MXPA03003854A

MXPA03003854A - Identificacion y caracterizacion de un mutante de antocianina (ant1) en jitomate.

Info

Publication number: MXPA03003854A
Application number: MXPA03003854A
Authority: MX
Inventors: Alex Liu
Original assignee: Exelixis Plant Sciences Inc
Priority date: 2000-10-30
Filing date: 2001-10-29
Publication date: 2004-10-15
Also published as: WO2002055658A2; EP1330517A4; WO2002055658A3; US7034138B2; US20020133848A1; JP2004517621A; EP1330517A2; EP1330517B1; CN1473195A; JP4150590B2; NZ526084A; ATE408009T1; DE60135770D1; CA2426163A1

Abstract

La presente invencion se dirige a un nuevo fenotipo de planta, designado Antocianina (Ant1), una secuencia de acido nucleico expresada en plantas que demuestran el fenotipo de ANT1 y la secuencia de aminoacido correspondiente. Tambien se proporcionan celulas de planta que muestran expresion de ANT1 modificada.

Description

IDENTIFICACIÓN Y CARACTERIZACIÓN DE UN MUTANTE DE ANTOCIANINA (ANT1 ) EN JITOMATE REFERENCIA A SOLICITUDES RELACIONADAS Esta Solicitud reivindica la prioridad a la solicitud de patente provisional No. de serie 60/244,685, presentada el 30 de Octubre del 2000, el contenido de la cual se incorpora en la presente en su totalidad.

CAMPO DE LA INVENCIÓN La presente invención se refiere a un fenotipo de planta, designado Antocianina 1 (ANT1), junto con secuencias de polipéptido y ADN asociadas con el mismo.

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN Los métodos tradicionales para el descubrimiento de gén , incluyendo mutagénesis química, irradiación e inserción de T-ADN , utilizados para seleccionar la pérdida de función de mutantes, tienen limitaciones. Los métodos mutagénicos tales como estos raramente identifican genes que sean innecesarios en el genoma, y la caracterización de gen es consumidora de tiempo y laboriosa. El mareaje de activación es un método mediante el cual los genes se regulan fuertemente y al azar sobre una escala amplia de genoma, después de lo cual los fenotipos específicos se seleccionan y se eligen. El aislamiento de mutantes por mareaje de activación se ha reportado (Hayashi et al. , 1992) . Una construcción de mareaje de T-ADN de activación se utilizó para activar los genes en el cultivo de célula de tabaco permitiendo a las células crecer en la ausencia de hormonas de crecimiento de planta (Walden et al., 1994). Los genes se han aislado de las secuencias genómicas de planta que flanquean la marca de T-ADN y se asignan putativamente a las respuestas de hormona de crecimiento de planta (Ver, por ejemplo, Miklashevichs et al., 1997, Harling et al. , 1 997; Walden et al. , 1 994; y Schell et al. , 1998, que discute estudios relacionados). El primer gen caracterizado en Arabidopsls utilizando el mareaje de activación fue un gen que codifica la quinasa de histona incluida en la trayectoria de transducción de señal de citoquinina. La secuencia de gen se aisló del ADN genómico de planta mediante rescate de plásmido y el papel del gen, CKI1, en las respuestas de citoquinina en plantas se confirmó mediante la reintroducción en Arabidopsis (Kakimoto, 1996) . Esto se siguió por reportes de los diversos mutantes dominantes tales como TINY, LHY, y SH I utilizando un procedimiento similar junto con el elemento transposable Ds (Wilson et al. , 1 996, Shaffer et al. , 1 998, Fridborg et al. , 1999) . En un reporte más actual, el mareaje de T-ADN de activación y la selección de plantas para un fenotipo de floración temprana condujeron al aislamiento del gen FT (Kardailsky et al. , 1999). La aplicación potencial del mareaje de activación como un tecnología de alto rendimiento para el descubrimiento de gen, se ha demostrado en base a la selección de diversos genes mutantes dominantes en trayectorias de fotorreceptor, brasinosteroide, giberelina y señal de floración, así como también resistencia a la enfermedad. (Ver, por ejemplo, Weigel et al., 2000, Christensen et al. , 1998; Kardailsky et al. , 1999). La Arabidopsis se ha utilizado ampliamente como un modelo para la mejora de planta para las plantas tales como especie Brassica que tienen un tipo de silicuas de fruto. Sin embargo, la Arabidopsis no sirve como un modelo para plantas que tienen un fruto carnoso. Un método para identificar y caracterizar los genes en base a la expresión de gen modificada en plantas frutales se describe en la solicitud PCT WO0053794. Las variedades de frutal enano de las plantas frutales, particularmente variedades de frutal enano de jitomate, son útiles en la sobre expresión de uno o más genes de planta nativos en correlación a aquella sobre expresión con un fenotipo particular. Los jitomates de frutal enano se caracterizan por sus cortos entrenudos, que dan a las plantas una apariencia compacta. El cultivo miniatura Lycopersicon esculentum, Micro-Tom es una planta proporcionalmente enana que crece a alta densidad (hasta 1357 plantas/m" 2), tienen un ciclo corto de vida (70-80 días desde el sembrado hasta la maduración de fruto), y para cuyo tamaño de fruto, y tamaño de hoja se han reducido genéticamente (Meissner eí al. , 1997; Scott y Harbaugh, 1989). Además, Micro-Tom se ha mostrado que es resistente a un número de enfermedades y puede transformarse en frecuencias de hasta 80% a través de la transformación mediada por Agrobacterium de cotiledones (Meissner eí al., 1997). Similar al Micro-Tom, Florida Petite (Fia. Agr. Expt. Sta. Circ. S-285), Tim Pequeño y Cría Pequeña son variedades de frutal enano de jitomate que tienen un ciclo corto de vida, y para cuyo tamaño de fruto, y tamaño de hoja se han reducido genéticamente. Los esfuerzos se superan en ia industria y en la academia para desarrollar un medio para identificar genes asociados con características de planta particulares a fin de desarrollar plantas mejoradas que tienen tales características. La presente invención proporciona un fenotipo de planta asociado con la expresión modificada de un gen de planta nativo. En una selección de mareaje de activación en Micro-Tom, identificamos un gen incluido en la producción de pigmento. Las antocianinas son pigmentos que son responsables por varios de los colores, azul y rojo, en plantas. La base genética de la biosíntesis de antocianina se ha caracterizado bien en maíz, Petunia, y Antirrinio (Dooner et al. , 1991 ; Jayaram y Peterson, 1990; Quattrocchio F et al. , 1999).

BREVE DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN La invención proporciona secuencias de aminoácido y ácido nucleico asociadas con el fenotipo Antocianina 1 ("ANT1") en plantas, presentado como hoja modificada, color de fruta o flor. En un aspecto, la invención proporciona una o más secuencias de ácido nucleico de ANT1 aisladas comprendiendo una secuencia de ácido nucleico que codifica o es complementaria a una secuencia que codifica un polipéptido de ANT1 que tiene al menos 70%, 80%, 90% o más identidad de secuencia para la secuencia de aminoácido presentada como SEQ ID NO: 2. En otro aspecto, el polinucleótido comprende una secuencia de ácido nucleico que hibridiza, bajo condiciones rigurosas bajas, medias o altas, a la secuencia de ácido nucleico, o fragmento de la misma, presentada como SEQ ID NO: 1 , o el complemento de la misma. En un aspecto relacionado, la expresión de uno o más de tales polinucleótidos de ANT1 en una planta se asocia con el fenotipo de ANT1. La invención además proporciona vectores de transformación de planta, células de planta, partes de planta y plantas que comprenden una secuencia de ácido nucleico de ANT1. La expresión de tal secuencia de ácido nucleico de ANT1 en una planta se asocia con el fenotipo de ANT1, presentada como una hoja modificada, fenotipo de color de fruto o flor. La expresión de una secuencia de ácido nucleico de ANT1 puede modificares en plantas ornamentales, plantas que producen vegetales y fruto, plantas que producen el grano, plantas petrolíferas, y plantas que producen nueces, así como también otras plantas forrajeras, dando como resultado el fenotipo de ANT1. En un aspecto más, la invención proporciona un método para modificar el fenotipo de ANT1 en una planta al introducir una secuencia de ácido nucleico de ANT1 en células progenitoras de planta y al crecer las células para producir una planta transgénica.

DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN Al menos que se indique de otra forma, todos los términos científicos y técnicos utilizados en la presente tienen el mismo significado que tendrían para un experto en la materia de la presente invención. Los practicantes se dirigen particularmente a Sambrook et al., 1989, y Ausubel F et al., 1993, para las definiciones y términos de la materia. Se entiende que esta invención no se limita a la metodología en particular, protocolos, y reactivos descritos, a medida que estos pueden variar. Todas las publicaciones citadas en la presente, y listadas abajo inmediatamente después de los ejemplos, se incorporan expresamente en la presente para referencia para el propósito de describir las composiciones y metodologías que podrían utilizarse en relación con la invención. Todas las patentes citadas, publicaciones de patente, y secuencia y otra información en sitios de red de referencia también se incorporan para referencia. Según se utiliza en la presente, el término "vector" se refiere a una construcción de ácido nucleico designada para transferirse entre diferentes células huésped. Un "vector de expresión" se refiere a un vector que tiene la habilidad de incorporar y expresar fragmentos de ADN heterólogos en una célula ajena. Varios vectores de expresión eucariótica y procariótico se encuentran comercialmente disponibles. La selección de los vectores de expresión adecuada se encuentra dentro del conocimiento de aquellos que tienen experiencia en la materia. Una secuencia o construcción de ácido nucleico "heteróloga" tiene una parte de la secuencia que no es nativa para la célula de planta en la cual se expresa. Lo heterólogo, con respecto a una secuencia de control se refiere a una secuencia de control (es decir, promotor o reforzador) que no funciona en naturaleza para regular el mismo gen, la expresión del cual se regula actualmente. Generalmente, las secuencias de ácido nucleico heterólogas no son endógenas a la célula o parte del genoma en el cual se presentan, y se han agregado a la célula, por infección, transfección, microinyección, electroporación, o lo similar. Una construcción de ácido nucleico "heteróloga" puede contener una combinación de secuencia de control/secuencia codificadora de ADN que es la misma que, o diferente de una combinación de secuencia de control/secuencia codificadora de ADN encontrada en la planta nativa. Según se utiliza en la presente, el término "gen" significa el segmento de ADN incluido en la producción de cadena de polipéptido, que puede o no puede incluir regiones que preceden y siguen la región codificadora, por ejemplo, secuencias "conductoras" o no trasladas 5' (5' UTR) y secuencias "rastreadoras" o 3'UTR, así como también secuencias de intervención (intrones) entre lo segmentos de codificación individuales (exones). Según se utiliza en la presente, "por ciento (%) de identidad de secuencia" con respecto a la secuencia sujeto, o una parte específica de una secuencia sujeto, se define como el porcentaje de nucleótidos o aminoácidos en la secuencia de derivado de candidato idéntica con los nucleótidos o aminoácidos en la secuencia sujeto (o parte específica de la misma), después de alinear las secuencias e introducir aberturas, si es necesario para lograr el por ciento máximo de identidad de secuencia, según se genera por el programa WU-BLAST-2.0a19 (Altschul et al., J. Mol. Biol. (1997) 215:403-410; sitio de red blast.wustl.edu/blast/README.html) con todos los parámetros de búsqueda establecidos para valores de omisión. Los parámetros de HSP S y HSP S2 son valores dinámicos y se establecen por el programa por sí mismo dependiendo de la composición de la secuencia en particular y la composición de la base de datos en particular contra la secuencia de interés que se busca. Un % de valor de identidad se determina por el número de nucleotidos idénticos igualados o aminoácidos divididos por longitud de secuencia para la cual se reporta el por ciento de identidad. El por ciento (%) de similitud de secuencia de aminoácido" se determina al hacer el mismo cálculo como para determinar el % de identidad de secuencia de aminoácido, pero incluyendo las sustituciones de aminoácido conservadoras además de los aminoácidos idénticos en la computación. El término "% de homología" se utiliza intercambiablemente en la presente con el término de "% de identidad". Una secuencia de ácido nucleico se considera por ser "selectivamente hibridizable" a una secuencia de ácido nucleico de referencia si las dos secuencias hibridizan específicamente a otra bajo condiciones de lavado e hibridización de rigurosidad moderada a alta. Las condiciones de hibridización se basan en la temperatura de fundición (Tm) del complejo de unión de ácido nucleico o probeta. Por ejemplo, la "máxima rigurosidad" ocurre típicamente a aproximadamente Tm-5°C (5o abajo de la Tm de la probeta); la "alta rigurosidad" a aproximadamente 5-10° abajo de la Tm; "rigurosidad intermedia" a aproximadamente 10-20° abajo de la Tm de la probeta; y "baja rigurosidad" a aproximadamente 20-25° abajo de la Tm. Funcionalmente, las condiciones de máxima rigurosidad pueden utilizarse para identificar la secuencia que tiene identidad rigurosa o identidad cercana a rigurosa con la probeta de hibridización; mientras que las condiciones de alta rigurosidad se utilizan para identificar secuencias que tienen aproximadamente 80% o más de identidad de secuencia con la probeta. Las condiciones de hibridización de alta rigurosidad y moderada se conocen bien en la materia (ver, por ejemplo, Sambrook, et al. , 1989, Capítulos 9 y 11 , y en Ausubel, F.M. et al., 1993, expresamente incorporados para referencia en la presente). Un ejemplo de condiciones de alta rigurosidad incluye la hibridización a aproximadamente 42°C en 50% de formamida, 5X SSC, 5X de solución de Denhardt, 0.5% de SDS y 100 µ?/??? de ADN de vehículo desnaturalizado seguido por lavado dos veces en 2X SSC y 0.5% de SDS a temperatura ambiente y dos veces adicionales en 0.1X SSC y 0.5% de SDS a 42°C. Según se utiliza en la presente, "recombinante" incluye la referencia a una célula o vector, que se ha modificado por la introducción de una secuencia de ácido nucleico heterologa o que la célula se deriva de la célula así modificada. De esta manera, por ejemplo, las células recombinantes expresan genes que no se encuentran en la forma idéntica dentro de la forma nativa (no recombinante) de la célula o expresan genes nativos que de otra forma se expresan anormalmente, bajo expresarse o no expresarse del todo como resultado de la intervención humana deliberada. Según se utiliza en la presente, los términos "transformada", "establemente transformada", o "transgénica" con referencia a la célula de planta significa que la célula de planta tiene una secuencia de ácido nucleico no nativa (heterologa) integrada en su genoma que se mantiene a través de dos o más generaciones. Según se utiliza en la presente, el término "expresión" se refiere al proceso mediante el cual se produce un polipéptido a base de la secuencia de ácido nucleico de un gen. El proceso incluye tanto la transcripción como la translación. El término "introducida" en el contexto de insertar una secuencia de ácido nucleico en una célula, significa la "transfección", o "transformación", o "transducción" e incluye la referencia a la incorporación de una secuencia de ácido nucleico en una célula procariótica o eucariótica en donde la secuencia de ácido nucleico puede incorporarse en el genoma de la célula (por ejemplo, cromosoma, plásmido, plástido, o ADN mitocondrial), convertido en una réplica autónoma, o expresado transitoriamente (por ejemplo, mARN transfectado). Según se utiliza en la presente, una "célula de planta" se refiere a cualquier célula derivada de una planta, incluyendo células de tejido no diferenciado (por ejemplo, tejido leñoso cicatrizal), así como también semillas de planta, polen, progagulos, y embriones. Según se utiliza en la presente, los términos "nativa" o "tipo silvestre" en relación a una característica de planta dada o fenotipo se refiere a la forma en la cual esa característica o fenotipo se encuentra en la misma variedad de planta en naturaleza. Según se utiliza en la presente, el término "modificada" considerando una característica de planta, se refiere a un cambio en el fenotipo de una planta transgénica en relación a una planta no transgénica, según se encuentra en la naturaleza. Según se utiliza en la presente, el término "??" se refiere a la generación de plantas de la semilla de plantas T0. La generación de ?? es el primer grupo de plantas transformadas que pueden seleccionarse por la aplicación de un agente de selección, por ejemplo, un antibiótico o herbicida, para lo cual, la planta transgénica contiene el gen de resistencia correspondiente. Según se utiliza en la presente, el término "T2" se refiere a la generación de plantas por auto-fertilización de las flores de las plantas Ti , previamente seleccionadas por ser transgénicas. Según se utiliza en la presente, el término "parte de planta" incluye cualquier órgano de planta o tejido incluyendo, sin limitación, semillas, embriones, regiones meristemáticas, tejido leñoso cicatrizal, hojas, raíces, retoños, gametófitos, esporofitos, polen, y microsporas. Las células de planta pueden obtenerse de cualquier órgano de planta o tejido y cultivos preparados de los mismas. La clase de plantas que puede utilizarse en los métodos de la presente invención es generalmente tan amplia como la clase de plantas superiores permisibles para las técnicas de transformación, incluyendo tanto las plantas dicotiledóneas y monocotiledóneas. Según se utiliza en la presente, "planta transgénica" incluye referencia a una planta que comprende dentro de su genoma un polinucleótido heterólogo. Generalmente, el polinucleótido heterólogo se integra establemente dentro del genoma de tal forma que el polinucleótido pasa sobre generaciones sucesivas. El polinucleótido heterólogo puede integrarse en el genoma solo o como parte de una cásete de expresión recombinante. "Transgénica" se utiliza en la presente para incluir cualquier célula, estirpe de célula, tejido leñoso cicatrizal, tejido, parte de planta o planta, el fenotipo de los cuales se ha alterado por la presencia de ácido nucleico heterologo incluyendo aquellas transgénicas inicialmente tan alteradas así como también aquellas creadas por cruces sexuales o propagación asexual de la transgénica inicial. De esta manera, una planta dentro de sus células un polinucleótido heterologo se refiere en la presente a una "planta transgénica". El polinucleótido heterologo puede ya sea integrarse establemente en el genoma, o puede ser extra-cromosomal. Preferentemente, el polinucleótido de la presente invención se integra establemente en el genoma de tal forma que el polinucleótido pasa sobre generaciones sucesivas. El polinucleótido se integra en el genoma solo o como parte de un cásete de expresión recombinante. "Transgénica" se utiliza en la presente para incluir cualquier célula, estirpe de célula, tejido leñoso cicatrizal, tejido, parte de planta o planta, el genotipo de los cuales se ha alterado por la presencia de ácidos nucleicos heterólogos incluyendo aquellas transgénicas inicialmente tan alteradas así como también aquellas creadas por cruces sexuales o propagación asexual de las transgénicas iniciales. Una célula de planta, tejido, órgano, o planta en la cual las construcciones de ADN recombinante que contienen las construcciones de expresión que se han introducido se considera "transformada" "transfectada", o "transgénica". Una planta o célula transformada o transgénica también incluye la sucesión de la célula o planta y la sucesión producida de un programa de reproducción que emplea tal planta transgénica como un pariente en un cruce y que muestra un fenotipo alterado que se da como resultado de la presencia de una secuencia de ácido nucleico recombínante. De aquí en adelante, una planta de la invención incluirá cualquier planta que tenga una célula que contiene una construcción con secuencias de ácido nucleico introducidas, sin considerar si la secuencia se introdujo directamente a través del medio de transformación o se introdujo por transferencia generacional de una célula progenitora que recibió originalmente la construcción por transformación directa. Los términos "Antocianina 1" y "ANT1", según se utilizan en la presente comprenden secuencias de aminoácido y ácido nucleico de Antocianina 1 nativa (ANT1), homólogos, variantes y fragmentos de las mismas. Una molécula de ácido nucleico de ANT1 aislada es una molécula de ácido nucleico de ANT1 que se identifica y se separa de al menos una molécula de ácido nucleico contaminante con la cual se asocia ordinariamente en la fuente natural del ácido nucleico de ANT1. Una molécula de ácido nucleico de ANT1 aislada es diferente en la forma o fijación en la cual se encuentra en la naturaleza. Sin embargo, una molécula de ácido nucleico de ANT1 aislada incluye moléculas de ácido nucleico de ANT1 contenidas en las células que expresan ordinariamente ANT1 en donde, por ejemplo, la molécula de ácido nucleico se encuentra en una ubicación cromosomal diferente de aquella de las céTulas naturales. Según se utiliza en la presente, el término "muíante" con referencia a un gen o secuencia de polinucleótido difiere del gen o secuencia de polinucleótído tipo silvestre correspondiente ya sea en términos de secuencia o expresión, en donde la diferencia contribuye a una característica o fenotipo de planta modificada. En relación a la planta o línea de planta, el término "muíante" se refiere a una planta o línea de planta que tiene un fenotipo o característica de planta modificada, en donde el fenotipo modificado o característica se asocia con la expresión modificada de un gen o secuencia de polinucleótído tipo silvestre. Generalmente, una secuencia de polinucleótído "variante" codifica una secuencia de aminoácido "variante" que se altera por uno o más aminoácidos de la secuencia de polipéptido de referencia. La secuencia de polinucleótído variante puede codificar una secuencia de aminoácido variante que tiene sustituciones "no conservadoras" o "conservadoras". Los polinucleótídos variantes también pueden codificar secuencias de aminoácido variantes que tienen inserciones o supresiones de aminoácido, o ambas. Según se utiliza en la presente, el término "fenotipo" puede utilizarse intercambiablemente con el término "característica". Los términos se refieren a una característica de planta que es fácilmente observable o medible y se da como resultado de la interacción de ía elaboración genética de la planta con el ambiente en el cual se desarrolla. Tal fenotipo incluye cambios químicos en ía elaboración de planta que se da como resultado de la expresión de gen mejorada que puede o no puede dar como resultado cambios morfológicos en la planta, pero que son medibles utilizando técnicas analíticas conocidas por aquellos expertos en la materia.

