JP2011045357A - カルコン3−ヒドロキシラーゼ活性を有するポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含んで成る核酸分子 - Google Patents
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Abstract
【解決手段】特定な配列からなる核酸分子を含んで成るか、特定な配列からなる核酸分子を含んで成る分子とハイブリダイズすることができる、カルコン3−ヒドロキシラーゼ活性を有するポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含んで成る単離された核酸分子。ここで前記ヌクレオチド配列は、モチーフFASRPLSX1X2G(X3)m(GSAGGD)n(ここでX1は、トレオニン又はセリンであり、X2はアラニン又はグリシンであり、X3はいずれかのアミノ酸であり、mは50〜200の整数であり、nは0又は1である)を含んで成るポリペプチドを含んで成る。
【選択図】なし
Description
本発明によれば、配列番号1は、次のヌクレオチド配列を有する:
このモチーフを有するポリペプチドは、本発明に従って使用されるためには特に適切化される。
本発明のさらなる観点は、本発明の核酸分子を含んで成るベクターに関する。
本発明に従って使用され得るベクターは、当業者に十分に知られており、そしてほとんど異なった手段で細胞中に導入され得る。従って、本発明のベクターは、それぞれ、エレクトロポレーション、マイクロプロジェクトボンバードメント、アグロバクテリウムを用いての、又はRNA又はDNAウィルスにより、標的細胞中に導入され得る。
本発明はさらに、次の図面及び例に基づいて、より詳細に示されるが、しかしながら、それらは本発明を制限しない。
材料及び方法
植物材料:
試験を、コスモス・スルフレウスcv. “Sunny Goldgelb”(Austrosaat, Austria)の花弁により実施した。植物材料を、2006年、夏、及び2007年、夏に集め、液体窒素においてショック−凍結し、そして−80℃で貯蔵した。
[14C]イソリクイリチゲニン(ISO)を、Halbwirthなど. (2006)[Plant Science 170 (2006) 587-595]に記載のようにして、4−ヒドロキシ[環−U−14C]ベンズアルデヒド(33.1Mbq/mg)から出発して合成した。14[C]ナリンゲニン(NAR)、[14C]ジヒドロケンプフェロール(DHK)、[14C]ケンプフェロール(KAM)及び[14C]アピゲニン(API)の合成を、Halbwirth及びStich(2008)[Phytochemistry 67 (2006) 1080-1987]に従って実施し;ナリンゲニン合成については、[2−14C]マロニル−補酵素A(55mCi/mモル)(Amersham International, UK)及び組換えカルコンシンターゼを使用し、そしてDHK, KAM及びAPIの続く合成を、マルス・ドメスチカ(Malus, domestica)からの組換えフラバノン3−ヒドロキシラーゼ、ルドベクキア・ヒルタ(Rudbeck hirta)からの組換えフラボノールシンターゼ、及びダリア・バリアビリス(Dahlia variabilis)からの高フラボンシンターゼII活性を有するミクロソーム酵素調製物により、それぞれ実施した。
cDNA合成のために、コスモス・スルフレウス花弁からのmRNAを、MMACS mRNA単離キット(Miltenyl Biotec)により抽出し、そして逆転写を、RevertAid H Minus MuLV逆転写酵素キット(Fermentas Life Science)及びOligo(−dT)アンカープライマーCACCACGCGTATCGATGTCGAC(T)16Vにより実施した。次にRT PCRを、HCBI遺伝子銀行からの次のキク科(アステラセアエ)F3’H配列の保存された領域に由来する、変性されたプライマーTGGMGDATGCTKMGGAARATYTG(前方プライマー)及びGCCCATTCMAYNGTRCTAGATGA(逆方向プライマー)により実施した:
対の及び複数の配列一列整列を、基質特異性の決定に影響を及ぼす領域を同定するために、ソフトウェアトールChustalWを用いて実施した。主にキク科の種からの次のF3’H配列を、複数の配列一列整列のために使用した:コスモス・スルフレウス(Acc. N.:FJ216426)、ダリア・バリアビリス(Acc. No.:FJ216428)、タゲテス・エレクタ(Acc. No.:FJ216430)、キヌガサギク(Rudbeckia hirta)(Acc. No.:FJ216431)、エキノプス・バンナチカス(Echinops bannaticus)(Acc. No.:FJ753549)、ヤグルマギク(Centaurea cyanus)(Acc. N.:FJ753550)、ガーベラ(Gerbera hybrida)(Acc. No.:ABA64468)、オステオスペルマム・ヒブリダ(Osteospermum hybrida)(Acc. No.:ABB29899)、シコリウム・インチバス(Cichorium intibus)(Acc. No.:FJ753548)、アンチリナム・マジウス(Acc. No.:DQ272592)及びアラビドプシス・タリアナ(Arabidopsis thaliana)(Acc. No.:AF271651)(Schlangenなど. 2009)。
アミノ酸残基の挿入を、挿入されるべき、それぞれのアミノ酸残基をコードする、過剰の塩基を有するプライマーにより導入した。欠失を、欠失されるべきアミノ酸残基をコードする塩基を欠いている、それぞれのF3’H cDNAの2種のフラグメントの増幅を用いて導入した。前記2種の増幅されたフラグメントの続く融合を、キメラ遺伝子の構造について記載のようにして実施した。
標的化された突然変異誘発を、メガプライマーPCRを用いて実施した。このPCRを次の2段階で実施した:最初のPCRにおいては、メガプライマーを、Pfu DNAポリメラーゼ(Promega)により増幅した。このために、突然変異されるべき挿入されたcDNAを有するプラスミドを、鋳型として使用した。他方では、プライマーとして、所望する突然変異が挿入され、そしてそのために必要とされる修飾された塩基を有する、部位で結合する内部プライマー、及び発現プライマーを使用した。他方では、この増幅された、突然変異誘発されたフラグメントを、第2PCRにおいて、プライマー及びその対応する発現プライマーとして使用し、Expand High Fidelity PCR System (Roche)により所望する突然変異を有する完全なORFを増幅した。
異種発現のために、プルーフリーディングアンプリコンを、酵母発現ベクターpYES2.1/V5-His-TOPO(商標)(Invitrogen, UK)中に連結し、そしてE. コリTOP10F’(Invitrogen, UK)を形質転換した。センス構造体の同定をPCRにより行い、このために、遺伝子特異的前方向及びプラスミド特異的逆方向プライマーを使用した。センス構造体を単離し、そして正しい配列を配列決定により確かめた。次に、所望するプラスミドを用いて、酵母株INVSc1(Invitrogen, UK)を形質転換した。異種発現を、既知方法に従って実施し、そして調製されたタンパク質を液体窒素においてショック凍結し、そして-80℃で貯蔵した。この調製におけるタンパク質の量の決定を、変性されたLowry方法に従って行った。
異種発現されたF3’Hの基質特異性を決定するために、次の酵素試験を行った:それぞれ、20μgの組換え野生型CH3H又は50μgのハイブリッドタンパク質を、0.25nモルの[14C]−カルコン又はフラボノイド基質と共に、10mMのNADPH及び0.1MのKH PO−KHPO(0.4%アスコルビン酸ナトリウム(pH7.5)を含む)緩衝液の存在下で30℃でインキュベートした。30分後、酵素反応を、10μlの氷酢酸により停止し、そしてフェノール化合物をEtOAcにより2度、抽出した。有機相を、セルロースプレート上に適用し、そしてDAW(クロロホルム:氷酢酸:水、10:9:1)においてクロマトグラフィー処理した。放射能の検出及び定量化を、TLC分析を用いて行う。
速度論的データ(見掛けのミカエリス定数(Km)及び反応の最大速度(Vmax))を、Lineweaver Burkプロットを用いて決定した。
コスモス・スルフレウスCH3H cDNAのクローニング及び配列分析:
この例においては、コスモス・スルフレウスからのcDNAの完全なコード配列を、種々のキク科の種からの変性されたプライマー(NCBI GenBanK Acc. Nos.:FJ216431, FJ753549, EJ753550, ABA64468, ABB29899, FJ753548及びAF313488)及び続くRACE技法を用いて単離できた。このクローンの誘導されたアミノ酸配列は、膜結合されたcyt P450タンパク質(N−末端疎水性膜アンカー、高く保有されたヘムドメイン、等)の保存されたモチーフすべてを有する。
コスモス・スルフレウスからのcDNAクローの異種発現において得られた、組換え酵素による酵素研究においては、6’−デオキシカルコンイソリクイリチゲニンによる高い触媒CH3H活性が示され得た。運動学的研究は、最高のVmax/Kmax(18.01/s*kg)が基質としてIsoを用いて得られることを示した(表1)。
それらの研究は、この酵素のF3’H活性及び欠失するCH3H活性を確認した。2種の組換えタンパク質のターンオーバー率は、図4に列挙される。
C. スルフレウスCH3HにおけるCH3H活性において役割を演じ得る領域を同定するために、一列整列研究を実施した。そのために、すでに言及されているF3’Hアミノ酸配列、すなわちカルコンをヒドロキシル化できない組換え酵素が使用された(Schlangenなど. 2009, Plant Science 177 (2009)97-102)。一列整列の分析においては、C. スルフレウスのCH3H配列におては、Gotoh(1992)によるcyt P450酵素における推定上の基質検出領域(SRS1)として記載される1つの領域が、他のF3’Hアミノ酸配列のそれぞれのSRS1領域に比較して、著しい差異を有することが決定され得た。さらに、領域D(192)GSAGGDP(199)は、このアミノ酸配列に単に存在する、コスモス・スルフレウスCH3H配列において検出され得る(図2)。C. スルフレウスとの対の一列整列においては、CH3Hが、F3’Hに比較して、4個のアミノ酸残基の挿入を有し(SAGG領域、図1)、そして挿入された4種のアミノ酸残基の隣接する残基がまた、CH3Hにおいて異なる(SAGG+N領域、図1)ことを示す。
一列整列において見出される著しい領域がCH3H活性に対して影響を有するかどうかを同定できるようにするために、C. スルフレウスCH3H及び次のC. スルフレウスF3’H cDNAフラグメント(C1-C5、図4及び5)を含む5種のキメラ遺伝子を構成した:C1:アミノ酸位置1−196:F3’H及び210−512:CH3H;C2:アミノ酸位置1−210:CH3H及び211−512:F3’H;C3:アミノ酸位置1−119:CH3H及び124−512:F3’H;C4:アミノ酸位置1−193:CH3H及び198−512:F3’H。前記アミノ酸位置は、C. スルフレウスF3’H及びCH3Hの対の一列整列に基づかれる。キメラ遺伝子の生成のために使用されるすべてのプライマーは図5に列挙され、そしてキメラ遺伝子の図示が図4に示される。
標的化された突然変異誘発:
アミノプロリンの特定性質のために(プロリンはヘリックス及びシート破壊体であり、そして時折、ループ又はターンに見られる)、A199におけるSAGG+N領域からのP199を、この位置でコスモス・スルフレウスF3’H配列に見出され得る、アラニンにより突然変異誘発した(図1)。このために使用されるプライマー及び図示が、それぞれ表3及び図4に見出される得る。
C. スルフレウスからの生来の酵素、及び5種のキメラ(C1-C5)及び3種の突然変異誘発された酵素(M1, M2及びM3、図4)を、総合的に、酵母において異種発現した。それらの基質許容性に関しての組換え酵素による研究は、M3を除くすべての発現された酵素がF3’H活性を有することを示した(図4)。しかしながら、カルコンのヒドロキシル化が、キメラ遺伝子C1, C2及びC5、及びM1により観察された。しかしながら、組換え酵素C1に関しては、低いCH3H活性のみが、F3’H活性及び他の組換え酵素のCH3H活性に比較して、観察され得た。
