JP2002542789A - フラボンシンターゼｉｉ酵素をコードする遺伝子配列およびその使用 - Google Patents
フラボンシンターゼｉｉ酵素をコードする遺伝子配列およびその使用Info
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Abstract
(57)【要約】
本発明は、フラボノイド代謝の酵素を、特にフラボンシンターゼＩＩ（ＦＮＳＩＩ）をコードする遺伝子配列またはその誘導体、そして花の色を特定的に修正するための、葉、花およびその他の植物または生物体組織におけるフラボン含量または発現を改変するためのそれらの使用に関する。使用は、医学的または同様の用途のための、例えば癌を治療するための、またはヒト免疫防御を改善するための天然機能性フラボンの合成のための発現系も網羅する。
Description
【０００１】 本発明は、フラボノイド代謝の酵素、特にフラボンシンターゼＩＩ（ＦＮＳ
ＩＩ）をコードする遺伝子配列またはその誘導体、ならびに花の色を標的化改変
するための、それぞれ葉、花および植物または他の生物のその他の組織における
フラボン含量またはフラボンパターンを改変するためのそれらの使用に関する。
本発明はさらに、医学的または同様の用途のための、例えば癌を治療するための
、またはヒト免疫防御を改善するための天然機能性フラボンの合成のための発現
系における使用に関する。
ＩＩ）をコードする遺伝子配列またはその誘導体、ならびに花の色を標的化改変
するための、それぞれ葉、花および植物または他の生物のその他の組織における
フラボン含量またはフラボンパターンを改変するためのそれらの使用に関する。
本発明はさらに、医学的または同様の用途のための、例えば癌を治療するための
、またはヒト免疫防御を改善するための天然機能性フラボンの合成のための発現
系における使用に関する。
【０００２】 フラボノイドおよび植物中のそれらの機能 フラボノイドは、種々の組織、例えば花、葉または根で検出されている最も重
要な、そして最も一般的な植物色素である。さらに、それらは植物において最も
よく特性化された二次代謝産物の１つである。今日まで、３０００以上の異なる
フラボノイドが特性化されている。それらは、中央のＣ環の酸化の程度に基づい
て、異なるサブクラス（例えば、フラボン、フラボノールまたはアントシアン）
に分けられている。さらに、各型は、ヒドロキシル化、アシル化またはグリコシ
ル化によりさらに修飾され得る（Heller and Forkmann, 1994）。分子の異なる
物理化学的特性のために、サブクラスは、一部分、非常に異なる生物学的機能を
示し得る。
要な、そして最も一般的な植物色素である。さらに、それらは植物において最も
よく特性化された二次代謝産物の１つである。今日まで、３０００以上の異なる
フラボノイドが特性化されている。それらは、中央のＣ環の酸化の程度に基づい
て、異なるサブクラス（例えば、フラボン、フラボノールまたはアントシアン）
に分けられている。さらに、各型は、ヒドロキシル化、アシル化またはグリコシ
ル化によりさらに修飾され得る（Heller and Forkmann, 1994）。分子の異なる
物理化学的特性のために、サブクラスは、一部分、非常に異なる生物学的機能を
示し得る。
【０００３】 植物細胞中のある種のフラボノイドの蓄積は、対応する酵素の利用可能性によ
っており、この場合、酵素の利用可能性は、結局、それぞれの遺伝子の発現によ
っている。フラボノイド生合成の遺伝子の発現の調節は、実質的には、植物種、
発生段階および環境条件により決定される。
っており、この場合、酵素の利用可能性は、結局、それぞれの遺伝子の発現によ
っている。フラボノイド生合成の遺伝子の発現の調節は、実質的には、植物種、
発生段階および環境条件により決定される。
【０００４】 フラボノイドは、植物体の内外で重要な役割を演じる。したがって、例えばあ
る種のフラボノールは、花粉管の成長に必要とされることが示されている。フラ
ボノールの蓄積がそれらの生合成経路を遮断することにより抑制されると、不稔
花粉が得られる（Taylor and Jorgensen, 1992）。生物的および非生物的シグナ
ルはともに、植物とその環境との相互作用中にフラボノイドの蓄積を生じ得る。
したがって、例えばＵＶ照射は、フラボノールおよびフラボンの蓄積をもたらす
。これは、異なる種におけるそれぞれのフラボノイド生合成遺伝子の転写の誘導
により達成される（Kubasek et al., 1992）。しかし、その他のストレス因子、
例えば創傷、激しい温度変化および水のストレスも、異なる種におけるフラボノ
イド蓄積および／または遺伝子発現を誘導し得る（Hradzina, 1982）。フラボノ
イドは、植物とその他の生物体との相互作用において二重の役割を割り当てられ
ている。一方でフェノール系化合物として、フラボノイドは、捕食者に対する抑
止物として（Harborne and Grayer, 1994）、種々の病原体に対するフィトアレ
キシン作用を有し、他方でそれらは、マメ科（Leguminosae）の植物および特定
の微生物間のコミュニケーションに関与する。この点において、フラボノイドは
、植物との共生を確立するために必要な遺伝子をその後発現する窒素固定細菌の
ためのシグナリング剤として役立つ（Redmond et al., 1986）。花、葉および果
実においては、フラボノイドそして特に有色アントシアンだけでなく、カルコン
、オーロン、フラボンおよびフラボノールは、種々の二次代謝産物の色およびパ
ターンに関与する。他の特性、例えば臭いとともに、後者は、装飾および食料品
として植物を用いる種々の動物だけでなくヒトによる認識のために重要である（
Harborne and Grayer, 1994）。さらに、特定のフラボノイド、例えばフラボン
アピゲニンおよびフラボノールケルセチンは、植物体内のオーキシン輸送に影響
を及ぼす（Jacobs and Rubery, 1988）。
る種のフラボノールは、花粉管の成長に必要とされることが示されている。フラ
ボノールの蓄積がそれらの生合成経路を遮断することにより抑制されると、不稔
花粉が得られる（Taylor and Jorgensen, 1992）。生物的および非生物的シグナ
ルはともに、植物とその環境との相互作用中にフラボノイドの蓄積を生じ得る。
したがって、例えばＵＶ照射は、フラボノールおよびフラボンの蓄積をもたらす
。これは、異なる種におけるそれぞれのフラボノイド生合成遺伝子の転写の誘導
により達成される（Kubasek et al., 1992）。しかし、その他のストレス因子、
例えば創傷、激しい温度変化および水のストレスも、異なる種におけるフラボノ
イド蓄積および／または遺伝子発現を誘導し得る（Hradzina, 1982）。フラボノ
イドは、植物とその他の生物体との相互作用において二重の役割を割り当てられ
ている。一方でフェノール系化合物として、フラボノイドは、捕食者に対する抑
止物として（Harborne and Grayer, 1994）、種々の病原体に対するフィトアレ
キシン作用を有し、他方でそれらは、マメ科（Leguminosae）の植物および特定
の微生物間のコミュニケーションに関与する。この点において、フラボノイドは
、植物との共生を確立するために必要な遺伝子をその後発現する窒素固定細菌の
ためのシグナリング剤として役立つ（Redmond et al., 1986）。花、葉および果
実においては、フラボノイドそして特に有色アントシアンだけでなく、カルコン
、オーロン、フラボンおよびフラボノールは、種々の二次代謝産物の色およびパ
ターンに関与する。他の特性、例えば臭いとともに、後者は、装飾および食料品
として植物を用いる種々の動物だけでなくヒトによる認識のために重要である（
Harborne and Grayer, 1994）。さらに、特定のフラボノイド、例えばフラボン
アピゲニンおよびフラボノールケルセチンは、植物体内のオーキシン輸送に影響
を及ぼす（Jacobs and Rubery, 1988）。
【０００５】 フラボノイド生合成経路（図１Ａ） フラボノイドの構造は、２つの芳香族環（ＡおよびＢ）ならびに中央複素環（
Ｃ）を含む（図１Ｂ）。植物体内では、それらは、Ｌ−フェニルアラニンから出
発して、フェニルアラニンアンモニアリアーゼ（ＰＡＬ）およびケイ皮酸４−ヒ
ドロキシラーゼ（４ＣＬ）の酵素反応によりフェニルプロパノイド経路を経て合
成される。この反応に起因する４−クマロイルＣｏＡは３分子のマロニルＣｏＡ
と一緒にテトラヒドロキシカルコンを生じる。この反応は、フラボノイド生合成
の鍵となる酵素であるカルコンシンターゼ（ＣＨＳ）により触媒される（図１Ａ
）。一般に、テトラヒドロキシカルコン（ＴＨＣ）は、酵素カルコンイソメラー
ゼ（ＣＨＩ）により迅速に異性体化されて、ナリンゲニン（ＮＡＲ）を生じる。
異なるその後の反応は、アントシアンを生成する。フラボンは、シトクロムＰ４
５０酵素であるＦＮＳ ＩまたはＦＮＳ ＩＩの作用により副経路を経て生成さ
れる。この種類の酵素は、天然に遍く存在し、シトクロムＰ４５０酵素に関する
種々の遺伝子が、脊椎動物、昆虫、酵母、真菌、細菌および植物から単離され、
シーケンシングされている。
Ｃ）を含む（図１Ｂ）。植物体内では、それらは、Ｌ−フェニルアラニンから出
発して、フェニルアラニンアンモニアリアーゼ（ＰＡＬ）およびケイ皮酸４−ヒ
ドロキシラーゼ（４ＣＬ）の酵素反応によりフェニルプロパノイド経路を経て合
成される。この反応に起因する４−クマロイルＣｏＡは３分子のマロニルＣｏＡ
と一緒にテトラヒドロキシカルコンを生じる。この反応は、フラボノイド生合成
の鍵となる酵素であるカルコンシンターゼ（ＣＨＳ）により触媒される（図１Ａ
）。一般に、テトラヒドロキシカルコン（ＴＨＣ）は、酵素カルコンイソメラー
ゼ（ＣＨＩ）により迅速に異性体化されて、ナリンゲニン（ＮＡＲ）を生じる。
異なるその後の反応は、アントシアンを生成する。フラボンは、シトクロムＰ４
５０酵素であるＦＮＳ ＩまたはＦＮＳ ＩＩの作用により副経路を経て生成さ
れる。この種類の酵素は、天然に遍く存在し、シトクロムＰ４５０酵素に関する
種々の遺伝子が、脊椎動物、昆虫、酵母、真菌、細菌および植物から単離され、
シーケンシングされている。
【０００６】 フラボンシンターゼは、対応するフラボンアピゲニン（Ａｐ）およびルテオリ
