WO2011022743A1 - Chalkon hydroxylase - Google Patents

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WO2011022743A1
WO2011022743A1 PCT/AT2010/000304 AT2010000304W WO2011022743A1 WO 2011022743 A1 WO2011022743 A1 WO 2011022743A1 AT 2010000304 W AT2010000304 W AT 2010000304W WO 2011022743 A1 WO2011022743 A1 WO 2011022743A1
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WO
WIPO (PCT)
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asteraceae
nucleic acid
acid molecule
sequence
seq
Prior art date
Application number
PCT/AT2010/000304
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English (en)
French (fr)
Inventor
Heidrun Halbwirth
Karin Schlangen
Karl Stich
Original Assignee
Technische Universität Wien
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Publication date
Application filed by Technische Universität Wien filed Critical Technische Universität Wien
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
    • C12N15/8241—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology
    • C12N15/8242—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with non-agronomic quality (output) traits, e.g. for industrial processing; Value added, non-agronomic traits
    • C12N15/8243—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with non-agronomic quality (output) traits, e.g. for industrial processing; Value added, non-agronomic traits involving biosynthetic or metabolic pathways, i.e. metabolic engineering, e.g. nicotine, caffeine
    • C12N15/825—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with non-agronomic quality (output) traits, e.g. for industrial processing; Value added, non-agronomic traits involving biosynthetic or metabolic pathways, i.e. metabolic engineering, e.g. nicotine, caffeine involving pigment biosynthesis
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/0004—Oxidoreductases (1.)
    • C12N9/0071—Oxidoreductases (1.) acting on paired donors with incorporation of molecular oxygen (1.14)
    • C12N9/0073—Oxidoreductases (1.) acting on paired donors with incorporation of molecular oxygen (1.14) with NADH or NADPH as one donor, and incorporation of one atom of oxygen 1.14.13

Definitions

  • the present invention relates to nucleic acid molecules comprising a nucleotide sequence encoding a polypeptide having chalcone 3-hydroxylase activity.
  • the flower color is one of the most striking properties of ornamental plants and is therefore a significant factor in their market value.
  • genetic engineering approaches to creating new varieties are becoming increasingly important. Examples of this are the production of blue carnations and the so-called blue rose, which are already commercially available in many countries worldwide.
  • the color of flowers is mainly based on the presence of two different pigment groups, carotenoids and flavonoids.
  • the formation of the red, blue and purple flower color is mainly due to the flavonoid class of anthocyanins, while yellow flower color is caused in most cases by the accumulation of carotenoids.
  • the yellow plant color is formed by yellow flavonoids and their biosynthetically related anthochloric pigments (chalcone and aurone). Therefore, modification of the chalcopyrone or flavonoid metabolism can significantly contribute to the change of flower colors.
  • the introduction of the yellow flower color in ornamental plants, of which no or only a few yellow varieties are available is of particular interest. Often, only small changes in the pigment structure lead to drastic color changes. This applies above all to the number of hydroxyl groups in the basic structures.
  • Yellow flavones are the major pigments in some Asteraceae bleeds. While the common common flavones do not produce yellow flower colors, the presence of an additional hydroxyl group at position 2 of the B-ring of luteolin causes the pigment to turn yellow. Isoetin (2'-hydroxyluteolm) was identified as the main yellow pigment of Heywoodiella oligocephala. The introduction of a hydroxylase catalyzing the 2'-hydroxylation could lead to the formation of yellow-colored flavones in the bleeds of transgenic plants which generally produce only ordinary flavones.
  • 3-Deoxyanthocyans are rare plant pigments which as such are found only in a few plants such as celery, zea mays (corn) and sorghum (millet). Three members of this group could be identified, apigeninidm (3-deoxypelargonidine), luteolinidine (3-deoxycyanidine), and colidin.
  • apigenimidine derivatives contribute to the yellow color of the flower.
  • the others are orange to light red in color.
  • the biochemical formation of the flavan-4-ols as precursors for the 3-deoxyanthocyans is due to the reduction of the carbonyl group of the flavanones at position 4. This reaction is catalyzed by dihydroflavonol-4 reductase in a large number of crop and ornamental plants, but usually occurs only in plants in which the FHT response is inhibited.
  • the deep yellow anthochloric pigments have only a limited distribution in nature, but are often found in Asteraceae or Scrophula ⁇ aceae species.
  • two types of chalcone can be synthesized in the blood, the 6 'hydroxychalcone (phloroglucinol type) and the 6' deoxychalcone (resorcinol type).
  • the corresponding aurones are the 4-hydroxy and the 4-deoxyaurones (identical position, different numbering of the rings).
  • Chalkones are plant secondary metabolites and biochemical precursors for all flavonoid classes. Therefore, and because of their physiological functions in plants, such as influencing the color of blood, they play an important role in plant physiology.
  • the rare ⁇ ren 6 '-Deoxychalkone are often accumulated in bleeding from Asteraceae species, since they are not chemically reacted with the respective 5- Deoxyflavanonen can not be accepted as substrates even by the chalcoisomerases (CHIs) of most plants.
  • CHIs chalcoisomerases
  • chalcones in the B-ring may have other hydroxyl groups in addition to the hydroxyl group at position 4 (corresponding to position 4 'for flavonoids) at positions 3 or 3 and 5 (corresponding to positions 3' or 3 '). and 5 'in the flavonoids).
  • flavonoid 3' hydroxylase F3'H
  • flavonoid 3 ', 5' hydroxylase F3 ', 5'H
  • the F3'Hs are membrane-bound cytochrome (cyt) P450-dependent monooxygenases.
  • CytP450 enzymes The superfamily of CytP450 enzymes is a group of very diverse enzymes that catalyze many different and complex oxygenation reactions involving a large number of substrates in the presence of NADPH or NADH. They contain a ham group and occur in both pro- and eukaryotes. In plants, an exceptionally high number of CytP450 genes can be found. In Arabidopsis e.g. 272 CytP450 genes could be detected. The sequence identities of the CytP450 enzymes are often very low.
  • the object of the present invention is to provide nucleic acids encoding polypeptides which are capable of hydroxylating chalcones in the B-ring, for example to influence the coloring in plants.
  • the present invention relates to an isolated nucleic acid molecule comprising a Nukleotidseguenz which encodes a polypeptide having chalcone 3-hydroxylase activity, wherein the nucleotide sequence SEQ ID NO. 1 comprises or at least 60% identity to SEQ ID NO is capable of hybridizing to a molecule comprising the sequence of SEQ ID NO: 1, wherein the nucleotide sequence encodes a polypeptide comprising the motif FASRPLSX I X 2 G (X 3 ) m (GSAGGD) n , where Xi is threonine or serine X 2 is alanine or glycine, X 3 is any amino acid sequence of 50-200 amino acids and n is 0 or 1.
  • polypeptides in particular hydroxylases, such as, for example, flavonoid 3'-hydroxylases which have a specific motif (as defined above), are capable of hydroxylating chalcones at position 3.
  • hydroxylases such as, for example, flavonoid 3'-hydroxylases which have a specific motif (as defined above)
  • the knowledge of such hydroxylases makes it possible to modulate the expression of these hydroxylases in order, for example, to overexpress or inhibit them in vivo.
  • knowledge of these enzymes enables the amount of hydroxylated chalcone to be modulated in a plant cell to thereby alter the color composition therein.
  • plants which comprise the nucleic acid molecules of the invention have, for example, bleeds with a intense yellowing on.
  • the nucleic acid molecule according to the invention catalyses the hydroxylation of various chalcones (which also includes, for example, 6'-deoxychalcones and dihydrochalcones) at position 3.
  • various chalcones which also includes, for example, 6'-deoxychalcones and dihydrochalcones
  • this leads to an intensification of the yellowing by the accumulation of chalcones a 3, 4-hydroxymuster, and also to an increased formation of aurones, since such chalcones are also the preferred precursors for auron-forming enzymes.
  • dihydrochalcones the formation of 3-hydroxychalkone derivatives is promoted, which are involved in the pathogen defense or have health-promoting effect due to their antioxidant properties.
  • the nucleic acid molecule according to the invention may contain SEQ ID No. 1 as nucleotide sequence or at least 60%, preferably at least 65%, preferably at least 70%, preferably at least 75%, preferably at least 80%, preferably at least 85%, preferably at least 90%, preferably at least 95% , preferably at least 97%, preferably at least 98%, preferably at least 99%, in particular 100%, having identity to SEQ ID No. 1.
  • Identity between at least two sequences can be performed by overlaying one nucleic acid or amino acid sequence with at least one other corresponding sequence overlaid ("alignment"), for example according to the method of DJ Lipman and WR Pearson (Science 227 (1985) ), 1435-1441) or F. Corpet (Nucl. Acids Res.
  • the nucleic acid molecule according to the invention is capable of hybridizing with a molecule comprising the sequence of SEQ ID No. 1.
  • a molecule comprising the sequence of SEQ ID No. 1.
  • Hybridization refers to the binding of complementary strands of nucleic acids (i.e., sense: antisense strands) to each other by hydrogen bonds, similar to the bonds naturally occurring in chromosomal DNA.
  • Stringency levels are used to hybridize a nucleic acid to a target nucleic acid. These conditions can easily be varied by the person skilled in the art. According to the invention, the nucleic acid molecule hybridizes under more or less stringent conditions.