Según se utiliza en la presente, el término "fenotipo interesante" con referencia a una planta producida por los métodos descritos en la presente se refiere a un fenotipo medible o fácilmente observable demostrado por una planta de generación subsecuente y/o ?? , que no se muestra por una planta que no se ha transformado así (y/o no es la sucesión de una planta que ya se ha transformado) y representa una mejora en la planta. Una "mejora" es una característica que puede mejorar la utilidad de una especie o variedad de planta al proporcionar la planta con la calidad única. Por calidad única se entiende una característica nueva o un cambio para una característica existente de una especie de planta que es un cambio cuantitativo (aumentar o reducir) o un cambio cualitativo en una característica dada. El Gen y Fenotipo de ANT1 identificado. El gen y fenotipo de esta invención se identificaron en una selección utilizando el mareaje de activación. El mareaje de activación es un proceso mediante el cual una construcción de ácido nucleico heteróloga que comprende una secuencia de control de secuencia de ácido nucleico, por ejemplo, un reforzador, se inserta en un genoma de planta. Las secuencias reforzadoras actúan para mejorar (a transcripción de uno o más genes de planta nativa (Ver, por ejemplo, Walden R, ef al. , 1994; Weigel D er a/., 2000). Brevemente, un gran número de plantas de jitomate (Lycopersíum esculentum) cv. Micro-Tom se transformaron con una forma modificada del vector de mareaje de activación pSK!015 (Weigel et al., 2000), que comprende un T-ADN (es decir, la secuencia derivada del plásmído Tí de Agrobacterium tumifaciens que se transfieren a un huésped de célula de planta durante la infección de Agrobacterium) , un elemento reforzador y un gen marcador seleccíonable. La construcción, pAG3202, se describe además en los Ejemplos. Siguiente a la inserción al azar de pAG3202 en el genoma de plantas transformadas, el elemento reforzador puede dar como resultado los genes de regulación en la cercanía de la inserción de T-ADN, generalmente dentro de 5- 1 0 kílobase (kb) de la inserción. En la generación de Ti, las plantas se expusieron al agente selectivo a fin de recuperar específicamente aquellas plantas que expresaron el marcador seleccíonable y por lo tanto hospedaron las inserciones del vector de mareaje de activación. Las plantas transformadas se observaron por fenotipos interesantes, que se identificaron generalmente en morfología, una selección bioquímica, prueba de tolerancia a herbicida, identificación de objetivo herbicida, prueba de resistencia bacteriana o fúngica, prueba de resistencia a nematodo o insecto, selección para tolerancia de tensión, tal como sequía, tolerancia a antibiótico o sal, y características de salida, tales como aceite, almidón , pigmento, o composición de vitamina. La secuencia genómica que rodea la inserción de T-ADN se analiza a fin de identificar genes responsables de los fenotipos interesantes. Los genes responsables de originar tales fenotipos se identifican como objetivos atractivos para la manipulación para agricultura, alimentos, plantas ornamentales, y/o industrias farmacéuticas. Se apreciará que en la mayoría de los casos, cuando un fenotipo modificado se da como resultado de la expresión mejorada de un gen marcado, el fenotipo es dominante. En algunos casos, la expresión mejorada de un gen de planta nativa dado o un fragmento del mismo puede dar como resultado la expresión reducida o inactivación de su homólogo u otro gen de planta nativa, que da como resultado el fenotipo interesante. La inserción de T-ADN también puede dar como resultado la ruptura ("pérdida de función") de un gen de planta nativa, en cuyo caso el fenotipo es generalmente recesivo. La presente invención proporciona una hoja modificada, fenotipo de color de fruto o flor, identificado en líneas de ACTTAG Mico-Tom que se observaron en la etapa de tejido leñoso cicatrizal por tener color púrpura y retoños púrpura. Las plantas púrpura se derivaron de tejido leñoso cicatrizal caulogénico de color púrpura en el cultivo. Las líneas de planta clónales (es decir, retoños adicionales que se originan del mismo tejido leñoso cicatrizal caulogénico de color púrpura o aquellos multiplicados de la primera planta púrpura ya sea en cultivo de tejido o por cortes en el invernadero) se identificaron por tener coloración púrpura en hojas, sépalos y flores. Las plantas también se observaron por mostrar un color de fruto modificado descrito como un color rojo más profundo en relación a las plantas Micro-Tom tipo silvestre. El fenotipo y el gen asociado se han designado Antocianina 1 ("ANT1"). La invención también proporciona una secuencia de ácido nucleico aislada y nuevamente aislada que se identificó por análisis de la secuencia de ADN genómico que rodea la inserción de T-ADN correlacionándose con el fenotipo de ANT1. En particular, los solicitantes han identificado y caracterizado la estructura de lectura abierta del gen de ANT1 , que se sobre expresa específicamente en plantas que tienen e\ fenotipo de ANT1, y que se proporciona en la SEQ I D NO: 1 . Una descripción detallada del aislamiento y caracterización de ANT1 se establece en los Ejemplos. Composiciones de la Invención Ácidos Nucleicos de ANT1 El gen de ANT1 puede utilizarse en el desarrollo de plantas transgénicas que tienen un fenotipo deseado. Esto puede lograrse utilizando la secuencia de ANT1 nativa, una secuencia de ANT1 variante o un homólogo o fragmento de la misma. Una secuencia de ácido nucleico de ANT1 de esta invención puede ser una secuencia de ARN o ADN , derivada de ADN genómico, cADN o mARN. La secuencia de ácido nucleico puede clonarse, por ejemplo, al aislar el ADN genómico de una fuente adecuada, y amplificar y clonar la secuencia de interés utilizando PCR. Alternativamente, la secuencia de ácido nucleico puede sintetizarse, ya sea completamente o en parte, especialmente en donde es deseable proporcionar secuencias preferidas de planta. De esta manera, toda o parte del gen estructural deseado (aquella parte del gen que codifica un polipéptido o proteína) puede sintetizarse utilizando los codones preferidos por un huésped seleccionado. La invención proporciona un polinucleótido que comprende una secuencia de ácido nucleico que codifica o es complementaria a una secuencia que codifica un polipéptido de ANT1 que tiene la secuencia de aminoácido presentada en SEQ I D NO: 2 y una secuencia de polinucleótido idéntica sobre su longitud completa de la secuencia de ácido nucleico de ANT1 presentada en SEQ ID NO: 1. La invención también proporciona la secuencia codificadora para el polipéptido de ANT1 maduro, una variante o fragmento de la misma, así como también la secuencia codificadora para el polipéptido maduro o un fragmento de la misma en una estructura de lectura con otras secuencias codificadoras, tales como aquellas que codifican una secuencia secretora o rastreadora, una secuencia de proteína pre-, pro-, o prepro- Un polínucleótído de ANT1 también puede incluir secuencias no codificadoras, incluyendo por ejemplo, pero no limitándose a, secuencias no codificadoras 5' y 3', tales como secuencias no trasladadas, transcritas, señales de terminación, sitios de unión de ribosoma, secuencias que estabilizan el mARN , intrones, señales de poliadenilación, y secuencia codificadora adicional que codifica aminoácidos adicionales. Por ejemplo, una secuencia marcadora puede incluirse para facilitar la purificación del polipéptido fusionado. Los polinucleótidos de la presente invención también incluyen polinucleótidos aislados que comprenden un gen estructural y las secuencias naturalmente asociadas que controlan la expresión de gen. Cuando un polinucleótido aislado de la invención comprende una secuencia de ácido nucleico de ANT1 flanqueada por una secuencia de ácido nucleico de no-ANT1 , la longitud total del polinucleótido combinado es típicamente menor a 25 kb, y usualmente menor a 20 kb, o 15 kb, y en alguno casos menor a 10 kb, o 5 kb. Además de las secuencias de polipéptido correspondientes y ácido nucleico de ANT1 descritas en la presente, se contempla que las variantes de ANT1 pueden prepararse. Las variantes de ANT1 pueden prepararse al introducir cambios de polinucleótido adecuados en la secuencia de ácido nucleico de ANT1; por síntesis del polipéptido de ANT1 deseado o al alterar el nivel de expresión del gen de ANT1 en plantas. Aquellos expertos en la materia apreciarán que los cambios de aminoácido pueden alterar el procesamiento post-transiacíonal del polipéptido de ANT1 , tal como el cambiar el número o posición de sitios de glicosilación o alterar las características de soporte de membrana. En un aspecto, las secuencias codificadoras de ANT1 preferidas incluyen un polinucleótido que comprende una secuencia de aminoácido que codifica o es complementaria a una secuencia que codifica un polipéptido de ANT1 que tiene al menos 50%, 60%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% o más identidad de secuencia a la secuencia de aminoácido presentada en SEQ ID NO: 2. En otro aspecto, las variantes preferidas incluyen una secuencia de polinucleótido de ANT1 que es al menos 50% a 60% idéntica sobre su longitud completa a la secuencia de ácido nucleico de ANT1 presentada como SEQ ID NO: 1 , y las secuencias de ácido nucleico que son complementarias a tal secuencia de ANT1. Más preferentemente, las secuencias de polinucleótido de ANT1 comprenden una región que tiene al menos 70%, 80%, 85%, 90% o 95% o más identidad de secuencia a la secuencia de ANT1 presentada como SEQ ID NO: 1. En un aspecto relacionado, las variantes preferidas incluyen polinucleótidos que son "selectivamente hibridizable" a la secuencia de polinucleótido de ANT1 presentada como SEQ ID NO: 1 . Las variantes de secuencia también incluyen moléculas de ácido nucleico que codifican el mismo polípéptido según se codifica por la secuencia de polinucleótido de ANT1 descrita en la presente. De esta manera, cuando la estructura codificadora o una molécula de ácido nucleico identificado se conoce, por ejemplo, mediante homología para saber los genes o por extensión de la secuencia, se aprecia que como resultado de la degeneración del código genético, un número de secuencias codificadoras puede producirse. Por ejemplo, el tripleto CGT codifica la arginina de aminoácido. La arginina se codifica alternativamente por CGA, CGC, CGG, AGA, y AGG. Por lo tanto, se aprecia que tales sustituciones en la región codificadora caen dentro de las variantes de secuencia que se cubren por la presente invención. Cualquiera y todas estas variantes de secuencia pueden utilizarse en la misma manera según se describe en la presente para la secuencia principal de ANT1 identificada, SEQ I D NO: 1 . Se aprecia más que tales variantes de secuencia pueden o no pueden hibridizar selectivamente a la secuencia principal. Esto podría ser posible, por ejemplo, cuando la variante de secuencia incluye un codón diferente para cada uno de los aminoácidos codificados por el nucleotido principal. Tales variantes, sin embargo, se contemplan específicamente y se comprenden por la presente invención. De acuerdo con la presente invención, también se comprenden las secuencias que son al menos 70% idénticas a tales variantes de secuencia derivadas por degeneración. A pesar de que las variantes de secuencia de nucleotido de ANT1 son preferentemente capaces de hlbridízar a las secuencias de nucleótido recitadas en la presente bajo condiciones de moderadamente alta o alta rigurosidad, existen, en algunos casos, ventajas para utilizar las variantes en base a la degeneración del código, según se describe anteriormente. Por ejemplo, los codones pueden seleccionarse para aumentar la escala en cuya expresión del péptido ocurre en un organismo eucariótico o procariótico particular, de acuerdo con el uso de codón óptimo dictado por el organismo huésped en particular. Alternativamente, puede ser deseable producir el ARN que tiene vidas medías más largas que el mARN producido por las secuencias recitadas. Las variaciones en la secuencia de ácido nucleico de ANT1 de longitud completa nativa descrita en la presente, pueden hacerse, por ejemplo, utilizando cualquiera de las técnicas y directrices para mutaciones conservadoras y no conservadoras, según se conocen generalmente en la materia, mutagénesís mediada por oligonucleótido (dirigida por sitio), exploración de alanina, y mutagénesís de PCR. La mutagénesís dirigida por sitio (Kunkel TA et al., 1991); mutagénesís de cásete (Crameri A et al. , 1995); mutagénesís de selección de restricción (Haught C et al., 1994), u otras técnicas conocidas pueden realizarse sobre al ADN clonado para producir secuencias de ácido nucleico codificando las variantes de ANT1. Se contempla que las secuencias de gen asociadas con el fenotipo de ANT1 pueden sintetizarse, ya sea completamente o en parte, especialmente en donde es deseable proporcionar secuencias preferidas de huésped. De esta manera, todo o parte del gen estructural deseado (aquella parte del gen que codifica la proteína) puede sintetizarse utilizando codones preferidos por un huésped seleccionado. Los codones preferidos de huésped pueden determinarse, por ejemplo, de los codones utilizados más frecuentemente en las proteínas expresadas en una especie de huésped deseado. Se prefiere que un polinucleótido de ANT1 codifique un polipéptido de ÁNT1 que retiene sustancialmente la misma actividad o función biológica como el polipéptido de ANT1 maduro codificado por el polinucleótido establecido como SEQ ID NO: 1 (es decir, da como resultado el fenotipo de ANT1 cuando se sobre expresa en una planta). Las variantes también incluyen fragmentos del polinucleótido de ANT1 de la invención, que pueden utilizarse para sintetizar un polinucleótido de ANT1 de longitud compfeta. Las modalidades preferidas incluyen polinucleótidos que codifican variantes de polipéptido en donde 5 a 10, 1 a 5, 1 a 3, 2, 1 o ninguno de residuos de aminoácido de una secuencia de polipéptido de ANT1 de la invención se sustituyen, agregan o suprimen, en cualquier combinación. Las sustituciones, adiciones, y supresiones particularmente preferida son silenciosas de tal forma que no alteran las propiedades o actividades del polinucleótido o polipéptido. Una secuencia de polinucleótido que codifica un polipéptido de ANT1 también puede utilizarse para construir probetas de híbridizacíón para mayor análisis genético. La selección de un cADN o biblioteca genómica con la probeta seleccionada puede conducirse utilizando procedimientos estándares, tales como los descritos en Sambrook et al., 1989). Las condiciones de hibridización, incluyendo moderada rigurosidad y alta rigurosidad, se proporcionan en Sambrook, et al., supra. Las probetas o partes de las mismas también pueden emplearse en técnicas PCR para generar un grupo de secuencias para identificación de secuencias de ANT1 precisamente relacionadas. Cuando las secuencias de ANT1 se identifican para utilizarse como probetas, una parte en particular de una secuencia codificadora de ANT1 , por ejemplo, una parte altamente conservada de la secuencia codificadora, puede utilizarse. Por ejemplo, una secuencia de nucleótido de ANT1 puede utilizarse como una probeta de hibridización para una biblioteca de cADN para aislar genes, por ejemplo, aquellos que codifican variantes que ocurren naturalmente de ANT1 de otras especies de planta, que tienen un nivel deseado de identidad de secuencia para la secuencia de nucleótido de ANT1 descrita en SEQ ID NO: 1. Las probetas ejemplares tienen una longitud de aproximadamente 20 a aproximadamente 50 bases. En otro procedimiento ejemplar, un ácido nucleico que codifica un polipéptido de ANT1 puede obtenerse al seleccionar cADN elegido o bibliotecas genómicas que utilizan la secuencia de aminoácido descrita en la presente, y, si es necesario, que utilizan los procedimientos de extensión de carga iniciadora convencionales según se describe en Sambrook et al., supra, para detectar los precursores de ANT1 e intermedios de procesamiento de mARN que pueden no haberse transcrito inversos en cADN. Según se discute anteriormente, las secuencias de ácido nucleico de esta invención pueden incluir secuencia de mARN o cADN , genómica. Por "codificación" se entiende que la secuencia corresponde a una secuencia de aminoácido en particular ya sea en una orientación de antí-sentido o sentido. Por "extracromosomal" se entiende que la secuencia se encuentra fuera del genoma de planta de la cual se asocia naturalmente. Por "recombínante" se entiende que la secuencia contiene una modificación genéticamente elaborada a través de la manipulación por medio de mutagénesis, enzimas de restricción, y lo similar. Una vez que la forma deseada de una secuencia de ácido nucleico de ANT1 , homólogo, variante o fragmento de la misma, se obtiene, puede modificarse en una variedad de maneras. Cuando la secuencia incluye regiones de flanqueo no codificador, las regiones de flanqueo pueden sujetarse a la disecación, mutagénesis, etc. De esta manera, las transiciones, transversiones, supresiones, e inserciones pueden realizarse sobre la secuencia que ocurre naturalmente. Con o sin tal modificación, la forma deseada de la secuencia de ácido nucleico de ANT1, homólogo, variante o fragmento de la misma, puede incorporarse en un vector de expresión de planta para la transformación de células de planta. En una modalidad preferida, la invención proporciona un polipéptido de ANT1, que tiene una secuencia de polipéptido de ANT1 de longitud completa o madura nativa que comprende la secuencia presentada en SEQ ID NO: 2. Un polipéptido de ANT1 de la invención puede ser el polipéptido de ANT1 maduro, parte de una proteína de fusión o un fragmento o variante de la secuencia de polipéptido de ANT1 presentada en SEQ ID NO: 2.