ン（Ｌｕ）を合成するための基質として異なるフラバノン、例えばＮＡＲまたは
エリオジクトール（ＥＲＩ）を用いる。この目的のために、図１Ｂに示すように
、位置Ｃ２およびＣ３間に二重結合が導入される。フラボンは、グリコシル化形
態ならびにメチル化形態で植物体内に存在し得る。
ン（Ｌｕ）を合成するための基質として異なるフラバノン、例えばＮＡＲまたは
エリオジクトール（ＥＲＩ）を用いる。この目的のために、図１Ｂに示すように
、位置Ｃ２およびＣ３間に二重結合が導入される。フラボンは、グリコシル化形
態ならびにメチル化形態で植物体内に存在し得る。
【０００７】 フラバノンからのin vitroでのフラボンの生成は、ＵＶ照射Petroselium cris
pum細胞懸濁培養の酵素調製物中で最初に観察された。対応する酵素は、フラボ
ンシンターゼ Ｉ（ＦＮＳ Ｉ）と呼ばれている可溶性２−オキソグルタレート
依存性ジオキシゲナーゼである。しかしながら、種々のフラボン産生植物、例え
ばグロキシニア(Sinningia cardinalis)、キンギョソウ(Antirrhinium majus)、
クマツヅラ(Verbena hybrida)、コルムネア(Columnea hybrida)、キク(Chrysant
hemum morifolium)、ガーベラ(Gerbera hybrids)の花、ならびにダイズ(Glycine
max)の浸透的誘導細胞懸濁培養では、この反応は、Ｐ４５０シトクロムのクラ
スに属するＮＡＤＰＨ依存性ミクロソーム酵素である前記のＦＮＳ ＩＩにより
触媒される（Heller and Forkmann, 1994）。ガーベラGerbera hybridsの花にお
けるフラボンの生成は、Ｆｎｓ遺伝子座により調節される。フラボン合成は優性
対立遺伝子を保有する系統で検出されるだけであり、一方、ＦＮＳ ＩＩ活性は
ホモ接合劣性系統では検出不可能である（図２；Martens and Forkmann, 1998）
。
pum細胞懸濁培養の酵素調製物中で最初に観察された。対応する酵素は、フラボ
ンシンターゼ Ｉ（ＦＮＳ Ｉ）と呼ばれている可溶性２−オキソグルタレート
依存性ジオキシゲナーゼである。しかしながら、種々のフラボン産生植物、例え
ばグロキシニア(Sinningia cardinalis)、キンギョソウ(Antirrhinium majus)、
クマツヅラ(Verbena hybrida)、コルムネア(Columnea hybrida)、キク(Chrysant
hemum morifolium)、ガーベラ(Gerbera hybrids)の花、ならびにダイズ(Glycine
max)の浸透的誘導細胞懸濁培養では、この反応は、Ｐ４５０シトクロムのクラ
スに属するＮＡＤＰＨ依存性ミクロソーム酵素である前記のＦＮＳ ＩＩにより
触媒される（Heller and Forkmann, 1994）。ガーベラGerbera hybridsの花にお
けるフラボンの生成は、Ｆｎｓ遺伝子座により調節される。フラボン合成は優性
対立遺伝子を保有する系統で検出されるだけであり、一方、ＦＮＳ ＩＩ活性は
ホモ接合劣性系統では検出不可能である（図２；Martens and Forkmann, 1998）
。
【０００８】 ３つの型の色素、即ちベタレイン、カロテノイドおよびフラボノイドが花の色
に関与する。ベタレインは、それらが黄色、橙色、赤色および紫色に関与する中
心子類(Centrospermae)の２〜３の科にのみ存在する。カロテノイドは、橙色お
よび黄色の色合いを生じ、たいていの橙色および黄色花の主要色素である。フラ
ボノイドは、それぞれ花および植物における最も重要かつ最も広く行きわたった
色素である。この群は、グリコシル化形態、そしてしばしばアシル化形態で液胞
中に存在する着色アントシアンを含む。異なるアントシアンは、異なる色合いを
生じ得る。花の色はそれぞれ、液胞のｐＨ、金属との錯化、ならびにグリコシル
化およびアシル化のパターンによりさらに影響される（Forkmann, 1991）。種々
の花の色の発色のための別の重要な因子は、無色フラボノイド、例えばフラボン
またはフラボノールとの、あるいはタンニンとのアントシアンの同時色素沈着で
ある（Scott-Moncrieff, 1936）。フラボンと同時色素沈着されるアントシアン
は、紫と青の間で変わり得るアントシアンの基本構造によって異なる色を獲得し
得る（Asen and Horowitz, 1974; Goto and Kondo, 1991）。さらに、いくつか
のフラボン、例えばイソエチンは、黄色花色素として同定されている（Harborne
, 1978）。
に関与する。ベタレインは、それらが黄色、橙色、赤色および紫色に関与する中
心子類(Centrospermae)の２〜３の科にのみ存在する。カロテノイドは、橙色お
よび黄色の色合いを生じ、たいていの橙色および黄色花の主要色素である。フラ
ボノイドは、それぞれ花および植物における最も重要かつ最も広く行きわたった
色素である。この群は、グリコシル化形態、そしてしばしばアシル化形態で液胞
中に存在する着色アントシアンを含む。異なるアントシアンは、異なる色合いを
生じ得る。花の色はそれぞれ、液胞のｐＨ、金属との錯化、ならびにグリコシル
化およびアシル化のパターンによりさらに影響される（Forkmann, 1991）。種々
の花の色の発色のための別の重要な因子は、無色フラボノイド、例えばフラボン
またはフラボノールとの、あるいはタンニンとのアントシアンの同時色素沈着で
ある（Scott-Moncrieff, 1936）。フラボンと同時色素沈着されるアントシアン
は、紫と青の間で変わり得るアントシアンの基本構造によって異なる色を獲得し
得る（Asen and Horowitz, 1974; Goto and Kondo, 1991）。さらに、いくつか
のフラボン、例えばイソエチンは、黄色花色素として同定されている（Harborne
, 1978）。
【０００９】 顕花観賞植物の新規の変種を開発することは、園芸植物育種における重要な目
的である。過去において、育種の古典的方法は、多数の経済的に重要な観賞植物
における多数の異なる色の確立に一部は成功している。しかしながら、個々の種
の遺伝子プールは、自然なやり方で実行されるこのようなアプローチの可能性を
制限する。これが、今日、全範囲の色を示す種が２〜３種しかないことの理由で
ある。さらに、育種の古典的方法により生成される改変は、標的化され得ない。
花の審美的価値は種々の因子、例えば形態、香りおよび色により決定され、交雑
によるこの因子のうちの１つの改変は、一般に、同様のその他の可視的特徴を犠
牲にして成し遂げられ得るだけで、非常に時間と労力を要するため、新規の変種
を成し遂げるための有効な方法が用いられねばならない。標的化方法で植物の花
の色を改変する可能性は、その他の方法と比較した場合、明らかな利点を提供す
る。これは、新規性が重要な市場因子である高い製品売上を有する領域において
特に重要である。例えば、主要切り花種、例えばバラ、キク、カーネーション、
ユリ、チューリップおよびガーベラの青色花変種の開発は、切り花市場だけでな
く鉢植え植物市場にも実質的市場利益をもたらす。植物体内での共色素(copigme
nts)、例えばフラボンの合成を制御する可能性は、花の色の標的化改変の有益な
応用である。さらに花の他に、この応用は、果実およびその他の農業植物、例え
ば果実および野菜に、そして例えば観賞植物の葉にも適用され得る。
的である。過去において、育種の古典的方法は、多数の経済的に重要な観賞植物
における多数の異なる色の確立に一部は成功している。しかしながら、個々の種
の遺伝子プールは、自然なやり方で実行されるこのようなアプローチの可能性を
制限する。これが、今日、全範囲の色を示す種が２〜３種しかないことの理由で
ある。さらに、育種の古典的方法により生成される改変は、標的化され得ない。
花の審美的価値は種々の因子、例えば形態、香りおよび色により決定され、交雑
によるこの因子のうちの１つの改変は、一般に、同様のその他の可視的特徴を犠
牲にして成し遂げられ得るだけで、非常に時間と労力を要するため、新規の変種
を成し遂げるための有効な方法が用いられねばならない。標的化方法で植物の花
の色を改変する可能性は、その他の方法と比較した場合、明らかな利点を提供す
る。これは、新規性が重要な市場因子である高い製品売上を有する領域において
特に重要である。例えば、主要切り花種、例えばバラ、キク、カーネーション、
ユリ、チューリップおよびガーベラの青色花変種の開発は、切り花市場だけでな
く鉢植え植物市場にも実質的市場利益をもたらす。植物体内での共色素(copigme
nts)、例えばフラボンの合成を制御する可能性は、花の色の標的化改変の有益な
応用である。さらに花の他に、この応用は、果実およびその他の農業植物、例え
ば果実および野菜に、そして例えば観賞植物の葉にも適用され得る。
【００１０】 花の色に対するそれらの寄与の他に、フラボノイドおよび特にフラボンは、他
の生物学的特性および作用も有する。例えば、いくつかの植物では、それらは単
食性昆虫および少食性昆虫に対する食餌刺激剤であることが見出されている（Ha
rborne and Grayer, 1994）。大多数の場合、おそらくはグリコシドの溶解度改
良のために、グリコシドは対応するアグリコンより高い作用を示す。さらに、昆
虫は異なる糖残基間を識別でき、それにより活性化合物がさらに弁別される。さ
らに、アグリコンの基本構造も異なる作用を生じ得る。多数のその他の二次植物
代謝産物と比較して、フラボノイドおよびフラボンはそれぞれ、明らかに、昆虫
に過剰毒性作用を及ぼさない。それにもかかわらず、すでに非常に低い濃度で、
食餌昆虫のための抑止物として作用し得る、または動物の成長を重度に抑制し得
るいくつかのフラボンが存在する。この点で、グリコシル化の型の作用は実証さ
れ得なかった。しかしながら、フラボンのそれぞれヒドロキシル化またはメトキ
シル化の型の作用は、実証され得た（Harborne and Grayer, 1994）。
の生物学的特性および作用も有する。例えば、いくつかの植物では、それらは単
食性昆虫および少食性昆虫に対する食餌刺激剤であることが見出されている（Ha
rborne and Grayer, 1994）。大多数の場合、おそらくはグリコシドの溶解度改
良のために、グリコシドは対応するアグリコンより高い作用を示す。さらに、昆
虫は異なる糖残基間を識別でき、それにより活性化合物がさらに弁別される。さ
