JP2004517621A - トマト中のアントシアニン変異体(ant1)の同定と特徴付け - Google Patents
トマト中のアントシアニン変異体(ant1)の同定と特徴付け Download PDFInfo
- Publication number
- JP2004517621A JP2004517621A JP2002556709A JP2002556709A JP2004517621A JP 2004517621 A JP2004517621 A JP 2004517621A JP 2002556709 A JP2002556709 A JP 2002556709A JP 2002556709 A JP2002556709 A JP 2002556709A JP 2004517621 A JP2004517621 A JP 2004517621A
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- ant1
- plant
- sequence
- polynucleotide
- phenotype
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Granted
Links
- 235000010208 anthocyanin Nutrition 0.000 title abstract description 17
- 229930002877 anthocyanin Natural products 0.000 title abstract description 17
- 239000004410 anthocyanin Substances 0.000 title abstract description 17
- 150000004636 anthocyanins Chemical class 0.000 title abstract description 17
- 240000003768 Solanum lycopersicum Species 0.000 title description 17
- 235000007688 Lycopersicon esculentum Nutrition 0.000 title description 16
- 238000012512 characterization method Methods 0.000 title description 4
- 150000007523 nucleic acids Chemical group 0.000 claims abstract description 72
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 claims abstract description 40
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 claims abstract description 29
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 claims description 60
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 claims description 57
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 claims description 55
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 claims description 55
- 238000000034 method Methods 0.000 claims description 53
- 108091033319 polynucleotide Proteins 0.000 claims description 49
- 102000040430 polynucleotide Human genes 0.000 claims description 49
- 239000002157 polynucleotide Substances 0.000 claims description 49
- 230000009466 transformation Effects 0.000 claims description 40
- 239000012634 fragment Substances 0.000 claims description 35
- 239000013598 vector Substances 0.000 claims description 27
- 230000009261 transgenic effect Effects 0.000 claims description 26
- FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 4-amino-1-[(2r)-6-amino-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-amino-3-phenylpropanoyl]amino]-3-phenylpropanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]hexanoyl]piperidine-4-carboxylic acid Chemical compound C([C@H](C(=O)N[C@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H](CCCCN)C(=O)N1CCC(N)(CC1)C(O)=O)NC(=O)[C@H](N)CC=1C=CC=CC=1)C1=CC=CC=C1 FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 0.000 claims description 15
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 claims description 8
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 claims description 7
- 239000002243 precursor Substances 0.000 claims description 5
- 230000001747 exhibiting effect Effects 0.000 claims description 4
- 210000000130 stem cell Anatomy 0.000 claims description 3
- 102100032533 ADP/ATP translocase 1 Human genes 0.000 claims 9
- 101000768061 Escherichia phage P1 Antirepressor protein 1 Proteins 0.000 claims 9
- 101000796932 Homo sapiens ADP/ATP translocase 1 Proteins 0.000 claims 9
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 abstract description 52
- 241000196324 Embryophyta Species 0.000 description 216
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 92
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 description 31
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 28
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 27
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 26
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 26
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 23
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 21
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 21
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 20
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 20
- 101150017961 ant-1 gene Proteins 0.000 description 18
- 238000003780 insertion Methods 0.000 description 17
- 230000037431 insertion Effects 0.000 description 17
- 241000589158 Agrobacterium Species 0.000 description 16
- 108091026890 Coding region Proteins 0.000 description 15
- 235000013399 edible fruits Nutrition 0.000 description 15
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 14
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 14
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 14
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 14
- 235000002637 Nicotiana tabacum Nutrition 0.000 description 13
- 244000061176 Nicotiana tabacum Species 0.000 description 13
- 229930027917 kanamycin Natural products 0.000 description 13
- 229960000318 kanamycin Drugs 0.000 description 13
- SBUJHOSQTJFQJX-NOAMYHISSA-N kanamycin Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CN)O[C@@H]1O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O[C@@H]2[C@@H]([C@@H](N)[C@H](O)[C@@H](CO)O2)O)[C@H](N)C[C@@H]1N SBUJHOSQTJFQJX-NOAMYHISSA-N 0.000 description 13
- 229930182823 kanamycin A Natural products 0.000 description 13
- 206010020649 Hyperkeratosis Diseases 0.000 description 12
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 12
- 239000003623 enhancer Substances 0.000 description 10
- 230000001404 mediated effect Effects 0.000 description 10
- 238000002703 mutagenesis Methods 0.000 description 10
- 231100000350 mutagenesis Toxicity 0.000 description 10
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 description 10
- 230000004913 activation Effects 0.000 description 9
- 239000011782 vitamin Substances 0.000 description 9
- 235000013343 vitamin Nutrition 0.000 description 9
- 229940088594 vitamin Drugs 0.000 description 9
- 229930003231 vitamin Natural products 0.000 description 9
- 108010085238 Actins Proteins 0.000 description 8
- 229920001817 Agar Polymers 0.000 description 8
- HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N Chloroform Chemical compound ClC(Cl)Cl HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- 229930006000 Sucrose Natural products 0.000 description 8
- CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N Sucrose Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@]1(CO)O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N 0.000 description 8
- 239000008272 agar Substances 0.000 description 8
- 238000012217 deletion Methods 0.000 description 8
- 230000037430 deletion Effects 0.000 description 8
- 238000009396 hybridization Methods 0.000 description 8
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 8
- 108020004999 messenger RNA Proteins 0.000 description 8
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 8
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 8
- 239000005720 sucrose Substances 0.000 description 8
- 241000219194 Arabidopsis Species 0.000 description 7
- 230000008859 change Effects 0.000 description 7
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 7
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 7
- 239000000047 product Substances 0.000 description 7
- 239000006152 selective media Substances 0.000 description 7
- 108020004705 Codon Proteins 0.000 description 6
- PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N Glycerine Chemical compound OCC(O)CO PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 108700001094 Plant Genes Proteins 0.000 description 6
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 6
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 6
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 6
- 230000002018 overexpression Effects 0.000 description 6
- 230000008569 process Effects 0.000 description 6
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 6
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Chemical compound O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 240000008042 Zea mays Species 0.000 description 5
- 235000002017 Zea mays subsp mays Nutrition 0.000 description 5
- 238000007792 addition Methods 0.000 description 5
- 230000003115 biocidal effect Effects 0.000 description 5
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 description 5
- 235000013305 food Nutrition 0.000 description 5
- 230000006870 function Effects 0.000 description 5
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 5
- 229940124452 immunizing agent Drugs 0.000 description 5
- 239000000049 pigment Substances 0.000 description 5
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 5
- 241000894007 species Species 0.000 description 5
- 238000013518 transcription Methods 0.000 description 5
- 230000035897 transcription Effects 0.000 description 5
- 102000007469 Actins Human genes 0.000 description 4
- IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N Atomic nitrogen Chemical compound N#N IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 108700028146 Genetic Enhancer Elements Proteins 0.000 description 4
- OJOBTAOGJIWAGB-UHFFFAOYSA-N acetosyringone Chemical compound COC1=CC(C(C)=O)=CC(OC)=C1O OJOBTAOGJIWAGB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 4
- 229960003669 carbenicillin Drugs 0.000 description 4
- FPPNZSSZRUTDAP-UWFZAAFLSA-N carbenicillin Chemical compound N([C@H]1[C@H]2SC([C@@H](N2C1=O)C(O)=O)(C)C)C(=O)C(C(O)=O)C1=CC=CC=C1 FPPNZSSZRUTDAP-UWFZAAFLSA-N 0.000 description 4
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 4
- 238000011161 development Methods 0.000 description 4
- 230000018109 developmental process Effects 0.000 description 4
- 238000004520 electroporation Methods 0.000 description 4
- JTEDVYBZBROSJT-UHFFFAOYSA-N indole-3-butyric acid Chemical compound C1=CC=C2C(CCCC(=O)O)=CNC2=C1 JTEDVYBZBROSJT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 4
- 210000000056 organ Anatomy 0.000 description 4
- 238000003757 reverse transcription PCR Methods 0.000 description 4
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 4
- 230000019491 signal transduction Effects 0.000 description 4
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 4
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 4
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 description 3
- 241000589155 Agrobacterium tumefaciens Species 0.000 description 3
- 241001515826 Cassava vein mosaic virus Species 0.000 description 3
- 241000219112 Cucumis Species 0.000 description 3
- 235000009854 Cucurbita moschata Nutrition 0.000 description 3
- 240000001980 Cucurbita pepo Species 0.000 description 3
- 238000007400 DNA extraction Methods 0.000 description 3
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 108091092195 Intron Proteins 0.000 description 3
- 101100288095 Klebsiella pneumoniae neo gene Proteins 0.000 description 3
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 3
- 108700026244 Open Reading Frames Proteins 0.000 description 3
- 240000007377 Petunia x hybrida Species 0.000 description 3
- 229920001213 Polysorbate 20 Polymers 0.000 description 3
- 240000007651 Rubus glaucus Species 0.000 description 3
- 235000011034 Rubus glaucus Nutrition 0.000 description 3
- 235000009122 Rubus idaeus Nutrition 0.000 description 3
- 108091023040 Transcription factor Proteins 0.000 description 3
- 102000040945 Transcription factor Human genes 0.000 description 3
- 235000016383 Zea mays subsp huehuetenangensis Nutrition 0.000 description 3
- 125000000539 amino acid group Chemical group 0.000 description 3
- 239000003242 anti bacterial agent Substances 0.000 description 3
- 230000000692 anti-sense effect Effects 0.000 description 3
