen. Drei Vertreter dieser Gruppe konnten identifiziert werden, Api-geninidin (3-Deoxypelargonidin), Luteolinidin (3-Deoxycyanidin) und Columnidin. Von diesen tragen jedoch nur Apigeninidin-Derivate zur gelben Blütenfarbe bei. Die anderen weisen eine orange- bis hellrote Färbung auf. Die biochemische Bildung der Flavan-4-ole als Vorläufer für die 3-Deoxyanthocyane wird durch die Reduktion der Carbonylgruppe der Flavanone an Position 4 bedingt. Diese Reaktion wird in einer großen Anzahl von Kultur-und Zierpflanzen durch die Dihydroflavonol-4-Reduktase katalysiert, findet aber gewöhnlich nur in Pflanzen statt, in denen die FHT-Reaktion gehemmt ist.
Die tiefgelben anthochloren Pigmente (Chalkone und Aurone) haben in der Natur nur eine beschränkte Verbreitung, kommen jedoch häufig in Asteraceae- oder Scrophulariaceae-Arten vor. Generell können zwei Arten von Chalkonen in den Blüten synthetisiert werden, die 6'-Hydroxychalkone (Phloroglucinoltyp) und die 6'-Deoxychalkone (Resorcinoltyp). Die entsprechenden Aurone sind die 4-Hydroxy- und die 4-Deoxyaurone (identische Position, unterschiedliche Nummerierung der Ringe). 6'-Deoxychalkone werden durch die Chalkonsynthase zusammen mit der Chalkonketidreduktase (CHKR, synonym Polyketidreduktase, PKR, Chalcone reductase) über 3 3
• · ein Polyketid-Intermediat gebildet.
Chalkone sind pflanzliche Sekundärmetabolite und biochemische Vorläufer für alle Flavonoidklassen. Deshalb und aufgrund ihrer physiologischen Funktionen in Pflanzen, wie z.B. die Beeinflussung der Blütenfarbe, spielen sie eine wichtige Rolle in der Pflanzenphysiologie. Neben den gewöhnlichen 6'-Hydroxychalkonen, welche Intermediate der Biosynthese der weit verbreiteten 5-Hydroxyflavonoide darstellen, werden die selteneren 6'-Deoxychalkone häufig in Blüten von Asteraceen-Arten akkumuliert, da sie chemisch nicht zu den jeweiligen 5-Deoxyflavanonen umgesetzt werden können und auch von den Chalko-nisomerasen (CHIs) der meisten Pflanzen nicht als Substrate akzeptiert werden. Die Akkumulation von 6'-Deoxychalkonen führt zur Ausprägung von gelber Blütenfarbe. 6' -Hydroxychalkone werden dagegen nur in seltenen Fällen im Pflanzengewebe akkumuliert, da sie leicht enzymatisch oder chemisch zu Flavanonen umgewandelt werden können. Daher sind sie nur in wenigen Fällen für Gelbfärbung von Blüten verantwortlich, wie in den gelben Blüten von Nelken (Dianthus caryophyllus) , Löwenmäulchen (Antirrhinum ma-jus) und Strohblumen (Helichrysum bracteatum), da diesen Mutanten neben der CHI zumindest eine weitere Enzymaktivität des Flavonoidstoffwechsels fehlt.
Wie die Flavonoide, können auch Chalkone im B-Ring neben der Hydroxylgruppe an der Position 4 (entspricht der Position 4' bei Flavonoiden) weitere Hydroxylgruppen besitzen, und zwar an den Positionen 3 oder 3 und 5 (entsprechend den Positionen 3' oder 3' und 5' bei den Flavonoiden). Im Gegensatz zu der sehr gut untersuchten Hydroxylierung von Flavonoiden an der Position 3' und 3',5', welche von den CytochromP450 abhängigen Monooxygenasen Flavonoid-3'-Hydroxylase (F3'H) bzw. Flavonoid-3',5'-Hydroxylase (F3',5'H) katalysiert werden, bestand für lange Zeit Unklarheit darüber, welches Enzym für die Einführung von zusätzlichen Hydroxylgruppen im B-Ring von Chalkonen verantwortlich ist. Es konnte gezeigt werden, dass die Einführung einer Hydroxylgruppe an der Position 3 von 6'-Deoxychalkonen durch eine Cytochrom-P450-abhängige Monooxygenase katalysiert wird. Untersuchungen mit rekombinanten F3'Hs von verschiedenen Pflanzen, welche Chalkone in ihren Blütenblättern akkumulieren, als auch von solchen, die keine Chalkone akkumulieren, zeigten jedoch, dass diese F3'Hs nicht in der Lage sind, die Hydroxylierung von Chalkonen • · * · · ·· · · · • ·· · ·· ··· · · · · • · · · · · · ······ ·· · - 4 - zu katalysieren.
Wie schon erwähnt, handelt es sich bei den F3'Hs um membrangebundene Cytochrom (Cyt)P450 abhängige Monooxygenasen. Die Superfamilie der CytP450 Enzyme ist eine Gruppe sehr unterschiedlicher Enzyme, welche viele verschiedene und komplexe Qxygenie-rungsreaktionen mit einer großen Anzahl von Substraten in Anwesenheit von NADPH oder NADH katalysieren. Sie beinhalten eine Hämgruppe und kommen sowohl in Pro- als auch in Eukaryoten vor.
In Pflanzen kann eine außergewöhnlich hohe Anzahl von CytP450 Genen gefunden werden. In Arabidopsis z.B. konnten 272 CytP450 Gene detektiert werden. Die Sequenzidentitäten der CytP450 Enzyme sind oft sehr niedrig.
Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist die Bereitstellung von Nukleinsäuren kodierend für Polypeptide, die in der Lage sind, Chalkone im B-Ring zu hydroxylieren, um beispielsweise die Farbgebung bei Pflanzen zu beeinflussen.