Ordinariamente, el polipéptido de ANT1 de la invención tiene al menos 50% a 60% de identidad a una se'cuencia de aminoácido de ANT1 sobre su longitud completa. Más preferentemente, las secuencias de polipéptido de ANT1 comprenden una región que tiene al menos 70%, 80%, 85%, 90% o 95% o más identidad de secuencia a la secuencia de polipéptido de ANT1 de SEQ ID NO: 2. Los fragmentos y variantes de la secuencia de polipéptido de ANT1 de SEQ ID NO: 2, también se consideran por ser parte de la invención. Un fragmento es un polipéptido variante que tiene una secuencia de aminoácido que es completamente la misma como parte pero no del todo de la secuencia de aminoácido de los polipéptidos previamente descritos. Los fragmentos ejemplares comprenden al menos 10, 20, 30, 40, 50, 75 o 100 aminoácidos contiguos de SEQ ID NO: 2. Los fragmentos pueden ser "autoestables" o comprenderse dentro de un polipéptido más grande del cual el fragmento forma una parte o una región, más preferentemente como una región continua única. Los fragmentos preferidos son fragmentos biológicamente activos, que son aquellos fragmentos que median las actividades de los polipéptidos de la invención, incluyendo aquellos con actividad similar o actividad mejorada o con una actividad reducida. También se incluyen aquellos fragmentos que son antigénícos o inmunogénicos en animal, particularmente un humano. Los polipéptidos de ANT1 de la invención también incluyen polipéptidos que varían de la secuencia de polipéptido de ANT1 de SEQ ID NO: 2. Estas variantes pueden ser variantes sustitutivas, de inserción, o de supresión. Las variantes típicamente muestran la misma actividad biológica cualitativa como el análogo que ocurre naturalmente, a pesar de que las variantes también pueden seleccionarse, las cuales tienen características modificadas según se describe posteriormente. Una "sustitución" se da como resultado del remplazo de uno o más nucleótidos o aminoácidos por diferentes nucleótidos o aminoácidos, respectivamente. Una "inserción" o "adición" es aquel cambio en una secuencia de aminoácido o nucleótido que ha dado como resultado la adición de uno 0 más residuos de aminoácidos o nucleótidos, respectivamente, según se compara a la secuencia que ocurre naturalmente. Una "supresión" se define como un cambio en cualquier secuencia de aminoácido o nucleótido en donde uno o más residuos de aminoácidos o nucleótidos, se ausentan. Las sustituciones de aminoácido son típicamente de residuos únicos; las inserciones usualmente serán en el orden de aproximadamente 1 a 20 aminoácidos, a pesar de que pueden tolerarse inserciones considerablemente más grandes. Las supresiones varían de aproximadamente 1 a aproximadamente 20 residuos, a pesar de que en algunas supresiones pueden ser mucho más grandes. Las sustituciones, supresiones, inserciones o cualquier combinación de las mismas pueden utilizarse para llegar en un derivado final. Generalmente, estos cambios se hacen en pocos aminoácidos para minimizar la alteración de la molécula. Sin embargo, pueden tolerarse grandes cambios en ciertas circunstancias. Las sustituciones de aminoácido pueden dar como resultado el reemplazo de un aminoácido con otro aminoácido que tiene propiedades químicas y/o estructurales similares, tales como el reemplazo de una leucina con una serína, es decir, reemplazos de aminoácido conservadores. Las inserciones o supresiones pueden opcionalmente encontrarse en el rango de 1 a 5 aminoácidos. Las sustituciones generalmente se hacen de acuerdo con las "sustituciones conservadoras" conocidas. Una "sustitución conservadora" se refiere a la sustitución de un aminoácido en una clase por un aminoácido en la misma clase, en donde una clase se define por propiedades de cadena lateral de aminoácido fisicoquímico común y las frecuencias de alta sustitución en proteínas homologas encontradas en ía naturaleza (según se determina, por ejemplo, mediante un aglomerante de intercambio de frecuencia de Dayhoff o aglomerante BLOSUM). (Ver generalmente, Doolittle, R.F., 1986). Una "sustitución no conservadora" se refiere a la sustitución de un aminoácido en una clase con un aminoácido de otra clase. Las variantes de polípéptído de ANT1 muestran típicamente la misma actividad biológica cualitativa como el análogo que ocurre naturalmente, a pesar de que las variantes también se seleccionan para modificar las características del polipéptido de ANT1, según sea necesario. Por ejemplo, los sitios de glicosilacíón, y más particularmente uno o más sitios de glicosilacíón N-unidos u O-unidos pueden alterarse o removerse. Aquellos expertos en la materia apreciarán que los cambios de aminoácido pueden alterar los procesos post-translacionales del polipéptido de ANT1, tal como cambiar el número o posición de los sitios de glicosilacíón o alterar las características de soporte de la membrana. Las variaciones pueden hacerse utilizando métodos conocidos en la materia tal como mutagénesis mediada por oligonucleótido (dirigida de sitio), exploración de alanina, y mutagénesis de PCR. La mutagénesis dirigida por sitio [Cárter ef al., 1986; Zoller et al. , 1987], mutagénesis de cásete [Wells et al. , 1985]; mutagénesis de selección de restricción [Wells et al., 1986] u otras técnicas conocidas pueden realizarse sobre al ADN clonado para producir secuencias de ácido nucleico codificando las variantes de ANT1. También incluidos dentro de la definición de polipéptidos de ANT1 se encuentran otros relacionados a los polipéptidos de ANT1. De esta manera, las secuencias de carga iniciadora de PCR degenerado o probeta pueden utilizarse para encontrar otros polipéptidos relacionados. Las secuencias de carga iniciadora o probeta pueden diseñarse para toda o parte de la secuencia de polipéptido de ANT1 , o las secuencias fuera de la región codificadora. Como se sabe generalmente en la materia, las cargas iniciadoras de PCR preferida son desde aproximadamente 15 a aproximadamente 35 nucleótidos en longitud, prefiriéndose con desde aproximadamente 20 a aproximadamente 30, y pueden contener inosina según sea necesario. Las condiciones para la reacción de PCR se conocen generalmente en la materia. Las modificaciones covalentes de los polipéptidos de ANT1 también se incluyen dentro del alcance de esta invención. Por ejemplo, la invención proporciona los polipéptidos de ANT1 que son una proteína madura y pueden comprender aminoácidos terminales de carboxilo o amino adicionales, o aminoácidos dentro del polipéptido maduro (por ejemplo, cuando la forma madura de la proteína tiene más de una cadena de polipéptidos). Tales secuencias pueden, por ejemplo, jugar un papel en el procesamiento de una proteína de una precursora a una forma madura, permitir el transporte de proteína, acortar o alargar la vida media de proteína, o facilitar la manipulación de la proteína en ensayos o producción. Se contempla que las enzimas celulares pueden utilizarse para remover cualquiera de los aminoácidos adicionales de la proteína madura. [Ver, por ejemplo, Creighton, TE, 1983]. En una modalidad preferida, la sobre expresión de un polipéptido de ANT1 o variante del mismo se asocia con el fenotipo de ANT1. Anticuerpos La presente invención además proporciona anticuerpos de polipéptido anti-ANT1. Los anticuerpos pueden ser policlonales, monoclonales, humanizados, anticuerpos biespecíficos o heteroconjugados. Los métodos para preparar anticuerpos policlonales se conocen por el experto en la materia. Tales anticuerpos policlonales pueden producirse en un mamífero, por ejemplo, siguiendo a una o más inyecciones de un agente de inmunización, y preferentemente, un adyuvante. Típicamente, el agente de inmunización y/o adyuvante se inyectará en el mamífero por una serie de inyecciones intraperitoneales o subcutáneas. El agente de inmunización puede incluir un polipéptido de ANT1 o una proteína de fusión del mismo. Puede ser útil conjugar el antígeno en una proteína conocida por ser inmunogénica en el mamífero a inmunizarse. El protocolo de inmunización puede determinarse por un experto en la materia en base a protocolos estándares o por experimentación de rutina. Alternativamente, los anticuerpos de polipéptido ant -ANT1 pueden ser anticuerpos monoclonales. Los anticuerpos monoclonales pueden producirse por hibridomas, en donde un ratón, hámster, u otro animal huésped adecuado, se inmuniza con un agente de inmunización para producir linfocitos que producen o son capaces de producir anticuerpos que se unirán específicamente al agente de inmunización [Kohier et al., 1975]. Los anticuerpos monoclonales también pueden elaborarse por métodos de ADN recombinante, tales como aquellos descritos en la Patente de E. U. No. 4,816,567. Los anticuerpos de polipéptido de ant\-ANT1 de la invención pueden además comprender anticuerpos humanizados o anticuerpos humanos. El término "anticuerpo humano" se refiere a formas humanizadas de anticuerpos no humanos (por ejemplo, murino) que son anticuerpos quiméricos, cadenas de inmunoglobulina o fragmentos de las mismas (tales como Fv, Fab, Fab', F(ab)'2 u otras secuencias parciales de unión de antígeno de anticuerpos) que contienen alguna parte de la secuencia derivada de anticuerpo no humano. Los métodos para humanizar anticuerpos no humanos se conocen bien en la materia, según se detalla más en Jones et al., 1986; iechmann et al., 1988; y Verhoeyen et al. , 1988. Los métodos para producir anticuerpos humanos también se conocen en la materia. Ver, por ejemplo, Jakobovits, A, et al. , 1995; Jakobovits, A, 1995. En un procedimiento ejemplar, los anticuerpos policlonales ant\-ANT1 se utilizan para el aislamiento de gen. El análisis Western blot puede conducirse para determinar ese ANT1 o una proteína relacionada se presenta en un extracto crudo de una especie de planta en particular. Cuando la reactividad se observa, los genes que codifican la proteína pueden aislarse al seleccionar las bibliotecas de expresión representando la especie de planta en particular. Las bibliotecas de expresión pueden construirse en una variedad de vectores comercialmente disponibles, incluyendo lambda gt1 1 , según se describe en Sambrook, et al., 1989. Utilidad del Gen y Fenotipo de ANT1 De lo precedente, puede apreciarse que la secuencia de nucleótido ANT1 , la secuencia de proteína y fenotipo encuentran utilidad en la expresión modulada de la proteína de ANT1 y el desarrollo de fenotipos no nativos asociados con tal expresión modulada. El fenotipo de ANT1 tiene características que distinguen al muíante de las plantas tipo silvestre, incluyendo color de hoja modificado, color de flor modificado y color de fruto modificado. Las antocianinas se conocen por contribuir a color de hoja, color de flor y color de fruto. Las antocianinas son un grupo de flavonoides solubles en agua que imparten de color rosa a púrpura a las hojas y otras órganos (Harbone et al. , 1988). Las antocianinas se han asociado con varias funciones de desarrollo y fisiológicas importantes en las plantas, incluyendo, pero no limitándose a: (1) modificación de la cantidad y calidad de luz capturada (Barker et al., 1977); (2) protección de los efectos de radiación de UV-B (Burger y Edwards, 1996 y Klaper et al., 1996); (3) defensa contra herbívoros (Coley y Kusar, 1996); (4) protección de fotoinhibición (Gould et al. , 1995 y Dodd et al., 1998); y (5) limpieza de intermedios de oxígeno reactivo en ambientes estresantes (Furuta et al. 1995; Sherwin et al. , 1998; y Yamasaki 1997). Las antocianinas han demostrado actividad anti-oxidante, sugiriendo un papel en protección contra el cáncer, enfermedades del hígado y cardiovasculares (Kamei et al., 1993; Suda et al., 1997; y Wang et al. , 2000). Ver también los sitios de red en www.pslgroup.com/dg/39fb2.htm, www.wellweb.com/nutri/phytochemicals.htm, y www.nal.usda. gov/ttic/tektran/data/000007/1 9/0000071 970.html. Considerando esto, el fenotipo de ANT1 descrito en la presente no solamente es brillante y de aquí en adelante encuentra utilidad en la mejora del valor decorativo de plantas ornamentales, flores y alimentos, así también ofrece el potencial para beneficios de saluda cuando el fenotipo de ANT1 se expresa en variedades de planta utilizadas como aditivos alimenticios o de alimentos. En un aspecto, la hoja modificada, el color de flor y fruto de las plantas que tienen el fenotipo de ANT1 encuentra utilizada en el desarrollo de plantas ornamentales mejoradas, frutas y/o flores cortadas. En otro aspecto, el contenido de antocianina modificada en plantas que tienen el fenotipo de ANT1 encuentra utilidad en los aditivos alimenticios y de alimentados derivados en planta. En otro aspecto, según se describe posteriormente en los Ejemplos, el gen ANT1 tiene utilidad como un marcador de transformación en plantas genéticamente manipuladas. En otro aspecto, según se describe más en los Ejemplos, el gen ANT1 tiene utilidad como un marcador de transformación en plantas genéticamente manipuladas. En la práctica de la invención , el fenotipo de ANT1 y la expresión de ANT1 modificado es generalmente aplicable a cualquier tipo de planta, según se describe posteriormente. Los métodos descritos en la presente son generalmente aplicables para todas las plantas. A pesar de que el mareaje de activación e identificación de gen se llevó a cabo en jitomate, siguiendo la identificación de una secuencia de ácido nucleico y fenotipo asociado, el gen elegido, un homologo, variante o fragmento del mismo, puede expresarse en cualquier tipo de planta. En un aspecto, la invención se dirige a plantas frutales y vegetales. La invención se aplica generalmente a plantas que producen frutos carnosos; por ejemplo, pero no se limitan a, jitomate (Lycopersicum); uva (vitas); fresa (Fragaria); frambuesa, zarzamora, frambuesa americana (Rubus); grosellas y uva crespa (Ribes); vacinio, arándano, anavia, baya de arándano (Vaccinum); kiwi y uva crespa China (Actinida); manzana (Malus); pera (Pyrus); melones (Cucumis sp.) miembros del género Prunus, por ejemplo, ciruelo, cereza, nectarina y durazno; chicozapote (Manilkara zapotilla); mango; aguacate; albaricoque; duraznos; cerezas; piña; papaya; parchita; citrón; palmera de dátiles; plátano; e higo. De igual forma, la invención es aplicable a plantas vegetales, incluyendo, pero no limitándose a, remolachas, habichuelas verdes, brócoli, col de Bruselas, col, apio, acelga, pepinos, berenjenas, pimientas, calabazas, ruibarbo, calabaza de invierno, calabaza de verano, calabacín, lechuga, rábano, zanahoria, alverja, papa, maíz, murraya y hierbas. En un aspecto relacionado, la invención se dirige a la industria de flor cortada, plantas que producen granos, plantas petrolíferas y plantas que producen nueces, así como también otras plantas forrajeras incluyendo, pero no limitándose a, algodón (Gossypium), alfalfa (Medicago sativa), lino (Linum usitatissimum), tabaco (Nicotiana), hierbas para céspedes (familia Poaceae), y otras plantas forrajeras. Las referencias que describen técnicas de transformación adecuadas para estas y otras plantas se enlistan en la Solicitud de Patente No. de Serie 09/846,758. El experto reconocerá que una amplia variedad de técnicas de transformación existen en la materia, y nuevas técnicas se están encontrando continuamente disponibles. Cualquier técnica que es adecuada para la planta huésped objetivo puede emplearse dentro del alcance de la presente invención. Por ejemplo, las construcciones pueden introducirse en una variedad de formas incluyendo, pero no limitándose a, una cepa de ADN, en un plásmido, o en un cromosoma artificial. La introducción de las construcciones en las células planta objetivo puede lograrse por una variedad de técnicas, incluyendo, pero no limitándose a transformación mediada de Agrobacterium, electroporación, microinyección, co-precipitación de calcio-fosfato-ADN de bombardeo de microproyectil o transformación mediada de liposoma de una construcción de ácido nucleico heteróloga que comprende la secuencia codificadora de ANT1. La transformación de la planta es preferentemente permanente, es decir, por integración de las construcciones de expresión introducidas en el genoma de planta huésped, de tal forma que las construcciones introducidas se pasan hacia las generaciones de planta sucesivas. En una modalidad, los sistemas de vector en base de Ti binario, pueden utilizarse para transferir y confirmar la asociación entre expresión mejorada de un gen identificado con un fenotipo o característica de planta en particular. Los vectores binarios de Agrobacterium estándares se conocen por aquellos expertos en la materia y varios se encuentran comercialmente disponibles, tales como pBI121 (Clontech Laboratories, Palo Alto, CA). El procedimiento óptimo para la transformación de plantas con vectores de Agrobacterium variará con el tipo de planta a transformarse. Los métodos ejemplares para la transformación mediada por Agrobacterium incluyen la transformación de explantaciones de hipocotilo, punta de retoño, tallo o tejido de hoja, derivadas de sembrados estériles y/o plantaciones. Tales plantas transformadas pueden reproducirse sexualmente, o por cultivo de tejido o célula. La transformación de agrobacterium se ha descrito previamente por un gran número de diferentes tipos de plantas y los métodos para tal transformación pueden encontrarse en la literatura científica. Dependiendo del uso pretendido, puede elaborarse una construcción de ácido nucleico heterólogo que comprende una secuencia de ácido nucleico asociada con el fenotipo de ANT1, y que codifica la proteína entera, o una parte biológicamente activa de la misma para la transformación de células de planta y generación de plantas transgénicas. La expresión de una secuencia de ácido nucleico de ANT1 o un homólogo, variante o fragmento de la misma puede llevarse a cabo bajo el control de un promotor regulable, inducible o constitutivo. En algunos casos, la expresión de la secuencia de ácido nucleico de ANT1 u homólogo, variante o fragmento de la misma puede regularse en una etapa de desarrollo o manera específica de tejido o asociada de tejido. De acuerdo con lo anterior, la expresión de las secuencias codificadoras de ácido nucleico descritas en la presente puede regularse con respecto al nivel de expresión, el (los) tipo (s) de tejido en donde la expresión tiene lugar y/o la etapa de desarrollo de expresión que conduce a un amplio espectro de aplicaciones en donde la expresión de una secuencia codificadora de ANT1 se modula en una planta. Los promotores fuertes con reforzadores pueden dar como resultado un nivel alto de expresión. Cuando un nivel bajo de actividad básica se desea, un promotor débil puede ser una mejor elección. La expresión de secuencia de ácido nucleico. de ANT1 u homólogo, variante o fragmento de la misma también puede controlarse en el nivel de transcripción, por el uso de promotores específicos de tipo célula o elementos de promotor en el vector de expresión de planta. Los numerosos promotores útiles para la expresión de gen heterólogo se encuentran disponibles. Los promotores constitutivos ejemplares incluyen el promotor de frambuesa E4 (Patentes de E.U. Nos. 5,783,393 y 5,783,394), el 35S CaMV (Jones JD et al., 1992), el promotor CsV V (Verdaguer B. et al., 1998) y el promotor de actina de melón. Los promotores específicos de tejido ejemplares incluyen los promotores E4 y E8 de jitomate (Patente de E.U. No. 5,859,330) y el promotor de gen de jitomate 2AII (Van Haaren MJJ et al., 1993). Cuando las secuencias de ANT1 se pretenden para utilizarse como probetas, una parte en particular de una secuencia codificadora de ANT1 , por ejemplo, una parte altamente conservadora de una secuencia codificadora, puede utilizarse. Todavía en otro aspecto, en algunos casos puede ser deseable inhibir la expresión de secuencias de ANT1 endógenas en una célula huésped. Los métodos ejemplares para practicar este aspecto de la invención incluyen, pero no se limitan a, la supresión anti-sentido (Smith, et al. , 1988); co-supresión (Napoli, et al. , 1989); ribozimas (Publicación de PCT WO 97/10328); y combinaciones de sentido y antisentido (Waterhouse, et al. , 1998). Los métodos para la supresión de secuencias endógenas en una célula huésped típicamente emplean la transcripción o transcripción y translación de al menos una parte de la secuencia a suprimirse. Tales secuencias pueden ser homologas a la codificación así como también regiones no codificadoras de la secuencia endógena. En alguno casos, puede ser deseable inhibir la expresión de la secuencia de nucleótido de ANT1. Esto puede lograrse utilizando procedimientos generalmente empleados por aquellos expertos en la materia con la secuencia de nucleótido de ANT1 proporcionada en la presente. Las pruebas genéticas y moleculares estándares pueden realizarse para analizar la asociación entre un gen clonado y un fenotipo observado. Un número de otras técnicas que son útiles para determinar (pronosticar o confirmar) la función de un gen o producto de gen en plantas, se describen abajo. Análisis de ADN/ARN El ADN tomado de una planta mutante puede secuenciarse para identificar la mutación en el nivel de nucleótido. El fenotipo mutante puede rescatarse al sobre expresar el gen tipo silvestre (WT). Los modelos de expresión de gen específico de tejido y de etapa en mutante vs. líneas WT, por ejemplo, mediante la hibridización in situ, pueden determinarse. El análisis del estado de metilación del gen, especialmente las regiones reguladoras de flanco, puede realizarse. Otras técnicas adecuadas incluyen la sobre expresión, expresión ectópica, expresión en otras especies de planta y combate de gen (genética inversa, combate de objetivo, silencio de gen inducido viral (VIGS, ver Baulcombe D, 1999). En una aplicación preferida, el análisis de microgrupo, también conocido como configuración de transcripción o configuración de expresión, se utiliza para medir simultáneamente diferencias o cambios inducidos en la expresión de varios genes diferentes. Las técnicas para el análisis de microgrupo se conocen bien en la materia (Schena M et al. , Science (1995) 270:467-470; Baldwin D et al., 1999; Dangond F, Physiol Genomics (2000) 2:53-58; van Hal NL et al., J. Biotechnol (2000) 78:271-280; Ríchmond T y Somerville S, Curr Opin Plant Biol. (2000) 3:108-1 16). El análisis de microgrupo de líneas marcadas individuales puede llevarse a cabo, especialmente aquellas de las cuales se han aislado los genes. Tal análisis puede identificar otros genes que se regulan coordinadamente como una consecuencia de la sobre expresión del gen de interés, que puede ayudar a colocar un gen desconocido en una trayectoria en particular. Análisis de Producto de Gen El análisis de productos de gen puede incluir expresión de proteína recombinante, producción de antisuero, inmunolocalización, ensayos bioquímicos para actividad catalítica u otra, análisis de estado de fosforilación, y análisis de interacción con otras proteínas por medio de los ensayos dos híbridos de levadura. Análisis de Trayectoria El análisis de trayectoria puede incluir colocar un gen o producto de gen dentro de una trayectoria de señalización o bioquímica en base a su fenotipo de sobre expresión o por homología de secuencia con genes relacionado. Alternativamente, el análisis puede comprender cruces genéticas con líneas WT y otras líneas mutantes (creando mutantes dobles) para ordenar el gen en una trayectoria, o determinar el efecto de una mutación sobre la expresión de genes "reportadores" aguas abajo en una trayectoria. Otros Análisis Pueden realizarse otros análisis para determinar o confirmar la participación del gen aislado y su producto en una trayectoria de señalización o metabólica en particular, y para ayudar a determinar la función de gen. Todas las publicaciones, patentes y solicitudes de patente se incorporan en la presente expresamente para referencia en su totalidad.