らに、アグリコンの基本構造も異なる作用を生じ得る。多数のその他の二次植物
代謝産物と比較して、フラボノイドおよびフラボンはそれぞれ、明らかに、昆虫
に過剰毒性作用を及ぼさない。それにもかかわらず、すでに非常に低い濃度で、
食餌昆虫のための抑止物として作用し得る、または動物の成長を重度に抑制し得
るいくつかのフラボンが存在する。この点で、グリコシル化の型の作用は実証さ
れ得なかった。しかしながら、フラボンのそれぞれヒドロキシル化またはメトキ
シル化の型の作用は、実証され得た（Harborne and Grayer, 1994）。
【００１１】 さらに、いくつかのフラボンは、特定植物上の蝶の産卵を刺激する。産卵は、
動物がその刺激を認識するまで起こらないことが示されている。このような刺激
物質としては、例えばフラボンビセニン−２および種々のルテオリン誘導体が挙
げられる。これらの物質の合成がそれぞれの宿主植物中で遮断される場合、蝶に
よる産卵を、したがってそれらの幼虫による食餌損害を抑制し得る。
動物がその刺激を認識するまで起こらないことが示されている。このような刺激
物質としては、例えばフラボンビセニン−２および種々のルテオリン誘導体が挙
げられる。これらの物質の合成がそれぞれの宿主植物中で遮断される場合、蝶に
よる産卵を、したがってそれらの幼虫による食餌損害を抑制し得る。
【００１２】 植物の天然化学防御メカニズムの利用は、例えば果実および土壌に用いられる
物質の残渣により引き起こされる環境汚染のような、合成殺昆虫剤の使用に伴っ
て遭遇する問題を回避し得る。さらに、多くの合成殺虫剤に関して観察される耐
性発生は回避されるかまたは少なくとも遅延され、時としては、薬剤および適用
のための多大な経費が節約される。
物質の残渣により引き起こされる環境汚染のような、合成殺昆虫剤の使用に伴っ
て遭遇する問題を回避し得る。さらに、多くの合成殺虫剤に関して観察される耐
性発生は回避されるかまたは少なくとも遅延され、時としては、薬剤および適用
のための多大な経費が節約される。
【００１３】 フラボノイドの別の重要な生物学的特性は、種々の根粒菌種における根粒形成
遺伝子(nodulation genes)の活性化に関する。これらの細菌はマメ科植物に感染
して、窒素固定根粒を形成する。この過程において、宿主植物により産生される
フラボノイドは、それにより細菌が感染過程を誘導する「シグナリング剤」とし
て作用する。これらの植物特異的活性化合物としては、種々のフラボン、例えば
アピゲニン、ルテオリンおよび７，４’−ジヒドロキシフラボンも挙げられる（
Firmin et al., 1986; Redmond et al., 1986）。この組織における根によるフ
ラボンの産生および送達またはフラボンパターンのそれぞれの改変は、窒素固定
を改良し、そしておそらくは非マメ科植物においてもこのメカニズムを確立する
可能性を提供する。
遺伝子(nodulation genes)の活性化に関する。これらの細菌はマメ科植物に感染
して、窒素固定根粒を形成する。この過程において、宿主植物により産生される
フラボノイドは、それにより細菌が感染過程を誘導する「シグナリング剤」とし
て作用する。これらの植物特異的活性化合物としては、種々のフラボン、例えば
アピゲニン、ルテオリンおよび７，４’−ジヒドロキシフラボンも挙げられる（
Firmin et al., 1986; Redmond et al., 1986）。この組織における根によるフ
ラボンの産生および送達またはフラボンパターンのそれぞれの改変は、窒素固定
を改良し、そしておそらくは非マメ科植物においてもこのメカニズムを確立する
可能性を提供する。
【００１４】 この天然共生メカニズムの利用は、窒素肥沃化を低減し、それにより栄養素の
洗い流しによる環境汚染を低減し得る。さらに、肥料およびそれらの散布のため
の費用が節約される。
洗い流しによる環境汚染を低減し得る。さらに、肥料およびそれらの散布のため
の費用が節約される。
【００１５】 植物体内では、いくつかの天然フラボノイド、例えばフラボンアピゲニンまた
はフラボノールケンペロールおよびケルセチンは、異なる植物組織および輸送系
におけるオーキシンの輸送に影響を及ぼす。この点で、それらは化学的輸送阻害
剤と同様に作用する。植物の成長調節剤として、オーキシンそれ自体は、細胞伸
長、細胞分裂、頂芽優性、根および苗条の再形成ならびに単為結実に影響を及ぼ
す。したがって、誘導改変化フラボノイド濃度（内因性変化および／または外因
性適用）は、それらのオーキシンとの相互作用を介して植物の成長に有意の作用
を及ぼし得る。これは、合成成長阻害剤に取って代わり得る。
はフラボノールケンペロールおよびケルセチンは、異なる植物組織および輸送系
におけるオーキシンの輸送に影響を及ぼす。この点で、それらは化学的輸送阻害
剤と同様に作用する。植物の成長調節剤として、オーキシンそれ自体は、細胞伸
長、細胞分裂、頂芽優性、根および苗条の再形成ならびに単為結実に影響を及ぼ
す。したがって、誘導改変化フラボノイド濃度（内因性変化および／または外因
性適用）は、それらのオーキシンとの相互作用を介して植物の成長に有意の作用
を及ぼし得る。これは、合成成長阻害剤に取って代わり得る。
【００１６】 さらに、生物活性物質であるフラボノイドは、ヒトおよび動物の食餌において
無視できない役割を有する。それらは、果実、野菜、木の実、種子、苗条だけで
なく、紅茶およびワイン中にも見出される。ある時から、抗アレルギー、抗炎症
、抗ウイルス、増殖低減および抗癌特性は、フラボノイドにそしていくつかのフ
ラボンに帰せられている。しかし、ヒトおよび動物の代謝および非常に複雑な免
疫系に及ぼす作用も説明されてきた。この点で、フラボノイドおよびフラボンは
それぞれ、多数の異なる酵素に（例えば、ヒアルロニダーゼまたはアルドースレ
ダクターゼに）影響を及ぼし、それらは、重要な酵素誘導および抗酸化特性を有
し、そしてフリーラジカルを掃去し、いくつかの金属陽イオンをキレート化し得
るし、細胞タンパク質リン酸化に影響を及ぼす（Middleton and Kandaswami, 19
94）。
無視できない役割を有する。それらは、果実、野菜、木の実、種子、苗条だけで
なく、紅茶およびワイン中にも見出される。ある時から、抗アレルギー、抗炎症
、抗ウイルス、増殖低減および抗癌特性は、フラボノイドにそしていくつかのフ
ラボンに帰せられている。しかし、ヒトおよび動物の代謝および非常に複雑な免
疫系に及ぼす作用も説明されてきた。この点で、フラボノイドおよびフラボンは
それぞれ、多数の異なる酵素に（例えば、ヒアルロニダーゼまたはアルドースレ
ダクターゼに）影響を及ぼし、それらは、重要な酵素誘導および抗酸化特性を有
し、そしてフリーラジカルを掃去し、いくつかの金属陽イオンをキレート化し得
るし、細胞タンパク質リン酸化に影響を及ぼす（Middleton and Kandaswami, 19
94）。
【００１７】 健康促進フラボノイド中のそれらの含量のためにヒトおよび動物栄養のために
重要な農業植物がそれぞれの化合物の含量やパターンの標的化改変により改良さ
れ得る場合、これはヒトおよび動物の健康食餌に大いに寄与する。
重要な農業植物がそれぞれの化合物の含量やパターンの標的化改変により改良さ
れ得る場合、これはヒトおよび動物の健康食餌に大いに寄与する。
【００１８】 したがって、例えば植物の花の色を変えるために、または耐性特性および植物
の共生を確立する能力を改良するために、標的化方法で植物におけるフラボノイ
ド生合成およびフラボンの生成をそれぞれ改変および制御するための手段および
方法を提供することが本発明の目的である。
の共生を確立する能力を改良するために、標的化方法で植物におけるフラボノイ
ド生合成およびフラボンの生成をそれぞれ改変および制御するための手段および
方法を提供することが本発明の目的である。
【００１９】 限定フラボンの標的化合成に有用な手段および方法を提供することは、本発明
の別の目的である。このような方法で得られるフラボンは、癌療法に用途を見出
し得るか、あるいは薬剤の形態でヒトおよび動物の健康に寄与し得る。
の別の目的である。このような方法で得られるフラボンは、癌療法に用途を見出
し得るか、あるいは薬剤の形態でヒトおよび動物の健康に寄与し得る。
【００２０】 本発明によれば、本発明の目的は、特許請求の範囲により達成される。
【００２１】 したがって、本発明は、フラボンシンターゼＩＩ（ＦＮＳ ＩＩ）をコードす
る核酸配列に関する。一実施態様において、本発明は、配列番号１で示されるよ
うな核酸配列に、またはその一部分に関する。別の実施態様では、本発明は、配
列番号１で示されるような核酸配列またはその一部分とハイブリダイズし、かつ
／または、配列番号１で示されるような配列の少なくとも１つ又はそれ以上の領
域と（好ましくは全領域と）、核酸配列またはアミノ酸配列のレベルで、少なく
とも４０％、さらに好ましくは少なくとも４５％、さらに好ましくは少なくとも
５５％、最も好ましくは少なくとも６５〜７０％、さらに最も好ましくは８５％
以上の相同性を有する核酸配列に関する。好ましくは、核酸配列は、フラボンシ
ンターゼの生物学的活性を有するタンパク質またはポリペプチドをコードする。
別の実施態様では、本発明は、前記の実施態様の核酸配列に関して縮重される核
酸配列に関する。好ましい実施態様では、本発明の核酸配列は、ＤＮＡまたはＲ
ＮＡであり、ガーベラ（Gerbera hybrids）、エゾギク（Callistephus chinensi
s）、キンギョソウ（Antirrhinium majus）、シマカンギク（Chrysanthemum ind
icum）、ダリア（Dahlia hybrids）、グロキシニア（Sinningia hybrids）、ク
マツヅラ（Verbena hybrids）およびウシノシタ（Streptocarpus (S. hybrids)
）のようなフラボン含有植物から得られる。別の好ましい実施態様では、本発明
の核酸配列は、組換え核酸配列である。さらに、本発明は、フラボンシンターゼ
ＩＩ（ＦＮＳ ＩＩ）をコードする配列と相補的な核酸配列に関する。
る核酸配列に関する。一実施態様において、本発明は、配列番号１で示されるよ
うな核酸配列に、またはその一部分に関する。別の実施態様では、本発明は、配
列番号１で示されるような核酸配列またはその一部分とハイブリダイズし、かつ