  • hybridization is used herein to refer to conditions under which nucleic acid hybrids are stable As known to those skilled in the art, the stability of hybrids is reflected in the melting temperature (Tm) of the hybrids Hybrids are a function of sodium ion concentration and temperature Typically, the hybridization reaction is carried out under conditions of lower stringency, followed by washes of varying but higher stringency With respect to hybridization stringency, such washing conditions apply.
  • moderately stringent hybridization refers to conditions that allow target nucleic acids to bind to a complementary nucleic acid that has about 60% identity, preferably about 75% identity, more preferably about 85% identity with the target DNA; more than about 90% identity with the target DNA being particularly preferred.
  • moderately stringent conditions are conditions equivalent to hybridization in 50% formamide, 5 x Denhart's solution, 5 x SSPE, 0.2% SDS at 42 ° C and subsequent washing in 0.2 x SSPE, 0.2% SDS 65 ° C.
  • high stringency hybridization refers to conditions that permit hybridization of only those nucleic acid sequences that form stable hybrids in 0.018 M NaCl at 65 ° C (ie, when a hybrid in 0.018 M NaCl is not stable at 65 ° C it will not be stable under conditions of high stringency as contemplated here).
  • High stringency conditions may, for example, by hybridization in 50% formamide, 5 x Denhart's solution, 5 x SSPE, 0.2% SDS at 42 ° C, followed by washing in 0.1 x SSPE and 0.1% SDS at 65 0 C be provided.
  • low stringency hybridization refers to conditions equivalent to hybridization in 10% formamide, 5 * Denhart's solution, 6 * SSPE, 0.2% SDS at 42 ° C and subsequent washing in 0.1x SSPE, 0.2% SDS at 50 0 C.
  • Denhart-aciiund SSPE see, eg, Sambrook et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989) are known in the art, as are other suitable hybridization annealing buffer ,
  • SEQ ID No. 1 according to the invention has the following nucleotide sequence:
  • polypeptide encoded by SEQ ID NO: 1 has the following amino acid sequence according to the invention: MTILPLLLYPSLTALLLYVLLNLRPRHPNRLPPGPSPWPIVGNLPHLGASPHQSLAT-
  • the motif is FASRPLSTAG (X 3 ) m (GSAGGD) n or FASRPLS-SGG (X 3 ) m (GSAGGD) n .
  • Polypeptides which have this motif are particularly well suited for use in accordance with the invention.
  • Another aspect of the present invention relates to a vector comprising a nucleic acid molecule according to the present invention.
  • the nucleic acid molecules of the subject invention can be introduced into a vector. With the help of this vector, the nucleic acid molecules can be introduced into cells of plants or microorganisms.
  • the vectors used can be used for the cloning or for the expression of corresponding products. Therefore, corresponding elements such as promoters, replication origins, etc. are provided in the vectors.
  • the vectors used according to the invention may contain a promoter which is effective for plant cells, for example the CaMV 35S promoter, the nopaline synthase promoter or the sucrose synthase promoter.
  • the vectors are used to introduce the nucleic acid molecule according to the invention into the genome of a target cell, appropriate elements can be provided on the vector which enable a recombination of the nucleic acid into the genome.
  • Vectors which can be used according to the invention are well known to the person skilled in the art and can be introduced in a variety of ways into a cell.
  • the vector according to the present invention can be introduced into the target cell by electroporation, microprojectile bombardment, Agrobacterium transfer or RNA or DNA viruses.
  • a still further aspect of the present invention relates to a cell, in particular a plant cell, comprising a nucleic acid molecule or a vector according to the present invention.
  • a cell in particular a plant cell, comprising a nucleic acid molecule or a vector according to the present invention.
  • a still further aspect of the present invention relates to the use of the nucleic acid molecules or proteins of the invention in the preparation of chalcone derivatives having a 3,4-hydroxylation pattern, e.g. 3-hydroxyphloretin derivatives, butapine and eriodictyol chalcone.
  • the nucleic acid molecules of the present invention can be introduced into plant cells and thus into plants to produce transgenic plants capable of expressing the polypeptide of the invention. Therefore, another aspect of the present invention also relates to a transgenic plant comprising a nucleic acid molecule or a vector according to the present invention.
  • the nucleic acid molecule according to the invention or the vector according to the invention can be introduced into plant cells and plants by methods which are sufficiently known to the person skilled in the art.
  • the plant is selected from the group consisting of ornamental plants such as African Violets, Azaleas, Rhododendrons, Pelargonium, Fuchsias, Cyclamen, Poinsettias, Antirrhinum, Aster (Asteraceae), Begonia (Begoniaceae), Callistephus (Asteraceae), Campanula (Campanulaceae ), Catharanthus (Apocynaceae), Chrysanthemum (Asteraceae), Cineraria (Asteraceae), Dedanthremum (Asteraceae), Dianthus (Caryophyliaceae), Dahlia (Asteraceae), Euphorbia (Euphorbiaceae), Gerbera (Asteraceae),.
  • ornamental plants such as African Violets, Azaleas, Rhododendrons, Pelargonium, Fuchsias, Cyclamen, Poinsettias, Antirrhinum, A
  • nucleic acid molecule according to the invention also makes genetic engineering approaches based on polyketide reductase or aurone synthase are based, significantly strengthened. If a purely yellow shade is to be achieved, preferably white or cream-colored plants are used, whereby chalcone isomerase mutants or plants possessing a polyketide reductase are preferred. The use of pink or red-flowered plants leads to the formation of orange or salmon-colored flowers.
  • pathogens in particular to fungi, viruses, viroids, bacteria and nematodes.
  • such plants show resistance to Puccinia / Ustilago, Phytophora, Blumeria / Peronosporacea, barley yellow dwarf virus, sugarcane mosaic virus, plum pox, Xanthomonas campestric pv. Citri, Erwinia amylovora, Erwinia carotovora, Meloidogyne incognita and Heterodera schachtii.
  • Another aspect of the present invention relates to a cut flower or seeds of a transgenic plant according to the present invention.
  • Fig. 1 shows a pairwise alignment of the Cosmos CH3H and F3'H amino acid sequences.
  • FIG. 2 shows alignments of regions of different F3'Hs amino acid sequences.
  • Fig. 3 the substrate specificities of Cosmos F3'H and M2 are shown in percent relative to naringenin (100%).
  • Fig. 5 shows the primers used for the construction of the chimeric genes.
  • Figures 6-17 show the nucleic acid sequences of various flavonoid hydroxylases.
  • Isoliquiritigenin (ISO) was prepared from 4-hydroxy [ring-U-14C] benzaldehyde (33.1 Mbq / mg) (Amersham International, UK) as described in Halbwirth et al. (2006) [Plant Science 170 (2006) 587-595]. The syntheses of
  • Kaempferol (KAM) and [14C] apigenin (API) were synthesized according to Halbwirth and Stich (2008) [Phytochemistry 67 (2006) 1080-1087]: [2-14C] malonyl coenzyme A (55 mCi / mmol) (Amersham International, UK) and recombinant chalcone synthase, and the subsequent syntheses of DHK, KAM and API were each recombinant with recombinant flavanone 3-hydroxylase from Malus domestica
  • mRNA was extracted from the Cosmos sulphureus petals with the ⁇ MACS mRNA isolation kit (Miltenyi Biotech), and reverse transcription was performed with the RevertAid H Minus MuLV reverse transcriptase kit (Fermentas Life Science) and the oligo (-dT) anchor primer GACCACGCGTATCGAT- GTCGAC (T) 16V was performed.
  • RT PCR was then performed with the degenerate primers TGGMGDATGCTKMGGAARATYTG (forward primer) and GCCCATTCMAYNGTRCTAGATGA (reverse primer) derived from the conserved regions of the following Asteraceae F3 'H sequences from the NCBI GenBank: Rudbeckia hirta (Acc. FJ216431), Echinops bannaticus (No: FJ753549), Centaurea cyanus (No: FJ753550), Gerbera hybrida (No: ABA64468), Osteospermum hybrida (No: ABB29899), Cichorium intibus ( Acc. No: FJ753548) and Callistephus chinensis (Acc.
  • Pairwise and multiple sequence alignments were performed with the ClustalW software tool to identify regions that could affect the determination of substrate specificity.
  • the following F3 'H sequences mainly from Asteraceae species, were used for multiple sequence alignments: Cosmos sulphureus (Acc. No: FJ216426), Dahlia variabilis (Acc.
  • the fragments which were to be fused were amplified with a Pfu DNA polymerase (Promega, Germany) in separate PCR reactions and incubated for 10 minutes in a total volume of 20 ⁇ l each containing ca. 50 ng of cDNA from each fragment and ligated to a T4 DNA ligase (Promega, Germany).
  • the diluted ligation was used as template for the subsequent proofreading PCR in which the entire chimeric gene was amplified with the Taq / Pwo polymerase system (Invitrogen, UK).
  • Insertions of amino acid residues were introduced with primers that have an overhang of bases that code for the particular amino acid residues that should be inserted. Deletions were inserted by amplification of two fragments of the respective F3'H cDNA which lack the bases that encode the amino acid residues that should be deleted. The subsequent fusion of the two amplified fragments was performed as described in the construction of the chimeric genes.