Mientras que la invención se ha descrito con referencia a los métodos específicos y modalidades, se apreciará que diversas modificaciones y cambios pueden hacerse sin alejarse de la invención. EJEMPLO 1 Generación de Plantas con un Fenotipo de ANT1 por Transformación con una Construcción de Mareaje de Activación l. Preparación de Vector Aarobacteríum. Los mutantes se generaron utilizando una versión modificada del vector "ACTTAG" de mareaje de activación, pSKI015 (Identificador de GenBank [Gl] 6537289; Weigel D et al., 2000). Este vector binario, llamado pAG3202, contiene los siguientes componentes: el elemento principal pSKI; un reforzador 4X 35S que consiste de cuatro repeticiones en serie de la región de reforzador del promotor CaMV 35S incluyendo 4 fragmentos Alu1 -EcoRV en serie, 129 bp de secuencia de CaMV asociada con cada repetición de Alu1-EcoRV en serie, y una secuencia repetida de 7 bp adicional que no se encuentra en la región de reforzador 35S del genoma CaMV; ei marcador elegible nptil bajo el control de un promotor de frambuesa E4 (RE4); un elemento de terminación 7 de gen Agrobacterium ubicado aguas abajo del gen nptil, adyacente al borde izquierdo del plásmido. La secuencia de pAG3202 se proporciona en SEQ ID NO: 3. Las colonias únicas de cepas de Agrobacterium tumefaciens EHA 105/EHA 101/GV3101 que contienen el plásmido binario pAG3202 crecieron en el medio MGL en pH 5.4 durante la noche y diluido a aproximadamente 5x108 células/ml con MGL o medio de co-cultivo de planta líquido.