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 3
- 239000003086 colorant Substances 0.000 description 3
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 3
- 230000013595 glycosylation Effects 0.000 description 3
- 238000006206 glycosylation reaction Methods 0.000 description 3
- 230000012010 growth Effects 0.000 description 3
- 230000002363 herbicidal effect Effects 0.000 description 3
- 239000004009 herbicide Substances 0.000 description 3
- 230000006872 improvement Effects 0.000 description 3
- SEOVTRFCIGRIMH-UHFFFAOYSA-N indole-3-acetic acid Chemical compound C1=CC=C2C(CC(=O)O)=CNC2=C1 SEOVTRFCIGRIMH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 3
- 235000009973 maize Nutrition 0.000 description 3
- 238000010208 microarray analysis Methods 0.000 description 3
- 239000003921 oil Substances 0.000 description 3
- 230000037361 pathway Effects 0.000 description 3
- 230000008635 plant growth Effects 0.000 description 3
- 239000000256 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Substances 0.000 description 3
- 235000010486 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Nutrition 0.000 description 3
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 3
- 230000004044 response Effects 0.000 description 3
- 239000002689 soil Substances 0.000 description 3
- 238000010200 validation analysis Methods 0.000 description 3
- PRPINYUDVPFIRX-UHFFFAOYSA-N 1-naphthaleneacetic acid Chemical compound C1=CC=C2C(CC(=O)O)=CC=CC2=C1 PRPINYUDVPFIRX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 235000009436 Actinidia deliciosa Nutrition 0.000 description 2
- 244000298697 Actinidia deliciosa Species 0.000 description 2
- 239000004475 Arginine Substances 0.000 description 2
- 235000015510 Cucumis melo subsp melo Nutrition 0.000 description 2
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 2
- ZHNUHDYFZUAESO-UHFFFAOYSA-N Formamide Chemical compound NC=O ZHNUHDYFZUAESO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241000219146 Gossypium Species 0.000 description 2
- 102000018997 Growth Hormone Human genes 0.000 description 2
- 108010051696 Growth Hormone Proteins 0.000 description 2
- 244000017020 Ipomoea batatas Species 0.000 description 2
- 235000002678 Ipomoea batatas Nutrition 0.000 description 2
- KFZMGEQAYNKOFK-UHFFFAOYSA-N Isopropanol Chemical compound CC(C)O KFZMGEQAYNKOFK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- FAIXYKHYOGVFKA-UHFFFAOYSA-N Kinetin Natural products N=1C=NC=2N=CNC=2C=1N(C)C1=CC=CO1 FAIXYKHYOGVFKA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 235000004431 Linum usitatissimum Nutrition 0.000 description 2
- 240000006240 Linum usitatissimum Species 0.000 description 2
- 241000124008 Mammalia Species 0.000 description 2
- 240000004658 Medicago sativa Species 0.000 description 2
- 240000005561 Musa balbisiana Species 0.000 description 2
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 description 2
- 240000008839 Petunia integrifolia Species 0.000 description 2
- ISWSIDIOOBJBQZ-UHFFFAOYSA-N Phenol Chemical compound OC1=CC=CC=C1 ISWSIDIOOBJBQZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241000276498 Pollachius virens Species 0.000 description 2
- 241001290151 Prunus avium subsp. avium Species 0.000 description 2
- 235000006040 Prunus persica var persica Nutrition 0.000 description 2
- 241000220324 Pyrus Species 0.000 description 2
- 108020004511 Recombinant DNA Proteins 0.000 description 2
- 238000002105 Southern blotting Methods 0.000 description 2
- 244000078534 Vaccinium myrtillus Species 0.000 description 2
- 235000005824 Zea mays ssp. parviglumis Nutrition 0.000 description 2
- FJJCIZWZNKZHII-UHFFFAOYSA-N [4,6-bis(cyanoamino)-1,3,5-triazin-2-yl]cyanamide Chemical compound N#CNC1=NC(NC#N)=NC(NC#N)=N1 FJJCIZWZNKZHII-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 2
- 150000007513 acids Chemical class 0.000 description 2
- 230000003213 activating effect Effects 0.000 description 2
- 239000002671 adjuvant Substances 0.000 description 2
- 238000012867 alanine scanning Methods 0.000 description 2
- 229960000723 ampicillin Drugs 0.000 description 2
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 2
- 238000004873 anchoring Methods 0.000 description 2
- 239000000427 antigen Substances 0.000 description 2
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 description 2
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 description 2
- ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N arginine Natural products OC(=O)C(N)CCCNC(N)=N ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 2
- 230000004071 biological effect Effects 0.000 description 2
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 2
- 238000004364 calculation method Methods 0.000 description 2
- 238000012219 cassette mutagenesis Methods 0.000 description 2
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 2
- 235000013339 cereals Nutrition 0.000 description 2
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 2
- 235000019693 cherries Nutrition 0.000 description 2
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 2
- 238000003501 co-culture Methods 0.000 description 2
- 235000005822 corn Nutrition 0.000 description 2
- 238000005520 cutting process Methods 0.000 description 2
- UQHKFADEQIVWID-UHFFFAOYSA-N cytokinin Natural products C1=NC=2C(NCC=C(CO)C)=NC=NC=2N1C1CC(O)C(CO)O1 UQHKFADEQIVWID-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000004062 cytokinin Substances 0.000 description 2
- 210000002257 embryonic structure Anatomy 0.000 description 2
- 229930003935 flavonoid Natural products 0.000 description 2
- 150000002215 flavonoids Chemical class 0.000 description 2
- 235000017173 flavonoids Nutrition 0.000 description 2
- 235000013373 food additive Nutrition 0.000 description 2
- 239000002778 food additive Substances 0.000 description 2
- 239000012737 fresh medium Substances 0.000 description 2
- 235000012055 fruits and vegetables Nutrition 0.000 description 2
- 108020001507 fusion proteins Proteins 0.000 description 2
- 102000037865 fusion proteins Human genes 0.000 description 2
- IXORZMNAPKEEDV-OBDJNFEBSA-N gibberellin A3 Chemical class C([C@@]1(O)C(=C)C[C@@]2(C1)[C@H]1C(O)=O)C[C@H]2[C@]2(C=C[C@@H]3O)[C@H]1[C@]3(C)C(=O)O2 IXORZMNAPKEEDV-OBDJNFEBSA-N 0.000 description 2
- 239000000122 growth hormone Substances 0.000 description 2
- 230000002163 immunogen Effects 0.000 description 2
- 230000001976 improved effect Effects 0.000 description 2
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 description 2
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 2
- 230000010354 integration Effects 0.000 description 2
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 2
- 239000000543 intermediate Substances 0.000 description 2
- QANMHLXAZMSUEX-UHFFFAOYSA-N kinetin Chemical compound N=1C=NC=2N=CNC=2C=1NCC1=CC=CO1 QANMHLXAZMSUEX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229960001669 kinetin Drugs 0.000 description 2
- 239000011159 matrix material Substances 0.000 description 2
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 2
- 238000000520 microinjection Methods 0.000 description 2
- 230000000877 morphologic effect Effects 0.000 description 2
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 description 2
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 2
- 239000012071 phase Substances 0.000 description 2
- 230000037039 plant physiology Effects 0.000 description 2
- 238000003259 recombinant expression Methods 0.000 description 2
- 230000008929 regeneration Effects 0.000 description 2
- 238000011069 regeneration method Methods 0.000 description 2
- 239000011347 resin Substances 0.000 description 2
- 229920005989 resin Polymers 0.000 description 2
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 2
- 238000002741 site-directed mutagenesis Methods 0.000 description 2
- 239000008223 sterile water Substances 0.000 description 2
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 2
- 230000001629 suppression Effects 0.000 description 2
- 229940027257 timentin Drugs 0.000 description 2
- 238000001890 transfection Methods 0.000 description 2
- 238000013519 translation Methods 0.000 description 2
- LWIHDJKSTIGBAC-UHFFFAOYSA-K tripotassium phosphate Chemical compound [K+].[K+].[K+].[O-]P([O-])([O-])=O LWIHDJKSTIGBAC-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 2
- 230000017260 vegetative to reproductive phase transition of meristem Effects 0.000 description 2
- 230000028604 virus induced gene silencing Effects 0.000 description 2
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 2
- 239000005631 2,4-Dichlorophenoxyacetic acid Substances 0.000 description 1
- 108020003589 5' Untranslated Regions Proteins 0.000 description 1
- 229920000936 Agarose Polymers 0.000 description 1
- 235000003840 Amygdalus nana Nutrition 0.000 description 1
- 244000144730 Amygdalus persica Species 0.000 description 1
- 244000099147 Ananas comosus Species 0.000 description 1
- 235000007119 Ananas comosus Nutrition 0.000 description 1
- 240000001436 Antirrhinum majus Species 0.000 description 1
- 240000007087 Apium graveolens Species 0.000 description 1
- 235000015849 Apium graveolens Dulce Group Nutrition 0.000 description 1
- 235000010591 Appio Nutrition 0.000 description 1
- 241000219195 Arabidopsis thaliana Species 0.000 description 1
- 101100274514 Arabidopsis thaliana CKL11 gene Proteins 0.000 description 1
- 229930192334 Auxin Natural products 0.000 description 1
- 235000000832 Ayote Nutrition 0.000 description 1
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 1
- 241000219310 Beta vulgaris subsp. vulgaris Species 0.000 description 1
- 241000219198 Brassica Species 0.000 description 1
- 240000007124 Brassica oleracea Species 0.000 description 1
- 235000003899 Brassica oleracea var acephala Nutrition 0.000 description 1
- 235000011299 Brassica oleracea var botrytis Nutrition 0.000 description 1
- 235000011301 Brassica oleracea var capitata Nutrition 0.000 description 1
- 235000004221 Brassica oleracea var gemmifera Nutrition 0.000 description 1
- 235000017647 Brassica oleracea var italica Nutrition 0.000 description 1
- 235000001169 Brassica oleracea var oleracea Nutrition 0.000 description 1
- 240000003259 Brassica oleracea var. botrytis Species 0.000 description 1
- 244000308368 Brassica oleracea var. gemmifera Species 0.000 description 1
- 235000004936 Bromus mango Nutrition 0.000 description 1
- 101150064755 CKI1 gene Proteins 0.000 description 1
- 235000002566 Capsicum Nutrition 0.000 description 1
- 235000009467 Carica papaya Nutrition 0.000 description 1
- 240000006432 Carica papaya Species 0.000 description 1
- 102000053642 Catalytic RNA Human genes 0.000 description 1
- 108090000994 Catalytic RNA Proteins 0.000 description 1
- 235000021538 Chard Nutrition 0.000 description 1
- 241000207199 Citrus Species 0.000 description 1
- 108700010070 Codon Usage Proteins 0.000 description 1
- 241001573881 Corolla Species 0.000 description 1
- 229920000742 Cotton Polymers 0.000 description 1
- 241000699800 Cricetinae Species 0.000 description 1
- 235000010071 Cucumis prophetarum Nutrition 0.000 description 1
- 240000008067 Cucumis sativus Species 0.000 description 1
- 235000010799 Cucumis sativus var sativus Nutrition 0.000 description 1
- 235000003949 Cucurbita mixta Nutrition 0.000 description 1
- 240000004244 Cucurbita moschata Species 0.000 description 1
- 235000009852 Cucurbita pepo Nutrition 0.000 description 1
- 235000009804 Cucurbita pepo subsp pepo Nutrition 0.000 description 1
- 241000219130 Cucurbita pepo subsp. pepo Species 0.000 description 1