Die vorliegende Erfindung betrifft ein isoliertes Nukleinsäuremolekül, umfassend eine Nukleotidsequenz, welche für ein Polypeptid mit Chalkon 3-Hydroxylase-Aktivität kodiert, wobei die Nukleotidsequenz SEQ ID Nr. 1 umfasst oder mindestens 60% Identität zu SEQ ID Nr. 1 aufweist oder in der Lage ist mit einem Molekül umfassend die Sequenz aus SEQ ID Nr. 1 zu hybridisieren, wobei die Nukleotidsequenz für ein Polypeptid kodiert, welches das Motiv FASRPLSX1X2G (X3)m(GSAGGD) n umfasst, wobei Χχ Threonin oder Serin, X2 Alanin oder Glycin, X3 eine beliebige Aminosäure, m eine ganze Zahl zwischen 50 und 200 und n 0 oder 1 ist.
Es wurde erfindungsgemäß herausgefunden, dass Polypeptide, insbesondere Hydroxylasen, wie beispielsweise Flavonoid 3'-Hydroxylasen, welche ein bestimmtes Motiv (wie oben definiert) aufweisen, in der Lage sind, Chalkone an der Position 3 zu hydroxylieren. Die Kenntnis derartiger Hydroxylasen ermöglicht es die Expression dieser Hydroxylasen zu modulieren, um diese beispielsweise in vivo überzuexprimieren oder zu inhibieren. Insbesondere ermöglicht die Kenntnis dieser Enzyme die Menge an hydroxylierten Chalkonen in einer Pflanze bzw. Pflanzenzelle zu modulieren, um dadurch die Farbzusammensetzung in derselbigen zu verändern. So weisen Pflanzen, welche die erfindungsgemäßen Nukleinsäuremoleküle umfassen, beispielsweise Blüten mit einer intensiven Gelbfärbung auf. • ·· · · ·· · · · • · · ♦····♦ · ·♦· • · · · · · ♦ ······ · · ♦ - 5 - ................
Das erfindungsgemäße Nukleinsäuremolekül katalysiert die Hydroxylierung von verschiedenen Chalkonen (das inkludiert beispielsweise auch 6'-Deoxychalkone und Dihydrochalkone) an der Position 3. Dies führt im Fall der 6'-Hydroxychalkone und 4-Deoxyaurone zu einer Intensivierung der Gelbfärbung durch die Anreicherung von Chalkonen mit einem 3,4-Hydroxymuster, und auch zu einer vermehrten Bildung von Auronen, da solche Chalkone auch die bevorzugten Precursor für Auron-bildende Enzyme darstellen. Im Fall der Dihydrochalkone wird die Bildung von 3-Hydroxychalkonderivaten begünstigt, die an der Pathogenabwehr beteiligt sind bzw. aufgrund ihrer antioxidativen Eigenschaften gesundheitsfördernde Wirkung besitzen.
Das erfindungsgemäße Nukleinsäuremolekül kann SEQ ID Nr. 1 als Nukleotidsequenz oder mindestens 60%, vorzugsweise mindestens 65%, vorzugsweise mindestens 70%, vorzugsweise mindestens 75%, vorzugsweise mindestens 80%, vorzugsweise mindestens 85%, vorzugsweise mindestens 90%, vorzugsweise mindestens 95%, vorzugsweise mindestens 97%, vorzugsweise mindestens 98%, vorzugsweise mindestens 99%, insbesondere 100%, Identität zu SEQ ID Nr. 1 aufweisen.
Identität zwischen mindestens zwei Sequenzen kann durch Überlagerung durchgeführt werden, bei der eine Nukleinsäureoder Aminosäuresequenz mit mindestens einer weiteren entsprechenden Sequenz übereinander gelegt werden („Alignment"). Beispielsweise nach dem Verfahren von D. J. Lipman und W. R. Pear-son (Science 227 (1985), 1435-1441) oder F. Corpet (Nucl. Acids Res. 16 (1988), 10881-10890). Vorzugsweise geschieht dies über Algorithmen, welche von kommerziell erhältlichen Computerprogrammen angewendet werden. Hierzu gehört beispielsweise das Programm Vector NTi""Suite 7.0, erhältlich von der Firma InforMax, Inc., USA, vorzugsweise mit den vorgegebenen Standard-Parametern. Eine weitere Software, mit deren Hilfe Sequenzidentität bestimmt werden kann, ist z.B. „Sequence Analysis Software Package der Genetics Computer Group, University of Wisconsin Biotechnology Center, 1710 University Avenue, Madison, WI53705". Diese Software überlagert ähnliche Sequenzen durch Zuordnung von Homologiegraden.
Das erfindungsgemäße Nukleinsäuremolekül ist in der Lage, mit einem Molekül umfassend die Sequenz aus SEQ ID Nr. 1 zu hybridisieren.
Hybridisierung bezeichnet die Bindung komplementärer Stränge von Nukleinsäuren (d.h. sense:Antisense-Stränge) miteinander durch Wasserstoffbindungen, ähnlich den Bindungen, die natürlicherweise in chromosomaler DNA Vorkommen. Dabei werden Strin-genzniveaus verwendet, um eine Nukleinsäure mit einer Ziel-Nukleinsäure zu hybridisieren. Diese Bedingungen können leicht durch den Fachmann variiert werden. Erfindungsgemäß hybridisiert das Nukleinsäuremolekül unter mehr oder weniger stringenten Bedingungen.
Der Ausdruck „stringente Hybridisierung" wird hier verwendet, um Bedingungen zu bezeichnen, unter welchen Nukleinsäurehybride stabil sind. Wie dem Fachmann bekannt ist, wird die Stabilität von Hybriden in der Schmelztemperatur (Tm) der Hybride reflektiert. Im allgemeinen ist die Stabilität eines Hybrids eine Funktion der Natriumionenkonzentration und der Temperatur. Typischerweise wird die Hybridisierungsreaktion unter Bedingungen niedrigerer Stringenz, gefolgt von Waschungen variierender, aber höherer Stringenz, durchgeführt. Bezugnahme auf Hybridisie-rungsstringenz betrifft derartige Waschbedingungen.