  • Targeted mutageneses were made by megaprimer PCR carried out. This PCR was done in two steps: in the first PCR, a megaprimer was amplified with Pfu DNA polymerase (Promega). For this, the plasmid with the inserted cDNA, which was to be mutated, was used as a template. On the one hand, primers used were an internal primer which binds at the site in which the desired mutation is to be inserted and has the altered base sequence required for this, as well as an external expression primer. This amplified mutated fragment, in turn, was then used in a second PCR as a primer together with the corresponding expression primer to amplify the entire ORF with the desired mutations with the X Expand High Fidelity PCR System (Roche).
  • the proofreading amplicons were transformed into the yeast expression vector pYES2. l / V5-His-TOPO® (Invitrogen, UK) and transformed into E. coli TOPlOF 1 (Invitrogen, UK).
  • the identification of the sense constructs was carried out using a PCR in which a gene-specific forward and a plasmid-specific reverse primer was used. Sense constructs were isolated and the correct sequence confirmed by sequencing. Desired plasmids were then transformed into the yeast strain INVSc 1 (Invitrogen, UK).
  • the heterologous expression was carried out by known methods in science and the prepared proteins were stored frozen in liquid nitrogen and stored at -8O 0 C. The amount of protein in the preparations was carried out by a modified Lowry method.
  • the following enzyme assays were performed: 20 ⁇ g of the recombinant wild type CH3H and 50 ⁇ g of the hybrid proteins, respectively, were in presence with 0.25 nmol [14C] -labelled chalcone or flavonoid substrates of 10 mM NADPH and 0.1 M KH2PO4- K2HPO4 (0.4% Na-ascorbate, pH: 7, 5) buffer incubated at 30 0 C. After 30 minutes, the enzymatic reactions were stopped with 10 ⁇ l of glacial acetic acid and the phenolic compounds were extracted twice with EtOAc. The organic phases were applied to cellulose plates and chromatographed in CAW (chloroform: glacial acetic acid: water, 10: 9: 1). Detection and quantification of the Dioactivity was carried out by TLC analysis.
  • the complete coding sequence of a Cosmos sulphureus cDNA could be isolated using degenerate primers from various Asteraceae species (NCBI GenBank Acc-Nos: FJ216431, FJ753549, FJ753550, ABA64468, ABB29899, FJ753548 and AF313488) followed by RACE techniques.
  • the deduced amino acid sequence of this clone has all the conserved motifs of membrane bound CytP450 proteins (such as the N-terminal hydrophobic membrane anchor, the highly conserved heme domain, etc.).
  • the sequence of this cDNA clone has been inserted into the EMBL / GenBank databases under the following Accession number entered: FJ216429.
  • P199 was derived from the SAGG + N region in A199 according to the alanine which can be found in the Cosmos sulphureus F3'H sequence at this position ( Figure 1).
  • the primers used for this and a schematic representation can each be found in Table 3 and FIG. 4.
  • transgenic apple trees The production of transgenic apple trees is carried out by
  • An increased resistance to Erwinia amylovora the transgenic apple, which overexpress the nucleotide of the invention can be tested as follows: The sprouts are cut back to a height of 10 cm 3-4 weeks prior to testing. The bacteria are grown on King's B agar plates for 24 h and then resuspended in phosphate buffer. The cell concentration is adjusted spectrophotometrically to 10 7 cfu / ml. As a negative control, phosphate buffer is emptied on empty King's B agar plates and decanted again. For inoculation, the leaf tips of the two youngest, unfolded leaves are cut with scissors previously immersed in a culture solution containing the pathogen. For each transgenic line 10-20 individuals are tested and compared to the control. The degree of infection is calculated from the ratio of the length of the damaged shoot compared to the total length of the drive.

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Abstract

Die vorliegende Erfindung betrifft ein isoliertes Nukleinsäuremolekül, umfassend eine Nukleotidsequenz, welche für ein Polypeptid mit Chalkon 3-Hydroxylase-Aktivität kodiert, wobei die Nukleotidsequenz SEQ ID Nr. 1 umfasst oder mindestens 60% Identität zu SEQ ID Nr. 1 aufweist oder in der Lage ist mit einem Molekül umfassend die Sequenz aus SEQ ID Nr. 1 zu hybridisieren, wobei die Nukleotidsequenz für ein Polypeptid kodiert, welches das Motiv FASRPLSX1X2G(X3)m(GSAGGD)n umfasst, wobei X1 Threonin oder Serin, X2 Alanin oder Glycin, X3 eine beliebige Aminosäuresequenz mit 50-200 Aminosäuren und n 0 oder 1 ist.

Description

Chalkon Hydroxylase
Die vorliegende Erfindung betrifft Nukleinsäuremoleküle, umfassend eine Nukleotidsequenz, welche für ein Polypeptid mit Chalkon 3-Hydroxylase-Aktivität kodiert.
Die Blütenfarbe ist eine der auffallendsten Eigenschaften von Zierpflanzen und ist daher ein bedeutender Faktor für ihren Marktwert. Neben der traditionellen Züchtung gewinnen gentechnische Ansätze zur Schaffung neuer Sorten immer mehr an Bedeutung. Beispiele dafür sind die Erzeugung blauer Nelken sowie die der so genannten blauen Rose, welche bereits weltweit in sehr vielen Ländern kommerziell erhältlich sind.
Die Ausprägung der Blütenfarben basiert hauptsächlich auf der Anwesenheit von zwei verschiedenen Pigmentgruppen, den Carotinoiden und den Flavonoiden. Für die Bildung der roten, blauen und lila Blütenfarbe ist hauptsächlich die Flavonoidklasse der Anthocyane verantwortlich, während gelbe Blütenfarbe in den meisten Fällen durch die Akkumulation von Carotinoiden entsteht. In einigen Pflanzenarten wird die gelbe Pflanzenfarbe jedoch von gelben Flavonoiden und deren biosynthetisch verwandten anthoch- loren Pigmenten (Chalkone und Aurone) gebildet. Daher kann eine Modifikation des Chalkon- bzw. Flavonoidstoffwechseis entscheidend zur Veränderung von Blütenfarben beitragen. Neben der Züchtung von Pflanzen mit blauen Blüten ist die Einführung der gelben Blütenfarbe in Zierpflanzen, von denen keine oder nur vereinzelte gelbe Sorten erhältlich sind, von besonderem Interesse. Oft führen nur kleine Änderungen in der Pigmentstruktur zu drastischen Farbveränderungen. Dies gilt vor allem für die Anzahl der Hydroxylgruppen in den Grundstrukturen.
Obwohl viele Flavonoide in chemisch reiner Form eine blassgelbe Farbe aufweisen, führt ihre Anwesenheit in Petalen nicht zur Ausprägung von gelber Blütenfarbe. Die sogenannten „gelben Flavonole" weisen neben dem gewöhnlichen 5,7-
Hydroxylierungsmuster des A-Rings eine zusätzliche Hydroxylgruppe in Position 6 oder 8 auf, die eine Absorptionsverschiebung in den längerwelligen Bereich und damit eine Verstärkung der gelben Farbe bewirkt. Die Anwesenheit solcher höher hydroxylierten Verbindungen führt zur Ausprägung gelber Blütenfarbe. Quercetagetin wurde zuerst als gelbes Pigment in verschiedenen Tagetes-Arten identifiziert und kommt auch in den Blüten von Rudbeckia hirta vor .
Gelbe Flavone stellen die Hauptpigmente in einigen Bluten von Asteraceaen dar. Wahrend die gewöhnlichen verbreiteten Flavone nicht zur Ausprägung von gelben Blutenfarben fuhren, bewirkt die Anwesenheit einer zusätzlichen Hydroxylgruppe an der Position 2 des B-Rings von Luteolin eine Gelbfärbung des Pigments. Isoetin (2' -Hydroxyluteolm) wurde als gelbes Hauptpigment von Heywoodiella oligocephala identifiziert. Die Einfuhrung einer Hydroxylase, welche die 2' -Hydroxylierung katalysiert, konnte zur Bildung von gelb gefärbten Flavonen in den Bluten transgener Pflanzen fuhren, die generell nur gewöhnliche Flavone produzieren .
Im Gegensatz zu den gelben Flavonolen, bei denen die Anwesenheit einer zusätzlichen Hydroxylgruppe zur Ausprägung gelber Blutenfarbe fuhrt, ist der Verlust einer Hydroxylgruppe an der Position 3 von Anthocyanen bzw. Anthocyanidinen für eine Verschiebung der Absorption in den kurzerwelligen Bereich und damit für die orange und gelbe Farbe der sogenannten 3-Deoxyanthocyane verantwortlich. 3-Deoxyanthocyane sind seltene pflanzliche Pigmente, die als solche nur in einigen wenigen Pflanzen wie Gesne- riaceen, Zea mays (Mais) und in Sorghum-Arten (Hirse) vorkommen. Drei Vertreter dieser Gruppe konnten identifiziert werden, Api- geninidm (3-Deoxypelargonidin) , Luteolinidin (3-Deoxycyanidin) und Columnidin. Von diesen tragen jedoch nur Apigenimdin- Derivate zur gelben Blutenfarbe bei. Die anderen weisen eine orange- bis hellrote Färbung auf. Die biochemische Bildung der Flavan-4-ole als Vorlaufer für die 3-Deoxyanthocyane wird durch die Reduktion der Carbonylgruppe der Flavanone an Position 4 bedingt. Diese Reaktion wird in einer großen Anzahl von Kultur- und Zierpflanzen durch die Dihydroflavonol-4-Reduktase katalysiert, findet aber gewöhnlich nur in Pflanzen statt, in denen die FHT-Reaktion gehemmt ist.