トランスジェニックリンゴの木の創造が、文献(Szankowskiなど.;Plant C3ll Rep 2003, 22 141-149)に記載されるように、アグロバクテリウムを用いて、若いリンゴの木の葉の形質転換により行われる。その植物を、自己根づいた植物として温室において試験するか、又は野外光のような条件下で、従来の基質上に植える。葉を、Satoなど., 2001 (Plant Science 160, 229-336)の方法に従って、HPLCを用いて、高められた3−ヒドロキシフロレチン含有率について試験した。病原体防御と3−ヒドロキシフロレチンとの間の関係は、文献から知られている(Elstner, E. F., Obwald, W., Schneider, I., 1996. Phytopathologia. Allgemeine und biochemische Grundlagen. Spektrum Akademischer Verlag, Heidelberg, Berlin, Oxford.)。
Claims (7)
- 配列番号1を含んで成るか、又は配列番号1と60%の同一性を有するか、又は配列番号1の配列を含んで成る分子とハイブリダイズすることができる、カルコン3−ヒドロキシラーゼ活性を有するポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含んで成る単離された核酸分子であって、前記ヌクレオチド配列が、モチーフFASRPLSX1X2G(X3)m(GSAGGD)n(ここでX1は、トレオニン又はセリンであり、X2はアラニン又はグリシンであり、X3はいずれかのアミノ酸であり、mは50〜200の整数であり、nは0又は1である)を含んで成るポリペプチドを含んで成ることを特徴とする核酸分子。
- 前記モチーフが、FASRPLSTAG(X3)m(GSAGGD)n又はFASRPLSSGG(X3)m(GSAGGD)nであることを特徴とする請求項1記載の核酸分子。
- 請求項1又は2記載の核酸分子を含んで成るベクター。
- 請求項1又は2記載の核酸分子、又は請求項4記載のベクターを含んで成る細胞、特に植物細胞。
- 請求項1又は2記載の核酸分子、又は請求項4記載のベクターを含んで成るトランスジェニック植物。
- 前記植物が、装飾用植物、特にペチュニア(petunias)、セントポーリア(African violets)、ツツジ(azaleas)、ツツジ属(rhododendrons)、テンジクアオイ類(pelargonium)、フクシア(fuchsias)、シクラメン(cyclamens)、ポインセチア(poinsettias)、キンギョソウ属(Antirrhimum)、コンギク属(Aster)(Asteraceae)、ゲゴニア(Begonia)(Begoniaceae)、カリステパス(Callistephus)(Asteraceae)、ホタルブクロ属(Campanula)(Campanulaceae)、カサランタス(Catharanthus)(Apocynaceae)、キク(Chrysanthenum)(Asteraceae)、シネラリア(Cineraria)(Asteraceae)、デダントレマム(Dedanthremum)(Asteraceae)、ナデシコ(Dianthus)(Caryophyllaceae)、ダリア(Dahlia)(Asteraceae)、トウダイグサ(Euphorbia)(Euphorbiaceae)、ガーベラ(Gerbera)(Asteraceae)、アジサイ属(Hydrangea)(Hydrangeaceae)、ユリ(Lilium)(Liliaceae)、リシアンタス(Lisiantus)(=ユーストマ)(=Eustoma)(Gentianaceae)、ワスレナグサ属(Myosotis)(Boraginaceae)、ニエレムベルギア(Nierembergia)(Solanaceae)、ラン属(Orchidaceae)、オステオスペルマム(Osteospermum)(Asteraceae)、バラ属(Rosa)(Rosaceae)、スカエウォラ(Scaevola)(Scaevola)(Goodeniaceae)、シンニンギア(Sinningia)(Gesneriaceae)、ストレプトカルパス(Streptocarpus)(Gesneriaceae)、トレニア(Torenia)(Linderniaceae)、チューリップ(Liliaceae)、ビジョザクラ(Verbena)(Violaceae)及びマラスsp.(Malus sp.)から成る群から選択される請求項5記載のトランスジェニック植物。
- 請求項5又は6記載のトランスジェニック植物の切花又は種子。
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