Wie hier verwendet bezeichnet der Ausdruck "mäßig stringente Hybridisierung" Bedingungen, die Ziel-Nukleinsäure gestatten, eine komplementäre Nukleinsäure zu binden, die etwa 60% Identität, vorzugsweise etwa 75% Identität, stärker bevorzugt etwa 85% Identität mit der Ziel-DNA hat; wobei mehr als etwa 90% Identität mit der Ziel-DNA besonders bevorzugt werden. Vorzugsweise sind mäßig stringente Bedingungen Bedingungen, äquivalent der Hybridisierung in 50% Formamid, 5 χ Denhart-Lösung, 5 χ SSPE, 0,2% SDS bei 42°C und nachfolgendes Waschen in 0,2 χ SSPE, 0,2% SDS bei 65°C.
Der Ausdruck "Hybridisierung mit hoher Stringenz" bezeichnet Bedingungen, die Hybridisierung von nur denjenigen Nukleinsäuresequenzen gestatten, die stabile Hybride in 0,018 M NaCl bei 65°C bilden (d.h., wenn ein Hybrid in 0,018 M NaCl bei 65°C nicht stabil ist, wird es unter Bedingungen hoher Stringenz, wie sie hier in Betracht gezogen werden, nicht stabil sein). Bedingungen hoher Stringenz können zum Beispiel durch Hybridisierung in 50% Formamid, 5 χ Denhart-Lösung, 5 χ SSPE, 0,2% SDS bei 42°C und nachfolgendes Waschen in 0,1 χ SSPE und 0,1% SDS bei 65°C bereitgestellt werden.
Der Ausdruck "Hybridisierung mit geringer Stringenz" be- • ·· · · ·· · · · • · · · ·· ··· · ··· ······ · · «····· ·· · - 7 - ................ zeichnet Bedingungen, äquivalent der Hybridisierung in 10% Formamid, 5 x Denhart-Lösung, 6 * SSPE, 0,2% SDS bei 42°C und nachfolgendes Waschen in 0,1 χ SSPE, 0,2% SDS bei 50°C. Denhart-Lösung und SSPE (siehe z.B. Sambrook et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989) sind dem Fachmann bekannt, wie es andere geeignete Hybridisierungspuffer sind. SEQ ID Nr. 1 hat erfindungsgemäß die folgende Nukleotidsequenz:
ATGACTATTCTACCCCTACTACTCTACCCTTCCCTAACTGCCTTACTACTGTACGTACTTCTTAACCTGCGCCCCCG
TCACCCTAACCGTCTCCCGCCGGGACCAAGCCCATGGCCGATCGTCGGAAACCTACCGCACCTCGGCGCGAGTCCGC
ATCAGTCGCTGGCGACGTTGGGCGCAAAGTACGGCCCGTTGATGTACCTCCGACTCGGGTTTGTTGACGTGGTGGTG
GCGGCGTCTGCTTCAGTCGCTGCACAGTTTTTAAAAGTTCATGATCTTAACTTCGCAAGCCGGCCGCTGAGCTCTGG
CGGGAAGTATATCGCGTATAATTATCAGGATATGGTGTTTGCACCGTACGGTCCGAGATGGCGGATGCTTAGGAAGA
TTTGCTCCGTGCATATGTTTTCTGCTAAAGCAATGGACGGATTTCGTCATGTTCGGCAGGAGGAAGTAGCTATACTC
ACGCGCACTTTAGTAAGCGCTGGAAAATCGCCGGTGAAGTTAGGTCAAATACTTAACGTGTGCACCACGAACGCATT
AGCACGAGTGGTGTTAGGTCGGAGAGTATTCGCCGACGGAAGTGCAGGTGGTGATCCGAAGGCGGATGAGTTCAAGG
ATATGGTGGTGGAGCTGATGGTGTTGGCCGGAGAATTTCACATCGGTGACTTTATCCCGGCGCTTGACTGGCTGGAC
CTGCAAGGCATTAAAAACAAGATGAAGAAACTTCACGCTCGATTCGATTCGTTCCTTCACGGGATCCTTGAAGAGCA
TAAGTCCGGCAAGTTTGGCGCGCCGAGTCATGGTGATTTGTTGAGCACATTGATCTCGTTGAAGGATGATGCCGATG
GTGAAGGCGGGAAGCTTTCAGATGTTGAAATCAAAGCTTTGCTTCTGAACTTATTTGTCGCCGGAACAGACACATCA
TCAAGTÄCAGTGGAATGGGCAATAGCCGAGCTAATTCGACATCCAAAGCTACTAAAACAAGCCCAAAAAGAAATGGA
CAATGTAGTTGGTCGAGACCGGCTTGTAACTGAATTAGACTTAAACGAGTTAAATTTTCTACAAGCCATTGTAAAAG
AGACCTTTAGGCTTCACCCTTCAACACCACTCTCGTTACCAAGAATTGCATCAGAGAGTTGTGAAGTTGACGGATAT
TACATTCCCAAGGGATCCACGCTCCTTGTTAATGTGTGGGCCATTGCTCGTGACCCGÄATGTGTGGGCTGACCCACT
TGAATTCCGGCCCATGCGGTTCTTGCCTGGAGGCGAAAAGCCTAATGTTGATGTTCAAGGAAACAACTTTGAAGTTA
TACCGTTTGGGGCTGGGCGAAGGATTTGTGTGGGTATTAGTCTAGGGTTGAGAATGGTCCAGCTACTTGTTGCAACA
TTGGTTCAAACCTTTGATTGGGAATTGGCTAATGGGTTAAACCCGGAGAAGCTAAACATGGATGAAGCCTTTGGGTT
AACCCTTCAGAAGGCTGAGCCCTTGATGGTGCACCCAATGCCGAGACTAGCTCCACACGTGTATGGAAGTCATTAA
Das von SEQ ID Nr. 1 kodierte Polypeptid hat erfindungsgemäß die folgende Aminosäuresequenz:
MTILPLLLYPSLTALLLYVLLNLRPRHPNRLPPGPSPWPIVGNLPHLGASPHQSLATLAAKYGP lmylrlgfvdvvvaasasvaaqflkvhdln’fasrplssggkyiaynyqdmvfapygprwrmlrk
ICSVHMFSAKAMDGFRHVRQEEVAILTRTLySAGKSPVKLGQILNVUTTNALARVVLGRRVFAD gsaggd|pkadefkdmvvelmvlagefhigdfipaldwldlqgiknkmkklharfdsflhgilee
HKSGKFGAPSHGDLLSTLISLKDDADGEGGKLSDVEIKALLLNLFVAGTDTSSSTVEWAIAELI rhpkllkqaqkemdnvvgrdrlvteldlnelnflqaivketfrlhpstplslpriasescevdg yyipkgstllvnvwaiardpnvwadplefrpmrflpggekpnvdvqgnnfevipfgagrricvg • · • ··· • ·· · · · · # • · · · ·· ·«· ·«···· ······ » · · 0 ·· ·· ·· ··· ···· ··· “ o — ISLGLRMVQLLVATLVQTFDWELANGLNPEKLNMDEAFGLTLQKAEPLMVHPMPRLAPHVYGSH (SEQ ID Nr. 2)
Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ist das Motiv FASRPLSTAG (X3)m (GSAGGD) n oder FASRPLSSGG(X3)m(GSAGGD)n.