Die tiefgelben anthochloren Pigmente (Chalkone und Aurone) haben in der Natur nur eine beschrankte Verbreitung, kommen jedoch häufig in Asteraceae- oder Scrophulaπaceae-Arten vor. Generell können zwei Arten von Chalkonen in den Bluten synthetisiert werden, die 6' -Hydroxychalkone (Phloroglucinoltyp) und die 6' -Deoxychalkone (Resorcinoltyp) . Die entsprechenden Aurone sind die 4-Hydroxy- und die 4-Deoxyaurone (identische Position, unterschiedliche Nummerierung der Ringe) . 6' -Deoxychalkone werden durch die Chalkonsynthase zusammen mit der Chalkonketidreduktase (CHKR, synonym Polyketidreduktase, PKR, Chalcone reductase) über ein Polyketid-Intermediat gebildet.
Chalkone sind pflanzliche Sekundarmetabolite und biochemische Vorlaufer für alle Flavonoidklassen . Deshalb und aufgrund ihrer physiologischen Funktionen in Pflanzen, wie z.B. die Beeinflussung der Blutenfarbe, spielen sie eine wichtige Rolle in der Pflanzenphysiologie . Neben den gewohnlichen 6'- Hydroxychalkonen, welche Intermediate der Biosynthese der weit verbreiteten 5-Hydroxyflavonoide darstellen, werden die seltene¬ ren 6' -Deoxychalkone häufig in Bluten von Asteraceen-Arten akkumuliert, da sie chemisch nicht zu den jeweiligen 5- Deoxyflavanonen umgesetzt werden können und auch von den Chalko- nisomerasen (CHIs) der meisten Pflanzen nicht als Substrate akzeptiert werden. Die Akkumulation von 6' -Deoxychalkonen fuhrt zur Ausprägung von gelber Blutenfarbe. 6' -Hydroxychalkone werden dagegen nur in seltenen Fallen im Pflanzengewebe akkumuliert, da sie leicht enzymatisch oder chemisch zu Flavanonen umgewandelt werden können. Daher sind sie nur in wenigen Fallen für Gelbfärbung von Bluten verantwortlich, wie in den gelben Bluten von Nelken (Dianthus caryophyllus) , Lowenmaulchen (Antirrhinum ma- jus) und Strohblumen (Helichrysum bracteatum) , da diesen Mutanten neben der CHI zumindest eine weitere Enzymaktivitat des Flavonoidstoffwechseis fehlt.
Wie die Flavonoide, können auch Chalkone im B-Ring neben der Hydroxylgruppe an der Position 4 (entspricht der Position 4' bei Flavonoiden) weitere Hydroxylgruppen besitzen, und zwar an den Positionen 3 oder 3 und 5 (entsprechend den Positionen 3' oder 3' und 5' bei den Flavonoiden) . Im Gegensatz zu der sehr gut untersuchten Hydroxylierung von Flavonoiden an der Position 3' und 3', 5', welche von den CytochromP450 abhangigen Monooxygenasen Flavonoid-3' -Hydroxylase (F3'H) bzw. Flavonoid-3' , 5' -Hydroxylase (F3',5'H) katalysiert werden, bestand für lange Zeit Unklarheit darüber, welches Enzym für die Einfuhrung von zusätzlichen Hydroxylgruppen im B-Rmg von Chalkonen verantwortlich ist. Es konnte gezeigt werden, dass die Einfuhrung einer Hydroxylgruppe an der Position 3 von 6' -Deoxychalkonen durch eine Cytochrom- P450-abhangige Monooxygenase katalysiert wird. Untersuchungen mit rekombinanten F3'Hs von verschiedenen Pflanzen, welche Chalkone in ihren Blütenblättern akkumulieren, als auch von solchen, die keine Chalkone akkumulieren, zeigten jedoch, dass diese F3'Hs nicht in der Lage sind, die Hydroxylierung von Chalkonen zu katalysieren.
Wie schon erwähnt, handelt es sich bei den F3'Hs um membrangebundene Cytochrom (Cyt)P450 abhangige Monooxygenasen . Die Su- perfamilie der CytP450 Enzyme ist eine Gruppe sehr unterschiedlicher Enzyme, welche viele verschiedene und komplexe Oxygenie- rungsreaktionen mit einer großen Anzahl von Substraten in Anwesenheit von NADPH oder NADH katalysieren. Sie beinhalten eine Hamgruppe und kommen sowohl in Pro- als auch in Eukaryoten vor. In Pflanzen kann eine außergewöhnlich hohe Anzahl von CytP450 Genen gefunden werden. In Arabidopsis z.B. konnten 272 CytP450 Gene detektiert werden. Die Sequenzidentitaten der CytP450 Enzyme sind oft sehr niedrig.
Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist die Bereitstellung von Nukleinsäuren kodierend für Polypeptide, die in der Lage sind, Chalkone im B-Ring zu hydroxylieren, um beispielsweise die Farbgebung bei Pflanzen zu beeinflussen.
Die vorliegende Erfindung betrifft ein isoliertes Nuklein- sauremolekul, umfassend eine Nukleotidseguenz, welche für ein Polypeptid mit Chalkon 3-Hydroxylase-Aktivitat kodiert, wobei die Nukleotidsequenz SEQ ID Nr. 1 umfasst oder mindestens 60% Identität zu SEQ ID Nr. 1 aufweist oder in der Lage ist mit einem Molekül umfassend die Sequenz aus SEQ ID Nr. 1 zu hybridisieren, wobei die Nukleotidsequenz für ein Polypeptid kodiert, welches das Motiv FASRPLSXIX2G (X3) m (GSAGGD) n umfasst, wobei Xi Threonin oder Serin, X2 Alanin oder Glycin, X3 eine beliebige Ammosauresequenz mit 50-200 Aminosäuren und n 0 oder 1 ist.
Es wurde erfindungsgemaß herausgefunden, dass Polypeptide, insbesondere Hydroxylasen, wie beispielsweise Flavonoid 3'- Hydroxylasen, welche ein bestimmtes Motiv (wie oben definiert) aufweisen, in der Lage sind, Chalkone an der Position 3 zu hydroxylieren. Die Kenntnis derartiger Hydroxylasen ermöglicht es die Expression dieser Hydroxylasen zu modulieren, um diese beispielsweise in vivo uberzuexpπmieren oder zu inhibieren. Insbesondere ermöglicht die Kenntnis dieser Enzyme die Menge an hyd- roxylierten Chalkonen in einer Pflanze bzw. Pflanzenzelle zu modulieren, um dadurch die Farbzusammensetzung in derselbigen zu verandern. So weisen Pflanzen, welche die erfindungsgemaßen Nuk- leinsauremolekule umfassen, beispielsweise Bluten mit einer in- tensiven Gelbfärbung auf.
Das erfindungsgemäße Nukleinsäuremolekül katalysiert die Hydroxylierung von verschiedenen Chalkonen (das inkludiert beispielsweise auch 6' -Deoxychalkone und Dihydrochalkone) an der Position 3. Dies führt im Fall der 6' -Hydroxychalkone und 4- Deoxyaurone zu einer Intensivierung der Gelbfärbung durch die Anreicherung von Chalkonen mit einem 3, 4-Hydroxymuster, und auch zu einer vermehrten Bildung von Auronen, da solche Chalkone auch die bevorzugten Precursor für Auron-bildende Enzyme darstellen. Im Fall der Dihydrochalkone wird die Bildung von 3- Hydroxychalkonderivaten begünstigt, die an der Pathogenabwehr beteiligt sind bzw. aufgrund ihrer antioxidativen Eigenschaften gesundheitsfördernde Wirkung besitzen.
Das erfindungsgemäße Nukleinsäuremolekül kann SEQ ID Nr. 1 als Nukleotidsequenz oder mindestens 60%, vorzugsweise mindestens 65%, vorzugsweise mindestens 70%, vorzugsweise mindestens 75%, vorzugsweise mindestens 80%, vorzugsweise mindestens 85%, vorzugsweise mindestens 90%, vorzugsweise mindestens 95%, vorzugsweise mindestens 97%, vorzugsweise mindestens 98%, vorzugsweise mindestens 99%, insbesondere 100%, Identität zu SEQ ID Nr. 1 aufweisen.
Identität zwischen mindestens zwei Sequenzen kann durch Überlagerung durchgeführt werden, bei der eine Nukleinsäure- o- der Aminosäuresequenz mit mindestens einer weiteren entsprechenden Sequenz übereinander gelegt werden („Alignment") . Beispielsweise nach dem Verfahren von D. J. Lipman und W. R. Pearson (Science 227 (1985), 1435-1441) oder F. Corpet (Nucl. Acids Res . 16 (1988), 10881-10890). Vorzugsweise geschieht dies über Algorithmen, welche von kommerziell erhältlichen Computerprogrammen angewendet werden. Hierzu gehört beispielsweise das Programm Vector NTi""Suite 7.0, erhältlich von der Firma InforMax, Inc., USA, vorzugsweise mit den vorgegebenen Standard-Parametern. Eine weitere Software, mit deren Hilfe Sequenzidentität bestimmt werden kann, ist z.B. „Sequence Analysis Software Package der Ge- netics Computer Group, University of Wisconsin Biotechnology Center, 1710 University Avenue, Madison, WI53705". Diese Software überlagert ähnliche Sequenzen durch Zuordnung von Homologiegraden .