Para el almacenamiento a largo plazo, las colonias positivas de PCR crecieron en medio selectivo, el glicerol se agrega a una concentración final de 30% y los cultivos se congelan rápidamente, así se almacenan a -80°C. Para el inicio de cultivos de Agrobacteríum densos para la transformación de planta, los cultivos base crecieron en medio selectivo, el glicerol se agrega a una concentración final de 30%, y un número de 20 µ!_ alícuotas se congelan rápidamente en nitrógeno líquido y se almacenan a -80°C. II. Transformación y Selección de utantes Micro-Tom Los mutantes de mareaje de activación se generaron en jitomate cv. Micro-Tom utilizando la transformación mediada de Agrobacteríum. Las plantas de vivero y plantaciones estériles se utilizaron como la fuente de explantaciones. Más específicamente, el tejido hipocótilo se transformó. Las semillas de (Lycopersium esculentum) se esterilizaron por superficie en 25% de blanqueador con tween 20 por 15 minutos y se enjuagaron con agua estéril antes de colocarse en medio de germinación de semilla (sales MS, vitaminas Nitsch, 3% de sucrosa y 0.7% de ágar, pH 5.8), se modificaron por la adición de auxina y/o citoquininas y ácido giberélico según sea necesario. Los cultivos se incubaron a 24°C con un período de foto de 16 hrs. (50-60 µ?t???.p?'?1). Se utilizaron plantas de vivero de siete a diez días de edad y plantas in vitro de un mes para las explantaciones de hipocótilo. Los hipocótilos se cortaron en segmentos de 3-5 mm, después se sumergieron en suspensión bacteriana, se mancharon en papel filtro estéril y se colocaron en medio de co-cultivación . Las explantaciones se sumergieron en suspensión bacteriana, se mancharon en papel filtro estéril y se colocaron en medio de co-cultivación (sales MS, vitaminas LS, 3% de sucrosa, 0.1 mg/l quinetina, 0.2 mg/l 2,4-D, 200 mg/l de fosfato de ácido de potasio, 50 /¿M de acetosiringona y 0.7% de ágar, pH 5.4) por 2-3 días. Después de dos a tres días de co-cultivo, las explantaciones se transfirieron a medio de regeneración de retoño que contiene sales MS, vitaminas Nitsch, 3% de . sucrosa, 2 mg/l de zeatina, 500 mg/l de carbenicilina, 200 mg/L de timetina y 0.7% de ágar a pH 5.8, se complementaron con el antibiótico, canamicina a 75-400 mg/l a fin de seleccionar los transformantes que expresan nptll. El nivel de selección de antibiótico se elevó gradualmente durante un período de 8 semanas en base a la respuesta de tejido. Las explantaciones se transfirieron a medio fresco cada dos semanas. El inicio de tejido leñoso cicatrizal con señales de inicios de retoño se observó de 3-6 semanas dependiendo del tipo de explantación. La regeneración de retoño y tejido leñoso cicatrizal se observó para continuar durante aproximadamente 4 meses después de los cuales los tejidos de las explantaciones se declinan. Un tejido leñoso cicatrizal púrpura se observó entre el tejido que crece en el medio de selección. Los retoños regenerados mostraron una variedad de fenotipos de color y fueron completamente verdes, enteramente púrpuras, o mezcla de verde y púrpura a diversos grados. Los retoños verdes de aproximadamente 1 cm en tamaño con meristemo de retoño distintos se cortaron del tejido leñoso cicatrizal y se transfirieron al medio de inducción de raíz que contiene sales MS, vitaminas N itsch, 3% de sucrosa, 1 mg/l de I BA, 50 mg/l de canamicina , 1 00 mg/l de carbenicilina o 100 mg/L de timetina o 0.7% de ágar, pH 5.8. Las plantas con raíces se plantaron al suelo en un invernadero Bioseguro. Las plantas se transportaron a las facilidades del invernadero , se condensaron en macetas de 3.5"marcadas para identificación de planta. Los transformantes se observaron en la etapa de tejido leñoso cicatrizal y después las plantas Ti se establecieron en el invernadero para variaciones fenotípicas en relación a las plantas de Micro-Tom tipo silvestre. Para lograr esto, diversas plantas tipo silvestre se mantuvieron en proximidad cercana a las plantas transgénicas. Cada planta se observó estrechamente dos veces una semana con observaciones notadas y documentadas por fotógrafos. Las imágenes de cada grupo de 8 plantas se registraron utilizando una cámara Digital (DC-260) , y las observaciones de morfología se hicieron en aproximadamente cuatro semanas después de la plantación . Once líneas de Micro-Tom se desarrol laron del tejido leñoso cicatrizal originalmente identificado por su color púrpura y retoños púrpura en la etapa caulogénica. Las líneas de planta clonal se identificaron por tener color de hoja modificado con un tinte púrpura pesado en hojas, color de flor modificado caracterizado por estrías púrpura en pétalos y sépalos y flores con un tinte púrpura mezclado con el color amarillo normal de la corola. Las plantas también se observaron por mostrar un color de fruto modificado descrito como un color rojo más profundo en relación a las plantas Micro-Tom tipo si lvestre. Las líneas de planta clonal (mutantes) se designaron Antocianina 1 ("ANT1"). El mutante de ANT1 se identificó de poco menos 2000 líneas ACTTAG de jitomate de Micro-Tom individuales que se desarrollaron siguiendo la transformación de cultivo de tejido con el plásmido binario pAG3202, y la selección de medio que contiene canamicina. Se hicieron observaciones y se tomaron fotos de las líneas de planta ANT1 Ti clónales que mostraron el fenotipo ANT1, designadas H000001484, H000001624, H000001708, ????00 7?9, H000001710, H00000171 1 , H000001712, H00000173, H000001715, H000001716 y H000001717. Las semillas se colectaron de las plantas T-i de la línea H000001624 y crecieron para generar plantas T2. De las 1 1 fuera de las 18 semillas que germinaron, y 8 plantas mostraron coloración púrpura, confirmando que la ANT1 es una mutación dominante. Los resultados indicaron que la ANT1 es una ganancia de característica de función, esperada del mareaje de activación en base a la sobre expresión de un gen nativo. EJEMPLO 2 Caracterización de Plantas que Muestran el Fenotipo de ANT1 El ADN genómico de Micro-Tom se extrajo del clon H000001'484 del mutante marcado de activación originalmente identificado en la etapa de tejido leñoso cicatrizal, en suficiente producción y calidad de rescate de plásmido de líneas de planta marcadas de activación utilizando el procedimiento descrito abajo. Se realizó mayor análisis utilizando el tejido combinado derivado de las líneas de planta H000001624, H000001708, H000001709, H000001710, H00000171 1 , H000001712, H000001713, H000001715, H000001716 y H000001717. I. Extracción de ADN Genómico de Jitomate Micro-Tom Los sistemas de Nucleón™ PhytoPure™ (equipos de extracción de ADN fúngico y de planta) de Amersham™ se utilizaron para extraer ADN genómico. Los métodos fueron esencialmente como sigue: 1 .0g de tejido fresco del clon H000001484 creció en nitrógeno líquido para producir un polvo de floración libre, se transfirió así a un tubo centrífugo de 15 mi de polipropileno. 4.6 mi de Reactivo 1 del equipo Nucleón Phytopure se agregó a través del mezclado, seguido por la adición de 1.5 mi de Reactivo 2 del equipo Nucleón Phytopure, con inversión hasta que se obtuvo una mezcla homogénea. La mezcla se incubó a 65°C en un baño de agitación de agua por 10 minutos, y se colocó sobre hielo por 20 minutos. Las muestras se removieron del hielo, 2 mi de -20°C de cloroformo se agregó, se mezcló y se centrífugo a 1300g por 10 minutos. El sobrenadante se transfirió en un tubo fresco, 2ml de cloroformo frío, 200 µ? de suspensión de resina de extracción de ADN de Nucleón PhytoPure se agregaron y la mezcla se agitó sobre un agitador inclinado por 10 minutos a temperatura ambiente, después se centrífugo a 1300 g por 10 minutos. Sin distribuir la capa de suspensión de resina Nucleón, la fase que contiene ADN superior se transfirió en un tubo fresco, se centrífugo a 9500 rpm por 30 minutos para clarificar la fase acuosa transferida si la fase superior apareció nubosa, un volumen igual de isopropanol frío se agregó, y el tubo se invirtió gentilmente a ADN precipitado. Se formó en pastilla así por centrifugación, se lavo con 70% de etanol frío, se volvió a formar en pastilla, y secó por aire. El ADN se volvió a suspender en regulador TE (10 mM de Tris, HCI, pH 7.4, 1 mM de EDTA) , que contiene RNasa, se incubó a 55°C por 15 minutos, se extrajo más fenol/cloroformo, así el cloroformo, se ejecutó en 1 % de gel agarosa para revisar la Calidad de ADN, la concentración de ADN determinada por el fluorómetro de ADN (Hoeffer DyNA Quant 200). El ADN extraído de retoños del clon ANT1 H000001484 en la etapa de tejido leñoso cicatrizal caulogénico y de plantas tipo silvestre se amplificó por PCR utilizando cargas iniciadoras que amplifican una secuencia reforzadora 35S, y cargas iniciadoras que amplifican una región de la secuencia de vector pBluescript en pAG3202. La amplificación que utiliza cargas iniciadoras que giran la región de reforzador 35S da como resultado una escalera de productos, indicando que las cuatro copias del reforzador 35S se presentaron. La amplificación que utiliza cargas iniciadoras para el vector pBluescript se hizo principalmente para detectar la (s) inserción (es) de T-ADN en plantas transformadas y se ha optimizado para las siguientes condiciones: Temp. de reblandecimiento: 57°C, 30 ciclos [94°C, 30 seg; 57°C, 1 min; 72°C, 1 min], 1 ciclo [72°C, 7 min]. La línea ACTTAG™, H000001484 (ANT1), se confirmó como positiva por la presencia de secuencias de reforzador 35S y vector PAG3202 por PCR, y como positiva hibridización Southern que verifica la integración genómica del ADN ACTTAG y que muestra la presencia de una inserción de T-ADN única en la línea transgénica clonal. I I . Rescate de Plásmido El ADN genómico de la línea clonal H000001484 se ingirió por las enzimas de restricción utilizadas en la Hibridización Southern. Los fragmentos de restricción se auto-ligaron y se utilizaron para transformar las células E. coli. Los plásmidos que contenían un vector pBluescript de longitud completa, reforzador 4X 35S, y un fragmento de ADN genómico de flanqueo de T-ADN de borde derecho, se rescataron. Más específicamente, el ADN genómico se ingirió con Hind I II y Xho I bajo condiciones de reacción estándares a 37°C durante la noche. Las reacciones de ligación se fijaron conteniendo los siguientes y se dejaron a 16°C durante la noche: ADN Genómico Ingerido 40 µ? Regulador de Ligación 5X 50 µ? Ligasa (Gibcol, I U/µ?) 10 µ? ddH20 150 µ? El ADN ligado se precipitó, se volvió a suspender en ddl-hO y se utilizó para transformar células SURE E. coli (Stratagene) por medio de la electroporación, con 10 pg de plásmido pUC18 como un control. La mezcla de transformación se esparció sobre dos láminas LB que contienen 100 µg/ml de ampicilina y se incubó durante la noche a 37°C. Las colonias únicas se recogieron de las láminas y se utilizaron para comenzar un cultivo de brote de LB-ampicilina de 5 mi de cada colonia al cultivarse durante la noche a 37°C. El plásmido se extrajo del cultivo y la restricción se ingirió para confirmar el tamaño de inserción genómica. II I. Secuenciación de Plásmidos Rescatados La secuenciación se logró utilizando un Equipo de Reacción Lista de Secuenciación de Ciclo Terminador ABI Prism BigDye™ (PE Applied Biosystem) , Polimerasa de ADN AmpliTaq (Perkin-Elmer), un Analizador Genético ABI Prism™310 (Perkin Elmer) y software de análisis de secuencia; por ejemplo, Sequencer™ 3.1.1 o MacVector 6.5.3. La secuenciación se hizo esencialmente de acuerdo a los protocolos del fabricante. Los extremos izquierdo de los plásmidos rescatados se secuenciaron a través del borde de T-ADN derecho. La secuencia rescata se sometió a análisis utilizando los programas de comparación de secuencia BLAST en