／または、配列番号１で示されるような配列の少なくとも１つ又はそれ以上の領
域と（好ましくは全領域と）、核酸配列またはアミノ酸配列のレベルで、少なく
とも４０％、さらに好ましくは少なくとも４５％、さらに好ましくは少なくとも
５５％、最も好ましくは少なくとも６５〜７０％、さらに最も好ましくは８５％
以上の相同性を有する核酸配列に関する。好ましくは、核酸配列は、フラボンシ
ンターゼの生物学的活性を有するタンパク質またはポリペプチドをコードする。
別の実施態様では、本発明は、前記の実施態様の核酸配列に関して縮重される核
酸配列に関する。好ましい実施態様では、本発明の核酸配列は、ＤＮＡまたはＲ
ＮＡであり、ガーベラ（Gerbera hybrids）、エゾギク（Callistephus chinensi
s）、キンギョソウ（Antirrhinium majus）、シマカンギク（Chrysanthemum ind
icum）、ダリア（Dahlia hybrids）、グロキシニア（Sinningia hybrids）、ク
マツヅラ（Verbena hybrids）およびウシノシタ（Streptocarpus (S. hybrids)
）のようなフラボン含有植物から得られる。別の好ましい実施態様では、本発明
の核酸配列は、組換え核酸配列である。さらに、本発明は、フラボンシンターゼ
ＩＩ（ＦＮＳ ＩＩ）をコードする配列と相補的な核酸配列に関する。
【００２２】 したがって、本発明は、フラボンシンターゼＩＩ（ＦＮＳ ＩＩ）または前記
酵素の機能的誘導体をコードする核酸配列あるいはそれと相補的な核酸配列を含
む単離核酸配列を提供する。「ＦＮＳ ＩＩ酵素」という用語は、対応するフラ
ボンの合成のための基質としてフラバノン、例えばナリンゲニンおよびエリオジ
クチオール、あるいはこの種類のその他の化合物を用いるフラボノイド生合成経
路の酵素を意味する。
酵素の機能的誘導体をコードする核酸配列あるいはそれと相補的な核酸配列を含
む単離核酸配列を提供する。「ＦＮＳ ＩＩ酵素」という用語は、対応するフラ
ボンの合成のための基質としてフラバノン、例えばナリンゲニンおよびエリオジ
クチオール、あるいはこの種類のその他の化合物を用いるフラボノイド生合成経
路の酵素を意味する。
【００２３】 好ましいのは、その天然環境から単離された、あるいは化学的に合成された本
発明の核酸である。特に好ましいのは、in vitroで生成されるかまたは得られる
核酸分子、例えばゲノムＤＮＡ断片、組換えおよび合成分子、ならびに異種核酸
と組合せた核酸である。これは、ゲノムＤＮＡまたはｃＤＮＡあるいはＦＮＳ
ＩＩをコードするそれらの部分、あるいはそれ自体のまたは別のプロモーターと
逆配向のそれらの部分も含む。さらに、天然の密接に関連した核酸配列が含まれ
る。
発明の核酸である。特に好ましいのは、in vitroで生成されるかまたは得られる
核酸分子、例えばゲノムＤＮＡ断片、組換えおよび合成分子、ならびに異種核酸
と組合せた核酸である。これは、ゲノムＤＮＡまたはｃＤＮＡあるいはＦＮＳ
ＩＩをコードするそれらの部分、あるいはそれ自体のまたは別のプロモーターと
逆配向のそれらの部分も含む。さらに、天然の密接に関連した核酸配列が含まれ
る。
【００２４】 「フラボンシンターゼＩＩをコードする核酸配列」という用語は、その最も一
般的形態で本明細書中で用いられ、直接または塩基の相補的アレイを介してＦＮ
Ｓ ＩＩのアミノ酸配列を定義する任意の配列順のヌクレオチド塩基を含む。
般的形態で本明細書中で用いられ、直接または塩基の相補的アレイを介してＦＮ
Ｓ ＩＩのアミノ酸配列を定義する任意の配列順のヌクレオチド塩基を含む。
【００２５】 フラボンシンターゼＩＩの一部または全アミノ酸配列を有するポリペプチドは
、全長ＦＮＳ ＩＩまたはその活性不完全形態を意味する。
、全長ＦＮＳ ＩＩまたはその活性不完全形態を意味する。
【００２６】 別の実施態様では、本発明は、植物またはその他の生物体における遺伝子プロ
ーブとして用いられ得るオリゴヌクレオチド、または対応する遺伝子の発現を制
御するための「アンチセンス」分子に関する。本明細書中に記載されるような「
アンチセンス」分子は、それ自体のまたは任意のその他のプロモーターに関して
逆配向の、構造遺伝子、ゲノム遺伝子またはｃＤＮＡ遺伝子あるいはその一部か
らなる遺伝子構築物も含む。
ーブとして用いられ得るオリゴヌクレオチド、または対応する遺伝子の発現を制
御するための「アンチセンス」分子に関する。本明細書中に記載されるような「
アンチセンス」分子は、それ自体のまたは任意のその他のプロモーターに関して
逆配向の、構造遺伝子、ゲノム遺伝子またはｃＤＮＡ遺伝子あるいはその一部か
らなる遺伝子構築物も含む。
【００２７】 別の実施態様では、ＦＮＳ ＩＩまたはその種々の機能的誘導体をコードする
核酸配列は、内因性ＦＮＳ ＩＩの活性を低減するために用いられるか、あるい
は代替的に、前記の酵素またはその種々の誘導体または部分をコードする核酸配
列は、アンチセンス配向で用いられて、ＦＮＳ ＩＩの活性を低減する。さらに
、ＦＮＳ ＩＩあるいはＦＮＳ ＩＩの断片または一部分のアンチセンス転写体
（例えば、オリゴヌクレオチド分子）は、酵素を特定する天然ｍＲＮＡの全体ま
たは部分と二重らせんを形成し、したがって活性酵素へのｍＲＮＡの蓄積または
翻訳を抑制することも可能である。別の可能性は、特定核酸配列を不活性化する
ためのリボザイムの使用である。
核酸配列は、内因性ＦＮＳ ＩＩの活性を低減するために用いられるか、あるい
は代替的に、前記の酵素またはその種々の誘導体または部分をコードする核酸配
列は、アンチセンス配向で用いられて、ＦＮＳ ＩＩの活性を低減する。さらに
、ＦＮＳ ＩＩあるいはＦＮＳ ＩＩの断片または一部分のアンチセンス転写体
（例えば、オリゴヌクレオチド分子）は、酵素を特定する天然ｍＲＮＡの全体ま
たは部分と二重らせんを形成し、したがって活性酵素へのｍＲＮＡの蓄積または
翻訳を抑制することも可能である。別の可能性は、特定核酸配列を不活性化する
ためのリボザイムの使用である。
【００２８】 本明細書中に記載するＦＮＳ ＩＩ活性の改変は、正常内因性または既存の活
性値と比較した場合、３０％まで、さらに好ましくは３０〜５０％、さらに好ま
しくは５０〜７５％、最も好ましくは７５％、あるいはそれより高い場合も低い
場合もある活性の増大または低減に関する。活性の量は、Martens and Forkmann
（1998）に記載の方法を用いて容易に試験され得る（例３参照）。
性値と比較した場合、３０％まで、さらに好ましくは３０〜５０％、さらに好ま
しくは５０〜７５％、最も好ましくは７５％、あるいはそれより高い場合も低い
場合もある活性の増大または低減に関する。活性の量は、Martens and Forkmann
（1998）に記載の方法を用いて容易に試験され得る（例３参照）。
【００２９】 本発明に記載した核酸は、一本鎖または二本鎖および線状または共有的閉環状
の分子の形態で存在するリボ核酸またはデオキシリボ核酸でもあり得る。一般に
、核酸分子は、ｃＤＮＡの形態で存在する。本発明は、低い、好ましくは中程度
の、最も好ましくは高いストリンジェントな条件下、本発明の核酸分子と、特に
配列番号１で示される配列またはその一部または一領域とハイブリダイズするそ
の他の核酸分子も含む。特に好ましい実施態様は、配列番号１で示される核酸配
列を含む核酸分子、あるいは配列番号１で示されるような配列の少なくとも１つ
又はそれ以上の領域と（好ましくは全領域と）、核酸配列またはアミノ酸配列の
レベルで、少なくとも４０％、さらに好ましくは少なくとも４５％、さらに好ま
しくは少なくとも５５％、最も好ましくは少なくとも６５〜７０％、さらに最も
好ましくは８５％以上の類似性を有する分子に関するが、この場合、核酸は、Ｆ
ＮＳ ＩＩ活性を有する酵素をコードするか、またはそれをコードする配列と相
補的である。
の分子の形態で存在するリボ核酸またはデオキシリボ核酸でもあり得る。一般に
、核酸分子は、ｃＤＮＡの形態で存在する。本発明は、低い、好ましくは中程度
の、最も好ましくは高いストリンジェントな条件下、本発明の核酸分子と、特に
配列番号１で示される配列またはその一部または一領域とハイブリダイズするそ
の他の核酸分子も含む。特に好ましい実施態様は、配列番号１で示される核酸配
列を含む核酸分子、あるいは配列番号１で示されるような配列の少なくとも１つ
又はそれ以上の領域と（好ましくは全領域と）、核酸配列またはアミノ酸配列の
レベルで、少なくとも４０％、さらに好ましくは少なくとも４５％、さらに好ま
しくは少なくとも５５％、最も好ましくは少なくとも６５〜７０％、さらに最も
好ましくは８５％以上の類似性を有する分子に関するが、この場合、核酸は、Ｆ
ＮＳ ＩＩ活性を有する酵素をコードするか、またはそれをコードする配列と相
補的である。
【００３０】 さらに、本発明は、前記の核酸分子の一部分との、そして特に配列番号１で示
されるものとのハイブリダイゼーションのためのオリゴヌクレオチドプライマー
またはコンピテントプローブの形態での核酸分子を含む。ハイブリダイゼーショ
ンは、低い、好ましくは中程度の、最も好ましくは高いストリンジェントな条件
下で実行され得る。好ましくは、前記の部分は、遺伝子の５’または３’末端に
対応する。本明細書中の目的のために、５’末端は構造遺伝子配列の開始コドン
〜遺伝子の中間領域に延びる領域と定義される。３’末端は、本明細書中では、
遺伝子の中間領域および終止コドン間の構造遺伝子配列を限定する領域であると
みなされる。したがって、オリゴヌクレオチドまたはプローブは５’末端または
３’末端と、あるいは５’または３’末端の両方に共通な領域とハイブリダイズ
し得る、ということは明らかである。本発明は、すべてのこのようなプローブを
含む。好ましいオリゴヌクレオチドは、例４に示されている。
されるものとのハイブリダイゼーションのためのオリゴヌクレオチドプライマー
またはコンピテントプローブの形態での核酸分子を含む。ハイブリダイゼーショ
ンは、低い、好ましくは中程度の、最も好ましくは高いストリンジェントな条件
下で実行され得る。好ましくは、前記の部分は、遺伝子の５’または３’末端に
対応する。本明細書中の目的のために、５’末端は構造遺伝子配列の開始コドン
〜遺伝子の中間領域に延びる領域と定義される。３’末端は、本明細書中では、
遺伝子の中間領域および終止コドン間の構造遺伝子配列を限定する領域であると