Das erfindungsgemäße Nukleinsäuremolekül ist in der Lage, mit einem Molekül umfassend die Sequenz aus SEQ ID Nr. 1 zu hyb- ridisieren .
Hybridisierung bezeichnet die Bindung komplementärer Stränge von Nukleinsäuren (d.h. sense : Antisense-Strange) miteinander durch Wasserstoffbindungen, ahnlich den Bindungen, die natürlicherweise in chromosomaler DNA vorkommen. Dabei werden Strin- genzniveaus verwendet, um eine Nukleinsäure mit einer Ziel- Nukleinsaure zu hybridisieren. Diese Bedingungen können leicht durch den Fachmann variiert werden. Erfindungsgemaß hybridisiert das Nukleinsauremolekul unter mehr oder weniger stringenten Bedingungen .
Der Ausdruck „stringente Hybridisierung" wird hier verwendet, um Bedingungen zu bezeichnen, unter welchen Nukleinsäure- hybride stabil sind. Wie dem Fachmann bekannt ist, wird die Stabilität von Hybriden in der Schmelztemperatur (Tm) der Hybride reflektiert. Im allgemeinen ist die Stabilität eines Hybrids eine Funktion der Natriumionenkonzentration und der Temperatur. Typischerweise wird die Hybridisierungsreaktion unter Bedingungen niedrigerer Stringenz, gefolgt von Waschungen variierender, aber höherer Stringenz, durchgeführt. Bezugnahme auf Hybridisie- rungsstringenz betrifft derartige Waschbedingungen.
Wie hier verwendet bezeichnet der Ausdruck "maßig stringente Hybridisierung" Bedingungen, die Ziel-Nukleinsaure gestatten, eine komplementäre Nukleinsäure zu binden, die etwa 60% Identität, vorzugsweise etwa 75% Identität, starker bevorzugt etwa 85% Identität mit der Ziel-DNA hat; wobei mehr als etwa 90% Identität mit der Ziel-DNA besonders bevorzugt werden. Vorzugsweise sind maßig stringente Bedingungen Bedingungen, äquivalent der Hybridisierung in 50% Formamid, 5 x Denhart-Losung, 5 x SSPE, 0,2% SDS bei 42°C und nachfolgendes Waschen in 0,2 x SSPE, 0,2% SDS bei 65°C.
Der Ausdruck "Hybridisierung mit hoher Stringenz" bezeichnet Bedingungen, die Hybridisierung von nur denjenigen Nukleinsäu- resequenzen gestatten, die stabile Hybride in 0,018 M NaCl bei 65°C bilden (d.h., wenn ein Hybrid in 0,018 M NaCl bei 65°C nicht stabil ist, wird es unter Bedingungen hoher Stringenz, wie sie hier in Betracht gezogen werden, nicht stabil sein) . Bedingungen hoher Stringenz können zum Beispiel durch Hybridisierung in 50% Formamid, 5 x Denhart-Losung, 5 x SSPE, 0,2% SDS bei 42°C und nachfolgendes Waschen in 0,1 x SSPE und 0,1% SDS bei 650C bereitgestellt werden. Der Ausdruck "Hybridisierung mit geringer Stringenz" bezeichnet Bedingungen, äquivalent der Hybridisierung in 10% For- mamid, 5 * Denhart-Lösung, 6 * SSPE, 0,2% SDS bei 42°C und nachfolgendes Waschen in 0,1 x SSPE, 0,2% SDS bei 500C. Denhart- Lösungiund SSPE (siehe z.B. Sambrook et al . , Molecular Cloning, A Laboratory Manual, CoId Spring Harbor Laboratory Press, 1989) sind dem Fachmann bekannt, wie es andere geeignete Hybridisie- rungspuffer sind.
SEQ ID Nr. 1 hat erfindungsgemäß die folgende Nukleotidse- quenz :
ATGACTATTCTACCCCTACTACTCTACCCTTCCCTAACTGCCTTACTACTGTACGTACTT- CTTAACCTGCGCCCCCGTCACCCTAACCGTCTCCCGCCGGGACCAAGCCCAT- GGCCGATCGTCGGAAACCTACCGCACCTCGGCGCGAGTCCGCATCAGTCGCTGGCGACGTT- GGCCGCAAAGTACGGCCCGTTGATGTACCTCCGACTCGGGTTTGTT- GACGTGGTGGTGGCGGCGTCTGCTTCAGTCGCTGCACAGTTTTTAAAAGTTCAT- GATCTTAACTTCGCAAGCCGGCCGCTGAGCTCTGGCGGGAAGTATATCGCGTATAATTATCAG- GATATGGTGTTTGCACCGTACGGTCCGAGATGGCGGATGCTTAGGAAGATTTGCTCCGTGCA- TATGTTTTCTGCTAAAGCAATGGACGGATTTCGTCATGTTCGGCAGGAGGAAGTAGCTATACT- CACGCGCACTTTAGTAAGCGCTGGAAAATCGCCGGTGAAGTTAGGTCA- AATACTTAACGTGTGCACCACGAACGCATTAGCACGAGTGGTGTTAGGTCGGAGAGTATT- CGCCGACGGAAGTGCAGGTGGTGATCCGAAGGCGGATGAGTTCAAGGATATGGTGGTGGAGCT- GATGGTGTTGGCCGGAGAATTTCACATCGGTGACTTTATCCCGGCGCTTGACTGGCTGGAC- CTGCAAGGCATTAAAAACAAGATGAAGAAACTTCACGCTCGATTCGATTCGTTCCTTCACGG- GATCCTTGAAGAGCATAAGTCCGGCAAGTTTGGCGCGCCGAGTCATGGTGATTTGTT- GAGCACATTGATCTCGTTGAAGGATGATGCCGATGGTGAAGGCGGGAAGCTTTCAGATGTT- GAAATCAAAGCTTTGCTTCTGAACTTATTTGTCGCCGGAACAGACACATCATCAAGTACAGTG- GAATGGGCAATAGCCGAGCTAATTCGACATCCAAAGCTACTAAAACAAGCCCAAAAAGAAATG- GACAATGTAGTTGGTCGAGACCGGCTTGTAACTGAATTAGACTTAAACGAGTTAAATTTT- CTACAAGCCATTGTAAAAGAGACCTTTAGGCTTCACCCTTCAACACCACTCTCGTTACCA- AGAATTGCATCAGAGAGTTGTGAAGTTGACGGATATTACATTCCCAAGG- GATCCACGCTCCTTGTTAATGTGTGGGCCATTGCTCGTGACCCGAATGTGTGGGCTGAC- CCACTTGAATTCCGGCCCATGCGGTTCTTGCCTGGAGGCGAAAAGCCTAATGTTGATGTTCA- AGGAAACAACTTTGAAGTTATACCGTTTGGGGCTGGGCGAAGGATTTGTGTGGGTAT- TAGTCTAGGGTTGAGAATGGTCCAGCTACTTGTTGCAACATTGGTTCAAACCTTTGATTGG- GAATTGGCTAATGGGTTAAACCCGGAGAAGCTAAACATGGATGAAGCCTTTGGGTTAACCCTT- CAGAAGGCTGAGCCCTTGATGGTGCACCCAATGCCGAGACTAGCTCCACACGTGTATGGAAGTCATTAA
Das von SEQ ID Nr. 1 kodierte Polypeptid hat erfindungsgemäß die folgende Aminosäuresequenz: MTILPLLLYPSLTALLLYVLLNLRPRHPNRLPPGPSPWPIVGNLPHLGASPHQSLAT-
LAAKYGPLMYLRLGFVDVVVAASASVAAQFLKVHDLNFASRPLSSGGKYIAYNYQDMVFAPY-
GPRWRMLRKICSVHMFSAKAMDGFRHVRQEEVAILTRTLVSAGKSPVKLGQILNVCTT-
NALARVVLGRRVFADGSAGGDPKADEFKDMVVELMVLAGEFHIGDFIPALDWLDLQGIKNK-
MKKLHARFDSFLHGILEEHKSGKFGAPSHGDLLSTLISLKDDADGEGGKLSDVEIKALL-
LNLFVAGTDTSSSTVEWAIAELIRHPKLLKQAQKEMDNVVGRDRLVTELDLNELNFLQAIV-
KETFRLHPSTPLSLPRIASESCEVDGYYIPKGSTLLVNVWAIARDPNVWADPLEFRPMRFLPG-
GEKPNVDVQGNNFEVIPFGAGRRICVGISLGLRMVQLLVATLVQTFDWELANGLN-
PEKLNMDEAFGLTLQKAEPLMVHPMPRLAPHVYGSH (SEQ ID NR. 2)
Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ist das Motiv FASRPLSTAG (X3) m (GSAGGD) n oder FASRPLS- SGG (X3)m (GSAGGD)n.
Polypeptide, welche dieses Motiv aufweisen, sind besonders gut geeignet, um erfindungsgemäß eingesetzt zu werden.
Ein weiterer Aspekt der vorliegenden Erfindung betrifft einen Vektor umfassend ein Nukleinsäuremolekül gemäß der vorliegenden Erfindung.