el sitio de red www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST. Una búsqueda BLASTN básica identificó una secuencia con 31 % de identidad al mARN de Antocianina 2 (An2) de Petunia integrífolia (Gl 7673087 y 7673085). La presencia de una estructura de lectura abierta (es decir, el cADN ANT1) se pronosticó utilizando el programa BLASTX. El análisis de RT-PCR confirmó que el gen cuya secuencia de nucleótido se presenta como SEQ I D NO: 1 (ANT1) se sobre expresó específicamente en tejido de plantas que tienen el mismo fenotipo de ANT1. Específicamente, el ARN se extrajo de tejidos combinados derivados de la línea de planta clonal H000001624, que mostró el fenotipo de ANT1, y de plantas tipo silvestre. El RT-PCR se realizó utilizando cargas iniciadoras a la secuencia presentada como SEQ ID NO: 1 y un gen de actina constitutivamente expresado (control positivo). Los resultados mostraron que las plantas que representan el fenotipo de ANT1 sobre expresaron el mARN del gen ANT1 , indicando la expresión mejorada del gen ANT1 correlacionado con el fenotipo de ANT1. La secuencia de aminoácido pronosticada de la secuencia de ácido nucleico de ANT1 se determinó utilizando el Vector NTI (Informas, North Bethesda, MD) y se presenta en SEQ ID NO: 2. Una búsqueda BLASTP 2.0.1 1 Básica que utiliza el sitio de red ncbi.nlm.nih.gov/BLAST y la secuencia de aminoácido de ANT1 pronosticada se condujo. Los resultados indicaron que la secuencia de proteína de ANT1 pronosticada tiene 49% de identidad a la secuencia de proteína An2 Petunia integrifolia (Gl 7673088 y 7673086) y 65%-85% de identidad a diversos factores de transcripción relacionados de Myb en la región N-terminal, de aproximadamente 1 -120 de SEQ ID NO:2. Estas proteínas relacionadas de Myb incluyeron An2 de Petunia por híbrida (Gl 7673084), Zea mays C1-I (Gl 22214), Zea mays factor de transcripción PL (Gl 2343273) y un factor de transcripción Arabidopsis (Gl 3941508). El gen de Petunia An2 es un regulador de la trayectoria biosintética de Antocianina (Quattrocchio et al. , 1999). Estos resultados sugieren que ANT1 se asocia con hoja modificada, color de fruto o flor en Micro-jitomate. EJEMPLO 3 Confirmación de Asociación de Fenotipo/Genotipo en Micro-jitomate A fin de confirmar más la asociación entre el fenotipo de ANT1 y el gen ANT1 presentado en SEQ ID NO: 1 , un fragmento genómico que comprende el gen ANT1 , proporcionado en la SEQ ID NO: 4, se sobre expresó en plantas Micro-Tom tipo silvestre. Específicamente, este fragmento genómico 1012 bp, incluyendo las regiones codificadoras de ANT1, se clonó en el sitio de clonación múltiple (MCS) del vector binario pAG2370. El pAG2370, cuya secuencia se proporciona en SEQ ID NO: 5, comprende el elemento principal de vector del vector binario pBIN19 (GI 1256363), fragmentos de borde derecho e izquierdo de T-ADN, y, entre fragmentos de borde, la secuencia promotora de CsVMV y una secuencia de terminación Nos para controlar la expresión del gen insertado, y el gen de fosfotransferasa de neomicina (NPTII), que confiere resistencia a canamicina, cuya expresión se controla por el promotor RE4 (Patente de E.U. No. 6054635) y la secuencia de terminación G7. El fragmento de ANT1 se clonó en sitios Smal/Spel de pAG2370, se insertó entre la región de promotor CsVMV, próxima al extremo 5' del fragmento genómico, y la secuencia de terminación Nos, próxima al extremo 3' del fragmento genómico. La construcción pAG2370-i4/Vn se transformó en Agrobacteríum tumefaciens por electroporación. La construcción de pAG2370-A/VT7 descrita anteriormente se introdujo en plantas de Micro-Tom tipo silvestre por medio de la transformación mediada de Agrobacteríum, esencialmente según se describe en el Ejemplo 1. En resumen, las explantaciones se cortaron de las plantas de vivero Micro-Tom. Las explantaciones se inocularon al remojarlas en suspensión de Agrobacteríum por 15 a 20 minutos, se mancharon en papel filtro estéril para remover el exceso de bacteria, y se laminaron. Las explantaciones sé co-cultivaron en medio no selectivo por 2-4 días a 24°C con un período foto de 16 horas, después del cual se transfirieron al medio selectivo (con canamicina) y se regresaron al cuarto de crecimiento. Las explantaciones se transfirieron a medio fresco cada dos semanas hasta que los retoños fueron de 0.5 a 1 cm de tallo. Los retoños se cortaron de las explantaciones, se colocaron en medio selectivo con canamicina en platillos Phyta (Sigma) y se regresaron al cuarto de crecimiento por dos a cuatro semanas. Los retoños se observaron para raíz, y los retoños de raíz se plantaron al suelo y se aclimataron en el invernadero. El proceso de transformación generó 64 casos T0 independientes. Las observaciones morfológicas demostraron que las 45 plantas transgénicas mostraron el fenotipo de color púrpura ANT1 y fueron parcial o completamente púrpura. El tejido se colectó de seis plantas T¡ mostrando el fenotipo ANT1 , y el RT-PCR se llevó a cabo utilizando tipo silvestre como un control. Mientras que la expresión de gen ANT1 podría detectarse en el control de tipo silvestre, cinco de seis plantas que muestran el fenotipo de ANT1 sobre expresaron la transcripción de ANT1. Los experimentos de control interno, utilizando un gen de actina constitutivamente expresado, mostró que todas las muestras tuvieron niveles similares de la expresión de actina. EJEMPLO 4 Confirmación de la Asociación de Fenotipo/Asociación en Arabidopsis A fin de confirmar más la asociación entre el fenotipo de ANT1 y el gen de ANT1 en plantas diferentes a Micro-Tom, el gen de ANT1 se introdujo en y se sobre expresó en Arabidopsis thaliana tipo silvestre. La construcción pAG2370-ANT1 descrita anteriormente se introdujo en plantas de Arabidopsis de tipo silvestre por medio de transformación mediada por Agrobacterium utilizando métodos de infiltración al vacío estándares. Todas las semillas infiltradas se laminaron en medio selectivo conteniendo canamicina, y plantas ?? resistentes a canamicina se transplantaron a platinas de 72 células. El proceso de transformación generó 10 casos To independientes, de los cuales siente mostraron el fenotipo de coloración púrpura de ANT1 en al menos parte de la planta. El tejido se colectó de cuatro plantas T¡ mostrando el fenotipo de ANT1, y RT-PCR se llevó a cabo utilizando tipo silvestre como un control. Mientras que ninguna expresión de gen de ANT1 podría detectarse en el control tipo silvestre, todas las plantas mostrando el fenotipo de ANT1 sobre expresaron la transcripción ANT1. Los experimentos de control interno, utilizando un gen de actina constitutivamente expresado, mostraron que todas las muestras tuvieron niveles similares de la expresión de actina. EJEMPLO 5 Confirmación de Asociación de Fenotipo/Genotipo en Tabaco A fin de confirmar más la asociación entre el fenotipo de ANT1 y el gen de ANT1 en plantas diferentes a Micro-Tom, el gen de ANT1 se introdujo y se sobre expresó en Nicotiana tabacum de tipo silvestre (tabaco, tipo Wisconsin 38). La construcción de pAG2370-A/vT7 anteriormente descrita se introdujo en plantas de tabaco tipo silvestre por medio de la transformación mediada de Agrobacterium que utiliza esencialmente los siguientes métodos. A fin de generar plantas de tabaco para la transformación, las semillas de tabaco germinaron como sigue: las semillas se agitaron aproximadamente diez minutos en un agitador de laboratorio, en una solución que contiene aproximadamente 1.3% a 2.1 % de hipoclorito de sodio y una gota de Tween 20 (monolaurato de Polioxietilenosorbitan) por 100 mililitros. Las semillas se lavaron así en agua estéril y se transfirieron de manera estéril a la superficie de medio TbSG (4.3 g/l de sales Skoog y Murashige, Phytotech: 1 ml/l de vitaminas MS, Sigma; 30 g/l de sucrosa; 8 g/l de ágar, Sígma; pH ajustado a ~5.8) en platos petri o platillos Phyta (Sigma), 10-50 semillas por recipiente, y se incubaron en luz a 25°C. Las plantas de tabaco se disecaron en papel de filtro estéril humedecido con agua desmineralizada, estéril, o medio de TbCo líquido (4.3 g/l de sales Skoog y Murashige, Phytotech; 1 ml/l de vitaminas MS, Sigma; 30 g/l de sucrosa; 200 mg/l de KH2P04; 2 mg/l de ácido indol-3-acético; 0.25 mg/l de quinetina; 0 a 100 µ? de Acetosiringona; 7 g/l de Ágar, Sigma; pH ajustado a 5.4-5.6). Las explantaciones con bordes de corte en todos los lados podrían generarse al cortar la hoja de la planta, disecando y descartando la vena media, y cortando la lámina de hoja en 3 a 5 mm cuadrados. Alternativamente, los discos podrían cortarse de la lámina utilizando un CORK BORER esterilizado. Las explantaciones se inocularon al remojarse por 15-120 minutos en suspensión de Agrobacterium (OD6oo entre 0.175 y 0.225) preparada con la construcción de pAG2370-AA/TÍ , después se mancharon y se laminaron en medio TbCo. Las explantaciones se co-cultivaron 2-4 días a 24°C con un período foto de 16 horas, y después se transfirieron a medio selectivo Tb (4.3 g/l de sales Skoog y Murashige; 1 ml/l de vitaminas Nitsch y Nitsch, Duchefa; 30 g/l de sucrosa; 0.5 a 2 mg/l de 6-bencilaminopurina; 0 a 1 mg/l de Ácido Naftilacético; 0 a 750 mg/l de Carbenicilina; 0 a 300 mg/l de Timentina; 0 a 500 mg/l de Canamicina; 7 a 8 g/l de Ágar, Sigma; pH ajustado a ~5.8) conteniendo canamicina y se re-transfirieron cada dos semanas hasta que los retoños fueron 0.5 a 1 cm de tallo. Los retoños se cortaron de las explantaciones, se colocaron en medio de TbR (4.3 g/l de sales Skoog y Murashige; 1 ml/l de vitaminas Nitsch y Nitsch, Duchefa; 30 g/l de sucrosa; 0 a 1 mg/l de ácido lndol-3-butírico; 0 a 1 mg/l de Ácido Naftilacético; 0 a 100 mg/l de Carbenicilina; 0 a 200 mg/l de Timentina; 0 a 100 mg/l de Canamicina; 7 a 8 g/l de Ágar, Sigma; pH ajustado a ~5.8.) con canamicina en platillos Phyta, y crecieron dos a cuatro semanas, después de cuyo tiempo los retoños con raíces se plantaron al suelo. El proceso de transformación generó 89 casos T0 independientes, de los cuales 54 mostraron el fenotipo de coloración púrpura de ANT1 en al menos parte de la planta. El tejido se colectó de cinco plantas T¡ mostrando el fenotipo de ANT1 , y RT-PCR se llevó a cabo utilizando el tipo silvestre como un control. Mientras que ninguna expresión de gen de ANT1 podría detectarse en el control tipo silvestre, todas las plantas mostrando el fenotipo de ANT1 sobre expresaron la transcripción ANT1. Los experimentos de control interno, utilizando un gen de actina constitutivamente expresado, mostraron que todas las muestras tuvieron niveles similares de la expresión de actina. EJEMPLO 6 Uso del gen de ANT1 como un marcador de transformación en ¡¡tomate y tabaco Habiendo recapitulado exitosamente el fenotipo de ANT1 en jitomate y tabaco, según se describe anteriormente, probamos la utilidad del gen de ANT1 para utilidad como un marcador de transformación, en base a su color púrpura característico, en estas especies. Transformamos las explantaciones de Micro-Tom y tabaco con el vector pAG2370-AA/TÍ , utilizando métodos descritos en los Ejemplos anteriores, crecieron las explantaciones en la presencia y ausencia de antibiótico (canamicina) , y se comparó la frecuencia de transformación en base a la raíz en la presencia de antibiótico en el medio a la frecuencia de transformación en base al color púrpura. Los resultados se muestran en la Tabla de abajo. Tabla 1 : Frecuencia de Transformación de tabaco y jitomate, en base a la selección de antibiótico o color *Este número refleja los múltiples casos transgénicos por explante original. Cuando la iniciación de tejido leñoso cicatrizal ocurre en dos o tres puntos distintos del explante original, cada uno se diseca y se corta para la regeneración de retoño.