Polypeptide, welche dieses Motiv aufweisen, sind besonders gut geeignet, um erfindungsgemäß eingesetzt zu werden.
Ein weiterer Aspekt der vorliegenden Erfindung betrifft einen Vektor umfassend ein Nukleinsäuremolekül gemäß der vorliegenden Erfindung.
Die Nukleinsäuremoleküle der gegenständlichen Erfindung können in einen Vektor eingebracht werden. Mit Hilfe dieses Vektors können die Nukleinsäuremoleküle in Zellen von Pflanzen oder Mikroorganismen eingebracht werden. Die verwendeten Vektoren können für die Klonierung oder für die Expression von entsprechenden Produkten eingesetzt werden. Daher sind in den Vektoren entsprechende Elemente wie Promotoren, Replikationsursprünge, usw. vorgesehen. Die erfindungsgemäß eingesetzten Vektoren können einen Pflanzenzellen wirksamen Promotor, wie beispielsweise den CaMV 35S-Promotor, den Nopalinsynthase-Promotor oder den Saccharose-synthase-Promotor, enthalten.
Falls die Vektoren dazu verwendet werden, um das erfindungsgemäße Nukleinsäuremolekül in das Genom einer Zielzelle einzubringen, können am Vektor entsprechende Elemente vorgesehen sein, die eine Rekombination der Nukleinsäure in das Genom ermöglichen .
Vektoren, welche erfindungsgemäß eingesetzt werden können, sind dem Fachmann hinreichend bekannt und können auf verschiedenste Weise in eine Zelle eingebracht werden. So kann der Vektor gemäß der vorliegenden Erfindung durch Elektroporation, Mikroprojektil-Bombardierung, Transfer mittels Agrobakterium oder durch RNA- bzw. DNA-Viren in die Zielzelle eingebracht werden.
Ein noch weiterer Aspekt der vorliegenden Erfindung betrifft eine Zelle, insbesondere Pflanzenzelle, umfassend ein Nukleinsäuremolekül oder einen Vektor gemäß der vorliegenden Erfindung. Selbstverständlich ist es auch möglich das Nukleinsäuremolekül bzw. den Vektor gemäß der vorliegenden Erfindung in anderen Zellen, wie beispielsweise Hefen, E.coli, filamentösen Pilzen und dergleichen zur Verfügung zu stellen.
Ein noch weitere Aspekt der vorliegenden Erfindung betrifft / / • · · · 9 • · · · 9 • · • · die Verwendung der erfindungsgemäßen Nukleinsäuremoleküle oder Proteine bei der Herstellung von Chalkonderivaten mit einem 3,4-Hydroxylierungsmuster, wie z.B. 3-Hydroxyphloretin-derivate, Butein und Eriodictyolchalkon.
Die Nukleinsäuremoleküle der vorliegenden Erfindung können in Pflanzenzellen und somit in Pflanzen eingebracht werden, um transgene Pflanzen herzustellen, welche in der Lage sind, das erfindungsgemäße Polypeptid zu exprimieren. Daher betrifft ein weiterer Aspekt der vorliegenden Erfindung auch eine transgene · Pflanze umfassend ein Nukleinsäuremolekül oder einen Vektor gemäß der vorliegenden Erfindung. Das erfindungsgemäße Nukleinsäuremolekül bzw. der erfindungsgemäße Vektor kann in Pflanzenzellen und Pflanzen mit Verfahren eingebracht werden, die dem Fachmann hinreichend bekannt sind.
Vorzugsweise ist die Pflanze ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Zierpflanzen, wie beispielsweise Usambaraveilchen, Azaleen, Rhododendren, Pelargonien, Fuchsien, Cyclamen, Weihnachtssterne, Antirrhinum, Aster (Asteraceae), Begonia (Begonia-ceae), Callistephus (Asteraceae), Campanula (Campanulaceae), Ca-tharanthus (Apocynaceae), Chrysanthemum (Asteraceae), Cineraria (Asteraceae), Dedanthremum (Asteraceae), Dianthus (Caryophylla-ceae), Dahlia (Asteraceae), Euphorbia (Euphorbiaceae), Gerbera (Asteraceae), Hydrangea (Hydrangeaceae), Lilium (Liliaceae), Li-sianthus (= Eustoma (Gentianaceae)), Myosotis (Boraginaceae), Nierembergia (Solanaceae), Orchidaceae, Osteospermum (Asteraceae) , Petunia (Solanaceaea), Rosa (Rosaceae), Saintpaulia (Ges-neriaceae), Scaevola (Goodeniaceae), Sinningia (Gesneriaceae), Streptocarpus (Gesneriaceae), Torenia (Linderniaceae), Tulipa (Liliaceae), Verbena (Verbenaceae), Veronica (Plantaginaceae), Viola (Violaceae) und Malus sp.. Durch die Anwesenheit des erfindungsgemäßen Nukleinsäuremoleküls werden auch gentechnologische Ansätze, die auf Polyketidreduktase oder Auronsynthase beruhen, wesentlich verstärkt. Soll ein rein gelber Farbton erzielt werden, werden vorzugsweise weiße oder cremefarbene Pflanzen eingesetzt, dabei sind Chalkonisomerase-Mutanten oder Pflanzen, die eine Polyketidreduktase besitzen, bevorzugt. Beim Einsatz von rosa oder rotblühenden Pflanzen kommt es zur Ausbildung von orangefarbenen oder lachsfarbigen Blüten.