- 235000003954 Cucurbita pepo var melopepo Nutrition 0.000 description 1
- 102000004127 Cytokines Human genes 0.000 description 1
- 108090000695 Cytokines Proteins 0.000 description 1
- 102000053602 DNA Human genes 0.000 description 1
- 102000016928 DNA-directed DNA polymerase Human genes 0.000 description 1
- 108010014303 DNA-directed DNA polymerase Proteins 0.000 description 1
- 235000002767 Daucus carota Nutrition 0.000 description 1
- 244000000626 Daucus carota Species 0.000 description 1
- 208000035240 Disease Resistance Diseases 0.000 description 1
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 1
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 1
- 108700024394 Exon Proteins 0.000 description 1
- 241000220223 Fragaria Species 0.000 description 1
- 235000016623 Fragaria vesca Nutrition 0.000 description 1
- 240000009088 Fragaria x ananassa Species 0.000 description 1
- 235000011363 Fragaria x ananassa Nutrition 0.000 description 1
- 241000233866 Fungi Species 0.000 description 1
- 108700039691 Genetic Promoter Regions Proteins 0.000 description 1
- 239000005980 Gibberellic acid Substances 0.000 description 1
- 229930191978 Gibberellin Natural products 0.000 description 1
- 235000009438 Gossypium Nutrition 0.000 description 1
- 241001091440 Grossulariaceae Species 0.000 description 1
- 241000238631 Hexapoda Species 0.000 description 1
- 241000282412 Homo Species 0.000 description 1
- 206010021033 Hypomenorrhoea Diseases 0.000 description 1
- 108060003951 Immunoglobulin Proteins 0.000 description 1
- 229930010555 Inosine Natural products 0.000 description 1
- UGQMRVRMYYASKQ-KQYNXXCUSA-N Inosine Chemical compound O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1N1C2=NC=NC(O)=C2N=C1 UGQMRVRMYYASKQ-KQYNXXCUSA-N 0.000 description 1
- 239000007836 KH2PO4 Substances 0.000 description 1
- 108010025815 Kanamycin Kinase Proteins 0.000 description 1
- 235000003228 Lactuca sativa Nutrition 0.000 description 1
- 240000008415 Lactuca sativa Species 0.000 description 1
- ROHFNLRQFUQHCH-UHFFFAOYSA-N Leucine Natural products CC(C)CC(N)C(O)=O ROHFNLRQFUQHCH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000227653 Lycopersicon Species 0.000 description 1
- 235000002262 Lycopersicon Nutrition 0.000 description 1
- 108700007750 Lycopersicon esculentum E4 Proteins 0.000 description 1
- 241000220225 Malus Species 0.000 description 1
- 244000070406 Malus silvestris Species 0.000 description 1
- 235000014826 Mangifera indica Nutrition 0.000 description 1
- 240000007228 Mangifera indica Species 0.000 description 1
- 235000010624 Medicago sativa Nutrition 0.000 description 1
- 235000017587 Medicago sativa ssp. sativa Nutrition 0.000 description 1
- 235000000551 Mimusops kauki Nutrition 0.000 description 1
- 244000182072 Mimusops kauki Species 0.000 description 1
- 235000016357 Mirtillo rosso Nutrition 0.000 description 1
- 108020005196 Mitochondrial DNA Proteins 0.000 description 1
- 235000003805 Musa ABB Group Nutrition 0.000 description 1
- 235000018290 Musa x paradisiaca Nutrition 0.000 description 1
- NWBJYWHLCVSVIJ-UHFFFAOYSA-N N-benzyladenine Chemical compound N=1C=NC=2NC=NC=2C=1NCC1=CC=CC=C1 NWBJYWHLCVSVIJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000004988 N-glycosylation Effects 0.000 description 1
- 241000244206 Nematoda Species 0.000 description 1
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 241000208125 Nicotiana Species 0.000 description 1
- 230000004989 O-glycosylation Effects 0.000 description 1
- 235000000370 Passiflora edulis Nutrition 0.000 description 1
- 244000288157 Passiflora edulis Species 0.000 description 1
- 206010034133 Pathogen resistance Diseases 0.000 description 1
- 239000006002 Pepper Substances 0.000 description 1
- 235000008673 Persea americana Nutrition 0.000 description 1
- 244000025272 Persea americana Species 0.000 description 1
- 235000016761 Piper aduncum Nutrition 0.000 description 1
- 240000003889 Piper guineense Species 0.000 description 1
- 235000017804 Piper guineense Nutrition 0.000 description 1
- 235000008184 Piper nigrum Nutrition 0.000 description 1
- 240000004713 Pisum sativum Species 0.000 description 1
- 235000010582 Pisum sativum Nutrition 0.000 description 1
- 235000015266 Plantago major Nutrition 0.000 description 1
- 241000209504 Poaceae Species 0.000 description 1
- 239000004743 Polypropylene Substances 0.000 description 1
- 108010043400 Protamine Kinase Proteins 0.000 description 1
- 241000220299 Prunus Species 0.000 description 1
- 235000011432 Prunus Nutrition 0.000 description 1
- 235000009827 Prunus armeniaca Nutrition 0.000 description 1
- 244000018633 Prunus armeniaca Species 0.000 description 1
- 240000005809 Prunus persica Species 0.000 description 1
- 235000015575 Prunus subcordata Nutrition 0.000 description 1
- 240000003605 Prunus subcordata Species 0.000 description 1
- 238000010240 RT-PCR analysis Methods 0.000 description 1
- 244000088415 Raphanus sativus Species 0.000 description 1
- 235000006140 Raphanus sativus var sativus Nutrition 0.000 description 1
- 102000007056 Recombinant Fusion Proteins Human genes 0.000 description 1
- 108010008281 Recombinant Fusion Proteins Proteins 0.000 description 1
- 235000001537 Ribes X gardonianum Nutrition 0.000 description 1
- 235000001535 Ribes X utile Nutrition 0.000 description 1
- 235000002357 Ribes grossularia Nutrition 0.000 description 1
- 235000016919 Ribes petraeum Nutrition 0.000 description 1
- 244000281247 Ribes rubrum Species 0.000 description 1
- 235000002355 Ribes spicatum Nutrition 0.000 description 1
- 102000006382 Ribonucleases Human genes 0.000 description 1
- 108010083644 Ribonucleases Proteins 0.000 description 1
- 101100397775 Saccharomyces cerevisiae (strain ATCC 204508 / S288c) YCK2 gene Proteins 0.000 description 1
- MTCFGRXMJLQNBG-UHFFFAOYSA-N Serine Natural products OCC(N)C(O)=O MTCFGRXMJLQNBG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000005708 Sodium hypochlorite Substances 0.000 description 1
- 235000002560 Solanum lycopersicum Nutrition 0.000 description 1
- 235000002597 Solanum melongena Nutrition 0.000 description 1
- 244000061458 Solanum melongena Species 0.000 description 1
- 235000002595 Solanum tuberosum Nutrition 0.000 description 1
- 244000061456 Solanum tuberosum Species 0.000 description 1
- 235000009184 Spondias indica Nutrition 0.000 description 1
- 229920002472 Starch Polymers 0.000 description 1
- 235000021536 Sugar beet Nutrition 0.000 description 1
- 108091036066 Three prime untranslated region Proteins 0.000 description 1
- 239000007984 Tris EDTA buffer Substances 0.000 description 1
- 239000007983 Tris buffer Substances 0.000 description 1
- 241000736767 Vaccinium Species 0.000 description 1
- 235000012511 Vaccinium Nutrition 0.000 description 1
- 235000003095 Vaccinium corymbosum Nutrition 0.000 description 1
- 240000001717 Vaccinium macrocarpon Species 0.000 description 1
- 235000017537 Vaccinium myrtillus Nutrition 0.000 description 1
- 235000017606 Vaccinium vitis idaea Nutrition 0.000 description 1
- 244000077923 Vaccinium vitis idaea Species 0.000 description 1
- 235000009754 Vitis X bourquina Nutrition 0.000 description 1
- 235000012333 Vitis X labruscana Nutrition 0.000 description 1
- 240000006365 Vitis vinifera Species 0.000 description 1
- 235000014787 Vitis vinifera Nutrition 0.000 description 1
- AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N ampicillin Chemical compound C1([C@@H](N)C(=O)N[C@H]2[C@H]3SC([C@@H](N3C2=O)C(O)=O)(C)C)=CC=CC=C1 AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N 0.000 description 1
- 238000000137 annealing Methods 0.000 description 1
- 229940088710 antibiotic agent Drugs 0.000 description 1
- 230000000890 antigenic effect Effects 0.000 description 1
- 230000003078 antioxidant effect Effects 0.000 description 1
- 235000021016 apples Nutrition 0.000 description 1
- 239000008346 aqueous phase Substances 0.000 description 1
- 210000004507 artificial chromosome Anatomy 0.000 description 1
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 1
- QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N atomic oxygen Chemical compound [O] QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000010165 autogamy Effects 0.000 description 1
- 239000002363 auxin Substances 0.000 description 1
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 1
- 238000010256 biochemical assay Methods 0.000 description 1
- 230000008238 biochemical pathway Effects 0.000 description 1
- 230000008827 biological function Effects 0.000 description 1
- 230000033228 biological regulation Effects 0.000 description 1
- 230000006696 biosynthetic metabolic pathway Effects 0.000 description 1
- 239000007844 bleaching agent Substances 0.000 description 1
- 235000021014 blueberries Nutrition 0.000 description 1
- 150000001647 brassinosteroids Chemical class 0.000 description 1
- 238000009395 breeding Methods 0.000 description 1
- 230000001488 breeding effect Effects 0.000 description 1
- 239000001506 calcium phosphate Substances 0.000 description 1
- 229910000389 calcium phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000011010 calcium phosphates Nutrition 0.000 description 1
- 201000011510 cancer Diseases 0.000 description 1
- 125000003178 carboxy group Chemical group [H]OC(*)=O 0.000 description 1
- 230000003197 catalytic effect Effects 0.000 description 1
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 1
- 230000036978 cell physiology Effects 0.000 description 1
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 1
- 230000002759 chromosomal effect Effects 0.000 description 1
- 210000000349 chromosome Anatomy 0.000 description 1
- 235000020971 citrus fruits Nutrition 0.000 description 1
- 239000012881 co-culture medium Substances 0.000 description 1
- 238000000975 co-precipitation Methods 0.000 description 1
- 239000007799 cork Substances 0.000 description 1
- 235000021019 cranberries Nutrition 0.000 description 1
- 244000038559 crop plants Species 0.000 description 1
- 239000000287 crude extract Substances 0.000 description 1
- 238000012258 culturing Methods 0.000 description 1
- 230000002950 deficient Effects 0.000 description 1
- 239000008367 deionised water Substances 0.000 description 1
- 229910021641 deionized water Inorganic materials 0.000 description 1
- 230000029087 digestion Effects 0.000 description 1
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 1
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 1
- 239000012154 double-distilled water Substances 0.000 description 1
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 1
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 1
- 244000013123 dwarf bean Species 0.000 description 1
- 230000005014 ectopic expression Effects 0.000 description 1
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 1
- 230000002708 enhancing effect Effects 0.000 description 1
- 210000003527 eukaryotic cell Anatomy 0.000 description 1
- 238000010195 expression analysis Methods 0.000 description 1
- 239000000284 extract Substances 0.000 description 1
- 235000004426 flaxseed Nutrition 0.000 description 1
- 238000007667 floating Methods 0.000 description 1
- 239000004459 forage Substances 0.000 description 1
- 235000021022 fresh fruits Nutrition 0.000 description 1
- 230000004345 fruit ripening Effects 0.000 description 1
- 101150054603 ft gene Proteins 0.000 description 1
- 230000002538 fungal effect Effects 0.000 description 1
- 230000004927 fusion Effects 0.000 description 1
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 1