みなされる。したがって、オリゴヌクレオチドまたはプローブは５’末端または
３’末端と、あるいは５’または３’末端の両方に共通な領域とハイブリダイズ
し得る、ということは明らかである。本発明は、すべてのこのようなプローブを
含む。好ましいオリゴヌクレオチドは、例４に示されている。
【００３１】 核酸またはその相補的形態は、全長酵素またはその一部または誘導体をコード
し得る。「誘導体」とは、好ましくはフラボンシンターゼＩＩ活性は保持された
ままでの、天然酵素に関する単一のまたは多数のアミノ酸置換、欠失および／ま
たは付加を意味する。この点で、本発明の核酸は、ＦＮＳ ＩＩをコードする天
然ヌクレオチド配列、ならびに単一のまたは多数のヌクレオチド置換、欠失およ
び／または付加を含む。本発明の核酸またはその相補的形態は、活性または不活
性であるＦＮＳ ＩＩの一部分もコードし得る。このような核酸分子は、オリゴ
ヌクレオチドプローブとして、異なる突然変異誘発技法で、またはアンチセンス
分子の調製のために、ポリメラーゼ連鎖反応のためのプライマーとして用いられ
得る。
し得る。「誘導体」とは、好ましくはフラボンシンターゼＩＩ活性は保持された
ままでの、天然酵素に関する単一のまたは多数のアミノ酸置換、欠失および／ま
たは付加を意味する。この点で、本発明の核酸は、ＦＮＳ ＩＩをコードする天
然ヌクレオチド配列、ならびに単一のまたは多数のヌクレオチド置換、欠失およ
び／または付加を含む。本発明の核酸またはその相補的形態は、活性または不活
性であるＦＮＳ ＩＩの一部分もコードし得る。このような核酸分子は、オリゴ
ヌクレオチドプローブとして、異なる突然変異誘発技法で、またはアンチセンス
分子の調製のために、ポリメラーゼ連鎖反応のためのプライマーとして用いられ
得る。
【００３２】 さらに、本発明は、本発明の核酸配列を含有する組換えＤＮＡ分子に関する。
好ましい実施態様では、組換えＤＮＡ分子は、ベクターまたはプロモーターを有
するベクターである。特に好ましい実施態様では、プロモーターは本発明の核酸
配列を発現し得る。本発明の核酸分子は、ベクター分子、例えば発現ベクターと
組合せて、両配向で存在し得る。この点では、「ベクター分子」という用語は、
細胞、特に植物細胞への核酸の輸送および／またはゲノムへの組込みを可能にす
る核酸分子の任意の中間ビヒクルを含むために、その最も一般的な意味で用いら
れる。好ましくは、これらのベクター分子またはその部分は、植物ゲノムへの組
込みのために用いられる。このようなベクター分子は、原核生物細胞中でおよび
／または真核生物細胞中で複製および／または発現され得る。中間ビヒクルは、
例えば電気穿孔、マイクロプロジェクターによる砲撃(microprojective bombard
ment)に、アグロバクテリウムを用いた輸送に、あるいはＤＮＡまたはＲＮＡウ
イルスを介した挿入における使用に適応され得る。中間ビヒクルおよび／または
そこに含入される核酸分子は、植物ゲノム中に安定的に組み込まれ得る。さらに
、核酸分子は、細胞中、特に植物細胞中の核酸分子の発現の開始に有用なプロモ
ーター配列も含有し得る。核酸分子およびプロモーターは、異なる方法を用いて
も細胞中に導入され得る（前記参照）。
好ましい実施態様では、組換えＤＮＡ分子は、ベクターまたはプロモーターを有
するベクターである。特に好ましい実施態様では、プロモーターは本発明の核酸
配列を発現し得る。本発明の核酸分子は、ベクター分子、例えば発現ベクターと
組合せて、両配向で存在し得る。この点では、「ベクター分子」という用語は、
細胞、特に植物細胞への核酸の輸送および／またはゲノムへの組込みを可能にす
る核酸分子の任意の中間ビヒクルを含むために、その最も一般的な意味で用いら
れる。好ましくは、これらのベクター分子またはその部分は、植物ゲノムへの組
込みのために用いられる。このようなベクター分子は、原核生物細胞中でおよび
／または真核生物細胞中で複製および／または発現され得る。中間ビヒクルは、
例えば電気穿孔、マイクロプロジェクターによる砲撃(microprojective bombard
ment)に、アグロバクテリウムを用いた輸送に、あるいはＤＮＡまたはＲＮＡウ
イルスを介した挿入における使用に適応され得る。中間ビヒクルおよび／または
そこに含入される核酸分子は、植物ゲノム中に安定的に組み込まれ得る。さらに
、核酸分子は、細胞中、特に植物細胞中の核酸分子の発現の開始に有用なプロモ
ーター配列も含有し得る。核酸分子およびプロモーターは、異なる方法を用いて
も細胞中に導入され得る（前記参照）。
【００３３】 本発明は、本発明のＤＮＡ分子を含有する宿主細胞にも関する。宿主細胞は、
原核生物または真核生物細胞、特に酵母細胞、昆虫細胞、植物細胞および哺乳類
細胞であり得る。
原核生物または真核生物細胞、特に酵母細胞、昆虫細胞、植物細胞および哺乳類
細胞であり得る。
【００３４】 本発明はさらに、本発明の核酸によりコードされるポリペプチドに関する。好
ましい実施態様では、本発明は、配列番号２で示されるようなアミノ酸配列を有
するポリペプチドまたはその一部分または誘導体に関する。別の好ましい実施態
様では、ポリペプチドは、フラボン含有植物、例えばガーベラ（Gerbera hybrid
s）、エゾギク（Callistephus chinensis）、キンギョソウ（Antirrhinium maju
s）、シマカンギク（Chrysanthemum indicum）、ダリア（Dahlia hybrids）、グ
ロキシニア（Sinningia hybrids）、クマツヅラ（Verbena hybrids）およびウシ
ノシタ（Streptocarpus hybrids）から得られる。特に好ましい実施態様では、
本発明のポリペプチドは、フラボンシンターゼＩＩ活性を有する。
ましい実施態様では、本発明は、配列番号２で示されるようなアミノ酸配列を有
するポリペプチドまたはその一部分または誘導体に関する。別の好ましい実施態
様では、ポリペプチドは、フラボン含有植物、例えばガーベラ（Gerbera hybrid
s）、エゾギク（Callistephus chinensis）、キンギョソウ（Antirrhinium maju
s）、シマカンギク（Chrysanthemum indicum）、ダリア（Dahlia hybrids）、グ
ロキシニア（Sinningia hybrids）、クマツヅラ（Verbena hybrids）およびウシ
ノシタ（Streptocarpus hybrids）から得られる。特に好ましい実施態様では、
本発明のポリペプチドは、フラボンシンターゼＩＩ活性を有する。
【００３５】 本発明の意味における誘導体は、配列番号２のアミノ酸配列のアミノ酸挿入誘
導体、欠失誘導体および／または置換アミノ酸変異体である。
導体、欠失誘導体および／または置換アミノ酸変異体である。
【００３６】 本発明のＦＮＳ ＩＩのアミノ酸挿入誘導体は、アミノおよびカルボキシル融
合、ならびに配列内の単一のまたは多数のアミノ酸の挿入のいずれもを含む。挿
入アミノ酸配列変異体は、１つ又はそれ以上のアミノ酸残基が予定部位でタンパ
ク質中に導入されたものであるが、しかし生成物の適切なスクリーニングを伴う
無作為挿入も可能である。欠失変異体は、配列からの１つ又はそれ以上のアミノ
酸の除去により特性化される。置換アミノ酸変異体は、配列の少なくとも１つの
残基が除去され、別の残基が同一位置に導入されたものである。典型的置換を、
表１に示す。
合、ならびに配列内の単一のまたは多数のアミノ酸の挿入のいずれもを含む。挿
入アミノ酸配列変異体は、１つ又はそれ以上のアミノ酸残基が予定部位でタンパ
ク質中に導入されたものであるが、しかし生成物の適切なスクリーニングを伴う
無作為挿入も可能である。欠失変異体は、配列からの１つ又はそれ以上のアミノ
酸の除去により特性化される。置換アミノ酸変異体は、配列の少なくとも１つの
残基が除去され、別の残基が同一位置に導入されたものである。典型的置換を、
表１に示す。
【００３７】
【表１】
【００３８】 概して、アミノ酸は、疎水性、親水性、電気陰性度、非常に分厚い側鎖等とい
った同様の特性を有するアミノ酸により置換される。アミノ酸置換は一般に、単
一残基のみに関するが、一方、挿入は、典型的には１〜１０アミノ酸残基の領域
に向けられ、欠失は１〜２０残基の領域である。好ましくは、欠失および挿入は
、例えば２残基の欠失または２残基の挿入のように隣接対で実行される。
った同様の特性を有するアミノ酸により置換される。アミノ酸置換は一般に、単
一残基のみに関するが、一方、挿入は、典型的には１〜１０アミノ酸残基の領域
に向けられ、欠失は１〜２０残基の領域である。好ましくは、欠失および挿入は
、例えば２残基の欠失または２残基の挿入のように隣接対で実行される。
【００３９】 本発明の誘導体の前記のアミノ酸変異体は、例えば固相合成および同様の方法
による、または組換えＤＮＡ操作によるといったようなペプチド合成のための既
知の技法を用いて容易に調製され得る。既知のまたは部分的に既知の配列を有す
るＤＮＡ中の予定部位での置換突然変異導入のための技法は周知であり、その例
としては、Ｍ１３突然変異誘発が挙げられる。置換、挿入または欠失を保有する
タンパク質の調製のためのＤＮＡ配列の操作は、例えばSambrook et al.（1989
）に詳述されている。
による、または組換えＤＮＡ操作によるといったようなペプチド合成のための既
知の技法を用いて容易に調製され得る。既知のまたは部分的に既知の配列を有す
るＤＮＡ中の予定部位での置換突然変異導入のための技法は周知であり、その例
としては、Ｍ１３突然変異誘発が挙げられる。置換、挿入または欠失を保有する
タンパク質の調製のためのＤＮＡ配列の操作は、例えばSambrook et al.（1989
）に詳述されている。
【００４０】 本発明のＦＮＳ ＩＩの組換えまたは合成突然変異体および誘導体のその他の
例は、炭水化物、脂質および／またはタンパク質もしくはポリペプチドのような
酵素に関連した任意の分子の単一または複数の置換、欠失および／または付加を
含む。
例は、炭水化物、脂質および／またはタンパク質もしくはポリペプチドのような
酵素に関連した任意の分子の単一または複数の置換、欠失および／または付加を
含む。
【００４１】 「類似体」および「誘導体」という用語は、ＦＮＳ ＩＩの任意の機能的化学
等価物も、そして前記のような任意のアミノ酸誘導体も含む。
等価物も、そして前記のような任意のアミノ酸誘導体も含む。