Es hat sich zudem gezeigt, dass Pflanzen, welche das erfindungsgemäße Polypeptid - kodiert durch das erfindungsgemäße Nuk- - 10 - • · · · ·· ··· · ··· ···♦·· · · φ ······ ·· · leinsäuremolekül - exprimieren, insbesondere überexprimieren, eine erhöhte Resistenz gegenüber Pathogenen, insbesondere gegenüber Pilzen, Viren, Viroiden, Bakterien und Nematoden, aufweisen. Insbesondere zeigen derartige Pflanzen Resistenzen gegenüber Puccinia/üstilago, Phytophora, Blumeria/Peronosporacea, barley yellow dwarf virus, sugarcane mosaic virus, plum pox, Xanthomonas campestric pv. Citri, Erwinia amylovora, Erwinia ca-rotovora, Meloidogyne incognita und Heterodera schachtii.
Ein weiterer Aspekt der vorliegenden Erfindung betrifft eine Schnittblume oder Samen einer transgenen Pflanze gemäß der vorliegenden Erfindung.
Die gegenständliche Erfindung wird ferner anhand der folgenden Figuren und Beispiele eingehender erläutert, ohne jedoch auf diese beschränkt zu sein.
Fig. 1 zeigt ein paarweises Alignment der Cosmos CH3H und F3'H Aminosäuresequenzen.
In Fig. 2 sind Alignments von Regionen verschiedener F3'Hs Aminosäuresequenzen abgebildet.
In Fig. 3 sind die Substratspezifitäten von Cosmos F3'H und M2 in Prozent relativ zu Naringenin (100%) dargestellt.
Fig. 4 zeigt eine schematische Darstellung der Konstruktion von Chimären und mutierten Genen der CH3H bzw. F3'H aus Cosmos sulphureus und Umsatzraten der resultierenden rekombinanten Enzyme (0-5%: -, 6-30%: +, 31-60%: ++, 61-100%: +++) .
Fig. 5 zeigt die verwendeten Primer für die Konstruktion der Chimären Gene.
Fig. 6-17 zeigen die Nukleinsäuresequenzen verschiedener Flavonoid-Hydroxylasen. BEISPIELE:
Beispiel 1:
Material und Methoden
Pflanzenmaterial
Die Untersuchungen wurden mit Blütenblättern von Cosmos sulphureus cv. „Sunny Goldgelb" (Austrosaat, Österreich) durchgeführt. Das Pflanzenmaterial wurde im Sommer 2006 und Sommer 2007 gesammelt, in flüssigem Stickstoff schockgefroren und bei -80°C gelagert.
Chemikalien [14C]Isoliquiritigenin (ISO) wurde ausgehend von 4-Hydroxy[ring-U-14C]Benzaldehyd (33.1 Mbq/mg) (Amersham Interna- 11
• · · · tional, ÜK) wie in Halbwirth et al. (2006) [Plant Science 170 (2006) 587-595] beschrieben synthetisiert. Die Synthesen von [14C]Naringenin (NAR), [14C]Dihydrokaempferol (DHK), [14C]Kaempferol (KAM) und [14C]Apigenin (API) wurden gemäß Halbwirth and Stich (2008) [Phytochemistry 67 (2006) 1080-1087] durchgeführt: Für die Naringeninsynthese wurden [2-14C]Malonyl-coenzym A (55 mCi/mmol) (Amersham International, UK) und rekom-binante Chalkonsynthase verwendet, und die anschließenden Synthesen von DHK·,. KAM und API wurden jeweils mit rekombinanter. Flavanon-3-Hydroxylase aus Malus domestica, rekombinanter Flavo-nol-Synthase aus Rudbeckia hirta und mikrosomalen Enzympräparationen mit hoher Flavon-Synthasell-Aktivität aus Dahlia variabi-lis durchgeführt.
Klonierung der Cosmos sulphureus CH3H Für die cDNA-Synthese wurde mRNA aus den Cosmos sulphureus-Blütenblättern mit dem pMACS mRNA isolation kit (Miltenyi Bio-tec) extrahiert, und die reverse Transkription wurde mit dem Re-vertAid H Minus MuLV reverse transcriptase-Kit (Fermentas Life Science) und dem Oligo(-dT) Anker-Primer GACCACGCGTATCGATGTC-GAC(T)16V durchgeführt. Eine RT PCR wurde dann mit den degenerierten Primern TGGMGDATGCTKMGGAARATYTG (forward primer) und GCCCATTCMAYNGTRCTAGATGA (reverse primer) durchgeführt, welche aus den konservierten Regionen folgender Asteraceae-F3'H-Sequenzen aus der NCBI GenBank abgeleitet wurden: Rudbeckia hirta (Acc.-No: FJ216431), Echinops bannaticus (Acc.-No: FJ753549), Centaurea cyanus (Acc.-No: FJ753550), Gerbera hybrida (Acc.-No: ABA64468), Osteospermum hybrida (Acc.-No: ABB29899), Cichorium intibus (Acc.-No: FJ753548) und Callistephus chinensis (Acc.-No: AF313488). Der gesamte ,Open Reading Frame' (ORF) wurde dann mit den spezifischen Primern ATGACTATTCTACCCCTACTACTC (forward primer) und CCTTAATGACTTCCATACACGTG (reverse primer) amplifiziert, welche aus den bei der 5'- und 3'-RACE erhaltenen Fragmente abgeleitet wurden.