Die Nukleinsäuremoleküle der gegenständlichen Erfindung können in einen Vektor eingebracht werden. Mit Hilfe dieses Vektors können die Nukleinsäuremoleküle in Zellen von Pflanzen oder Mikroorganismen eingebracht werden. Die verwendeten Vektoren können für die Klonierung oder für die Expression von entsprechenden Produkten eingesetzt werden. Daher sind in den Vektoren entsprechende Elemente wie Promotoren, Replikationsursprünge, usw. vorgesehen. Die erfindungsgemäß eingesetzten Vektoren können einen Pflanzenzellen wirksamen Promotor, wie beispielsweise den CaMV 35S-Promotor, den Nopalinsynthase-Promotor oder den Saccharose- synthase-Promotor, enthalten.
Falls die Vektoren dazu verwendet werden, um das erfindungsgemäße Nukleinsäuremolekül in das Genom einer Zielzelle einzubringen, können am Vektor entsprechende Elemente vorgesehen sein, die eine Rekombination der Nukleinsäure in das Genom ermöglichen .
Vektoren, welche erfindungsgemäß eingesetzt werden können, sind dem Fachmann hinreichend bekannt und können auf verschiedenste Weise in eine Zelle eingebracht werden. So kann der Vektor gemäß der vorliegenden Erfindung durch Elektroporation, Mikroprojektil-Bombardierung, Transfer mittels Agrobakterium o- der durch RNA- bzw. DNA-Viren in die Zielzelle eingebracht werden . Ein noch weiterer Aspekt der vorliegenden Erfindung betrifft eine Zelle, insbesondere Pflanzenzelle, umfassend ein Nuklein- säuremolekül oder einen Vektor gemäß der vorliegenden Erfindung. Selbstverständlich ist es auch möglich das Nukleinsäuremolekül bzw. den Vektor gemäß der vorliegenden Erfindung in anderen Zellen, wie beispielsweise Hefen, E. coli, filamentösen Pilzen und dergleichen zur Verfügung zu stellen.
Ein noch weitere Aspekt der vorliegenden Erfindung betrifft die Verwendung der erfindungsgemäßen Nukleinsäuremoleküle oder Proteine bei der Herstellung von Chalkonderivaten mit einem 3,4- Hydroxylierungsmuster, wie z.B. 3-Hydroxyphloretin-derivate, Bu- tein und Eriodictyolchalkon.
Die Nukleinsäuremoleküle der vorliegenden Erfindung können in Pflanzenzellen und somit in Pflanzen eingebracht werden, um transgene Pflanzen herzustellen, welche in der Lage sind, das erfindungsgemäße Polypeptid zu exprimieren . Daher betrifft ein weiterer Aspekt der vorliegenden Erfindung auch eine transgene Pflanze umfassend ein Nukleinsäuremolekül oder einen Vektor gemäß der vorliegenden Erfindung. Das erfindungsgemäße Nukleinsäuremolekül bzw. der erfindungsgemäße Vektor kann in Pflanzenzellen und Pflanzen mit Verfahren eingebracht werden, die dem Fachmann hinreichend bekannt sind.
Vorzugsweise ist die Pflanze ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Zierpflanzen, wie beispielsweise Usambaraveilchen, Azaleen, Rhododendren, Pelargonien, Fuchsien, Cyclamen, Weihnachtssterne, Antirrhinum, Aster (Asteraceae) , Begonia (Begoni- aceae) , Callistephus (Asteraceae) , Campanula (Campanulaceae) , Catharanthus (Apocynaceae) , Chrysanthemum (Asteraceae) , Cinera- ria (Asteraceae) , Dedanthremum (Asteraceae) , Dianthus (Caryo- phyliaceae) , Dahlia (Asteraceae) , Euphorbia (Euphorbiaceae) , Gerbera (Asteraceae) ,. Hydrangea (Hydrangeaceae) , Lilium (LiIi- aceae) , Lisianthus (= Eustoma (Gentianaceae) ) , Myosotis (Boragi- naceae) , Nierembergia (Solanaceae) , Orchidaceae, Osteospermum (Asteraceae) , Petunia (Solanaceaea) , Rosa (Rosaceae) , Saintpau- lia (Gesneriaceae) , Scaevola (Goodeniaceae) , Sinningia (Gesneri- aceae) , Streptocarpus (Gesneriaceae) , Torenia (Linderniaceae) , Tulipa (Liliaceae) , Verbena (Verbenaceae) , Veronica (Plantagi- naceae) , Viola (Violaceae) und Malus sp.. Durch die Anwesenheit des erfindungsgemäßen Nukleinsäuremoleküls werden auch gentechnologische Ansätze, die auf Polyketidreduktase oder Auronsyntha- se beruhen, wesentlich verstärkt. Soll ein rein gelber Farbton erzielt werden, werden vorzugsweise weiße oder cremefarbene Pflanzen eingesetzt, dabei sind Chalkonisomerase-Mutanten oder Pflanzen, die eine Polyketidreduktase besitzen, bevorzugt. Beim Einsatz von rosa oder rotbluhenden Pflanzen kommt es zur Ausbildung von orangefarbenen oder lachsfarbigen Bluten.
Es hat sich zudem gezeigt, dass Pflanzen, welche das erfin- dungsgemaße Polypeptid - kodiert durch das erfmdungsgemaße Nuk- leinsauremolekul - exprimieren, insbesondere uberexpπmieren, eine erhöhte Resistenz gegenüber Pathogenen, insbesondere gegenüber Pilzen, Viren, Viroiden, Bakterien und Nematoden, aufweisen. Insbesondere zeigen derartige Pflanzen Resistenzen gegenüber Puccinia/Ustilago, Phytophora, Blumeria/Peronosporacea, barley yellow dwarf virus, sugarcane mosaic virus, plum pox, Xanthomonas campestric pv. Citri, Erwinia amylovora, Erwinia carotovora, Meloidogyne incognita und Heterodera schachtii.
Ein weiterer Aspekt der vorliegenden Erfindung betrifft eine Schnittblume oder Samen einer transgenen Pflanze gemäß der vorliegenden Erfindung.
Die gegenstandliche Erfindung wird ferner anhand der folgenden Figuren und Beispiele eingehender erläutert, ohne jedoch auf diese beschrankt zu sein.
Fig. 1 zeigt ein paarweises Alignment der Cosmos CH3H und F3'H Aminosauresequenzen .
In Fig. 2 sind Alignments von Regionen verschiedener F3'Hs Aminosauresequenzen abgebildet.
In Fig. 3 sind die Substratspezifitaten von Cosmos F3'H und M2 in Prozent relativ zu Naringenin (100%) dargestellt.
Fig. 4 zeigt eine schematische Darstellung der Konstruktion von chimaren und mutierten Genen der CH3H bzw. F3'H aus Cosmos sulphureus und Umsatzraten der resultierenden rekombinanten Enzyme (0-5%: -, 6-30%: +, 31-60%: ++, 61-100%: +++) .
Fig. 5 zeigt die verwendeten Primer für die Konstruktion der chimaren Gene.
Fig. 6-17 zeigen die Nukleinsauresequenzen verschiedener Flavonoid-Hydroxylasen .
BEISPIELE :
Beispiel 1:
Material und Methoden
Pflanzenmaterial Die Untersuchungen wurden mit Blütenblättern von Cosmos sulphureus cv. „Sunny Goldgelb" (Austrosaat, Österreich) durchgeführt. Das Pflanzenmaterial wurde im Sommer 2006 und Sommer 2007 gesammelt, in flüssigem Stickstoff schockgefroren und bei -800C gelagert.
Chemikalien
[14C] Isoliquiritigenin (ISO) wurde ausgehend von 4- Hydroxy [ring-U-14C] Benzaldehyd (33.1 Mbq/mg) (Amersham International, UK) wie in Halbwirth et al. (2006) [Plant Science 170 (2006) 587-595] beschrieben synthetisiert. Die Synthesen von
[14C]Naringenin (NAR), [ 14C] Dihydrokaempferol (DHK),
[14C]Kaempferol (KAM) und [14C] Apigenin (API) wurden gemäß Halbwirth and Stich (2008) [Phytochemistry 67 (2006) 1080-1087] durchgeführt: Für die Naringeninsynthese wurden [2-14C]Malonyl- coenzym A (55 mCi/mmol) (Amersham International, UK) und rekom- binante Chalkonsynthase verwendet, und die anschließenden Synthesen von DHK, KAM und API wurden jeweils mit rekombinanter Flavanon-3-Hydroxylase aus Malus domestica, rekombinanter
Flavonol-Synthase aus Rudbeckia hirta und mikrosomalen Enzympräparationen mit hoher Flavon-Synthasell-Aktivität aus Dahlia va- riabilis durchgeführt.