- 238000010359 gene isolation Methods 0.000 description 1
- 238000003209 gene knockout Methods 0.000 description 1
- 238000012252 genetic analysis Methods 0.000 description 1
- 235000007919 giant pumpkin Nutrition 0.000 description 1
- IXORZMNAPKEEDV-UHFFFAOYSA-N gibberellic acid GA3 Natural products OC(=O)C1C2(C3)CC(=C)C3(O)CCC2C2(C=CC3O)C1C3(C)C(=O)O2 IXORZMNAPKEEDV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000003448 gibberellin Substances 0.000 description 1
- 235000021331 green beans Nutrition 0.000 description 1
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 1
- 235000015220 hamburgers Nutrition 0.000 description 1
- 230000036541 health Effects 0.000 description 1
- 208000019622 heart disease Diseases 0.000 description 1
- 244000038280 herbivores Species 0.000 description 1
- 235000008216 herbs Nutrition 0.000 description 1
- 239000008240 homogeneous mixture Substances 0.000 description 1
- 210000004408 hybridoma Anatomy 0.000 description 1
- 230000003053 immunization Effects 0.000 description 1
- 238000002649 immunization Methods 0.000 description 1
- 102000018358 immunoglobulin Human genes 0.000 description 1
- 238000007901 in situ hybridization Methods 0.000 description 1
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 1
- 230000002779 inactivation Effects 0.000 description 1
- 238000010348 incorporation Methods 0.000 description 1
- 239000003617 indole-3-acetic acid Substances 0.000 description 1
- 230000006698 induction Effects 0.000 description 1
- 230000008595 infiltration Effects 0.000 description 1
- 238000001764 infiltration Methods 0.000 description 1
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 description 1
- 230000000977 initiatory effect Effects 0.000 description 1
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 1
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 1
- 229960003786 inosine Drugs 0.000 description 1
- 239000007928 intraperitoneal injection Substances 0.000 description 1
- 125000001909 leucine group Chemical class [H]N(*)C(C(*)=O)C([H])([H])C(C([H])([H])[H])C([H])([H])[H] 0.000 description 1
- 239000002502 liposome Substances 0.000 description 1
- 238000009630 liquid culture Methods 0.000 description 1
- 208000019423 liver disease Diseases 0.000 description 1
- 230000007774 longterm Effects 0.000 description 1
- 210000004698 lymphocyte Anatomy 0.000 description 1
- 238000002844 melting Methods 0.000 description 1
- 230000008018 melting Effects 0.000 description 1
- 230000037353 metabolic pathway Effects 0.000 description 1
- 230000011987 methylation Effects 0.000 description 1
- 238000007069 methylation reaction Methods 0.000 description 1
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 1
- 238000010369 molecular cloning Methods 0.000 description 1
- 229910000402 monopotassium phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
- 230000004660 morphological change Effects 0.000 description 1
- 210000004897 n-terminal region Anatomy 0.000 description 1
- 239000001301 oxygen Substances 0.000 description 1
- 229910052760 oxygen Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000003068 pathway analysis Methods 0.000 description 1
- 235000021017 pears Nutrition 0.000 description 1
- 230000026731 phosphorylation Effects 0.000 description 1
- 238000006366 phosphorylation reaction Methods 0.000 description 1
- 230000000886 photobiology Effects 0.000 description 1
- 108091008695 photoreceptors Proteins 0.000 description 1
- 235000017807 phytochemicals Nutrition 0.000 description 1
- 238000003976 plant breeding Methods 0.000 description 1
- 229930000223 plant secondary metabolite Natural products 0.000 description 1
- 210000002706 plastid Anatomy 0.000 description 1
- -1 polypropylene Polymers 0.000 description 1
- 229920001155 polypropylene Polymers 0.000 description 1
- 239000013641 positive control Substances 0.000 description 1
- 230000004481 post-translational protein modification Effects 0.000 description 1
- 230000001323 posttranslational effect Effects 0.000 description 1
- GNSKLFRGEWLPPA-UHFFFAOYSA-M potassium dihydrogen phosphate Chemical compound [K+].OP(O)([O-])=O GNSKLFRGEWLPPA-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 229910000160 potassium phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000011009 potassium phosphates Nutrition 0.000 description 1
- 239000000843 powder Substances 0.000 description 1
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 1
- 125000002924 primary amino group Chemical group [H]N([H])* 0.000 description 1
- 210000001236 prokaryotic cell Anatomy 0.000 description 1
- 235000014774 prunus Nutrition 0.000 description 1
- 235000015136 pumpkin Nutrition 0.000 description 1
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 1
- 230000005855 radiation Effects 0.000 description 1
- 230000009257 reactivity Effects 0.000 description 1
- 230000003362 replicative effect Effects 0.000 description 1
- 238000011160 research Methods 0.000 description 1
- 230000000717 retained effect Effects 0.000 description 1
- 238000012552 review Methods 0.000 description 1
- 108091092562 ribozyme Proteins 0.000 description 1
- 230000003248 secreting effect Effects 0.000 description 1
- 230000001568 sexual effect Effects 0.000 description 1
- 238000002791 soaking Methods 0.000 description 1
- SUKJFIGYRHOWBL-UHFFFAOYSA-N sodium hypochlorite Chemical compound [Na+].Cl[O-] SUKJFIGYRHOWBL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 1
- 238000009331 sowing Methods 0.000 description 1
- 235000020354 squash Nutrition 0.000 description 1
- 230000000087 stabilizing effect Effects 0.000 description 1
- 238000010561 standard procedure Methods 0.000 description 1
- 239000008107 starch Substances 0.000 description 1
- 235000019698 starch Nutrition 0.000 description 1
- 238000003756 stirring Methods 0.000 description 1
- 238000003860 storage Methods 0.000 description 1
- 238000007920 subcutaneous administration Methods 0.000 description 1
- 239000007929 subcutaneous injection Substances 0.000 description 1
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 1
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 1
- 101150003509 tag gene Proteins 0.000 description 1
- 231100000027 toxicology Toxicity 0.000 description 1
- UZKQTCBAMSWPJD-UQCOIBPSSA-N trans-Zeatin Natural products OCC(/C)=C\CNC1=NC=NC2=C1N=CN2 UZKQTCBAMSWPJD-UQCOIBPSSA-N 0.000 description 1
- UZKQTCBAMSWPJD-FARCUNLSSA-N trans-zeatin Chemical compound OCC(/C)=C/CNC1=NC=NC2=C1N=CN2 UZKQTCBAMSWPJD-FARCUNLSSA-N 0.000 description 1
- 230000002103 transcriptional effect Effects 0.000 description 1
- 238000010361 transduction Methods 0.000 description 1
- 230000026683 transduction Effects 0.000 description 1
- 238000000844 transformation Methods 0.000 description 1
- 230000001131 transforming effect Effects 0.000 description 1
- 230000017105 transposition Effects 0.000 description 1
- QORWJWZARLRLPR-UHFFFAOYSA-H tricalcium bis(phosphate) Chemical compound [Ca+2].[Ca+2].[Ca+2].[O-]P([O-])([O-])=O.[O-]P([O-])([O-])=O QORWJWZARLRLPR-UHFFFAOYSA-H 0.000 description 1
- LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N tris Chemical compound OCC(N)(CO)CO LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 235000013311 vegetables Nutrition 0.000 description 1
- 210000003462 vein Anatomy 0.000 description 1
- 150000003722 vitamin derivatives Chemical class 0.000 description 1
- 238000001262 western blot Methods 0.000 description 1
- 238000003158 yeast two-hybrid assay Methods 0.000 description 1
- 229940023877 zeatin Drugs 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
- C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
- C12N15/8241—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology
- C12N15/8242—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with non-agronomic quality (output) traits, e.g. for industrial processing; Value added, non-agronomic traits
- C12N15/8243—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with non-agronomic quality (output) traits, e.g. for industrial processing; Value added, non-agronomic traits involving biosynthetic or metabolic pathways, i.e. metabolic engineering, e.g. nicotine, caffeine
- C12N15/825—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with non-agronomic quality (output) traits, e.g. for industrial processing; Value added, non-agronomic traits involving biosynthetic or metabolic pathways, i.e. metabolic engineering, e.g. nicotine, caffeine involving pigment biosynthesis
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/415—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from plants
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
- C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
- C12N15/8201—Methods for introducing genetic material into plant cells, e.g. DNA, RNA, stable or transient incorporation, tissue culture methods adapted for transformation
- C12N15/8209—Selection, visualisation of transformants, reporter constructs, e.g. antibiotic resistance markers
- C12N15/821—Non-antibiotic resistance markers, e.g. morphogenetic, metabolic markers
- C12N15/8212—Colour markers, e.g. beta-glucoronidase [GUS], green fluorescent protein [GFP], carotenoid
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
- A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
- A01K2217/00—Genetically modified animals
- A01K2217/05—Animals comprising random inserted nucleic acids (transgenic)
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Zoology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Botany (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Nutrition Science (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Breeding Of Plants And Reproduction By Means Of Culturing (AREA)
- Cultivation Of Plants (AREA)
Abstract
Description
【0001】
本出願は、2000年10月30日に出願された米国仮特許出願番号60/244,685に対して優先権を主張し、その内容は、その全体がここで取り入れられている。
(発明の分野)
【0002】
本発明は、アントシアニン1(ANT1)と命名される植物表現型、それと関連するDNA及びポリペプチド配列に関する。
(本発明の背景)
【0003】
機能変異体の損失をスクリーニングするために用いられる、化学突然変異誘発、照射及びT−DNA挿入を含む遺伝子発見の伝統的方法には限界がある。これらのような突然変異誘発法は、ゲノムで余分な遺伝子を殆ど同定せず、遺伝子キャラクタリゼーションは時間を浪費し骨の折れるものである。
【0004】
活性化タギングとは、特定の表現型がスクリーニングされて選択された後に、遺伝子がゲノム上で広範囲にランダムにそして強くアップレギュレーションされる方法である。活性化タギングによる変異体の単離が報告されてきた(Hayashiら, 1992)。活性化T−DNAタギングコンストラクトは、植物成長ホルモンが存在しなくても細胞が成長するように、タバコ細胞培養の遺伝子を修飾するために利用さた(Waldenら, 1994)。遺伝子は、T−DNAタグの側方の植物ゲノム配列から単離され、植物成長ホルモン応答を担うと推定されてきた(例えば、Miklashevichsら. 1997, Harlingら, 1997;Waldenら, 1994;及び関連する研究を論じているSchellら, 1998を参照せよ)。
【0005】
活性化タグを利用してシロイナズナで最初に特徴付けられた遺伝子は、サイトカイニンシグナル伝達経路に関わるヒストンキナーゼをコードする遺伝子である。その遺伝子配列は、プラスミドレスキューによって植物ゲノムDNAから単離され、植物におけるサイトカイニン応答における遺伝子CKI1の役割は、シロイナズへの再導入によって確かめられた(Kakimoto, 1996)。これは、Ds転移因子の他に類似の手法を用いて、TINY、LHY及びSHI等の幾つかのドミナント変異体の報告に従った(Wilsonら, 1996, Schafferら,1998, Fridborg ら, 1999)。より最近の報告では、活性化T−DNAタギング及び早期開花表現型に関する植物のスクリーニングは、FT遺伝子の単離につながった(Kardailskyら, 1999)。
【0006】
遺伝子発見のためのハイスループット技術のような、活性化タギングの潜在的用途は、耐病性だけでなく、光レセプター、ブラシノステロイド、ジベレリン及び開花シグナル経路に関わる幾つかのドミナント変異体のスクリーニングに基づいて示されてきた(例えば、Weigelら, 2000, Christensenら,1998;Kardailskyら, 1999)。
【0007】
シロイナズは、長角果状型の果実を有するアブラナ種等の植物の植物改良のモデルとして広く利用されてきた。しかしながら、シロイナズは、多肉果を有する植物のモデルとしては役目を果たさない。
【0008】
果実を産する植物での修飾された遺伝子の発現に基づく遺伝子を同定し特徴付ける方法は、PCT公開公報国際公開0053794に記載されている。果実産生植物の矮化種、特にトマトの矮化種は、1つ又は複数の植物遺伝子の過剰発現、及びその過剰発現を特定の表現型と関連させることにとって有用である。
【0009】
矮化トマトは、植物を小型にする、それらの短い節間によって特徴付けられる。小型トマト栽培品種(Lycopersicon esculentum cultivar)である、マイクロトム(Micro−Tom)は、高密度(1357植物/m−2まで)で生育する比例的な矮化植物であり、短いライフサイクル(播種から果実の成熟まで70−80日)を有し、そして果実の大きさ、及び葉の大きさは、遺伝的に低くされてきた(Meissnerら, 1997;Scott及びHarbaugh, 1989)。さらには、マイクロトムは、多くの病害に対して耐性を示し、子葉のアグロバクテリウム媒介形質転換を介して80%までの頻度で形質転換できる(Meissnerら, 1997)。マイクロトムに類似のフロリダペティテ(Florida Petite)(Fla. Agr. Expt. Sta. Circ. S−285)、タイニーティム(Tiny Tim)及びスモールフライ(Small Fry)は、短いライフサイクル、そして果実の大きさ、葉の大きさが遺伝的に小さくされてきたトマトの矮化種である。