Sequenzanalysen und Konstruktion von Chimären Genen
Paarweise und multiple Sequenzalignments wurden mit dem Softwaretool ClustalW durchgeführt, um Regionen zu identifizieren, die die Determinierung der Substratspezifität beeinflussen könnten. Folgende F3'H-Sequenzen, hauptsächlich aus Asteraceae Arten, wurden für multiple Sequenzalignments verwendet: Cosmos sulphureus (Acc.-No: FJ216426), Dahlia variabilis (Acc.-No: • ·· · · · ··· ···· ·····♦ · · · ··*··· ·· · - 12 - ................ FJ216428), Tagetes erecta (Acc.-No: FJ216430), Rudbeckia hirta (Acc.-No: FJ216431), Echinops bannaticus (Acc.-No: FJ753549), Centaurea cyanus (Acc.-No: FJ753550), Gerbera hybrida (Acc.-No: ABA64468), Osteospermum hybrida (Acc.-No: ABB29899), Cichorium intibus (Acc.-No: FJ753548), Antirrhinum majus (Acc.-No: DQ272592) and Arabidopsis thaliana (Acc.-No: AF271651) (Schlangen et al. 2009) . Ein paarweises Sequenzalignment wurde mit der aufgelisteten F3'H aus Cosmos sulphureus (Acc.-No: FJ216426) gemacht. Chimäre Gene, die aus cDNA-Fragmenten der erwähnten F3'H aus Cosmos sulphureus sowie aus cDNA-Fragmenten der neu isolierten Sequenz bestehen, wurden nach Seitz et al. (2007) hergestellt [FEBS letters 581 (2007) 3429-3434]. Dafür wurden die Fragmente, die fusioniert werden sollten, mit einer Pfu DNA po-lymerase (Promega, Germany) in separaten PCR-Reaktionen amplifi-ziert und 10 Minuten in einem Gesamtvolumen von 20 μΐ mit jeweils ca. 50 ng cDNA von jedem Fragment und einer T4 DNA ligase (Promega, Germany) ligiert. Die verdünnte Ligation wurde als Template für die anschließende proofreading-PCR verwendet, in der das gesamte chimäre Gen mit dem Taq/Pwo polymerase System (Invitrogen, UK) amplifiziert wurde.
Insertionen oder Deletionen von Aminosäureresten
Insertionen von Aminosäureresten wurden mit Primern eingeführt, die über einen Überhang von Basen verfügen, die für die jeweiligen Aminosäurereste kodieren, die inseriert werden sollten. Deletionen wurden mittels Amplifikation von zwei Fragmenten der jeweiligen F3'H cDNA eingefügt, denen die Basen fehlen, die für die Aminosäurereste kodieren, die deletiert werden sollten. Die anschließende Fusion der beiden amplifizierten Fragmente wurde wie bei der Konstruktion der Chimären Gene beschrieben durchgeführt.
Gezielte Mutagenese
Gezielte Mutagenesen wurden mittels der Megaprimer-PCR durchgeführt. Diese PCR wurde in zwei Schritten gemacht: in der ersten PCR wurde ein Megaprimer mit Pfu DNA Polymerase (Promega) amplifiziert. Dafür wurde das Plasmid mit der inserierten cDNA, die mutiert werden sollte, als Template verwendet. Als Primer wurden einerseits ein interner Primer verwendet, der an der Stelle bindet, in der die gewünschte Mutation eingefügt werden soll, und über die dafür notwendige veränderte Basenabfolge verfügt, sowie ein externer Expressionsprimer. Dieses amplifizierte • ·· · ·· ··· · · · · ····*· · · · ······ ·· · ·· Μ ·· ··· ···· ··· - 13 - mutierte Fragment wiederum wurde dann in einer zweiten PCR als Primer zusammen mit dem korrespondierenden Expressionsprimer verwendet, um den gesamten ORF mit den gewünschten Mutationen mit dem 'Expand High Fidelity PCR System' (Roche) zu amplifizie-ren.
Heterologe Expression in Hefe Für die heterologe Expression wurden die Proofreading-Amplikons in den Hefe-Expressionsvektor pYES2.l/V5-His-T0P0® (Invitrogen, UK) ligiert und in. E. coli TOPIOF.'. (Invitrogen, UK) . transformiert. Die Identifizierung der sense-Konstrukte erfolgte mit einer PCR, bei der ein Gen-spezifischer forward- und ein Plasmid-spezifischer reverse-Primer verwendet wurde. Sense-Konstrukte wurden isoliert und die richtige Sequenz durch Sequenzierung bestätigt. Gewünschte Plasmide wurden dann in den Hefestamm INVSc 1 (Invitrogen, UK) transformiert. Die heterologe Expression wurde nach in der Wissenschaft bekannten Methoden durchgeführt und die präparierten Proteine wurden in flüssigem Stickstoff schockgefroren und bei -80°C gelagert. Die Proteinmenge in den Präparationen wurde nach einer modifizierten Lowry Methode durchgeführt.
Enzym-Assays und Identifizierung der Produkte
Um die Substratspezifität der heterolog exprimierten F3'Hs zu bestimmen, wurden folgende Enzymtests durchgeführt: 20 pg der rekombinanten Wildtyp CH3H bzw. 50 pg der Hybrid-Proteine wurden mit 0,25 nmol [14C]-markierten Chalkon- oder Flavonoid-Substraten in Anwesenheit von 10 mM NADPH und 0,1 Μ KH2PO4-K2HPO4 (mit 0,4% Na-Ascorbat, pH: 7,5)-Puffer bei 30°C inkubiert. Nach 30 min wurden die enzymatischen Reaktionen mit 10 pl Eisessig gestoppt und die phenolischen Verbindungen zweifach mit EtOAc extrahiert. Die organischen Phasen wurden auf Celluloseplatten aufgetragen und in CAW (Chloroform:Eisessig:Wasser, 10:9:1) chromatographiert. Detektion und Quantifizierung der Radioaktivität erfolgte mittels TLC Analyse.
Kinetische Daten
Kinetische Daten (scheinbare Michaelis-Konstante (Km) und maximale Reaktionsgeschwindigkeit (Vmax)) wurden mittels Line-weaver-Burk-Geraden bestimmt.
Ergebnisse
Klonierung und Sequenzanalyse der Cosmos sulphureus CH3H cDNA • I · · t· · · · ···· ······ · · · ······ · · · - 14 - ................