Klonierung der Cosmos sulphureus CH3H
Für die cDNA-Synthese wurde mRNA aus den Cosmos sulphureus- Blütenblättern mit dem μMACS mRNA isolation kit (Miltenyi Bio- tec) extrahiert, und die reverse Transkription wurde mit dem Re- vertAid H Minus MuLV reverse transcriptase-Kit (Fermentas Life Science) und dem Oligo(-dT) Anker-Primer GACCACGCGTATCGAT- GTCGAC (T) 16V durchgeführt. Eine RT PCR wurde dann mit den degenerierten Primern TGGMGDATGCTKMGGAARATYTG (forward primer) und GCCCATTCMAYNGTRCTAGATGA (reverse primer) durchgeführt, welche aus den konservierten Regionen folgender Asteraceae-F3' H- Sequenzen aus der NCBI GenBank abgeleitet wurden: Rudbeckia hirta (Acc.-No: FJ216431), Echinops bannaticus (Acc.-No: FJ753549), Centaurea cyanus (Acc.-No: FJ753550) , Gerbera hybrida (Acc.-No: ABA64468), Osteospermum hybrida (Acc.-No: ABB29899) , Cichorium intibus (Acc.-No: FJ753548) und Callistephus chinensis (Acc.-No: AF313488) . Der gesamte , Open Reading Frame' (ORF) wurde dann mit den spezifischen Primern ATGACTATTCTACCCCTACTACTC (forward primer) und CCTTAATGACTTCCATACACGTG (reverse primer) amplifiziert, welche aus den bei der 5'- und 3'-RACE erhaltenen Fragmente ab- geleitet wurden.
Sequenzanalysen und Konstruktion von Chimären Genen
Paarweise und multiple Sequenzalignments wurden mit dem Softwaretool ClustalW durchgeführt, um Regionen zu identifizieren, die die Determinierung der Substratspezifität beeinflussen könnten. Folgende F3' H-Sequenzen, hauptsächlich aus Asteraceae Arten, wurden für multiple Sequenzalignments verwendet: Cosmos sulphureus (Acc.-No: FJ216426), Dahlia variabilis (Acc.-No:
FJ216428), Tagetes erecta (Acc.-No: FJ216430) , Rudbeckia hirta (Acc.-No: FJ216431), Echinops bannaticus (Acc.-No: FJ753549), Centaurea cyanus (Acc.-No: FJ753550), Gerbera hybrida (Acc.-No: ABA64468) , Osteospermum hybrida (Acc.-No: ABB29899) , Cichorium intibus (Acc.-No: FJ753548) , Antirrhinum majus (Acc.-No:
DQ272592) and Arabidopsis thaliana (Acc.-No: AF271651) (Schlangen et al. 2009) . Ein paarweises Sequenzalignment wurde mit der aufgelisteten F3'H aus Cosmos sulphureus (Acc.-No: FJ216426) gemacht. Chimäre Gene, die aus cDNA-Fragmenten der erwähnten F3'H aus Cosmos sulphureus sowie aus cDNA-Fragmenten der neu isolierten Sequenz bestehen, wurden nach Seitz et al . (2007) hergestellt [FEBS letters 581 (2007) 3429-3434] . Dafür wurden die Fragmente, die fusioniert werden sollten, mit einer Pfu DNA po- lymerase (Promega, Germany) in separaten PCR-Reaktionen amplifi- ziert und 10 Minuten in einem Gesamtvolumen von 20 μl mit jeweils ca. 50 ng cDNA von jedem Fragment und einer T4 DNA ligase (Promega, Germany) ligiert. Die verdünnte Ligation wurde als Template für die anschließende proofreading-PCR verwendet, in der das gesamte chimäre Gen mit dem Taq/Pwo Polymerase System (Invitrogen, UK) amplifiziert wurde.
Insertionen oder Deletionen von Aminosäureresten
Insertionen von Aminosäureresten wurden mit Primern eingeführt, die über einen Überhang von Basen verfügen, die für die jeweiligen Aminosäurereste kodieren, die inseriert werden sollten. Deletionen wurden mittels Amplifikation von zwei Fragmenten der jeweiligen F3'H cDNA eingefügt, denen die Basen fehlen, die für die Aminosäurereste kodieren, die deletiert werden sollten. Die anschließende Fusion der beiden amplifizierten Fragmente wurde wie bei der Konstruktion der Chimären Gene beschrieben durchgeführt .
Gezielte Mutagenese
Gezielte Mutagenesen wurden mittels der Megaprimer-PCR durchgeführt. Diese PCR wurde in zwei Schritten gemacht: in der ersten PCR wurde ein Megaprimer mit Pfu DNA Polymerase (Promega) amplifiziert . Dafür wurde das Plasmid mit der inserierten cDNA, die mutiert werden sollte, als Template verwendet. Als Primer wurden einerseits ein interner Primer verwendet, der an der Stelle bindet, in der die gewünschte Mutation eingefügt werden soll, und über die dafür notwendige veränderte Basenabfolge verfügt, sowie ein externer Expressionsprimer . Dieses amplifizierte mutierte Fragment wiederum wurde dann in einer zweiten PCR als Primer zusammen mit dem korrespondierenden Expressionsprimer verwendet, um den gesamten ORF mit den gewünschten Mutationen mit dem xExpand High Fidelity PCR System' (Roche) zu amplifizie- ren .
Heterologe Expression in Hefe
Für die heterologe Expression wurden die Proofreading- Amplikons in den Hefe-Expressionsvektor pYES2. l/V5-His-TOPO® (Invitrogen, UK) ligiert und in E. coli TOPlOF1 (Invitrogen, UK) transformiert. Die Identifizierung der sense-Konstrukte erfolgte mit einer PCR, bei der ein Gen-spezifischer forward- und ein Plasmid-spezifischer reverse-Primer verwendet wurde. Sense- Konstrukte wurden isoliert und die richtige Sequenz durch Sequenzierung bestätigt. Gewünschte Plasmide wurden dann in den Hefestamm INVSc 1 (Invitrogen, UK) transformiert. Die heterologe Expression wurde nach in der Wissenschaft bekannten Methoden durchgeführt und die präparierten Proteine wurden in flüssigem Stickstoff schockgefroren und bei -8O0C gelagert. -Die Proteinmenge in den Präparationen wurde nach einer modifizierten Lowry Methode durchgeführt.
Enzym-Assays und Identifizierung der Produkte
Um die Substratspezifität der heterolog exprimierten F3'Hs zu bestimmen, wurden folgende Enzymtests durchgeführt: 20 μg der rekombinanten Wildtyp CH3H bzw. 50 μg der Hybrid-Proteine wurden mit 0,25 nmol [14C] -markierten Chalkon- oder Flavonoid- Substraten in Anwesenheit von 10 mM NADPH und 0,1 M KH2PO4- K2HPO4 (mit 0,4% Na-Ascorbat, pH: 7, 5) -Puffer bei 300C inkubiert. Nach 30 min wurden die enzymatischen Reaktionen mit 10 μl Eisessig gestoppt und die phenolischen Verbindungen zweifach mit EtOAc extrahiert. Die organischen Phasen wurden auf Cellulose- platten aufgetragen und in CAW (Chloroform:Eisessig:Wasser, 10:9:1) chromatographiert . Detektion und Quantifizierung der Ra- dioaktivitat erfolgte mittels TLC Analyse.
Kinetische Daten
Kinetische Daten (scheinbare Michaelis-Konstante (Km) und maximale Reaktionsgeschwindigkeit (Vmax) ) wurden mittels Line- weaver-Burk-Geraden bestimmt.
Ergebnisse
Klonierung und Sequenzanalyse der Cosmos sulphureus CH3H cDNA
In diesem Beispiel konnte die komplette codierende Sequenz einer cDNA aus Cosmos sulphureus mithilfe von degenerierten Primern aus verschiedenen Asteraceae Arten (NCBI GenBank Acc-Nos: FJ216431, FJ753549, FJ753550, ABA64468, ABB29899, FJ753548 und AF313488) und anschließenden RACE-Techniken isoliert werden. Die abgeleitete Aminosäuresequenz dieses Klons verfügt über alle konservierten Motive von membrangebundenen CytP450-Proteinen (wie den N-terminalen hydrophoben Membrananker, die hochkonservierte Häm-Domäne usw.)- Die Sequenz dieses cDNA-Klons wurde in die EMBL/GenBank-Datenbanken unter der folgenden Accession- Number eingetragen: FJ216429. Alignments mit F3'H-Sequenzen, hauptsächlich aus Asteraceae-Arten, welche nicht oder nur im geringen Ausmaß in der Lage sind, Chalkone zu hydroxylieren, zeigen, dass die abgeleitete Aminosäuresequenz von der isolierten cDNA aus Cosmos sulphureus hohe Sequenzidentitäten mit den alig- nierten F3'Hs aufweist. Das paarweise Alignment mit der schon charakterisierten F3'H aus Cosmos sulphureus (Acc.-No: FJ216426) zeigt, dass diese beiden Sequenzen nicht identisch sind und über eine Sequenzidentität von 84% verfügen (Fig. 1) .
Enzymaktivitäten der putativen Cosmos sulphureus CH3H
In enzymatischen Studien mit dem rekombinanten Enzym, welches bei der heterologen Expression des cDNA-Klons aus Cosmos sulphureus gewonnen wurde, konnten hohe katalytische CH3H- Aktivitäten mit dem 6 ' -Deoxychalkon Isoliquiritigenin gezeigt werden. Kinetische Studien zeigten, dass der höchste Vmax/Km (18,01/s*kg) mit Iso als Substrat beobachtbar ist (Tabelle 1).