【００４２】 本発明の別の局面は、組換え体形態のＦＮＳ ＩＩに関する。組換え体形態の
酵素は、例えば種々の分野における、例えばヒト医学における使用のためのin v
itroでの種々のフラボンの生成のための、より活性な酵素または系を開発する可
能性を提供する。後者の系は、例えば癌研究に有用なものであり得る。
酵素は、例えば種々の分野における、例えばヒト医学における使用のためのin v
itroでの種々のフラボンの生成のための、より活性な酵素または系を開発する可
能性を提供する。後者の系は、例えば癌研究に有用なものであり得る。
【００４３】 別の実施態様では、本発明は、本発明の核酸配列を含有するトランスジェニッ
ク植物に関する。好ましい実施態様では、核酸配列は発現に適しており、任意に
制御され得るか、またはその発育とともに植物体内で制御される。別の好ましい
実施態様では、トランスジェニック植物は、フラボン含有植物、例えばガーベラ
（Gerbera hybrids）、エゾギク（Callistephus chinensis）、キンギョソウ（A
ntirrhinium majus）、シマカンギク（Chrysanthemum indicum）、ダリア（Dahl
ia hybrids）、グロキシニア（Sinningia hybrids）、クマツヅラ（Verbena hyb
rids）およびウシノシタ（S. hybrids）の群から選択され、内因性ＦＮＳ ＩＩ
を含有し、さらに本発明の非内因性ＦＮＳ ＩＩ核酸配列を含有する。
ク植物に関する。好ましい実施態様では、核酸配列は発現に適しており、任意に
制御され得るか、またはその発育とともに植物体内で制御される。別の好ましい
実施態様では、トランスジェニック植物は、フラボン含有植物、例えばガーベラ
（Gerbera hybrids）、エゾギク（Callistephus chinensis）、キンギョソウ（A
ntirrhinium majus）、シマカンギク（Chrysanthemum indicum）、ダリア（Dahl
ia hybrids）、グロキシニア（Sinningia hybrids）、クマツヅラ（Verbena hyb
rids）およびウシノシタ（S. hybrids）の群から選択され、内因性ＦＮＳ ＩＩ
を含有し、さらに本発明の非内因性ＦＮＳ ＩＩ核酸配列を含有する。
【００４４】 本発明によれば、ＦＮＳ ＩＩあるいはその誘導体また部分をコードする核酸
配列は、２つの考え得る配向のうちの１つで植物体中に導入され、そこで発現さ
れて、それにより、植物体内で合成される場合、ナリンゲニン（ＮＡＲ）および
／またはその他の適切な基質を転換する可能性を提供し、最終的に異なるフラボ
ンの生成をもたらす。さらに、前記の代謝産物の生成は、内因性のまたは既存の
ＦＮＳ ＩＩ活性の低減または排除により抑制され得る。ガーベラでは、フラボ
ンの合成は花の色の改変を生じる。一例としてＦｎｓ遺伝子座（ｆｎｓ＋ｆｎｓ
）に関してヘテロ接合であるフラボン含有橙色変種「Ｔｈ５８」を用いて、暗赤
色（フラボン無含有；遺伝子型ｆｎｓ ｆｎｓ）から異なる色合いの橙色−赤色
（フラボン含有；遺伝子型ｆｎｓ＋ ｆｎｓ）を経て黄色−橙色（極高フラボン
含量；遺伝子型ｆｎｓ＋ｆｎｓ＋）への変色は、自家生殖子孫で実証され得る。
この実験は、Ｆｎｓ遺伝子座に関してヘテロ接合型である他のガーベラ変種にも
適用され得る（例２も参照）。植物体内の２つの考え得る配向のうちの１つでの
核酸配列の発現は、構成的に誘導可能であるかまたは発育により得るし、そして
組織特異性でもあり得る。「発現」という用語は、ＲＮＡのまたはＲＮＡおよび
タンパク質の両方の産生を含むために、最も一般的な意味で用いられる。それは
、核酸分子の部分発現も含む。
配列は、２つの考え得る配向のうちの１つで植物体中に導入され、そこで発現さ
れて、それにより、植物体内で合成される場合、ナリンゲニン（ＮＡＲ）および
／またはその他の適切な基質を転換する可能性を提供し、最終的に異なるフラボ
ンの生成をもたらす。さらに、前記の代謝産物の生成は、内因性のまたは既存の
ＦＮＳ ＩＩ活性の低減または排除により抑制され得る。ガーベラでは、フラボ
ンの合成は花の色の改変を生じる。一例としてＦｎｓ遺伝子座（ｆｎｓ＋ｆｎｓ
）に関してヘテロ接合であるフラボン含有橙色変種「Ｔｈ５８」を用いて、暗赤
色（フラボン無含有；遺伝子型ｆｎｓ ｆｎｓ）から異なる色合いの橙色−赤色
（フラボン含有；遺伝子型ｆｎｓ＋ ｆｎｓ）を経て黄色−橙色（極高フラボン
含量；遺伝子型ｆｎｓ＋ｆｎｓ＋）への変色は、自家生殖子孫で実証され得る。
この実験は、Ｆｎｓ遺伝子座に関してヘテロ接合型である他のガーベラ変種にも
適用され得る（例２も参照）。植物体内の２つの考え得る配向のうちの１つでの
核酸配列の発現は、構成的に誘導可能であるかまたは発育により得るし、そして
組織特異性でもあり得る。「発現」という用語は、ＲＮＡのまたはＲＮＡおよび
タンパク質の両方の産生を含むために、最も一般的な意味で用いられる。それは
、核酸分子の部分発現も含む。
【００４５】 本発明は、ＦＮＳ ＩＩあるいは活性突然変異体または誘導体を合成し得るト
ランスジェニック植物の製造方法に関する。前記の方法は、前記の核酸分子の考
え得る発現を達成する条件下で前記のＦＮＳ ＩＩをコードするヌクレオチド配
列を含む核酸分子による適切な植物の細胞の安定形質転換、細胞からのトランス
ジェニック植物の再生、および特定の時間中の、かつ核酸の発現を達成するのに
適した条件下での前記のトランスジェニック植物の成長を包含する。トランスジ
ェニック植物は、匹敵する非トランスジェニック植物で測定される値と比較して
より高い値のＦＮＳ ＩＩ活性を示し得るし、その値は匹敵する非トランスジェ
ニック植物の値と比較してより低いこともある。
ランスジェニック植物の製造方法に関する。前記の方法は、前記の核酸分子の考
え得る発現を達成する条件下で前記のＦＮＳ ＩＩをコードするヌクレオチド配
列を含む核酸分子による適切な植物の細胞の安定形質転換、細胞からのトランス
ジェニック植物の再生、および特定の時間中の、かつ核酸の発現を達成するのに
適した条件下での前記のトランスジェニック植物の成長を包含する。トランスジ
ェニック植物は、匹敵する非トランスジェニック植物で測定される値と比較して
より高い値のＦＮＳ ＩＩ活性を示し得るし、その値は匹敵する非トランスジェ
ニック植物の値と比較してより低いこともある。
【００４６】 本発明の一局面は、内因性または既存のＦＮＳ ＩＩ活性低減を示すトランス
ジェニック植物の製造方法に関する。この方法は、ＦＮＳ ＩＩの配列または相
補的配列をコードするヌクレオチド配列を含む核酸分子による適切な植物の細胞
の安定形質転換、細胞からのトランスジェニック植物の再生、ならびに必要な場
合には、核酸の発現を達成するのに適した条件下でのこのトランスジェニック植
物の栽培を包含する。
ジェニック植物の製造方法に関する。この方法は、ＦＮＳ ＩＩの配列または相
補的配列をコードするヌクレオチド配列を含む核酸分子による適切な植物の細胞
の安定形質転換、細胞からのトランスジェニック植物の再生、ならびに必要な場
合には、核酸の発現を達成するのに適した条件下でのこのトランスジェニック植
物の栽培を包含する。
【００４７】 本発明の別の局面は、内因性または既存のＦＮＳ ＩＩ活性低減を示す遺伝子
工学処理植物の製造方法に関する。この方法は、ＦＮＳ ＩＩあるいはその誘導
体または部分の適切に修飾された遺伝子から出発した同種組換えを経る、内在性
配列の修飾によるＦＮＳ ＩＩ遺伝子の改変を包含する。遺伝子は植物体中に導
入され、遺伝子工学処理植物が細胞から再生される。
工学処理植物の製造方法に関する。この方法は、ＦＮＳ ＩＩあるいはその誘導
体または部分の適切に修飾された遺伝子から出発した同種組換えを経る、内在性
配列の修飾によるＦＮＳ ＩＩ遺伝子の改変を包含する。遺伝子は植物体中に導
入され、遺伝子工学処理植物が細胞から再生される。
【００４８】 本発明の別の局面は、改変された花の特徴を有するトランスジェニック顕花植
物の製造方法に関する。この方法は、適切なフラボン無含有植物の細胞への本発
明の核酸配列の導入、細胞からのトランスジェニック植物の再生、ならびに本発
明の導入核酸配列の発現を達成するための時間および条件下でのトランスジェニ
ック植物の栽培を包含する。トランスジェニック植物は、例えば、トウダイグサ
（E. pulcherrima）、シクラメン（Cyclamen persicum）、バラ（Rosa hybrida
）、テンジクアオイ（P. spec.）、ベゴニア（B. spec.）、カーネーション（Di
anthus caryophyllus）およびチューリップ（Tulipa hybrids）からなるフラボ
ン含有植物の群から選択され得る。別の好ましい実施態様では、トランスジェニ
ック植物は、内在性フラボンシンターゼＩＩ（ＦＮＳ ＩＩ）を発現し得る。こ
のようなトランスジェニック植物は、例えばガーベラ（Gerbera hybrids）、エ
ゾギク（Callistephus chinensis）、キンギョソウ（Antirrhinium majus）、シ
マカンギク（Chrysanthemum indicum）、ダリア（Dahlia hybrids）、グロキシ
ニア（Sinningia hybrids）、クマツヅラ（Verbena hybrids）およびウシノシタ
（S. hybrids）からなる植物群から選択され得る。別の好ましい実施態様では、
この内因性フラボンシンターゼＩＩは、本発明により導入された核酸の発現中に
同時発現される。
物の製造方法に関する。この方法は、適切なフラボン無含有植物の細胞への本発
明の核酸配列の導入、細胞からのトランスジェニック植物の再生、ならびに本発
明の導入核酸配列の発現を達成するための時間および条件下でのトランスジェニ
ック植物の栽培を包含する。トランスジェニック植物は、例えば、トウダイグサ
（E. pulcherrima）、シクラメン（Cyclamen persicum）、バラ（Rosa hybrida
）、テンジクアオイ（P. spec.）、ベゴニア（B. spec.）、カーネーション（Di
anthus caryophyllus）およびチューリップ（Tulipa hybrids）からなるフラボ
ン含有植物の群から選択され得る。別の好ましい実施態様では、トランスジェニ
ック植物は、内在性フラボンシンターゼＩＩ（ＦＮＳ ＩＩ）を発現し得る。こ