In diesem Beispiel konnte die komplette codierende Sequenz einer cDNA aus Cosmos sulphureus mithilfe von degenerierten Primern aus verschiedenen Asteraceae Arten (NCBI GenBank Acc-Nos: FJ216431, FJ753549, FJ753550, ABA64468, ABB29899, FJ753548 und AF313488) und anschließenden RACE-Techniken isoliert werden. Die abgeleitete Aminosäuresequenz dieses Klons verfügt über alle konservierten Motive von membrangebundenen CytP450-Proteinen (wie den N-terminalen hydrophoben Membrananker, die hochkonservierte Häm-Domäne usw.). Die Sequenz dieses cDNA-Klons wurde·in die EMBL/GenBank-Datenbanken unter der folgenden Accession-Number eingetragen: FJ216429. Alignments mit F3'H-Sequenzen, hauptsächlich aus Asteraceae-Arten, welche nicht oder nur im geringen Ausmaß in der Lage sind, Chalkone zu hydroxylieren, zeigen, dass die abgeleitete Aminosäuresequenz von der isolierten cDNA aus Cosmos sulphureus hohe Sequenzidentitäten mit den alignierten F3'Hs aufweist. Das paarweise Alignment mit der schon charakterisierten F3'H aus Cosmos sulphureus (Acc.-No: FJ216426) zeigt, dass diese beiden Sequenzen nicht identisch sind und über eine Sequenzidentität von 84% verfügen (Fig. 1).
Enzymaktivitäten der putativen Cosmos sulphureus CH3H
In enzymatischen Studien mit dem rekombinanten Enzym, welches bei der heterologen Expression des cDNA-Klons aus Cosmos sulphureus gewonnen wurde, konnten hohe katalytische CH3H-Aktivitäten mit dem 6’-Deoxychalkon Isoliquiritigenin gezeigt werden. Kinetische Studien zeigten, dass der höchste Vmax/Km (18,01/s*kg) mit Iso als Substrat beobachtbar ist (Tabelle 1).
Deshalb wurde dieses Protein aus Cosmos sulphureus CH3H genannt. Zum Vergleich wurde die rekombinante F3'H aus Cosmos sulphureus (Accession No: FJ216426) mit den gleichen Substraten getestet. Diese Tests bestätigten die F3'H-Aktivität und die fehlende CH3H-Aktivität dieses Enzyms. Die Umsatzraten der beiden rekombinanten Proteine sind in Fig. 4 aufgelistet.
Identifizierung von Regionen, die bei der CH3H-Reaktion eine Rolle spielen könnten
Um Regionen zu identifizieren, die bei der CH3H Aktivität in C. sulphureus CH3H eine Rolle spielen könnten, wurden Alignment Studien durchgeführt. Dabei wurden die bereits erwähnten F3'H Aminosäuresequenzen verwendet, deren rekombinante Enzyme nicht in der Lage sind, Chalkone zu hydroxylieren (Schlangen et al. 2009, Plant Science 177 (2009) 97-102) . Bei Analyse des Alignments • ·· · · +· · · · ♦ · · · ·· · · · ···· ·«···· * · ♦ ····♦ · · · - 15 - ................ konnte festgestellt werden, dass eine Region, die als putative Substraterkennungsregion (SRS1) in CytP450 Enzymen von Gotoh (1992) beschrieben wurde, in der CH3H-Sequenz von C. sulphureus auffällige Unterschiede zu den jeweiligen SRSl-Regionen der anderen F3'H-Aminosäuresequenzen aufweist. Weiters kann in der Cosmos sulphureus CH3H Sequenz eine Region D(192)GSAGGDP(199) detektiert werden, die nur in dieser Aminosäuresequenz vorhanden ist (Fig. 2). Im paarweisen Alignment mit der C. sulphureus F3'H kann man sehen, dass die CH3H eine Insertion von vier Aminosäureresten verglichen mit der F3'H aufweist (SAGG-Region, Fig. 1), und die benachbarten Reste der inserierten vier Aminosäurereste sind auch unterschiedlich in der CH3H (SAGG+N-Region, Fig. 1).
Konstruktion von Chimären Genen
Um identifizieren zu können, ob die auffälligen Regionen, die in den Alignments gefunden wurden, einen Einfluss auf die CH3H-Aktivität haben, wurden fünf chimäre Gene konstruiert, die C. sulphureus CH3H und C. sulphureus F3'H cDNA Fragmente enthalten (C1-C5, Fig. 4 und 5): CI: Aminosäurepositionen 1-196: F3'H und 201-512: CH3H; C2: Aminosäurepositionen 1-210: CH3H und 211-512: F3'H; C3: Aminosäurepositionen 1-119: CH3H und 124-512: F3'H; C4: Aminosäurepositionen 1-193: CH3H und 198-512: F3'H.
Die Aminosäurepositionen basieren auf dem paarweisen Alignment von C. sulphureus F3'H and CH3H. Alle Primer, die für die Herstellung der Chimären Gene verwendet wurden, sind in Fig. 5 auf-gelistet, und eine schematische Darstellung der Chimären Gene ist in Fig. 4 dargestellt.
Konstruktion von mutierten cDNAs mit Insertionen und Deleti onen
Gezielte Mutagenese
Aufgrund der besonderen Eigenschaften der Aminosäure Prolin (Prolin ist ein Helix- und Faltblattbrecher und wird häufig in Loops oder Turns gefunden) wurde P199 aus der SAGG+N-Region in A199 gemäß dem Alanin, welches in der Cosmos sulphureus F3'H Sequenz an dieser Position gefunden werden kann, (Fig. 1), mutiert. Die dafür verwendeten Primer und eine schematische Darstellung können jeweils in Tabelle 3 und Fig. 4 gefunden werden.