Deshalb wurde dieses Protein aus Cosmos sulphureus CH3H genannt. Zum Vergleich wurde die rekombinante F3'H aus Cosmos sulphureus (Accession No: FJ216426) mit den gleichen Substraten getestet. Diese Tests bestätigten die F3'H-Aktivität und die fehlende CH3H-Aktivität dieses Enzyms. Die ümsatzraten der beiden rekombinanten Proteine sind in Fig. 4 aufgelistet. Identifizierung von Regionen, die bei der CH3H-Reaktion eine Rolle spielen konnten
Um Regionen zu identifizieren, die bei der CH3H Aktivität in C. sulphureus CH3H eine Rolle spielen konnten, wurden Alignment Studien durchgeführt. Dabei wurden die bereits erwähnten F3'H Aminosauresequenzen verwendet, deren rekombmante Enzyme nicht in der Lage sind, Chalkone zu hydroxylieren (Schlangen et al . 2009, Plant Science 177 (2009) 97-102) . Bei Analyse des Alignments konnte festgestellt werden, dass eine Region, die als putative Substraterkennungsregion (SRSl) in CytP450 Enzymen von Gotoh (1992) beschrieben wurde, in der CH3H-Sequenz von C. sulphureus auffallige Unterschiede zu den jeweiligen SRSl-Regionen der anderen F3' H-Aminosauresequenzen aufweist. Weiters kann in der Cosmos sulphureus CH3H Sequenz eine Region D (192) GSAGGDP (199) detektiert werden, die nur in dieser Aminosauresequenz vorhanden ist (Fig. 2). Im paarweisen Alignment mit der C. sulphureus F3 ' H kann man sehen, dass die CH3H eine Insertion von vier Aminosau- reresten verglichen mit der F3'H aufweist (SAGG-Region, Fig. 1), und die benachbarten Reste der inserierten vier Aminosaurereste sind auch unterschiedlich in der CH3H (SAGG+N-Region, Fig. 1) .
Konstruktion von chimaren Genen
Um identifizieren zu können, ob die auffalligen Regionen, die in den Alignments gefunden wurden, einen Einfluss auf die CH3H-Aktivitat haben, wurden fünf chimare Gene konstruiert, die C. sulphureus CH3H und C. sulphureus F3'H cDNA Fragmente enthalten (C1-C5, Fig. 4 und 5): Cl: Aminosaurepositionen 1-196: F3'H und 201-512: CH3H; C2 : Aminosaurepositionen 1-210: CH3H und 211- 512: F3'H; C3 : Aminosaurepositionen 1-119: CH3H und 124-512:
F3'H; C4: Aminosaurepositionen 1-193: CH3H und 198-512: F3'H. Die Aminosaurepositionen basieren auf dem paarweisen Alignment von C. sulphureus F3'H and CH3H. Alle Primer, die für die Herstellung der chimaren Gene verwendet wurden, sind in Fig. 5 aufgelistet, und eine schematische Darstellung der chimaren Gene ist in Fig. 4 dargestellt.
Konstruktion von mutierten cDNAs mit Insertionen und Deleti- onen
Gezielte Mutagenese
Aufgrund der besonderen Eigenschaften der Aminosäure Prolin (Prolin ist ein Helix- und Faltblattbrecher und wird häufig in Loops oder Turns gefunden) wurde P199 aus der SAGG+N-Region in A199 gemäß dem Alanin, welches in der Cosmos sulphureus F3'H Sequenz an dieser Position gefunden werden kann, (Fig. 1), mutiert. Die dafür verwendeten Primer und eine schematische Darstellung können jeweils in Tabelle 3 und Fig. 4 gefunden werden.
Enzym-Aktivitaten der heterolog exprimierten chimaren und mutierten Enzyme
Insgesamt wurden zwei native Enzyme aus C. sulphureus als auch fünf chimare (C1-C5) und drei mutierte Enzyme (Ml, M2 und M3, Fig. 4) heterolog in Hefe exprimiert. Studien mit den rekom- binanten Enzymen bezüglich ihrer Substratakzeptanz zeigten, dass alle exprimierten Enzyme außer M3 F3'H-Aktivitat besitzen (Fig. 4) . Die Hydroxylierung von Chalkonen konnte jedoch nur mit den chimaren Genen Cl, C2 und C5 als auch mit Ml beobachtet werden. Mit dem rekombinanten Enzym Cl konnte jedoch nur eine geringe CH3H-Aktivitat, verglichen mit der F3'H-Aktivitat und der CH3H- Aktivitat der anderen rekombinanten Enzyme, beobachtet werden.
Um kinetische Daten mit verschiedenen Substraten zu bestimmen, wurden kinetische Studien mit den rekombinanten Enzymen durchgeführt. Diese kinetischen Daten sind in Tabelle 1 aufge¬ listet.
Beispiel 2 :
Die Herstellung von transgenen Apfelbäumen erfolgt durch
Transformation von jungen Apfelblattern mittels Agrobakterium, wie in der Literatur beschrieben (Szankowski et al; Plant Cell Rep 2003, 22 141-149) . Die Pflanzen werden im Gewachshaus als selbstbewurzelte Pflanzen oder aufgepropft auf eine herkömmliche Unterlage unter Freilandlicht-ahnlichen Bedingungen getestet. Die Blatter werden auf einen erhöhten 3-Hydroxyphloretmgehalt mittels HPLC untersucht, beispielsweise nach der Methode von Sa- to et al., 2001 (Plant Science 160, 229-336). Ein Zusammenhang zwischen Pathogenabwehr und 3-Hydroxyphloretm ist aus der Literatur bekannt (Elstner, E. F., Oßwald, W., Schneider, I., 1996. Phytopathologie. Allgemeine und biochemische Grundlagen. Spektrum Akademischer Verlag, Heidelberg, Berlin, Oxford.). Eine erhöhte Resistenz gegen Erwinia amylovora der transgenen Apfel, die das erfindungsgemaße Nukleotid uberexprimieren, kann folgendermaßen getestet werden: Die Sprossen werden 3-4 Wochen vor der Testung auf eine Hohe von 10 cm zuruckgeschnitten . Die Bakterien werden auf King 's B-Agarplatten für 24 h angezogen und anschließend in Phosphatpuffer resuspendiert. Die Zellkonzentration wird spektrophotometrisch auf 107 cfu/ml eingestellt. Als Negativkontrolle wird Phosphatpuffer auf leere King's B-Agarplatten geleert und wieder dekantiert. Zur Inokulation werden die Blattspitzen der beiden jüngsten, entfalteten Blätter mit einer Schere abgeschnitten, die zuvor in eine Kulturlösung mit dem Erreger getaucht wurde. Pro transgener Linie werden 10-20 Individuen getestet und mit der Kontrolle verglichen. Der Infektionsgrad wird aus dem Verhältnis der Länge des geschädigten Triebs im Vergleich zur Gesamttrieblänge berechnet.

Claims

Patentansprüche :
1. Isoliertes Nukleinsäuremolekül, umfassend eine Nukleotidse- quenz, welche für ein Polypeptid mit Chalkon 3-Hydroxylase- Aktivität kodiert, wobei die Nukleotidsequenz SEQ ID Nr. 1 um- fasst oder mindestens 60% Identität zu SEQ ID Nr. 1 aufweist o- der in der Lage ist mit einem Molekül umfassend die Sequenz aus SEQ ID Nr. 1 zu hybridisieren, wobei die Nukleotidsequenz für ein Polypeptid kodiert, welches das Motiv FAS-
RPLSXiX2G (X3) m (GSAGGD) n umfasst, wobei X1 Threonin oder Serin, X2 Alanin oder Glycin, X3 eine beliebige Aminosäuresequenz mit 50- 200 Aminosäuren und n 0 oder 1 ist.
2. Nukleinsäuremolekül nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass das Motiv FASRPLSTAG (X3)m (GSAGGD) n oder FASRPLS-
SGG (X3)m (GSAGGD)n ist.
3. Vektor umfassend ein Nukleinsäuremolekül gemäß Anspruch 1 o- der 2.
4. Zelle, insbesondere Pflanzenzelle, umfassend ein Nukleinsäuremolekül gemäß Anspruch 1 oder 2 oder einen Vektor gemäß Anspruch 3.
5. Transgene Pflanze umfassend ein Nukleinsäuremolekül gemäß Anspruch 1 oder 2 oder einen Vektor gemäß Anspruch 3.
6. Transgene Pflanze nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, dass die Pflanze ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Zierpflanzen, insbesondere Petunien, Usambaraveilchen, Azaleen, Rhododendren, Pelargonien, Fuchsien, Cyclamen, Weihnachtssterne, Antirrhinum, Aster (Asteraceae) , Begonia (Begoniaceae) , Callis- tephus (Asteraceae) , Campanula (Campanulaceae) , Catharanthus (Apocynaceae) , Chrysanthemum (Asteraceae) , Cineraria (Asteraceae) , Dedanthremum (Asteraceae) , Dianthus (Caryophyllaceae) , Dahlia (Asteraceae) , Euphorbia (Euphorbiaceae) , Gerbera (Asteraceae) , Hydrangea (Hydrangeaceae) , Lilium (Liliaceae) , Lisian- thus (= Eustoma (Gentianaceae) ) , Myosotis (Boraginaceae) ,
Nierembergia (Solanaceae) , Orchidaceae, Osteospermum (Asteraceae) , Rosa (Rosaceae). , Scaevola (Goodeniaceae) , Sinningia (Ge- sneriaceae) , Streptocarpus (Gesneriaceae) , Torenia (Linderni- aceae) , Tulipa (Liliaceae) , Verbena (Verbenaceae) , Veronica (Plantaginaceae) , Viola (Violaceae) und Malus sp ..
7. Schnittblume oder Samen einer transgenen Pflanze nach Anspruch 5 oder 6.
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