のようなトランスジェニック植物は、例えばガーベラ（Gerbera hybrids）、エ
ゾギク（Callistephus chinensis）、キンギョソウ（Antirrhinium majus）、シ
マカンギク（Chrysanthemum indicum）、ダリア（Dahlia hybrids）、グロキシ
ニア（Sinningia hybrids）、クマツヅラ（Verbena hybrids）およびウシノシタ
（S. hybrids）からなる植物群から選択され得る。別の好ましい実施態様では、
この内因性フラボンシンターゼＩＩは、本発明により導入された核酸の発現中に
同時発現される。
【００４９】 一実施態様では、内因的に存在するフラボンシンターゼＩＩ活性は、核酸配列
の導入により低減される。この方法は、本発明の核酸配列またはそれと相補的な
配列による適切な植物の細胞の安定形質転換、細胞からのトランスジェニック植
物の再生、ならびに内因性または既存のＦＮＳ ＩＩの活性の量を変更するのに
適した時間および条件下でのこのトランスジェニック植物の栽培を包含する。好
ましくは、改変レベルは、匹敵する非トランスジェニック植物におけるＦＮＳ
ＩＩ活性の内因性または既存レベルより低い。任意に、内因性ＦＮＳ ＩＩ活性
の低減のためには、導入された核酸配列またはその相補的配列を発現することが
必要である。したがって、導入された遺伝子配列またはその相補的類似体の発現
は、所望の作用を成し遂げるために必要であり得る。これは、実質的には、改変
された花特徴を有する顕花植物を意味する。
の導入により低減される。この方法は、本発明の核酸配列またはそれと相補的な
配列による適切な植物の細胞の安定形質転換、細胞からのトランスジェニック植
物の再生、ならびに内因性または既存のＦＮＳ ＩＩの活性の量を変更するのに
適した時間および条件下でのこのトランスジェニック植物の栽培を包含する。好
ましくは、改変レベルは、匹敵する非トランスジェニック植物におけるＦＮＳ
ＩＩ活性の内因性または既存レベルより低い。任意に、内因性ＦＮＳ ＩＩ活性
の低減のためには、導入された核酸配列またはその相補的配列を発現することが
必要である。したがって、導入された遺伝子配列またはその相補的類似体の発現
は、所望の作用を成し遂げるために必要であり得る。これは、実質的には、改変
された花特徴を有する顕花植物を意味する。
【００５０】 この点で、本発明は、異なる花の特徴を示す顕花植物の製造方法に関する。こ
の方法は、ＦＮＳ ＩＩあるいはその誘導体または部分の適切に改変された遺伝
子の同種組換えを介した内因性配列の修飾によるＦＮＳ ＩＩ遺伝子の改変、植
物細胞への導入、ならびに細胞からの遺伝子工学処理植物の再生を包含する。
の方法は、ＦＮＳ ＩＩあるいはその誘導体または部分の適切に改変された遺伝
子の同種組換えを介した内因性配列の修飾によるＦＮＳ ＩＩ遺伝子の改変、植
物細胞への導入、ならびに細胞からの遺伝子工学処理植物の再生を包含する。
【００５１】 さらに、本発明の核酸分子は、発育依存様式で調節され得る。一般に、改変化
花序は、レシピエント植物の生理学的条件によって薄い色またはその他の色合い
を有する花を産生する可能性を除外する。「レシピエント植物」とは、測定可能
量のＦＮＳ ＩＩ酵素の基質またはＦＮＳ ＩＩ自体を産生し、対応する生理学
的特性および所望の色の発色に必要な遺伝子型を有する植物を指す。この例とし
ては、以下の植物が挙げられるが、これらに限定されない：グロキシニア（Sinn
ingia cardinalis）、キンギョソウ（Antirrhinium majus）、コルムネア（Colu
mnea hybrids）、ダリア（Dahlia variabilis）、グロキシニア（Sinningia car
dinalis）、ウシノシタ（Streptocarpus hybridus）、クマツヅラ（Verbena hyb
rids）、シマカンギク（Chrysanthemum indicum）、ユリ科のpeace lily（Spath
iphyllum wallisii）、ペチュニア（Petunia hybrida）、シクラメン（Cyclamen
persicum）、バラ（Rosa hybrids）およびテンジクアオイ（P. spec.）。
花序は、レシピエント植物の生理学的条件によって薄い色またはその他の色合い
を有する花を産生する可能性を除外する。「レシピエント植物」とは、測定可能
量のＦＮＳ ＩＩ酵素の基質またはＦＮＳ ＩＩ自体を産生し、対応する生理学
的特性および所望の色の発色に必要な遺伝子型を有する植物を指す。この例とし
ては、以下の植物が挙げられるが、これらに限定されない：グロキシニア（Sinn
ingia cardinalis）、キンギョソウ（Antirrhinium majus）、コルムネア（Colu
mnea hybrids）、ダリア（Dahlia variabilis）、グロキシニア（Sinningia car
dinalis）、ウシノシタ（Streptocarpus hybridus）、クマツヅラ（Verbena hyb
rids）、シマカンギク（Chrysanthemum indicum）、ユリ科のpeace lily（Spath
iphyllum wallisii）、ペチュニア（Petunia hybrida）、シクラメン（Cyclamen
persicum）、バラ（Rosa hybrids）およびテンジクアオイ（P. spec.）。
【００５２】 したがって、本発明は、ＦＮＳ ＩＩまたはその一部分をコードし、あるいは
必要な場合に、ＦＮＳ ＩＩの調節を成し遂げるために容易に転写され得るｍＲ
ＮＡ分子の全長または一部分と実質的に相補的である核酸配列を保有する組換え
遺伝子を、測定可能程度に発現するトランスジェニック植物の製造方法に関する
。この方法は、ＦＮＳ ＩＩあるいはその誘導体または一部分をコードするヌク
レオチド配列、あるいはコードヌクレオチド配列と相補的な配列を含む単離核酸
による適切な植物の細胞の安定形質転換を、必要な場合にはその単離核酸の発現
を可能にする条件下で、そして細胞からのトランスジェニック植物の再生を包含
する。
必要な場合に、ＦＮＳ ＩＩの調節を成し遂げるために容易に転写され得るｍＲ
ＮＡ分子の全長または一部分と実質的に相補的である核酸配列を保有する組換え
遺伝子を、測定可能程度に発現するトランスジェニック植物の製造方法に関する
。この方法は、ＦＮＳ ＩＩあるいはその誘導体または一部分をコードするヌク
レオチド配列、あるいはコードヌクレオチド配列と相補的な配列を含む単離核酸
による適切な植物の細胞の安定形質転換を、必要な場合にはその単離核酸の発現
を可能にする条件下で、そして細胞からのトランスジェニック植物の再生を包含
する。
【００５３】 例えば標的植物中で自然に生じる酵素の発現の低減または増大のための本発明
の使用の可能性を、当業者は直ちに理解する。これは、異なる新規の花の色合い
、例えば種々の橙色および暗赤色の色合いを生じる。
の使用の可能性を、当業者は直ちに理解する。これは、異なる新規の花の色合い
、例えば種々の橙色および暗赤色の色合いを生じる。
【００５４】 したがって、本発明は、本発明の核酸配列の全長または一部分を含有する、お
よび／または同種あるいはその関連形態または記載されたもの、特に花の特徴の
変化を示すトランスジェニック植物の場合のアンチセンス形態を含有する任意の
トランスジェニック植物に関する。トランスジェニック植物は、ＦＮＳ ＩＩを
コードするヌクレオチド配列またはその相補的配列を含めてそこに導入された核
酸分子を含有し得る。一般に、核酸は、植物ゲノム中に安定的に導入されるが、
しかし本発明は、例えば植物細胞中で複製可能なＤＮＡまたはＲＮＡウイルスの
ような自己複製核酸配列内のＦＮＳ ＩＩ核酸配列の導入も包含する。さらに、
本発明は、トランスジェニック植物の種子、特にフラボンを含有するものも含む
。
よび／または同種あるいはその関連形態または記載されたもの、特に花の特徴の
変化を示すトランスジェニック植物の場合のアンチセンス形態を含有する任意の
トランスジェニック植物に関する。トランスジェニック植物は、ＦＮＳ ＩＩを
コードするヌクレオチド配列またはその相補的配列を含めてそこに導入された核
酸分子を含有し得る。一般に、核酸は、植物ゲノム中に安定的に導入されるが、
しかし本発明は、例えば植物細胞中で複製可能なＤＮＡまたはＲＮＡウイルスの
ような自己複製核酸配列内のＦＮＳ ＩＩ核酸配列の導入も包含する。さらに、
本発明は、トランスジェニック植物の種子、特にフラボンを含有するものも含む
。
【００５５】 本発明のＦＮＳ ＩＩ遺伝子を用いて、植物体内でのフラボノイドの生合成お
よびフラボンの生成は、それぞれ、異なる方法での標的化方式で改変され得る。
よびフラボンの生成は、それぞれ、異なる方法での標的化方式で改変され得る。
【００５６】 先ず第一に、植物の分野では、２つの異なるアプローチが考慮されねばならな
い。一方では、フラボンおよびそのグリコシドを天然に生成する植物、例えばキ
ンギョソウおよびクマツヅラの花、クサギおよび柑橘類の葉、タチアオイおよび
エンジュ（マメ科）の根、ならびにサクラ(Prunus)およびマツ(Pinus spec.)の
硬材が利用可能である（Wollenweber, 1994; Williams and Harborne, 1994）。
この非常に大きい群の他に、ある種の組織中でのフラボン合成を欠くいくつかの
植物も存在する。これは、例えば重要な観賞植物、例えばテンジクアオイ、シク
ラメンおよびペチュニアのいくつかの花における、ならびにリンゴの葉における
場合である。
い。一方では、フラボンおよびそのグリコシドを天然に生成する植物、例えばキ
ンギョソウおよびクマツヅラの花、クサギおよび柑橘類の葉、タチアオイおよび
エンジュ（マメ科）の根、ならびにサクラ(Prunus)およびマツ(Pinus spec.)の
硬材が利用可能である（Wollenweber, 1994; Williams and Harborne, 1994）。
この非常に大きい群の他に、ある種の組織中でのフラボン合成を欠くいくつかの
植物も存在する。これは、例えば重要な観賞植物、例えばテンジクアオイ、シク
ラメンおよびペチュニアのいくつかの花における、ならびにリンゴの葉における
場合である。
【００５７】 したがって、本発明は、本発明の配列の導入により天然に生じるＦＮＳ ＩＩ