Enzym-Aktivitäten der heterolog exprimierten Chimären und mutierten Enzyme
Insgesamt wurden zwei native Enzyme aus C. sulphureus als auch fünf Chimäre (C1-C5) und drei mutierte Enzyme (Ml, M2 und • · · ♦ · ·· · · f • · · · ·· ··· · ··· ···»·· · · ··#··· ·· · - 16 - ................ M3, Fig- 4) heterolog in Hefe exprimiert. Studien mit den rekom-binanten Enzymen bezüglich ihrer Substratakzeptanz zeigten, dass alle exprimierten Enzyme außer M3 F3'H-Aktivität besitzen (Fig. 4). Die Hydroxylierung von Chalkonen konnte jedoch nur mit den Chimären Genen CI, C2 und C5 als auch mit Ml beobachtet werden. Mit dem rekombinanten Enzym CI konnte jedoch nur eine geringe CH3H-Aktivität, verglichen mit der F3'H-Aktivität und der CH3H-Aktivität der anderen rekombinanten Enzyme, beobachtet werden.
Um kinetische Daten mit verschiedenen Substraten zu bestimmen, wurden kinetische Studien mit den rekombinanten Enzymen durchgeführt. Diese kinetischen Daten sind in Tabelle 1 aufgelistet.
Beispiel 2:
Die Herstellung von transgenen Apfelbäumen erfolgt durch Transformation von jungen Apfelblättern mittels Agrobakterium, wie in der Literatur beschrieben (Szankowski et al; Plant Cell Rep 2003, 22 141-149). Die Pflanzen werden im Gewächshaus als selbstbewurzelte Pflanzen oder aufgepropft auf eine herkömmliche Unterlage unter Freilandlicht-ähnlichen Bedingungen getestet.
Die Blätter werden auf einen erhöhten 3-Hydroxyphloretingehalt mittels HPLC untersucht, beispielsweise nach der Methode von Sa-to et al., 2001 (Plant Science 160, 229-336). Ein Zusammenhang zwischen Pathogenabwehr und 3-Hydroxyphloretin ist aus der Literatur bekannt (Elstner, E.F., Oßwald, W., Schneider, I., 1996. Phytopathologie. Allgemeine und biochemische Grundlagen. Spektrum Akademischer Verlag, Heidelberg, Berlin, Oxford.). Eine erhöhte Resistenz gegen Erwinia amylovora der transgenen Äpfel, die das erfindungsgemäße Nukleotid überexprimieren, kann folgendermaßen getestet werden: Die Sprossen werden 3-4 Wochen vor der Testung auf eine Höhe von 10 cm zurückgeschnitten. Die Bakterien werden auf King's B-Agarplatten für 24 h angezogen und anschließend in Phosphatpuffer resuspendiert. Die Zellkonzentration wird spektrophotometrisch auf 107 cfu/ml eingestellt. Als Negativkontrolle wird Phosphatpuffer auf leere King's B-Agarplatten geleert und wieder dekantiert. Zur Inokulation werden die Blattspitzen der beiden jüngsten, entfalteten Blätter mit einer Schere abgeschnitten, die zuvor in eine Kulturlösung mit dem Erreger getaucht wurde. Pro transgener Linie werden 10-20 Individuen getestet und mit der Kontrolle verglichen. Der Infektionsgrad wird aus dem Verhältnis der Länge des geschädigten Triebs im Vergleich zur Gesamttrieblänge berechnet.
Claims (7)
- • ·· · · ·· · ·· • · · · ·· ··· · ··· • · · t r « · · · ····♦· · · · - 18 - ................ Patentansprüche: 1. Isoliertes Nukleinsäuremolekül, umfassend eine Nukleotidsequenz, welche für ein Polypeptid mit Chalkon 3-Hydroxylase-Aktivität kodiert, wobei die Nukleotidsequenz SEQ ID Nr. 1 umfasst oder mindestens 60% Identität zu SEQ ID Nr. 1 aufweist oder in der Lage ist mit einem Molekül umfassend die Sequenz aus SEQ ID Nr. 1 zu hybridisieren, wobei die Nukleotidsequenz für ein Polypeptid kodiert, welches das Motiv - FASRPLSX1X2G(X3) m(GSAGGD)n umfasst, wobei Xi Threonin oder Serin, X2 Alanin oder Glycin, X3 eine beliebige Aminosäure, m eine ganze Zahl zwischen 50 und 200 und n 0 oder 1 ist.
- 2. Nukleinsäuremolekül nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass das Motiv FASRPLSTAG (X3) m (GSAGGD) n oder FASRPLSSGG(X3)m(GSAGGD)n ist.
- 3. Vektor umfassend ein Nukleinsäuremolekül gemäß Anspruch 1 oder 2.
- 4. Zelle, insbesondere Pflanzenzelle, umfassend ein Nukleinsäuremolekül gemäß Anspruch 1 oder 2 oder einen Vektor gemäß Anspruch 3.
- 5. Transgene Pflanze umfassend ein Nukleinsäuremolekül gemäß Anspruch 1 oder 2 oder einen Vektor gemäß Anspruch 3.
- 6. Transgene Pflanze nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, dass die Pflanze ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Zierpflanzen, insbesondere Petunien, Usambaraveilchen, Azaleen, Rhododendren, Pelargonien, Fuchsien, Cyclamen, Weihnachtssterne, Antirrhinum, Aster (Asteraceae), Begonia (Begoniaceae), Cal-listephus (Asteraceae), Campanula (Campanulaceae), Catharanthus (Apocynaceae), Chrysanthemum (Asteraceae) , Cineraria (Asteraceae) , Dedanthremum (Asteraceae), Dianthus (Caryophyllaceae), Dahlia (Asteraceae), Euphorbia (Euphorbiaceae), Gerbera (Asteraceae) , Hydrangea (Hydrangeaceae) , Lilium (Liliaceae), Lisianthus (= Eustoma (Gentianaceae)), Myosotis (Boraginaceae), Nierember-gia (Solanaceae), Orchidaceae, Osteospermum (Asteraceae), Rosa (Rosaceae), Scaevola (Goodeniaceae), Sinningia (Gesneriaceae), 19 19• · · · • · · · · ·· ·· Streptocarpus (Gesneriaceae), Torenia (Linderniaceae), Tulipa (Liliaceae), Verbena (Verbenaceae), Veronica (Plantaginaceae), Viola (Violaceae) und Malus sp. .
- 7. Schnittblume oder Samen einer transgenen Pflanze nach Anspruch 5 oder 6.
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