Los resultados indicaron que el gen de ANT1 podrían utilizarse exitosamente para seleccionar los transformantes positivos en cultivos de jitomate y tabaco, y también pueden ser útiles en otras plantas.

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Claims

REIVINDICACIONES 1. Un polinucleótido aislado que comprende una secuencia de ácido nucleico que codifica o es complementaria a una secuencia que codifica un polipéptido de ANT1 que tiene la menos 70% de identidad de secuencia a la secuencia de aminoácido presentada como SEQ ID NO: 2. 2. El polinucleótido según la reivindicación 1 , que comprende una secuencia de ácido nucleico que se hibridiza bajo condiciones de alta rigurosidad a la secuencia de ácido nucleico presentada como SEQ ID NO: 1 , o el complemento o un fragmento de la misma. 3. El polinucleótido según la reivindicación 1 , caracterizado porque el polipéptido de ANT1 tiene al menos 80% de identidad de secuencia a la secuencia de aminoácido presentada como SEQ ID NO: 2. 4. El polinucleótido según la reivindicación 1 , caracterizado porque el polipéptido de ANT1 tiene al menos 90% de identidad de secuencia a la secuencia de aminoácido presentada como SEQ ID NO: 2. 5. El polinucleótido según la reivindicación 1 , caracterizado porque el polipéptido de ANT1 tiene la secuencia de aminoácido presentada como SEQ ID NO: 2. 6. El polinucleótido según la reivindicación 1 , que comprende la secuencia de ácido nucleico presentada como SEQ ID NO: 1 , o el complemento de la misma. 7. Un vector de transformación de planta que comprende un polinucleótido aislado según la reivindicación 1. 8. Una célula de planta transgénica que comprende el vector según la reivindicación 7. 9. Un método para producir un fenotipo de ANT1 en una planta, dicho método comprendiendo introducir en células progenitoras de la planta un vector de transformación de planta según la reivindicación 7 y crecer las células progenitoras transformadas para producir una planta transgénica, en donde dicha secuencia de polinucleótido se expresa y dicha planta transgénica muestra un fenotipo de ANT1. 10. Una planta obtenida por un método según la reivindicación 9. 1 1 . Una parte de planta obtenida de una planta según la reivindicación 10. 12. Un método para seleccionar una planta transformada que comprende un primer polinucleótido, comprendiendo las etapas de: (a) introducir en las células progenitoras de la planta un vector de transformación de planta que comprende el primer polinucleótido y un polinucleótido de ANT1 según la reivindicación 1 , (b) crecer las células progenitoras para producir una planta que muestra el fenotipo de ANT1, en donde la planta que muestra el fenotipo de ANT1 se selecciona como una planta transformada que también comprende el primer polinucleótido.