【0010】
特定の特性を有する改良植物を開発するために、特定の植物特性又は特徴に関連する遺伝子を同定する手法を開発するための努力が産業界及び学術界でおこなわれている。本発明は、天然植物遺伝子の修飾発現に関連する植物表現型を提供する。
【0011】
マイクロトムでの活性化タギングスクリーニングでは、我々は、色素生産に関わる遺伝子を同定した。アントシアニンは、植物の多くの赤及び青色を担う色素である。アントシアニン生合成の遺伝的基礎は、トウモロコシ、ペチュニア、及びキンギョソウでよく特徴付けられてきている(Doonerら, 1991;Jayaram及びPeterson, 1990;Quattrocchio Fら, 1999)。
(本発明の概要)
【0012】
本発明は、修飾された葉、花、又は果実色として示された植物のアントシアニン1(「ANT1」)表現型と関連する核酸及びアミノ酸配列を提供する。
【0013】
一側面では、本発明は、配列番号:2として示されているアミノ酸配列と少なくとも70%、80%、90%又はそれより大きい配列同一性を有するANT1ポリペプチドをコードする配列をコードする又はそれと相補的な核酸配列を含んでなる1つ又は複数の単離されたANT1核酸配列を提供する。
【0014】
その他の側面では、ポリヌクレオチドは、高度、中度、又は低度のストリンジェントな条件下で、配列番号:1、又はその相補鎖として示される核酸配列、又はその断片とハイブリダイズする核酸配列を含む。
【0015】
関連する側面では、植物における1つ又は複数のそのようなANT1ポリヌクレオチドの発現は、ANT1表現型と関連している。
【0016】
本発明は、さらに、植物形質転換ベクター、植物細胞、ANT1核酸配列を含む植物の部分及び植物を提供する。
【0017】
植物におけるそのようなANT1核酸配列の発現は、修飾された葉、花又は果実色素表現型として示されるANT1表現型と関連している。
【0018】
ANT1核酸配列の発現は、装飾用植物、果実及び野菜産生植物、穀物産生植物、油産生植物及び木の実産生植物、並びに他の作物植物で修飾することができ、結果としてANT1表現型となる。
【0019】
本発明のさらなる側面は、ANT1核酸配列を植物前駆細胞へ導入し、トランスジェニック植物を産するようにその細胞を生育することによる、植物におけるANT1表現型の修飾の方法を提供する。
(本発明の詳細な説明)
定義
【0020】
他に示されないのならば、ここで用いられるすべての技術的及び科学的用語は、本発明の分野における熟練者に対するのと同じように同じ意味を有する。
熟練者は、当該分野の定義及び用語に関しては、特に、Sambrookら, 1989, 及びAusubel FMら, 1993に従う。この発明が、特定の方法論、プロトコール、及び記載の試薬に限定されるものではく、これらは変わり得ることが理解されるべきである。
【0021】
ここで引用され、実施例の後に下に即座に列挙されているすべての刊行物は、本発明との関連で使用され得る組成物及び方法論を記載し開示する目的で、参考文献によって明確に取り入れられている。引用ウェブサイトのすべての特許、特許公報、及び配列と他の情報も、参考文献によって取り入れられている。
【0022】
ここで使用されるように、「ベクター」という用語は、 異なる宿主細胞の間を転移するように設計した核酸コンストラクトを指す。「発現ベクター」とは、外来細胞に異種DNA断片を取り入れ、それを発現させる能力を有するベクターを指す。多くの原核及び真核発現ベクターが商業的に入手可能である。適切な発現ベクターの選択は、当該分野に熟練している者が有する知識の範囲内にある。
【0023】
「非相同的」核酸コンストラクト又は配列は、植物細胞にとって自然ではないが、その中で発現する配列の一分部を有する。コントロール配列に関する非相同性とは、コントロール配列が現在は発現を制御しているのと同じ遺伝子を制御するように自然界で機能しないコントロール配列(すなわち、プロモーター又はエンハンサー)を指す。一般的に、非相同的核酸配列は、それらが存在する細胞又はゲノムの一部分に対して内因的ではなく、感染、形質移入、マイクロインジェクション、エレクトロポレーション等によって細胞へ加えられてきている。「非相同的」核酸コンストラクトは、天然の植物に見出されるコントロール配列/DNAコード化配列組み合わせと同じ又は異なるコントロール配列/DNAコード化配列組み合わせを含み得る。
【0024】
ここで使用される「遺伝子」という用語は、個々のコード化セグメント(エクソン)の間の介在配列(イントロン)だけでなく、コード化領域の前後、例えば、5’ 非翻訳(5’ UTR)又は「リーダー」配列及び3’ UTR又は「トレイラー」配列を含むことができるし、含まないこともある、ポリペプチド鎖を産することに関わるDNAのセグメントを意味する。
【0025】
ここで使用されているように、対象の配列、又は対象の配列の特定部分に関する「パーセント(%)配列同一性」とは、配列を整列させ、最大のパーセント配列同一性を得るために必要ならば間隙を導入し、すべての検索パラメーターをデフォルト値に設定し、プログラムWU−BLAST−2.0a19(Altschulら, J. Mol. Biol.(1997)215: 403−410;http://blast.wustl.edu/blast/README.html ウェブサイト)によって作製した、対象配列(又はその特定部分)のヌクレオチド又はアミノ酸と同一である候補誘導配列におけるヌクレオチド又はアミノ酸のパーセンテージとして定義される。HSP S及びHSP S2パラメーターは動的値であり、特定配列の組成物、及び興味ある配列が検索される特定のデータベースの組成物に依存し、プログラムそのものによって確立される。%同一性値は、一致する同一のヌクレオチド又はアミノ酸の数を、パーセント同一性が報告されている配列長によって割ることで決定される。「パーセント(%)アミノ酸配列類似性」は、%アミノ酸配列同一性を決定するのと同じような計算をするが、計算で同一のアミノ酸の他に保存的アミノ酸置換を含めることによって決定される。
【0026】
「%ホモロジー」という用語は、ここでは、「%同一性」という用語と交換可能に用いられる。
【0027】
核酸配列は、中度から高度のストリンジェントなハイブリダイゼーション及び洗浄条件下で、2つの配列が互いに特異的にハイブリダイズするならば、引例の核酸配列と「選択的にハイブリダイズが可能」であると考えられる。ハイブリダイゼーション条件は、核酸結合複合体又はプローブの融点温度(Tm)に基づいている。例えば、「最高ストリンジェント」は、通常は、約Tm−5℃(プローブのTmより5℃低い)で起こる;「高度ストリンジェント」は、Tmより約5−10℃低い;「中度ストリンジェント」は、プローブのTmより約10−20℃低い;そして「低度ストリンジェント」は、Tmより約20−25℃低い。機能的に、最高度ストリンジェント条件は、ハイブリダイゼーションプローブと厳密な同一性又はほぼ厳密な同一性を有する配列を同定するために用いることができる;一方で、高度ストリンジェント条件は、プローブと約80%又はそれより高い配列同一性を有する配列を同定するために用いられる。
【0028】
中度及び高度ストリンジェントハイブリダイゼーション条件は、当該分野で良く知られている(例えば、Sambrook, ら, 1989, 第9及び11章,及びAusubel, F. M., ら, 1993, ここで、参考文献として明確に取り入れられている)。高度ストリンジェント条件の例は、50%ホルムアミド、5X SSC、5Xデンハート溶液、0.5%SDS及び100μg/ml変性担体DNA中において約42℃でのハイブリダイゼーション、続いて室温で2X SSC及び0.5% SDSによる2回、及び42℃で0.1X SSC及び0.5% SDSによるさらに2回の洗浄を含む。
【0029】
ここで使用される「組み換え体」は、非相同的核酸配列の導入によって修飾されている細胞又はベクター、又はさらに修飾された細胞から誘導される細胞の言及を含む。従って、例えば、組み換え体細胞は、意図的なヒトの介入の結果として発現される又は発現されない下で、細胞の天然(非組み換え体)型の同一型では見出されない遺伝子を発現するか、又は、そうでなければ異常発現される天然遺伝子を発現する。
【0030】
ここで使用される、植物細胞に関する「形質転換された」、「安定に形質転換された」又は「トランスジェニック」という用語は、植物細胞が、2又はより多い世代を通して維持される、そのゲノムへ組み込まれた非天然(非相同的)核酸配列を有することを意味する。
【0031】
ここで使用される「発現」という用語は、ポリペプチドが遺伝子の核酸配列に基づいて産せられるプロセスを指す。このプロセスは、転写及び翻訳の双方を含む。
【0032】
核酸配列を細胞へ挿入するという文脈での「導入される」という用語は、「形質移入」、又は「形質転換」又は「形質導入」を意味し、核酸配列が細胞のゲノム(例えば、染色体、プラスミド、プラスチド、又はミトコンドリアDNA)へ取り込まれ、自律複製レプリコンへ転換、又は一過性発現(例えば、形質移入mRNA)し得る真核又は原核細胞への核酸配列の取り込みの言及を含む。
【0033】
ここで使用される「植物細胞」は、植物種子、花粉、プロガグレス(progagules)及び胚だけでなく、未分化組織(例えば、カルス)からの細胞を含む、植物から誘導される任意の細胞を指す。
【0034】
ここで使用される、与えられた植物の特性又は表現型に関連する「天然」及び「野生型」という用語は、その特性又は表現型が自然界の同じような種々の植物に見出される形態を指す。
【0035】
ここで使用される、植物特性に関する「修飾される」という用語は、自然界に見出されるような、非トランスジェニック植物に関連するトランスジェニック植物の表現型の変化を指す。
【0036】
ここで使用される「T1」という用語は、T0植物の種子からの植物の発生を指す。T1世代は、選択剤、例えば抗生物質又は除草剤の応用によって選択することができる形質転換植物の最初のセットであり、トランスジェニック植物が対応する耐性遺伝子を含んでいる。
【0037】
ここで使用される「T2」という用語は、以前には、トランスジェニックとして選択された、T1植物の花の自己受精による植物の発生を指す。
【0038】
ここで使用される「植物部分」という用語は、限定されることなく、種子、胚、成長点領域、カルス組織、葉、根、苗条、配偶体、胞子体、花粉、及び小胞子を含む、任意の植物器官又は組織を含む。植物細胞は、それから調製される任意の植物器官又は組織及び培養から得ることができる。本発明の方法で使用が可能な植物部門は、一般的に、単子葉及び双子葉植物の双方を含む、形質転換技術を施せる高等植物部門のように幅広い。
【0039】
ここで使用される「トランスジェニック植物」は、そのゲノム内に非相同的ポリヌクレオチドを含む植物についての言及を含む。一般的に、非相同的ポリヌクレオチドは、そのポリヌクレオチドが次の世代に受け継がれるように、ゲノムへ安定的に組み込まれる。この非相同的ポリヌクレオチドは、ゲノムのみへ、又は組み換え体発現カセットの一部として組み込まれる。「トランスジェニック」は、ここでは、任意の細胞、細胞株、カルス、組織、植物部分又は植物、最初のトランスジェニックから雄雌交配又は無性繁殖によって発生させたのと同様に、最初にそのように改変されたトランスジェニックを含む非相同的核酸の存在によって改変された遺伝子型を含むように使用される。
【0040】
従って、その細胞内に非相同的ポリヌクレオチドを有する植物は、ここでは、「トランスジェニック植物」と呼ばれている。その非相同的ポリヌクレオチドは、ゲノムへ安定に取り込まれることができるか、又は染色体外である可能性がある。好ましくは、本発明のポリヌクレオチドは、そのポリヌクレオチドが次の世代へ受け継がれるように、安定的にゲノムへ組み込まれる。このポリヌクレオチドは、ゲノムのみ又は組み換え体発現カセットの一部として、ゲノムへ組み込まれる。「トランスジェニック」は、ここでは、任意の細胞、細胞株、カルス、組織、植物部分又は植物、最初のトランスジェニックから雄雌交配又は無性繁殖によって発生させたのと同様に、最初にそのように改変されたトランスジェニックを含む非相同的核酸の存在によって改変された遺伝子型を含むように使用される。
【0041】
発現コンストラクトを含有する組み換え体DNAコンストラクトが導入された植物細胞、組織、器官、又は植物は、「形質転換された」、「形質移入された」、又は「トランスジェニック」と考えられる。トランスジェニック又は形質転換細胞又は植物は、また、細胞又は植物の子孫、及び組み換え体核酸配列の存在から生じる改変された表現型の交配及び提示することの親として、そのようなトランスジェニック植物を用いる繁殖プログラムから産せられる子孫を含む。従って、本発明の植物は、配列が直接に形質転換手法を介して導入されたのか、又は直接の形質転換によって最初にコンストラクトを受け取った前駆細胞からの世代転移によって導入されたのかどうかに関わらず、導入核酸配列を有するコンストラクトを含有する細胞を有する任意の植物を含む。
【0042】
ここで使用されている「アントシアニン1」及び「ANT1」という用語は、天然アントシアニン1(ANT1)核酸及びアミノ酸配列、相同体、その変異体及び断片を含む。
【0043】
「単離された」ANT1核酸分子は、通常は、ANT1核酸の天然ソースに付随している、少なくとも1つの夾雑核酸分子から同定し分離される。単離ANT1核酸分子は、自然界で見出された形態又は設定より他のものである。しかしながら、単離ANT1核酸分子は、例えば、核酸分子がその自然界の細胞とは異なる染色体位置にあり、通常はANT1を発現する細胞に含まれるANT1核酸分子を含む。
【0044】
ここで使用されているように、ポリヌクレオチド配列に関連する「変異体」という用語は、対応する野生型ポリヌクレオチド配列又は配列又は発現の観点の遺伝子とは異なり、違いが修飾植物表現型又は特性に貢献する。植物又は植物系統に関連して、「変異体」という用語は、修飾表現型又は特性が、野生型ポリヌクレオチド配列又は遺伝子の修飾発現と関連している、修飾植物表現型又は特性を有する植物又は植物系統を指す。
【0045】
一般的に、「変異体」ポリヌクレオチド配列は、参考文献のペプチド配列の1つ又は複数のアミノ酸によって改変される「変異体」アミノ酸配列をコードする。この変異体ポリヌクレオチド配列は、「保存的」又は「非保存的」置換を有する変異体アミノ酸配列をコードし得る。変異体ポリヌクレオチドは、アミノ酸挿入又は欠損、又は双方を有する変異体アミノ酸配列をもコードし得る。
【0046】
ここで使用されているように、「表現型」という用語は、「特性」という用語と交換可能に使用され得る。この用語は、容易に観察できるか、又は測定可能な植物の特徴を指し、植物の遺伝的性質とそれが生育する環境との相互作用から生じる。そのような表現型は、植物の形態的変化となり得る又はなり得ないが、当該分野の熟練者に既知の解析技術を使用して測定可能な、増幅した遺伝子発現から生じる、植物性質の化学的変化を含む。
【0047】
ここで使用されているように、ここで記載されている方法によって産せられる植物に関する「興味ある表現型」という用語は、形質転換されていなくて(及び/又は形質転換されている植物の子孫ではない)、植物の改良を示す植物によって示されない、T1及び/又は後の世代の植物によって示される容易に観察可能又は測定可能な表現型を指す。「改良」とは、植物に独特の性質を提供することによって、植物種又は変種の利用を促進することのできる特徴である。独特の性質によって、与えられた特徴又は特性における定量的変化(増加又は減少)又は定性的変化である、植物種の現存の特徴に対する新規な特徴又は変化を意味される。
同定された ANT1 表現型及び遺伝子
【0048】
本発明の遺伝子及び表現型は、活性化タギングを用いるスクリーニングで同定された。活性化タギングとは、核酸コントロール配列、例えばエンハンサーを含む非相同的核酸コンストラクトが植物ゲノムに挿入されることによるプロセスである。このエンハンサー配列は、1つ又は複数の天然の植物遺伝子の転写を高めるように作用する(例えば、Walden R.ら, 1994;Weigel Dら, 2000を参照せよ)。
【0049】
手短に言うと、多くのトマト(Lycopersicum esculentum)cv. マイクロトム(Micro−Tom)植物は、T−DNA(すなわち、アグロバクテリウム感染の間に植物細胞宿主へ転移させるアグロバクテリウム・ツメファシエンス(Agrobacterium tumefaciens )のTiプラスミドから誘導した配列)、エンハンサーエレメント及び選択可能なマーカー遺伝子を含む、活性化タギングベクターpSKI015(Weigelら, 2000)の修飾型で形質転換した。コンストラクトであるpAG3202は、実施例にさらに記載されている。形質転換した植物のゲノムへのpAG3202のランダム挿入の後、エンハンサーエレメントは、通常は、挿入の5−10キロベース(kb)内のT−DNA挿入の近傍のアップレギュレーション遺伝子となる可能性がある。T1世代では、植物は、選択可能なマーカーを発現し、それによって活性化タギングベクターの挿入を有した植物を特異的に回収するために、選択剤に曝される。形質転換植物は、一般的にT1、T2及び/又はT3世代で同定される、興味ある表現型について観察される。興味ある表現型は、形態学、生化学的スクリーニング、除草剤耐性試験、除草剤標的同定、糸状菌又は細菌耐性試験、昆虫又は線虫耐性試験、乾燥、塩又は抗生物質耐性等のストレス耐性に関するスクリーニング、及び油、澱粉、色素又はビタミン組成物等の産出特性に基づいて同定され得る。T−DNA挿入を囲むゲノム配列は、興味ある表現型を担う遺伝子を同定するために分析される。そのような表現型を起こすことを担う遺伝子は、農業、食品、装飾植物、及び/又は医薬産業に関する操作のための魅力ある標的として同定される。
【0050】
修飾表現型がタグ遺伝子の増幅した発現から生じる場合、殆どのケースでは、その表現型はドミナントである。ある場合では、与えられた天然植物遺伝子又はその断片の増幅した発現は、その相同体又はその他の天然植物遺伝子の低下した発現又は不活性化となり得て、興味ある表現型を引き起こす。T−DNA挿入は、また、表現型が一般的には劣性である、天然植物遺伝子の破壊(「機能の損失」)を引き起こす結果となる。
【0051】
本発明は、紫色及び紫根を有するカルスの段階で観察されたACTTAGマイクロトム系統で同定される修飾葉、花又は果実色表現型を提供する。紫植物は、培養の紫色のカーロジェニックカルス(caulogenic callus)から誘導された。クローン植物系統(すなわち、同じ紫色のカーロジェニックカルス(caulogenic callus)から、又は組織培養又はグリーンハウスでの裁断によるかいずれかによる最初の紫植物から増殖させたものに起源のあるさらなる苗条)を、葉、萼片及び花に紫天然色を有するとして同定した。この植物は、また、野生型マイクロトム植物と比べて深紅色と記載された修飾果実色を示すことが観察された。その表現型及び関連遺伝子は、アントシアニン1(「ANT1」)と命名された。
【0052】
本発明は、ANT1表現型と関連するT−DNA挿入の周囲のゲノムDNA配列の分析によって同定された、新しく同定及び単離された核酸配列を提供する。特に、出願人は、ANT1表現型を有する植物で特異的に過剰発現し、配列番号:1で提供されているANT1遺伝子のオープンリーディングフレームを同定し、特徴付けた。ANT1の単離及びキャラクタリゼーションの詳細な説明は、実施例に示されている。
【0053】
本発明の組成物
ANT1核酸
ANT1遺伝子は、所望する表現型を有するトランスジェニック植物の開発に用いることができる。これは、天然ANT1配列、その変異体ANT1配列、又は相同体、又は断片を使用して完遂することができる。
【0054】
本発明のANT1核酸配列は、ゲノムDNA、cDNA又はmRNAから誘導したDNA又はRNA配列であり得る。この核酸配列は、例えば、適切なソースからゲノムDNAを単離し、PCRを使用して興味ある配列を増幅してクローニングすることでクローンすることができる。あるいは、核酸配列は、特に植物が好む配列を提供することが望まれる場合に、完全に又は部分的のいずれかで合成され得る。従って、所望する構造遺伝子のすべて又は一部分(ポリペプチド又はタンパク質をコードする遺伝子の一部分)は、選択された宿主に好ましいコドンを使用して合成することができる。
【0055】
本発明は、配列番号:2に示されているアミノ酸配列を有するANT1ポリペプチド、及び配列番号:1に示されているANT1核酸配列とその全配列が同一であるポリヌクレオチド配列をコードする配列をコードするか、又は相補的な核酸配列を含んでなるポリヌクレオチドを提供する。本発明は、また、成熟ANT1ポリペプチド、その変異体又は断片に関するコード化配列、並びに、リーダー又は分泌配列、プレ、プロ、又はプレプロタンパク質配列をコードするような、他のコード化配列とのリーディングフレームにある成熟ポリペプチド又はその断片に関するコード化配列を提供する。
【0056】
ANT1ポリヌクレオチドは、例えば、限定されるものではないが、非コード化5’ 及び3’ 配列、例えば、転写、非翻訳配列、末端シグナル、リボゾーム結合部位、mRNAを安定化させる配列、イントロン、ポリアデニル化シグナル、及び付加的なアミノ酸をコードする付加的なコード化配列を含む、非コード化配列をも含む。例えば、マーカー配列は、融合ポリペプチドの精製を促進するために含めることができる。本発明のポリヌクレオチドは、また、構造遺伝子及び遺伝子発現をコントロールする自然に関連している配列を含むポリヌクレオチドを含む。
【0057】
本発明の単離されたポリペプチドが、非ANT1核酸配列が隣接するANT1核酸配列を含む場合、組み合わさったポリヌクレオチドの全長は、典型的には25kbよりも小さく、及び通常は20kbより低く、又は15kb、及び幾つかの場合には10kb又は5kbより低い。
【0058】
ここに記載のANT1核酸及び一致するポリヌクレオチド配列の他に、ANT1変異体が調製できることが考えられる。ANT1変異体は、適切なヌクレオチド変化をANT1核酸配列へ導入することによって;所望するANT1ポリペプチドの合成によって、又は植物におけるANT1遺伝子の発現レベルを改変することによって調製することができる。当該分野に熟練している者は、アミノ酸変化が、グリコシル化部位の数又は位置を変化させるか、又は膜固着特性を改変すること等、ANT1ポリペプチドの翻訳後プロセッシングを改変し得ることを評価する。
【0059】
一側面では、好ましいANT1コード化配列は、配列番号:2に示されるアミノ酸配列と少なくとも50%、60%、70%、75%、80%、85%、90%、95%又はより高い配列同一性を有するANT1ポリペプチドをコードする配列をコードするか、又はそれと相補的な核酸配列を含むポリヌクレオチドを含む。
【0060】
その他の側面では、好ましい変異体は、配列番号:1に示すANT1核酸配列とその全長が少なくとも50%から60%同一であるANT1ポリヌクレオチド配列、及びそのようなANT1配列と相補的な核酸配列を含む。より好ましいのは、配列番号:1に示すANT1配列と少なくとも70%、80%、85%、90%又は95%又はそれより高い配列同一性を有する領域を含むANT1ポリヌクレオチド配列である。
【0061】
関連する側面では、好ましい変異体は、配列番号:1に示すANT1ポリヌクレオチド配列と「選択的にハイブリダイズ可能な」ポリヌクレオチドを含む。
【0062】
配列変異体は、また、ここで記載のような、ANT1ポリヌクレオチド配列によってコードされているのと同じポリペプチドをコードする核酸分子を含む。従って、同定された核酸分子のコード化フレームが知られている場合、例えば、既知の遺伝子に対する相同性によって、又は配列の伸張によって、遺伝子コードの縮重の結果のように、コード化配列の多くを産することができる。例えば、トリプレットCGTは、アミノ酸アルギニンをコードする。アルギニンは、あるいは、CGA、CGC、CGG、AGA、及びAGGによってコードされている。従って、コード化領域のそのような置換は、本発明の範囲にある配列変異体内に入ることが好まれる。これら配列変異体の任意及びすべては、ここで記載されてているのと同じように、配列番号:1の同定されたANT1親配列のために使用することが可能である。
【0063】
そのような配列変異体が、親配列と選択的にハイブリダイズしてもしなくてもよいことがさらに好まれる。これは、例えば、配列変異体が、親ヌクレオチドによってコードされる各アミノ酸に対する異なるコドンを含む場合に可能であろう。そのような変異体は、それでもなお、本発明によって特異的に考慮され、包含される。本発明に従うと、同じく包含されているのは、そのような縮重誘導配列変異体と少なくとも70%の同一性である配列である。
【0064】
ANT1ヌクレオチド配列変異体は、好ましくは、中程度に高度又は高度にストリンジェントな条件下でここで引用されているヌクレオチド配列とハイブリダイズすることができるが、ある状況では、上記のようなコードの縮重を基礎とする変異体を用いることに利点がある。例えば、コドンは、特定の宿主生物によって決定付けられる最適コドンの利用に従って、ペプチドの発現が特定の原核生物又は真核生物で起こる速度を増すように選択することができる。あるいは、引用されている配列によって産せられるmRNAよりも長い半減期を有するRNAを産することが望ましいであろう。
【0065】
ここに記載の天然完全長ANT1核酸配列における変異は、例えば、保存的及び非保存的変異に関するいずれかの技術及びガイドラインであって、当該分野で一般的に知られている、オリゴヌクレオチド媒介(部位特異的)突然変異誘発、アラニンスキャンニング、及びPCR突然変異誘発を用いて作製することができる。部位特異的突然変異(Kunkel TAら, 1991);カセット突然変異誘発(Crameri Aら, 1995);制限選択突然変異誘発(Haught Cら, 1994)、又は他の既知の技術をクローンDNAに施して、ANT1変異体をコードする核酸配列を産することが可能である。
【0066】
特に、宿主が好む配列を提供することが望ましい場合に、ANT1表現型と関連する遺伝子配列を、完全に又は部分的のいずれかで合成することができる。従って、所望される構造遺伝子のすべて又は一部分(タンパク質をコードする遺伝子の一部分)は、選択される宿主によって好まれるコドンを使用して合成することができる。宿主が好むコドンは、例えば、所望される宿主種で発現されるタンパク質で最も頻繁に使用されるコドンから決定することができる。
【0067】
ANT1ポリヌクレオチドが、配列番号:1(すなわち、植物で過剰発現されるとANT1表現型となる)として示されているポリヌクレオチドによってコードされている成熟ANT1ポリペプチドと同じ生物学的機能又は活性を実質的に保持するANT1ポリヌクレオチドをコードすることが好まれる。
【0068】
変異体は、本発明のANT1ポリヌクレオチドの断片をも含み、完全長ANT1ポリヌクレオチドを合成するために用いることができる。好ましい実施態様は、本発明のANT1ポリペプチド配列の5から10,1から5,1から3,2,1又は非アミノ酸残基が、任意の組み合わせで置換、付与又は欠損している、ポリペプチド変異体をコードするポリヌクレオチドを含む。特に好ましいのは、ポリヌクレオチド又はポリペプチドの特性又は活性を改変しないような、置換、付与、及び欠損である。
【0069】
ANT1ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列は、さらなる遺伝的解析のためのハイブリダイゼーションプローブを構築するためにも使用できる。選択プローブによるcDNA又はゲノムライブラリのスクリーニングは、Sambrookら, 1989に記載のような標準的手法を用いておこなうことができる。中度にストリンジェント及び高度にストリンジェントを含むハイブリダイゼーション条件は、上掲のSambrookら,に提供されている。
【0070】
そのプローブ又は一部分は、極めて関連しているANT1配列の同定のための配列のプールを作製するために、PCR技術でも用いられ得る。ANT1配列がプローブとしての用途が意図される場合、ANT1コード化配列の特定部分、例えば、コード化配列の高度に保存された部分が使用され得る。
【0071】
例えば、配列番号:1に開示のANT1ヌクレオチド配列と所望するレベルの配列同一性を有する、他の植物種からのANT1の天然発生変異体をコードする遺伝子を単離するために、例えば、ANT1ヌクレオチド配列をcDNAライブラリのハイブリダイゼーションプローブとして使用することができる。例示的プローブは、約20から約50塩基長を有する。
【0072】
その他の例示的手法では、ここに開示の推定アミノ酸配列を使用して選択されたcDNA又はゲノムライブラリをスクリーニングすることによって、そして必要ならば、Sambrookら, 上掲に記載の常套的なプライマー伸張法を使用してcDNAへ逆転写され得ないANT1前駆体及びmRNAのプロセッシング中間体を検出することによって、ANT1ポリペプチドをコードする核酸を得ることができる。
【0073】
上で論じたように、この発明の核酸配列は、ゲノム、cDNA又はmRNA配列を含み得る。「コード化」によって、センス又はアンチセンス方向のいずれかの特定のアミノ酸配列に一致する配列が意味される。「染色体外」によって、配列が天然に随伴している植物ゲノムの外側にあることを意味している。「組み換え体」によって、配列が、突然変異誘発、制限酵素等による操作を通して遺伝子操作による修飾を含むことが意味される。
【0074】
一度、ANT1核酸配列、相同体、その変異体又は断片の所望する型が得られると、それは、種々の方法で修飾することができる。配列が非コード化フランキング領域を含む場合、そのフランキング領域は制限、突然変異誘発等に供せられる。従って、転移、塩基転換、欠損、及び挿入は、天然発生配列上でおこなわれ得る。
【0075】
そのような修飾があってもなくても、ANT1核酸配列、相同体、その変異体又は断片の所望する型は、植物細胞の形質転換のために植物発現ベクターへ取り込まれる。
【0076】
ANT1ポリペプチド
1つの好ましい実施態様では、本発明は、配列番号:2に示す配列を含んでなる天然成熟又は完全長ANT1ポリペプチド配列を有するANT1ポリペプチドを提供する。本発明のANT1ポリペプチドは、成熟ANT1ポリペプチド、配列番号:2に示すANT1ポリペプチド配列の融合タンパク質の一部分又は断片又は変異体である可能性がある。
【0077】
通常は、本発明のANT1ポリペプチドは、ANT1アミノ酸配列の全長と少なくとも50%から60%の同一性を有する。より好ましいのは、配列番号:2のANT1ポリペプチド配列と少なくとも70%、80%、85%、90%又は95%又はより高い配列同一性を有する領域を含むANT1ポリペプチド配列である。
【0078】
配列番号:2のANT1ポリペプチド配列の断片及び変異体も、本発明の一部分であると考えられる。断片は、前出に記載のポリペプチドのアミノ酸配列とすべてではないが一部分がすべて同じであるアミノ酸配列を有する変異体ポリペプチドである。例示的断片は、配列番号:2の少なくとも10,20,30,40,50,75,又は100連続アミノ酸を含む。この断片は、「独立している」又は断片が一部分又は領域、最も好ましくは単一で連続する領域であるより大きなポリペプチド内に含まれる。好ましい断片は、生物学的に活性な断片であって、それらが、類似の活性又は向上した活性又は減少した活性を有するものを含む本発明のポリペプチドの活性を媒介する。また、含まれるのは、動物、特にヒトで抗原性又は免疫原性の断片である。
【0079】
本発明のANT1ポリペプチドは、配列番号:2のANT1ポリペプチド配列から変化するポリペプチドを含む。これら変異体は、置換的、挿入的又は欠損変異体であり得る。変異体は、さらに下記のような修飾された特徴を有するとして選択されることも可能であるが、この変異体は、典型的には、天然発生類似体と同じような定性的な生物学的活性を示す。
【0080】
「置換」は、1つ又は複数のヌクレオチド又はアミノ酸を異なるヌクレオチド又はアミノ酸でそれぞれ置き換えることから生じる。
【0081】
「挿入」又は「付加」とは、天然発生配列と比較して、それぞれ、1つ又は複数のヌクレオチド又はアミノ酸残基の付加を引き起こす、ヌクレオチド又はアミノ酸配列の変化である。
【0082】
「欠損」とは、それぞれ、1つ又は複数のヌクレオチド又はアミノ酸残基が無い、ヌクレオチド又はアミノ酸配列のいずれかの変化として定義される。
【0083】
アミノ酸置換は、典型的には、1つの残基である;かなり大きな挿入は耐えられるが、挿入は、通常は、およそ約1から20アミノ酸である。ある場合、欠損はより大きい可能性があるが、欠損は、約1から約20残基の範囲である。
【0084】
置換、欠損、挿入又はそれらのいずれかの組み合わせは、最終の誘導体に至るように使用され得る。一般的に、これらの変化は、分子の改変を最小にするように僅かのアミノ酸に関しておこなわれる。しかしながら、より大きな変化は、ある環境下で許容され得る。
【0085】
アミノ酸置換は、1つのアミノ酸を類似の構造及び/又は化学特性を有するその他のアミノ酸で置換すること、例えば、ロイシンのセリンによる置換、すなわち、保存的アミノ酸置換の結果である可能性がある。挿入又は欠損は、場合によっては、1から5アミノ酸の範囲にある。
【0086】
置換は、一般的には、既知の「保存的置換」に従って作製される。「保存的置換」とは、1つのクラスのアミノ酸を同じクラスのアミノ酸によって置換することを指し、クラスとは、共通の物理化学的なアミノ酸側鎖の特性 、及び自然界で見出される相同タンパク質の高い置換頻度によって定義される(例えば、標準Dayhoff交換頻度マトリックス又はBLOSUMマトリックスによって決定されるように)。(一般的に、Doolittle, R. F., 1986を参照せよ。)
【0087】
「非保存的置換」とは、1つのクラスのアミノ酸をその他のクラスのアミノ酸で置換することを指す。
【0088】
ANT1ポリペプチド変異体は、典型的には、また、選択されて、必要とされるようにANT1ポリペプチドの特徴を修飾されるが、天然発生類似体と同じような定性的な生物学的活性を示す。例えば、グリコシル化部位、及びより特異的には、1つ又は複数のO−結合又はN−結合グリコシル化部位は、改変されるか又は除かれる。当該分野の熟練者は、グリコシル化部位の数や位置を変化させる、又は膜固着特性を改変する等のANT1ポリペプチドの翻訳後プロセスを改変し得るアミノ酸変化を評価する。
【0089】
変異は、オリゴヌクレオチド媒介(部位特異的)突然変異誘発、アラニンスキャンニング、及びPCR突然変異誘発等の当該分野で知られている方法を用いて作製することができる。部位特異的突然変異誘発[Carterら, 1986;Zollerら,1987]、カセット突然変異誘発[Wellsら, 1985]、制限選択突然変異誘発[Wellら, 1986]又は他の既知の技術をクローンDNA上でおこない、ANT1ポリペプチドコード化変異体DNAを産することができる。
【0090】
同じくANT1ポリペプチドの定義に含まれるのは、他の関連したANT1ポリペプチドである。従って、プローブ又は縮重PCRプライマー配列を使用して他の関連しているポリペプチドを見出すことができる。有用なプローブ又はプライマー配列は、ANT1ポリペプチド配列のすべて又は一部分、又はコード化領域の外側の配列に対して設計することができる。当該分野で一般的に知られているように、好ましいPCRプライマーは、約15から35ヌクレオチド長であり、約20から約30が好ましく、必要とされているようにイノシンを含むことができる。PCR反応の条件は、一般的に当該分野で知られている。
【0091】
ANT1ポリペプチドの共有結合的修飾も、本発明の範囲内に含まれる。例えば、本発明は、成熟タンパク質であり、付加的アミノ又はカルボキシル末端アミノ酸を含み得るANT1ポリペプチド、又は成熟ポリペプチド内のアミノ酸を提供する(例えば、タンパク質の成熟型が1つより多いポリペプチド鎖を有する場合)。そのような配列は、例えば、前駆体から成熟型へのタンパク質のプロセッシングで役割を担い、タンパク質輸送を可能にし、タンパク質半減期を短く又は長くし、又はアッセイ又は生産でのタンパク質の操作を促進することができる。細胞酵素を使用して、成熟タンパク質から任意の付加的アミノ酸を除くことができる[例えば、Creighton, TE, 1983を参照せよ]。
【0092】
好ましい実施態様では、ANT1ポリペプチド又はその変異体の過剰発現は、ANT1表現型と関連している。
【0093】
抗体
本発明は、さらに、抗ANT1ポリペプチド抗体を提供する。抗体は、ポリクローナル、モノクローナル、ヒト化、二重特異性又は異種コンジュゲート抗体であってもよい。
【0094】
ポリクローナル抗体を調製する方法は、熟練者に知られている。そのようなポリクローナル抗体は、例えば、免疫剤、そして好ましくはアジュバントの1つ又は複数の注入の後に、哺乳動物で産することが可能である。典型的には、免疫剤及び/又はアジュバントは、一連の皮下又は腹膜内注射によって哺乳動物へ注入される。免疫剤は、ANT1ポリペプチド又はその融合タンパク質を含む。抗原を免疫化される動物において免疫原性であることが知られているタンパク質とコンジュゲートさせることは有用であり得る。免疫化プロトコールは、標準プロトコールに基づいて一人の熟練者によって、又は日常的な実験によって決定することが可能である。
【0095】
あるいは、抗ANT1ポリペプチド抗体は、モノクローナル抗体であってもよい。モノクローナル抗体は、マウス、ハムスター、又は他の適切な宿主動物が、免疫剤と特異的に結合する抗体を産する、又は産することが可能なリンパ球を誘発するために免疫剤で免疫化される、ハイブリドーマによって産することができる[Kohlerら, 1975]。モノクローナル抗体は、米国特許第4,816,567号に記載のような組み換えDNA法によっても作製することができる。
【0096】
本発明の抗ANT1ポリペプチド抗体は、さらに、ヒト化抗体又はヒト抗体を含む。「ヒト化抗体」という用語は、非ヒト抗体から誘導した配列のある部分を含むキメラ抗体、その免疫グロブリン鎖又は断片(例えば、Fv,Fab,Fab’,F(ab’)2又は抗体の他の抗原結合部分配列)である非ヒト(例えば、マウス)抗体のヒト化型を指す。非ヒト抗体をヒト化する方法は、Jonesら, 1986;Riechmannら, 1988;Verhoeyenら, 1988にさらに詳しくあるように、当該分野で良く知られている。ヒト抗体を産する方法も、当該分野で知られている。例えば、Jakobovits, A,ら, 1995;Jakobovits, A, 1995を参照せよ。
【0097】
1つの例示的手法では、抗ANT1ポリクローナル抗体は、遺伝子単離に使用される。ウェスタンブロット解析は、ANT1又は関連タンパク質が特定の植物種の粗抽出物に存在していることを確かめるためにおこなわれ得る。反応性が観察されると、関連するタンパク質をコードする遺伝子は、特定の植物種を表す発現ライブラリをスクリーニングすることによって単離することができる。発現ライブラリは、Sambrook, ら, 1989に記載のように、ラムダgt11を含む種々の商業的に入手可能なベクターで構築することが可能である。
【0098】
ANT1 表現型及び遺伝子の用途
前記より、ANT1ヌクレオチド配列、タンパク質配列及び表現型は、ANT1タンパク質の修飾発現、及びそのような修飾発現に関連する非天然表現型の開発に用途を見出すことができる。
【0099】
ANT1表現型は、変異型から野生型植物を区別する特徴を有し、それには、修飾された葉の色、修飾された花の色及び修飾された果実色を含む。
【0100】
アントシアニンは、葉の色、花の色及び果実色に貢献する。アントシアニンは、ピンクから紫色を葉及び他の器官を分け与える水溶性フラボノイドの一群である(Harboneら, 1988)。アントシアニンは、植物の多くの重要な生理学的及び発生的機能に関わってきており、それらには、限定されるものではないが:(1)捕獲した光の量及び質の修飾(Barkerら, 1977);(2)UV−B照射の作用からの保護(Burger及びEdwards, 1996及びKlaperら, 1996);(3)草食動物に対する防御(Coley及びKusar, 1996);(4)光阻害からの保護(Gouldら, 1995及びDoddら, 1998);及び(5)ストレス環境下での活性酸素中間体の除去(Furutaら, 1995;Sherwinら, 1998;及びYamasaki 1997)が含まれる。アントシアニンは、抗オキシダント活性を示し、これは、癌、心臓及び肝臓疾患に対する防御の役割を示唆している(Kameiら, 1993;Sudaら, 1997;及びWangら,2000)。www. pslgroup. com/dg/39fb2.htm,www.wellweb.com/nutri/phytochemicals.htm,及びwww.nal.usda.gov/ttic/tektran/data/000007/19/0000071970.html.のウェブサイトも参照せよ。
【0101】
これを考慮すると、ここに記載のANT1表現型は、色彩豊かで、それ故に装飾植物、花及び食物の装飾価値を高めることに用途が見出されるだけでなく、ANT1表現型が植物種で発現して食品又は食品添加物として利用される場合には、健康に有益な潜在力をも与える。
【0102】
一側面では、ANT1表現型を有する植物の修飾葉、花、及び果実色には、改良装飾植物、果実及び/又は切花の開発に用途が見出せる。
【0103】
その他の側面では、ANT1表現型を有する植物に含まれる修飾アントシアニンには、植物誘導食品及び食品添加物において用途が見出せる。
【0104】
その他の側面では、実施例にさらに記載のように、ANT1遺伝子は、遺伝子組み換え植物における形質転換マーカーとしての用途を有する。
【0105】
本発明を実行することにおいては、ANT1表現型及び修飾ANT1発現は、一般的に、さらに下で詳細に示されているように、どんな型の植物にも応用可能である。
【0106】
ここに記載の方法は、一般的に、すべての植物へ応用可能である。活性タギング及び遺伝子同定は、核酸配列及び関連する表現型の同定に続いて、トマトで実行されるが、選択された遺伝子、相同体、その変異体又は断片は、どんな型の植物でも発現することができる。一側面では、本発明は、果実及び野菜を産する植物に関する。
【0107】
本発明は、一般的に、新鮮な果実を産する植物へ応用可能である;例えば、限定されるものではないが、トマト(Lycopersicum);ブドウ(Vitas);イチゴ(Fragaria);ラズベリー、ブラックベリー、ローガンベリー(Rubus);カラント及びグースベリー(Ribes);ブルーベリー、コケモモ、ハイデルベリー、クランベリー(Vaccinium)、キーウィフルーツ及びチャイニーズ・グースベリー(Actinida);リンゴ(Malus);西洋ナシ(Pyrus);プルナス・ジェネラ(Prunus genera)のメロン(Cucumis sp.)のメンバー、例えば、西洋スモモ、桜、ズバイモモ及びモモ;アカテツ科の木(Manilkara zapotilla);マンゴー;アボカド;アンズ;モモ類;桜;パイナップル;パパヤ;パッションフルーツ;柑橘類;ナツメヤシ;バナナ;オオバコ;及びイチジク。
【0108】
同じように、本発明は、野菜植物へ応用可能であり、それには、限定されるものではないが、砂糖大根、青いサヤインゲン、ブロッコリー、芽キャベツ、キャベツ、セロリ、フダンソウ、キュウリ、ナス、コショウ、カボチャ、大黄、冬カボチャ、ペボカボチャ、ズッキーニー、レタス、ダイコン、ニンジン、エンドウマメ、ジャガイモ、トウモロコシ、ゲッキツ及びハーブが含まれる。
【0109】
関連した側面では、本発明は、切花産業、穀物産生植物、油産生植物及びナッツ産生植物、並びに、限定されるものではないが、綿花(Gossypium)アルファルファ(Medicago sativa)、アマ(Linum usitatissimum)、タバコ(Nicotiana)、芝草(Poaceae 科)、及び他の飼料作物を含む他の作物に関する。
【0110】
これら及び他の植物に関する適切な形質転換技術を記載している参考文献は、特許出願連番第09/846,758号に列挙されている。
【0111】
熟練者は、幅広い種々の形質転換技術が当該分野に存在していることを認識していて、新しい技術が継続して入手可能になっている。標的宿主植物にとって適した任意の技術を、本発明の範囲内で用いることが可能である。例えば、コンストラクトを、DNAの鎖に限定されるものではないが、プラスミド、又は人工染色体を含む種々の形態へ導入することが可能である。標的植物細胞へのコンストラクトの導入は、限定されるものではないが、アグロバクテリウム媒介形質転換、エレクトロポレーション、マイクロインジェクション、マイクロプロジェクタイル・ボンバード・リン酸カルシウムDNA共沈殿、又はANT1コード化配列を含む非相同的核酸コンストラクトのリポソーム媒介形質転換を含む、種々の技術によって完遂することが可能である。植物の形質転換は、すなわち、導入発現コンストラクトの宿主植物ゲノムへの組み込みによって、好ましくは永久的なものであり、導入コンストラクトは、次の植物世代へ受け継がれる。
【0112】
一実施態様では、二元Tiベースベクター系を、同定した遺伝子の増幅発現を特定の植物特性又は表現型へ転移されたり、その間の関連を確かめたりするために用いることができる。pBI121等の標準的アグロバクテリウム二元ベクターは、当該分野の熟練者に知られており、その多くは商業的に入手可能である(Clontech Laboratories, パロ・アルト, カリフォルニア)。
【0113】
アグロバクテリウムベクターによる植物の形質転換にとって最適な手法は、形質転換される植物の型によって変化する。アグロバクテリウム媒介形質転換に関する例示的方法には、不稔性の若木及び/又は苗木から誘導した胚軸、茎頂、茎又は葉組織の外植片の形質転換が含まれる。そのような形質転換植物は、性的に、又は細胞又は組織培養によって再生されることが可能である。アグロバクテリウム形質転換は、以前、多くの異なる型の植物に関して記載されていて、そのような形質転換に関する方法は、科学的文献に見出すことができる。
【0114】
意図された用途によって、ANT1表現型に関連した核酸配列を含み、全タンパク質、又は、植物細胞の形質転換及びトランスジェニック植物の作製に関するその生物学的活性部分をコードする、非相同的な核酸コンストラクトが作製され得る。
【0115】
ANT1核酸配列又は相同体、その変異体又は断片の発現は、構成性、誘導性又は制御可能なプロモーターのコントロールの下でおこなうことができる。ある場合には、ANT1核酸配列又は相同体、その変異体又は断片の発現は、発生段階又は組織関連又は組織特異的な様式で制御され得る。従って、ここに記載の核酸コード化配列の発現は、発現のレベル、発現が起こる組織型及び/又はANT1コード化配列の発現が植物で調節される幅広い範囲の応用につながる発生段階の発現に関して制御され得る。
【0116】
エンハンサーを有する強力なプロモーターは、高いレベルの発現を引き起こすことができる。低レベルの基礎的活性が所望される場合、弱いプロモーターは、より良い選択である。ANT1核酸配列又は相同体、その変異体又は断片の発現は、植物発現ベクターでの細胞型特異的プロモーター又はプロモーターエレメントの使用によって、転写レベルでもコントロールすることができる。
【0117】
非相同的遺伝子発現にとって有用な多くのプロモーターが入手可能である。例示的な構成性プロモーターは、ラズベリーE4プロモーター(米国特許第5,783,393号及び第5,783,394号)、35SCaMV(Jones JDら, 1992)CsVMVプロモーター(Verdaguer Bら, 1998)及びメロンアクチンプロモーターを含む。例示的な組織特異的プロモーターは、トマトE4及びE8プロモーター(米国特許第5,859,330号)及びトマト2AII遺伝子プロモーター(Van Haaren MJJら, 1993)を含む。
【0118】
ANT1配列がプローブとしての用途が意図される場合、ANT1コード化配列の特定の部分、例えば、コード化配列の高度に保存された部分が使用され得る。
【0119】
さらにその他の側面では、ある場合には、宿主細胞内で内因性ANT1配列の発現を阻害することが所望されるであろう。本発明のこの側面を実行するための例示的方法は、限定されるものではないが、アンチセンス抑制(Smith, ら, 1988);同時抑制(Napoli,ら, 1989);リボザイム(PCT公開公報国際公開第97/10328号);及びセンス及びアンチセンスの組み合わせ(Waterhouseら, 1998)が含まれる。宿主細胞での内因性配列の抑制に関する方法は、通常は、少なくとも抑制されるべき配列の一部分の転写、又は転写及び翻訳を用いる。そのような配列は、内因性配列の非コード化領域だけでなくコード化領域と相同的であり得る。ある場合は、ANT1ヌクレオチド配列の発現を阻害することを所望してもよい。これは、ここで提供されているANT1ヌクレオチド配列をともない、当該分野の熟練者によって一般的に用いられている手法を利用して完遂することができる。
【0120】
クローン遺伝子と観察される表現型の間の関連を解析するために、標準的分子及び遺伝的試験をおこなうことができる。植物での遺伝子又は遺伝子産物の機能を決定する(予想すること又は確かめること)のに有用な多くの他の技術は、下に記載されている。
【0121】
DNA/RNA解析
変異体植物から取得したDNAを配列決定して、ヌクレオチドレベルでの変異を同定することができる。変異表現型は、野生型(WT)遺伝子を過剰発現させることによって救済することができる。例えば、インサイツハイブリダイゼーションによって、変異体対WT株の段階及び組織特異的遺伝子発現パターンを決定することができる。遺伝子、特にフランキング制御領域のメチル化体質の解析をおこなうことができる。他の適切な技術には、過剰発現、異所性発現、他の植物種及び遺伝子ノックアウトでの発現(逆遺伝学、標的ノックアウト、ウイルス誘導遺伝子サイレンシング(VIGS, Baulcombe D, 1999を参照せよ)が含まれる。
【0122】
好ましい応用では、発現プロファイリング又は転写プロファイリングとしても知られているマイクロアレイ解析は、多くの異なる遺伝子の異なる、又は誘導変化を同時に測定するのに使用される。マイクロアレイ解析に関する技術は、当該分野で良く知られている(Schena Mら, Science(1995) 270: 467−470;Baldwin Dら, 1999;Dangond F, Physiol Genomics(2000)2:53−58;van Hal NLら,J Biotechnol(2000) 78: 271−280;Richmond T及びSomerville S, Curr Opin Plant Biol (2000)3:108−116)。個々のタグ株のマイクロアレイ解析を、特に遺伝子が単離されたものについておこなうことができる。そのような解析は、対象の遺伝子の過剰発現の結果として、協調的に制御されている他の遺伝子を同定することが可能であり、それは、未知の遺伝子を特定の経路に配することを補助し得る。
【0123】
遺伝子産物解析
遺伝子産物の解析には、組み換えタンパク質発現、抗血清産生、免疫局在性、触媒又は他の活性に関する生化学的アッセイ、リン酸化状況の解析、及び酵母ツーハイブリッドアッセイを介する他のタンパク質との相互作用の解析が含まれる。
【0124】
経路の解析
経路の解析には、遺伝子又は遺伝子産物の過剰発現の表現型に基づいて、又は関連遺伝子との配列相同性によって、特定の生化学的又はシグナル伝達経路内に遺伝子又は遺伝子産物を配することを含めることができる。あるいは、解析には、経路に遺伝子を順付けるため、又は経路の下流の「レポーター」遺伝子の発現に対する変異の効果を確かめるためのWT株と他の変異株(二重変異を作製すること)の遺伝的交差を含めることができる。
【0125】
他の解析
特定の代謝又はシグナル伝達経路への単離された遺伝子及びその産物の関与を測定し確認するため、そして遺伝子機能の測定を補助するために、他の解析をおこなってもよい。
【0126】
すべての刊行物、特許及び特許出願は、ここで明確にそれらのすべてが参考文献として取り入れられている。
【0127】
本発明は、特定の方法及び実施態様に関連して記載されているが、種々の修飾及び変化は、本発明から離れることなく作製され得ることが理解されるであろう。
【0128】
実施例1
活性化タギングコンストラクトでの形質転換による、ANT1表現型を有する植物の作製
I. アグロバクテリウムベクターの調製
活性化タギング「ACTTAG」ベクターの修飾形であるpSKI015(GenBank Identifier[GI]6537289;Weigel Dら,2000)を使用することで、変異体を作製した。pAG3202と呼ばれるこの二元ベクターは、次の成分を有する:pSKIバックボーン; タンデムに4つのAlu1−EcoRV断片を含むCaMV35Sプロモーターのエンハンサー領域の4つのタンデムリピート、各タンデムAlu1−EcoRVリピートと結合している129bpのCaMV配列、及び天然CaMVゲノムの35Sエンハンサー領域には無い付加的な7bp繰り返し配列で構成される4X 35Sエンハンサー;ラズベリーE4(RE4)プロモーターのコントロール下のnptII選択可能マーカー;プラスミドの左境界域に近接する、nptII遺伝子の下流に位置するアグロバクテリウム遺伝子7終止エレメント。pAG3202配列は、配列番号:3に提供されている。
【0129】
二元プラスミドpAG3202を含有するアグロバクテリウム・ツメファシエンス株EHA 105/EHA 101/GV3101の単一コロニーは、pH5.4で、終夜にわたってMGL培地で生育し、MGL又は液体植物同時培養培地でおよそ5x108細胞/mlに希釈された。
【0130】
長期の貯蔵のために、PCRポジティブコロニーを選択培地で生育させ、30%の最終濃度となるようグリセロールを添加し、培養を素早く凍結させ、そして−80℃で貯蔵した。植物形質転換のための密度の高いアグロバクテリウム培養の開始のために、貯蔵培養を選択培地で生育させ、30%の最終濃度となるようにグリセロールを添加し、そして、幾らかの20μlアリコートを液体窒素で素早く凍結させて、−80℃で貯蔵した。
【0131】
II. マイクロトム変異体の形質転換及び選択
活性化タギング変異体を、アグロバクテリウム媒介形質転換を利用して、トマトcv. マイクロトムで作製した。不稔性の若木及び苗木を、外植片の起源として用いた。より特異的には、胚軸組織を形質転換した。
【0132】
(Lycopersium esculentum)の種子は、15分間、 ツイーン −20を含む25%漂白剤で表面を殺菌し、必要だとして、オーキシン及び/又はサイトカイン及びジベレリン酸の添加によって修飾した種子発芽培地(MS塩類、Nitschビタミン類、3%スクロース及び0.7%寒天,pH5.8)に配する前に無菌水で洗浄した。この培養は、24℃で16時間の光期間によってインキュベートした(50−60μmol. m−2s−1)。7から10日齢の若木及び一月齢のインビトロ植物を胚軸外植片として使用した。
【0133】
胚軸を3−5mmのセグメントに切り、次いで、細菌懸濁液に浸し、無菌フィルターぺーパー上にブロットし、そして同時培養培地に配した。この外植片を細菌懸濁液に浸し、無菌フィルターペーパー上にブロットし、そして2−3日の間、同時培養培地に配した(MS塩類、LSビタミン類、3%スクロース、0.1mg/lキネチン、0.2mg/l 2,4−D、200mg/l リン酸カリウム、50μM アセトシリンゴン及び0.7%寒天、pH5.4)。
【0134】
2から3日の同時培養の後、nptII発現形質転換体を選択するために抗生物質である75−400mg/lのカナマイシンを補充した、pH5.8のMS塩類、Nitschビタミン類、3%スクロース、2mg/lゼアチン、500mg/lカルベニシリン、200mg/Lチメチン(timetin)及び0.7%寒天を含有する苗条再生培地へ外植片を移植した。抗生物質の選択レベルを、組織応答に基づいて、徐々に8週間にわたって上昇させた。
【0135】
2週間毎に、外植片を新鮮な培地へ移植した。初期の苗条の兆候をともなうカルスの開始は、外植片の型によって3−6週間の間観察できる。カルス化及び苗条の再生は、外植片組織が衰退した後でおよそ4ヶ月にわたって継続することが観察された。紫カルスは、選択培地上で生育する組織の中に観察された。再生した苗条は、様々な色の表現型を示し、すべてが緑、すべてが紫、又は様々な程度で緑と紫の混合であった。はっきりとした苗条成長点をともなうおよそ1cmの大きさの緑の苗条をカルスから切り取り、MS塩類、Nitschビタミン類、3%スクロース、1mg/l IBA、50mg/lカナマイシン、100mg/lカルベニシリン又は100mg/Lチメチン(timetin)及び0.7%寒天、pH5.8を含有する根誘導培地へ移した。根を下ろした植物を、バイオセーフティーな温室の土壌へアウトプラントした。
【0136】
植物は、温室施設へ輸送されて、植物同定のための3.5’’ ポットタッグに植え付けられた。
【0137】
形質転換体は、カルスの段階で、また、T1植物が温室で、野生型マイクロトム植物と比較して、表現型変異体に関して確立された後で観察された。これに到達するまでに、野生型植物をトランスジェニック植物の極めて近くに置いた。各植物は、週に2回、しっかりと観察して写真で観察を注記し記録した。
【0138】
8つの植物の各プールのイメージを、デジタルカメラ(DC−260)を使用して記録し、形態観察は、植えた後の約4週目におこなった。
【0139】
11のマイクロトム株を、そのカーロジェニックな段階(caulogenic stage)での紫色及び紫根によって元々は同定されたカルスから発生した。このクローン植物株は、葉の上の深い紫のカストを有する修飾葉、花弁及び萼片及び花冠の標準黄色と混合した紫カストを有する花の上の紫筋によって特徴付けられる修飾花を有するとして同定される。この植物は、また、野生型マイクロトム植物と比較して深紅色として記載される修飾果実色を示すことが観察されている。このクローン植物株(変異体)は、アントシアニン1(「ANT1」)と命名された。
【0140】
このANT1変異体は、二元プラスミドpAG3202による組織培養形質転換、そしてカナマイシン含有培地上での選択によって開発した2000より少ない個々のマイクロトムトマトACTTAG株から同定された。
【0141】
観察をおこない、写真が撮られたANT1表現型を示すクローンT1ANT1植物株を、H000001484、H000001624、H000001708、H000001709、H000001710、H000001711、H000001712、H000001713、H000001715、H000001716及びH000001717と命名した。
【0142】
種子は、株H000001624のT1植物から収集し、生育させてT2植物を発生させた。発芽した18の種子のうちの11から、8つの植物が紫色を示し、ANT1はドミナント変異体であることが確かめられた。
【0143】
この結果は、ANT1が、天然遺伝子の活性化タギングを基礎とする過剰発現から期待される機能特性の獲得であることを示した。
【0144】
実施例2
ANT1 表現型を示す植物の特徴付け
マイクロトムゲノムDNAを、最初にカルスの段階で同定され、下記の手法を用いて活性化タグ植物株のプラスミドレスキューに関して十分な産生及び質として同定された活性化タギング変異体H000001484クローンから抽出された。さらなる解析を、H000001624、H000001708、H000001709、H000001710、H000001711、H000001712、H000001713、H000001715、H000001716及びH000001717植物株から誘導した混合組織を用いておこなった。
【0144】
I. マイクロトムトマトゲノム DNA 抽出物
アマシャム(商品名)のNucleon(商品名)PhytoPure(商品名)システム(植物及び糸状菌DNA抽出キット)を、ゲノムDNAの抽出に用いた。方法は、基本的に次の通りである:
【0145】
H000001484クローンの1.0gの新鮮な組織を液体窒素ですりつぶして自由に漂う粉体にし、次いで、15mlのポリプロピレン遠心分離管に移した。Nucleon Phytopureキットの4.6mlの試薬1を十分な混合によって添加し、均一な混合物が得られるまで反転させることによってNucleon Phytopureキットの1.5mlの試薬2の添加を続けた。この混合物を65℃で、10分間にわたって振盪ウォーターバスでインキュベートし、20分間氷上に配した。この試料を氷から取り除き、2mlの−20℃のクロロホルムを添加し、混合して、10分間、1300gで遠心分離した。その上澄みを2mlの冷クロロホルム、200μlのNucleon Phytopure DNA抽出樹脂懸濁液を添加した新鮮な試験管へ移し、その混合物を室温で10分間、チルトシェーカー上で振盪し、次いで10分間、1300gで遠心分離した。Nucleon樹脂懸濁層を撹拌せずに、上層のDNA含有相を新鮮な試験管へ移し、上相に曇りがあるならば、30分間、9500rpmで遠心分離して移した水相を透明にし、等量の冷イソプロパノールを添加し、そしてその試験管をDNAが沈殿するまで緩やかに反転させた。その後で、それを遠心分離によってペレットにし、冷70%エタノールで洗浄し、再びペレットにし、そして空気乾燥させた。
【0146】
DNAをリボヌクレアーゼを含有するTE緩衝液(10mMトリス、HCl、pH7.4、1mM EDTA)に懸濁させ、15分間、55℃でインキュベートし、さらにフェノール/クロロホルム、次いでクロロホルムで抽出し、1%アガロースゲルに流してDNAの質を確かめ、そのDNA濃度をDNA蛍光光度計(Hoeffer DyNA Quant 200)で測定した。
【0147】
カーロジェニックカルスな段階(caulogenic callus stage)にあり、野生型植物からのH000001484ANT1クローンの苗条から抽出したDNAを、35Sエンハンサー配列を増幅するプライマー、及びpAG3202のpBluescriptベクター配列の領域を増幅するプライマーを使用してPCR増幅した。35Sエンハンサー領域を測るプライマーを使用した増幅は、はしご状の産物を生じ、これは、35Sエンハンサーのすべて4つのコピーが存在していたことを示す。pBluescriptベクターに対するプライマーを使用する増幅は、形質転換植物のT−DNA挿入を検出するために主におこなわれ、次の条件のために最適化された:アニーリング温度:57℃、30サイクル[94℃、30秒;57℃、1分;72℃、1分]1サイクル[72℃、7分]。
【0148】
ACTTAG(商品名)株であるH000001484(ANT1)は、PCRによって、35Sエンハンサー及びpAG3202ベクター配列の存在に関してポジティブ、ACTTAGDNAのゲノムへの組み込み、及びクローントランスジェニック株での単一T−DNAの挿入の存在を示すサザンハイブリダイゼーションに関してポジティブであることが確かめられた。
【0149】
II. プラスミドレスキュー
H000001484クローン株のゲノムDNAを、サザンハイブリダイゼーションで使用する制限酵素によって消化した。その制限断片を自己ライゲーションし、大腸菌細胞を形質転換するために使用した。完全長pBluescriptベクター、4X 35Sエンハンサーを含有するプラスミド、及び右境界域T−DNAフランキングゲノムDNA断片を救済した。
【0150】
より具体的には、ゲノムDNAを、37℃で一晩、標準反応条件下でHindIII及びXhoIにより消化した。
【0151】
ライゲーション反応を以下を含めて設定し、16℃で一晩放置した:
【0152】
ライゲーションしたDNAを沈殿させ、ddH2Oに再懸濁させ、10pgのpUC18プラスミドをコントロールとして、エレクトロポレーションによって大腸菌SURE細胞(ストラタジーン)を形質転換するのに使用した。
【0153】
この形質転換混合物を、100μg/mlのアンピシリンを含有する2つのLBプレートに拡散し、37℃で一晩インキュベートした。そのプレートから単一コロニーを拾い上げ、37℃で一晩培養することによる、各コロニーの5ml LB−アンピシリン液体培養を開始した。プラスミドを培養から抽出し制限消化をしてゲノム挿入物の大きさを確かめた。
【0154】
III. レスキュープラスミドのシーケンシング
ABI Prism BigDye(商品名)Terminator Cycle シーケンシングReady Reactionキット(PEアプライド・バイオシステム)、AmpliTaq DNAポリメラーゼ(パーキン・エルマー)、ABI Prism(商品名)310 Genetic Analyzer(パーキン・エルマー)、及び配列解析ソフト、例えば、Sequencer(商品名)3.1.1又はMac Vector6.5.3を使用して、シーケンシングを完遂した。シーケンシングは、基本的には、製造者指示書に従っておこなわれた。
【0155】
救済されたプラスミドの左末端を、右T−DNA境界域を越えてシーケンシングした。
【0156】
救済した配列を、www.ncbi.nlm.nih.gov/BLASTウェブサイトのBLAST配列比較プログラムを使用する解析に供した。基礎的なBLASTNによる探索によって、配列がペチュニア・インテグリフォリア(Petunia integrifolia)(GI 7673087及び7673085)のアントシアニン2(An2)のmRNAと31%の同一性であることを同定した。オープンリーディングフレーム(即ち、ANT1 cDNA)の存在は、BLASTXプログラムを使用して予測された。
【0157】
RT−PCR解析によって、ヌクレオチド配列が配列番号:1(ANT1)に存在する遺伝子は、ANT1表現型を有する植物の組織で特異的に過剰発現していることが確かめられた。特に、RNAを、ANT1表現型を示すH000001624クローン植物株から誘導した混合組織、及び野生型植物から抽出した。RT−PCRは、配列番号:1として示される配列、及び構成的に発現するアクチン遺伝子(ポジティブコントロール)に対して特異的なプライマーを使用しておこなった。この結果は、ANT1表現型を示す植物がANT1遺伝子のmRNAを過剰発現することを示し、これは、ANT1遺伝子の増大した発現が、ANT1表現型と関連していることを示す。
【0158】
ANT1核酸配列から予測されたアミノ酸配列は、ベクターNTI(InforMax,ノースベセズダ,メリーランド)を使用して決定され、配列番号:2に示されている。ncbi.nlm.nih.gov/BLASTウェブサイト及び予測ANT1アミノ酸配列を使用するBasic BLASTP 2.0.11探索をおこなった。結果は、予測ANT1タンパク質配列が、ペチュニア・インテグリフォリア(Petunia integrifolia)のAn2タンパク質配列(GI 7673088及び7673086)と49%の同一性、及び配列番号:2のおよそアミノ酸1−120のN末端領域の幾つかのMyb関連転写因子と65%−85%の同一性を有することを示唆した。これらMyb関連タンパク質は、ペチュニアxハイブリッド(GI 7673084)のAn2、トウモロコシC1−I(GI22214)、トウモロコシPL転写因子(GI2343273)及びシロイナズ転写因子(GI3941508)を含む。ペチュニアAn2遺伝子は、アントシアニン生合成経路の制御因子である(Quattrocchioら, 1999)。
【0159】
これらの結果は、ANT1が、マイクロトマトの修飾葉、花、果実色と関連していることを示唆する。
【0160】
実施例3
マイクロトマトの表現型 / 遺伝子型の検証
ANT1表現型と配列番号:1に示すANT1遺伝子の間の関連をさらに確かめるために、配列番号:4に提供したANT1遺伝子を含むゲノム断片を、野生型マイクロトム植物で過剰発現させた。特に、ANT1コード化領域を含むこの1012bpゲノム断片を、二元ベクターpAG2370のマルチクローニング部位(MCS)へクローニングした。配列が配列番号:5に提供されているpAG2370は、二元ベクターpBIN19(GI1256363)のベクターバックボーン、T−DNA左及び右境界域断片、及び、境界域断片の間では、挿入遺伝子の発現をコントロールするCsVMVプロモーター配列及びNos終止配列 、発現がRE4プロモーター(米国特許第6054635号)及びG7終止配列によってコントロールされていて、カナマイシン耐性を付与するネオマイシンホスホトランスフェラーゼ(NPTII)遺伝子を含む。このANT1断片をpAG2370のSmaI/SpeI部位へクローニングし、ゲノム断片の5’ 末端に近接するCsVMVプロモーター領域と、ゲノム断片の3’ 末端に近接するNos終止配列の間に挿入した。このpAG2370−ANT1コンストラクトをアグロバクテリウム・ツメファシエンス(Agrobacterium tumefaciens )へエレクトロポレーションによって形質転換した。
【0161】
基本的に実施例1に記載のように、上記のpAG2370−ANT1コンストラクトを、アグロバクテリウム媒介形質転換によって野生型マイクロトム植物へ導入した。要約すると、外植片をマイクロトムの苗木から切り取った。外植片を15から120分にわたってアグロバクテリウム懸濁液中に浸すことによって播種し、無菌フィルターペーパー上にブロットして過剰な細菌を取り除いて配した。外植片を、16時間の明期、24℃で2−4日にわたって非選択培地で同時培養し、その後に、選択培地(カナマイシンを含む)へ移し、生育室へ戻した。外植片は、苗条が0.5から1cmの高さになるまで2週間毎に新鮮培地へ移した。苗条を外植片から切り出し、Phytatrays(シグマ)中のカナマイシンを含有する選択培地へ配し、2から4週間、生育室へ戻した。苗条には発根が観察され、根がついた苗条は、土壌に根を下ろし、温室に順応した。この形質転換過程は、64の独立したT0事象を生じた。形態学的な観察によって、45のトランスジェニック植物がANT1紫色表現型を示し、部分的に又は全てが紫のいずれかであったことが示された。ANT1表現型を示す6つのT1植物から組織が収集され、野生型をコントロールに使用して、RT−PCRをおこなった。ANT1遺伝子発現では野生型コントロールで検出されなかったが、ANT1表現型を示す6つの植物のうちの5つは、ANT1転写物を過剰発現した。構成的に発現されるアクチン遺伝子を使用した内部コントロール実験は、すべての試料が同じレベルのアクチン発現を有することを示した。
【0163】
実施例4
シロイナズでの表現型 / 遺伝子型の検証
マイクロトム以外の植物でのANT1表現型とANT1遺伝子の間の関連をさらに確かめるために、ANT1遺伝子を野生型シロイヌナズナ (Arabidopsis thaliana)に導入し、過剰発現させた。
【0164】
上記のpAG2370−ANT1コンストラクトを、標準真空浸潤法を使用するアグロバクテリウム媒介形質転換によって野生型シロイナズ植物へ導入した。すべての浸透種子を、カナマイシン含有選択培地へプレートし、カナマイシン耐性T1植物を72細胞フラットへ移植した。この形質転換プロセスは、10の独立したT0事象を発生させ、そのうちの7つは、少なくとも植物の一部分にANT1紫色表現型を示した。ANT1表現型を示す4つのT1植物から組織を収集し、野生型をコントロールとして使用し、RT−PCRをおこなった。ANT1遺伝子発現では野生型コントロールで検出されなかったが、ANT1表現型を示すすべての植物が、ANT1転写物を過剰発現した。構成的に発現されるアクチン遺伝子を使用した内部コントロール実験は、すべての試料が同じレベルのアクチン発現を有することを示した。
【0165】
実施例5
タバコでの表現型 / 遺伝子型の検証
【0166】
マイクロトム以外の植物でのANT1表現型とANT1遺伝子の間の関連をさらに確かめるために、ANT1遺伝子を野生型タバコ(Nicotiana tabacum)(タバコ、ウイスコンシン−38型)に導入し、過剰発現させた。
【0167】
上記のpAG2370−ANT1コンストラクトを、基本的に以下の方法を用いるアグロバクテリウム媒介形質転換によって、野生型タバコ植物へ導入した。形質転換のためのタバコ植物を生成するために、タバコ種子を次のように発芽させた:種子を、約1.3%から2.1%の次亜塩素酸ナトリウム及び100ミリリッター当たり1滴のトゥイーン−20(ポリオキシエチレンソルビタン・モノラウリン酸)を含有する溶液で、約10分間、実験室シェーカーで振盪した。次いで、種子を無菌水で洗浄し、容器当たり10−50種子で、ペトリ皿又はPhytatrays(シグマ)のTbSG培地(4.3g/l ムラシゲ・スク−グ塩類、Phytotech;1ml/l MSビタミン類、シグマ;30g/l スクロース;8g/l寒天、シグマ;pHを〜5.8に調整)の表面へ無菌的に移し、光の下で25℃でインキュベートした。タバコ植物を、無菌な、脱イオン水又は液体TbCo培地(4.3g/l ムラシゲ・スク−グ塩類、Phytotech;1ml/l MSビタミン類、シグマ;30g/l スクロース;200mg/l KH2PO4 ;2mg/l インドール−3−酢酸;0.25mg/l キネチン;0から100μM (薬品)アセトシリンゴン;7g/l寒天、シグマ;pHを5.4−5.6へ調整)で湿らせた無菌フィルターペーパー上で切り裂いた。すべての側面上に切り口を有する外植片は、葉を植物から切り出すこと、中央葉脈を切り裂きそして捨てること、そして3から5mm2 に葉のラミナを切ることによって作り出すことができた。あるいは、花盤は、無菌のコークボーラー(cork borer)を使用して、ラミナから切り出すことができる。
【0168】
外植片を、pAG2370−ANT1コンストラクトで調製したアグロバクテリウム懸濁液(OD600が0.175と0.225の間)中に15−120分間浸すことによって播種し、次いでTbCo培地上にブロットしてプレートした。外植片は、16時間の明期、24℃で2−4日間にわたって同時培養し、次いで、カナマイシンを含有するTb選択培地(4.3g/l ムラシゲ・スク−グ塩類;1ml/l Nitsch及びNitschビタミン類、Duchefa;30g/l スクロース;0.5から2mg/l 6−ベンジルアミノプリン;0から1mg/l ナフチル酢酸;0から750mg/l カルベニシリン;0から300mg/l チメンチン(Timentin);0から500mg/l カナマイシン;7から8g/l寒天、シグマ;pHを〜5.8に調整)へ移し、苗条が0.5から1cmの高さになるまで2週間毎に再移植をした。苗条は、外植片から切り出し、Phytatrays中のカナマイシンを含有するTbR培地(4.3g/l ムラシゲ・スク−グ塩類及び1ml/l Nitschビタミン類、Duchefa;30g/l スクロース;0から1mg/l インドール−3−酪酸;0から1mg/l ナフチル酢酸;0から100mg/l カルベニシリン;0から200mg/l チメンチン(Timentin);0から100mg/l カナマイシン;7から8g/l寒天、シグマ;pHを〜5.8に調整)に配し、2から4週間生育させて、その後で根を付けた苗条は土壌に植えられた。
【0169】
この形質転換プロセスは、89の独立したT0事象を発生させ、そのうち54が、少なくとも植物の一部分でANT1紫色表現型を示した。ANT1表現型を示す5つのT1植物から組織を収集し、野生型をコントロールとして使用し、RT−PCRをおこなった。ANT1遺伝子発現では野生型コントロールで検出されなかったが、ANT1表現型を示すすべての植物が、ANT1転写物を過剰発現した。構成的に発現されるアクチン遺伝子を使用した内部コントロール実験は、すべての試料が同じレベルのアクチン発現を有することを示した。
【0170】
実施例6
トマト及びタバコでの ANT1 遺伝子の形質転換マーカーとしての用途
【0171】
上記のようにして、トマト及びタバコでANT1表現型を成功裏に再利用し、我々は、ANT1遺伝子の特徴的紫色に基づいて、これらの種で、ANT1遺伝子の形質転換マーカーとしての用途を試験した。我々は、上の実施例に記載の方法を利用して、タバコ及びマイクロトム外植片をpAG2370−ANT1ベクターで形質転換し、抗生物質(カナマイシン)の存在及び非存在下で外植片を生育させ、培地中の抗生物質の存在下での発根に基づく形質転換頻度を紫色に基づく形質転換頻度と比較した。結果は、下の表に示してある。
【0172】
【0173】
この結果は、ANT1遺伝子が、トマト及びタバコの培養における、ポジティブな形質転換のスクリーニングに成功裏に利用でき、他の植物でも有用であり得ることを示した。
【0174】
参考文献
Altschul, S. F. ら, J. Mol. Biol. 215:403−410, 1990.
Altschul, S. F. ら, Nucleic Acids Res. 25:3389−3402, 1997.
Ausubel F M ら, Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, New York, N.Y., 1993.
Baldwin D ら, Cur Opin Plant Biol. 2(2):96−103, 1999.
Barker D H ら, Plant Cell and Environment 20: 617−624, 1977.
Baulcombe D, Arch Virol Suppl 15:189−201, 1999.
Behringer 及び Medford, Plant Mol. Biol. Rep. 10(2):190−198, 1992.
Burger J 及び Edwards G E. Plant and Cell Physiology 37: 395−399, 1996.
Carter ら, Nucl. Acids Res. 13:4331, 1986.
Christensen S ら, 9th International Conference on Arabidopsis Research. Univ. of Wisconsin−Madison, June 24−28, 1998. Abstract 165.
Coley P D 及び Kusar T A. In: Mulkey S S, Chazdon R L, Smith A P, eds. TROPICAL FOREST PLANT ECOPHYSIOLOGY. New York: Chapman and Hall 305−335,1996.
Cough, S J 及び Bent, A F, the Plant Journal 16(6): 735−743, 1998.
Crameri A 及び Stemmer W P, Bio Techniques 18(2):194−6, 1995.
Creighton, T. E., PROTEINS: STRUCTURE AND MOLECULAR PROPERTES, W. H. Freeman & Co., San Francisco, pp. 79−86, 1983.
Dodd I Cら,Journal of Experimental Botany 49: 1437−1445, 1998.
Doolittle, R. F., OF URFS and ORFS (University Science Books, CA, 1986.)
Dooner ら, 1991, Ann.Rev.Genet. 25:179−199.
Fang G ら, Plant Cell., 1(1): 141−50, 1989.
Feldman ら, Science 243: 1351−1354, 1989.
Fridborg I ら, Plant Cell 11: 1019−1032, 1999.
Furuta S ら, Sweetpotato Res Front (KNAES, Japan) 1:3, 1995.
Geest A H 及び Hall T C, Plant Mol Biol 32(4):579−88, 1996).
Gelvin, S. B., Schilperoort, R. A., Varma, D. P. S., eds. Plant Molecular Biology Manual 1990.
Glick, B R 及び Thompson, J E, Eds. METHODS IN PLANT MOLECULAR BIOLOGY AND BIOTECHNOLOGY, p. 213−221, CRC Press, 1993.
Gould K S, ら, Nature 378: 241−242, 1995.
Harling ら, EMBO J. 16: 5855−66, 1997.
Haught C ら, BioTechniques 16(1):47−48, 1994.
Hayashi H ら, Science 258: 1350−1353, 1992.
Harbone J B, The Flavonoids: Recent Advances. In: Goodwin T W, ed. PLANT PIGMENTS. London: Academic Press, 299−343, 1988.
Jakobovits, A, ら, Ann N Y Acad Sci 764:525−35, 1995.
Jakobovits, A, Curr Opin Biotechnol 6(5):561−6, 1995.
Jayaram 及び Peterson, 1990, Plant Breeding Reviews 2:91−137; Coe, 1994,
In `The Maize Handbook`, Freeling and Walbot, eds. Springer Verlag New York Inc., p. 279−281
Jensen, L. G., ら, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93:3487−3491, 1996.
Jones ら, Nature 321:522−525, 1986.
Jones J D ら, Transgenic Res 1:285−297 1992.
Kakimoto, Science 274: 982−5, 1996.
Kamei H ら,J Clin Exp Med 164: 829, 1993.
Kardailsky I ら, Science 286: 1962−1965, 1999.
Klaper R ら, Photochemistry and Photobiology 63: 811−813, 1996.
Kohler 及び Milstein, Nature 256:495, 1975.
Kunkel T A ら, Methods Enzymol. 204:125−39, 1991.
Liu ら, Plant Journal 8(3) 457−463, 1995.
Marks 及び Feldman, Plant Cell 1:1053−1050, 1989.
Meissner ら, The Plant Journal 12(6) 1465−1472, 1997.
Miklashevichs ら, Plant J. 12: 489−98, 1997.
Napoli, ら, Plant Cell 2:279−289, 1990.
Novak, J 及び Novak, L, Promega Notes Magazine Number 61:27, 1997.
Omirulleh ら, Plant Mol Biol. 21(3):415−28, 1993.
Quattrocchio F ら, 1999, Plant Cell 11: 1433−1444
Riechmann ら, Nature 332:323−327, 1988.
Sambrook ら, Molecular Cloning: A Laboratory Manual (Second Edition), Cold Spring Harbor Press, Plainview, N.Y., 1989.
Schaffer R, ら, Cell 93: 1219−1229, 1998.
Schell ら, Trends Plant Sci. 3: 130, 1998.
Scott, J W 及び Harbaugh, B K, University of Fla. Circular S−370, Dec. 1989.
Sherwin H W 及び Farrant J M., Plant Growth Regulation 24: 203−210, 1998.
Smith, ら, Nature 334:724−726, 1988.
Suda I, ら, 1997. Sweetpotato Res Front (KNAES, Japan) 4:3, 1997.
Van Haaren M J J ら, Plant Mol Bio 21:625−640, 1993.
Verdaguer B ら, Plant Mol Biol 37:1055−1067, 1998.
Verhoeyen ら, Science 239:1534−1536, 1988.
Walden ら, EMBO J. 13: 4729−36, 1994.
Walden ら, Plant Mol. Biol. 26: 1521−8, 1994.
Wang C J, ら, H Food Chem Toxicology 38: 411−416, 2000.
Waterhouse, ら, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95:13959−13964, 1998.
Wells ら, Gene 34:315, 1985.
Wells ら, Philos. Trans. R. Soc. London SerA 317:415,1986.
Weigel D, ら, Plant Physiology, 122:1003−1013, 2000.
Wilson K ら, Plant Cell 8: 659−671, 1996.
Xu Y L, ら, Plant Cell, 11: 927−36, 1999
Yamasaki H Trends in Plant Science 2:7−8, 1997
Zollerら, Nucl. Acids Res. 10: 6487, 1987
Claims (12)
- 配列番号:2に示すアミノ酸配列と少なくとも70%の配列同一性を有するANT1ポリペプチドをコードする配列をコードするか、又は相補的である核酸配列を含んでなる単離されたポリヌクレオチド。
- 配列番号:1で示される核酸配列、又はその相補鎖又は断片と、高度にストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸配列を含んでなる、請求項1のポリヌクレオチド。
- ANT1ペプチドが、配列番号:2で示されるアミノ酸配列と少なくとも80%の配列同一性を有する、請求項1のポリヌクレオチド。
- ANT1ペプチドが、配列番号:2で示されるアミノ酸配列と少なくとも90%の配列同一性を有する、請求項1のポリヌクレオチド。
- ANT1ペプチドが、配列番号:2で示されるアミノ酸配列を有する、請求項1のポリヌクレオチド。
- 配列番号:1で示される核酸配列、又はその相補鎖を含んでなる、請求項1のポリヌクレオチド。
- 請求項1の単離されたポリヌクレオチドを含んでなる植物形質転換ベクター。
- 請求項7のベクターを含んでなるトランスジェニック植物細胞。
- 植物でANT1表現型を産する方法であって、植物の前駆細胞へ請求項7に記載の植物形質転換ベクターを導入し、トランスジェニック植物を産するように該形質転換前駆細胞を生育させることを含んでなり、前記ポリヌクレオチド配列が発現し、前記トランスジェニック植物がANT1表現型を示す前記方法。
- 請求項9の方法によって得られる植物。
- 請求項10に記載の植物から得られる植物部分。
- (a)植物の前駆細胞へ最初のポリヌクレオチド及び請求項1に記載のANT1ポリヌクレオチドを含んでなる植物形質転換ベクターを導入し、及び
(b)ANT1表現型を示す植物が、最初のポリヌクレオチドも含む形質転換植物として選択される、ANT1表現型を示す植物を産するように前駆細胞を生育することの段階を含み、最初のポリヌクレオチドを含んでなる形質転換植物を選択する方法。
Applications Claiming Priority (2)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
US24468500P | 2000-10-30 | 2000-10-30 | |
PCT/US2001/050638 WO2002055658A2 (en) | 2000-10-30 | 2001-10-29 | Identification and characterization of an anthocyanin mutant (ant1) in tomato |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
JP2004517621A true JP2004517621A (ja) | 2004-06-17 |
JP4150590B2 JP4150590B2 (ja) | 2008-09-17 |
Family
ID=22923730
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP2002556709A Expired - Fee Related JP4150590B2 (ja) | 2000-10-30 | 2001-10-29 | トマト中のアントシアニン変異体(ant1)の同定と特徴付け |
Country Status (10)
Country | Link |
---|---|
US (1) | US7034138B2 (ja) |
EP (1) | EP1330517B1 (ja) |
JP (1) | JP4150590B2 (ja) |
CN (1) | CN1473195A (ja) |
AT (1) | ATE408009T1 (ja) |
CA (1) | CA2426163A1 (ja) |
DE (1) | DE60135770D1 (ja) |
MX (1) | MXPA03003854A (ja) |
NZ (1) | NZ526084A (ja) |
WO (1) | WO2002055658A2 (ja) |
Cited By (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JP2010517526A (ja) * | 2007-02-06 | 2010-05-27 | ザ ステイト オブ イスラエル ミニストリー オブ アグリカルチャー アンド ルーラル ディベロップメント アグリカルチュラル リサーチ オーガニゼイション (エー.アール.オー.) ザ ボルカニ セ | アントシアニンとフラボノールを大量に含む果物を生産する手段および方法 |
Families Citing this family (12)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US7304207B2 (en) * | 2001-10-29 | 2007-12-04 | Exelixis, Inc. | Identification and characterization of an Anthocyanin mutant (ANT1) in tomato |
WO2003084312A2 (en) * | 2002-04-04 | 2003-10-16 | Exelixis Plant Sciences, Inc. | Identification and characterization of an anthocyanin mutant (ant1) in tomato |
AU2003262898A1 (en) | 2002-08-28 | 2004-03-19 | Michael M. Neff | The gene for a dof transcription factor capable of altering the size and stature of a plant |
EP1618186A2 (en) * | 2003-04-25 | 2006-01-25 | Exelixis Plant Sciences, Inc. | Genes upregulated in a tomato plant having an increased anthocyanin content phenotype |
NZ542110A (en) | 2005-08-30 | 2008-07-31 | Horticulture & Food Res Inst | Compositions and methods for modulating pigment production in plants |
US8008543B2 (en) | 2005-10-26 | 2011-08-30 | Agriculture Victoria Services Pty Ltd | Modification of flavonoid biosynthesis in plants by PAP1 |
AU2006308510B2 (en) * | 2005-10-26 | 2013-01-10 | Agriculture Victoria Services Pty Ltd | Modification of flavonoid biosynthesis in plants |
CN105352999B (zh) * | 2015-10-12 | 2018-02-16 | 临沂大学 | 一种植物体液pH值器外测定的方法 |
CN107365865B (zh) * | 2017-09-01 | 2020-12-08 | 中国农业大学 | 与番茄果实颜色相关的分子标记及其应用 |
CN110402814A (zh) * | 2019-08-20 | 2019-11-05 | 北京市农林科学院 | 一种番茄隐性核雄性不育保持系的选育方法 |
CN113557914B (zh) * | 2021-07-27 | 2023-01-03 | 南方科技大学 | PIFs的暗处稳定剂在促进双子叶植物顶端弯钩发育中的应用 |
CN116904506B (zh) * | 2023-08-31 | 2023-12-12 | 中国科学院华南植物园 | 黑果枸杞LrANT1基因及其编码蛋白的应用 |
Family Cites Families (4)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JP3087246B2 (ja) * | 1991-07-11 | 2000-09-11 | インターナショナル フラワー ディベロップメンツ プロプライアタリー リミティド | フラボノイド経路の酵素をコードする遺伝子配列及びその使用 |
BR9306047A (pt) * | 1992-03-09 | 1997-11-18 | Univ Washington | Métodos para a regulagem de fertilidade de planta |
US5859329A (en) | 1992-08-05 | 1999-01-12 | International Flower Developments Pty. Ltd. | Genetic sequences encoding flavonol synthase enzymes and uses therefor |
JP4051719B2 (ja) | 1996-04-26 | 2008-02-27 | 東洋紡績株式会社 | シロイヌナズナの根毛形成開始を制御するcpc遺伝子及びそれを導入した植物 |
-
2001
- 2001-10-29 DE DE60135770T patent/DE60135770D1/de not_active Expired - Lifetime
- 2001-10-29 CN CNA018182445A patent/CN1473195A/zh active Pending
- 2001-10-29 US US10/033,190 patent/US7034138B2/en not_active Expired - Fee Related
- 2001-10-29 AT AT01993349T patent/ATE408009T1/de not_active IP Right Cessation
- 2001-10-29 WO PCT/US2001/050638 patent/WO2002055658A2/en active IP Right Grant
- 2001-10-29 JP JP2002556709A patent/JP4150590B2/ja not_active Expired - Fee Related
- 2001-10-29 CA CA002426163A patent/CA2426163A1/en not_active Abandoned
- 2001-10-29 MX MXPA03003854A patent/MXPA03003854A/es unknown
- 2001-10-29 NZ NZ526084A patent/NZ526084A/en unknown
- 2001-10-29 EP EP01993349A patent/EP1330517B1/en not_active Expired - Lifetime
Cited By (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JP2010517526A (ja) * | 2007-02-06 | 2010-05-27 | ザ ステイト オブ イスラエル ミニストリー オブ アグリカルチャー アンド ルーラル ディベロップメント アグリカルチュラル リサーチ オーガニゼイション (エー.アール.オー.) ザ ボルカニ セ | アントシアニンとフラボノールを大量に含む果物を生産する手段および方法 |
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
EP1330517B1 (en) | 2008-09-10 |
US20020133848A1 (en) | 2002-09-19 |
CA2426163A1 (en) | 2002-07-18 |
WO2002055658A3 (en) | 2003-01-09 |
CN1473195A (zh) | 2004-02-04 |
EP1330517A2 (en) | 2003-07-30 |
NZ526084A (en) | 2005-04-29 |
ATE408009T1 (de) | 2008-09-15 |
JP4150590B2 (ja) | 2008-09-17 |
MXPA03003854A (es) | 2004-10-15 |
DE60135770D1 (de) | 2008-10-23 |
WO2002055658A2 (en) | 2002-07-18 |
US7034138B2 (en) | 2006-04-25 |
EP1330517A4 (en) | 2005-08-03 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
AU2011222740B2 (en) | Molecular engineering of a floral inducer for crop improvement | |
US20100016565A1 (en) | Identification and characterization of an anthocyanin mutant (ant1) in tomato | |
JP4150590B2 (ja) | トマト中のアントシアニン変異体(ant1)の同定と特徴付け | |
KR101458578B1 (ko) | 표층 키메라 형질 전환 식물의 작출 방법 | |
Maligeppagol et al. | Genetic transformation of chilli (Capsicum annuum L.) with Dreb1A transcription factor known to impart drought tolerance | |
CN108715852B (zh) | 一种番茄果实成熟基因Sl0658及其应用 | |
US7304207B2 (en) | Identification and characterization of an Anthocyanin mutant (ANT1) in tomato | |
CN107557384B (zh) | 一种诱导植株矮化的遗传转化体系及其构建和应用 | |
US6563023B2 (en) | Identification and characterization of a CURLY phenotype (CUR) in plants | |
AU2002245189B8 (en) | Identification and characterization of an anthocyanin mutant (ANT1) in tomato | |
AU2002245189B2 (en) | Identification and characterization of an anthocyanin mutant (ANT1) in tomato | |
US6509191B2 (en) | Identification and characterization of a PAGODA phenotype (PGD) in plants | |
AU2002245189A1 (en) | Identification and characterization of an anthocyanin mutant (ANT1) in tomato | |
US6534695B2 (en) | Identification and characterization of a Dwarf and Late Flowering 2 phenotype (DLF2) in Arabidopsis | |
JP2004016201A (ja) | 花芽形成抑制遺伝子及び早期開花性が付与された植物 | |
CN117417943A (zh) | 闽楠mads8基因及其在提前植物开花中的应用 | |
CN116254276A (zh) | 谷子干旱胁迫基因SiCCA1及其应用 | |
WO2002070661A2 (en) | Identification and characterization of a waxy curled leaf phenotype (wcl1) in arabidopsis | |
WO2003067965A2 (en) | Identification and characterization of an glutamine dumper 1 phenotype (gdui1) in arabidopsis | |
JP2001037484A (ja) | メロンエチレン受容体遺伝子のプロモーター | |
WO2007145267A1 (ja) | 植物の根で発現するプロモーター | |
JP2002272292A (ja) | ワサビγチオニン遺伝子を導入した病害抵抗性植物 |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
A621 | Written request for application examination |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A621 Effective date: 20041001 |
|
A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20070508 |
|
A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20070808 |
|
A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20071023 |
|
A601 | Written request for extension of time |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A601 Effective date: 20080121 |
|
A602 | Written permission of extension of time |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A602 Effective date: 20080128 |
|
A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20080422 |
|
TRDD | Decision of grant or rejection written | ||
A01 | Written decision to grant a patent or to grant a registration (utility model) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A01 Effective date: 20080605 |
|
A01 | Written decision to grant a patent or to grant a registration (utility model) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A01 |
|
A61 | First payment of annual fees (during grant procedure) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A61 Effective date: 20080630 |
|
FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20110704 Year of fee payment: 3 |
|
R150 | Certificate of patent or registration of utility model |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R150 |
|
FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20120704 Year of fee payment: 4 |
|
LAPS | Cancellation because of no payment of annual fees |