活性を増大するかまたは低減することにより達成され得る植物およびその他の生
物体におけるＦＮＳ ＩＩ活性改変に関する。ＦＮＳ ＩＩ活性の量の低減は、
ダウンレギュレーションとも呼ばれる。
活性を増大するかまたは低減することにより達成され得る植物およびその他の生
物体におけるＦＮＳ ＩＩ活性改変に関する。ＦＮＳ ＩＩ活性の量の低減は、
ダウンレギュレーションとも呼ばれる。
【００５８】 フラボン含有植物では、フラボン合成は、適切な方法により標的化方式で上向
きまたは下向き調節され得るか、または完全にスイッチを切られ得る。これは、
植物に関するいくつかの結果である。基本的には、基質（フラボノン、例えばナ
リンゲニン）に対するいくつかの酵素（ＦＮＳ ＩＩ、ＦＨＴ、Ｆ３’Ｈ、Ｆ３
’，５‘Ｈ）の永続的な競合が存在するため、この種類の生合成経路の改変は、
全フラボン生合成に影響を及ぼす。これは、詳細には、例えばＦＮＳ ＩＩのア
ップレギュレーションが、例えばより薄い花の色が達成され得る下流生合成経路
（図１Ａ）におけるフラボノイドの合成を低減することを意味する。さらに、特
定組織に制限され得るフラボン含量のこの標的化増大により、耐性特性および植
物の共生を形成する能力が顕著に改善され得る。対照した場合、ダウンレギュレ
ーションは、植物により有益であり得る他のフラボノイドの合成の増大を生じる
。これは、ＵＶ防御に重要なフラボノールと、有色アントシアンまたは耐性誘導
プロアントシアニジンおよびフィトアレキシンの両方に影響を及ぼし得る。フラ
ボン生成の完全抑制は、ダウンレギュレーションの作用の増強を生じ、昆虫に対
して可能性のある刺激剤を除去し、したがって耐性発生に寄与し得る。
きまたは下向き調節され得るか、または完全にスイッチを切られ得る。これは、
植物に関するいくつかの結果である。基本的には、基質（フラボノン、例えばナ
リンゲニン）に対するいくつかの酵素（ＦＮＳ ＩＩ、ＦＨＴ、Ｆ３’Ｈ、Ｆ３
’，５‘Ｈ）の永続的な競合が存在するため、この種類の生合成経路の改変は、
全フラボン生合成に影響を及ぼす。これは、詳細には、例えばＦＮＳ ＩＩのア
ップレギュレーションが、例えばより薄い花の色が達成され得る下流生合成経路
（図１Ａ）におけるフラボノイドの合成を低減することを意味する。さらに、特
定組織に制限され得るフラボン含量のこの標的化増大により、耐性特性および植
物の共生を形成する能力が顕著に改善され得る。対照した場合、ダウンレギュレ
ーションは、植物により有益であり得る他のフラボノイドの合成の増大を生じる
。これは、ＵＶ防御に重要なフラボノールと、有色アントシアンまたは耐性誘導
プロアントシアニジンおよびフィトアレキシンの両方に影響を及ぼし得る。フラ
ボン生成の完全抑制は、ダウンレギュレーションの作用の増強を生じ、昆虫に対
して可能性のある刺激剤を除去し、したがって耐性発生に寄与し得る。
【００５９】 フラボンの全く新しい合成は、天然活性を欠く植物へのＦＮＳ ＩＩの標的化
度により達成され得る。したがって、存在する基質によって、フラボン含量およ
びフラボンパターンは制御され得る。この過程を確立することにより、花の色、
耐性特性および窒素固定細菌との共生を形成する能力は、標的化方式で改変され
得る。さらに、新規の生合成経路を開くことにより、植物にあまり利益のないフ
ラボノイド（例えば、食餌刺激剤）の生成が低減され、フラボンから生成される
ビフラボンの合成が確立され得る。
度により達成され得る。したがって、存在する基質によって、フラボン含量およ
びフラボンパターンは制御され得る。この過程を確立することにより、花の色、
耐性特性および窒素固定細菌との共生を形成する能力は、標的化方式で改変され
得る。さらに、新規の生合成経路を開くことにより、植物にあまり利益のないフ
ラボノイド（例えば、食餌刺激剤）の生成が低減され、フラボンから生成される
ビフラボンの合成が確立され得る。
【００６０】 これらのアプローチを用いて、重要なフラボン含有またはフラボン無含有農業
植物のフラボノイドのパターンおよび含量を改変し、ヒトおよび動物の生物学に
関するそれらのポジティブな特性を最適化し得る。
植物のフラボノイドのパターンおよび含量を改変し、ヒトおよび動物の生物学に
関するそれらのポジティブな特性を最適化し得る。
【００６１】 さらに、本発明は、種々の植物組織（花、根、葉等）およびその他の生物体に
おけるフラボン含量およびフラボンパターンのそれぞれの標的化改変のための方
法に関し、したがって、概して本発明は、フラボノイド組成物の改変、特に同時
色素沈着による花の色の改変、耐性特性の改変、ならびにマメ科植物の場合の根
粒形成の能力の改変に関する。
おけるフラボン含量およびフラボンパターンのそれぞれの標的化改変のための方
法に関し、したがって、概して本発明は、フラボノイド組成物の改変、特に同時
色素沈着による花の色の改変、耐性特性の改変、ならびにマメ科植物の場合の根
粒形成の能力の改変に関する。
【００６２】 別の実施態様では、本発明は、フラボンの合成のための本発明のポリペプチド
の使用に関する。適切な発現系では、適切な基質から出発して、酵素それ自体お
よびそれによりついには天然フラボンが合成され得る。健康促進天然フラボンを
生成するための適切な発現系の使用が可能である。これらの発現系は、植物起源
のものであるか、あるいはそれぞれ細胞培養または酵母培養からなり得る。植物
体内または細胞培養におけるＦＮＳ ＩＩの発現を用いて、それぞれのフラボン
を直接得ることができるが、この場合、酵母発現系は、無傷酵素を得るために好
ましい。この酵素を用いて、化学的または天然前駆体（フラバノン）を次に反応
させて、対応するフラボンを生成し得る。この方法で合成されるフラボンは、例
えば癌療法に用途を見出し得るか、または医薬品の生成においてヒトおよび動物
の健康に寄与し得る。
の使用に関する。適切な発現系では、適切な基質から出発して、酵素それ自体お
よびそれによりついには天然フラボンが合成され得る。健康促進天然フラボンを
生成するための適切な発現系の使用が可能である。これらの発現系は、植物起源
のものであるか、あるいはそれぞれ細胞培養または酵母培養からなり得る。植物
体内または細胞培養におけるＦＮＳ ＩＩの発現を用いて、それぞれのフラボン
を直接得ることができるが、この場合、酵母発現系は、無傷酵素を得るために好
ましい。この酵素を用いて、化学的または天然前駆体（フラバノン）を次に反応
させて、対応するフラボンを生成し得る。この方法で合成されるフラボンは、例
えば癌療法に用途を見出し得るか、または医薬品の生成においてヒトおよび動物
の健康に寄与し得る。
【００６３】 以下の図面および例を参照しながら、本発明を詳細に説明する。ガーベラ(Ger
bera hybrids)から得られた核酸配列に関して、本発明を説明する。同様の配列
は種々のその他の供給源、例えばその他の植物または特定の微生物から容易に単
離され得るということは、ここで明白である。その他のフラボン産生植物の例と
しては、グロキシニア（Sinningia hybrids）、キンギョソウ（Antirrhinium ma
jus）、コルムネア（Columnea hybrids）、ダリア（Dahlia variabilis）、グロ
キシニア（Sinningia caridinalis）、ウシノシタ（Streptocarpus hybrids）、
クマツヅラ（Verbena hybrida）、シマカンギク（Chrysanthemum indicum）、ピ
ースリリー(peace lily)（Spathiphyllum wallisii）が挙げられるが、これらに
限定されない。フラボノイド生合成経路の酵素、特にＦＮＳ ＩＩを直接または
間接的にコードするこれらの核酸配列はすべて、その供給源に関係なく、本発明
に包含される。
bera hybrids)から得られた核酸配列に関して、本発明を説明する。同様の配列
は種々のその他の供給源、例えばその他の植物または特定の微生物から容易に単
離され得るということは、ここで明白である。その他のフラボン産生植物の例と
しては、グロキシニア（Sinningia hybrids）、キンギョソウ（Antirrhinium ma
jus）、コルムネア（Columnea hybrids）、ダリア（Dahlia variabilis）、グロ
キシニア（Sinningia caridinalis）、ウシノシタ（Streptocarpus hybrids）、
クマツヅラ（Verbena hybrida）、シマカンギク（Chrysanthemum indicum）、ピ
ースリリー(peace lily)（Spathiphyllum wallisii）が挙げられるが、これらに
限定されない。フラボノイド生合成経路の酵素、特にＦＮＳ ＩＩを直接または
間接的にコードするこれらの核酸配列はすべて、その供給源に関係なく、本発明
に包含される。
【００６４】例１ 材料 化学物質、酵素および放射性化学物質 Carl Roth（Karlsruhe, Germany）からナリンゲニン、エリオジクチオール、
アピゲニンおよびルテオリンを入手した。パセリ懸濁液培養からの部分的精製カ
ルコンシンターゼ（ＣＨＳ）およびカルコンイソメラーゼを用いて、Britsch等
（1981）に記載された方法により、［１４Ｃ］マロニルＣｏＡ（ARC, St. Louis
, USA）およびｐ−クマロイルＣｏＡ（Dr. Werner Heller, GSF, Neuherberg, G
ermany）から［１４Ｃ］ナリンゲニンを調製した。他の酵素はすべて、市販供給
元から入手し、それらの仕様書にしたがって使用した。
アピゲニンおよびルテオリンを入手した。パセリ懸濁液培養からの部分的精製カ
ルコンシンターゼ（ＣＨＳ）およびカルコンイソメラーゼを用いて、Britsch等
（1981）に記載された方法により、［１４Ｃ］マロニルＣｏＡ（ARC, St. Louis
, USA）およびｐ−クマロイルＣｏＡ（Dr. Werner Heller, GSF, Neuherberg, G
ermany）から［１４Ｃ］ナリンゲニンを調製した。他の酵素はすべて、市販供給
元から入手し、それらの仕様書にしたがって使用した。
【００６５】 細菌および酵母菌株 以下の大腸菌株を用いた：ＴＯＰ１０Ｆ’およびＴＯＰ１０（ともにInvitrog
en , Groningen, Netherlandsから）。さらに、以下の酵母菌株を用いた：ＩＮ
ＶＳｃ１（Invitorgen）。 クローニングベクターｐＣＲ２．１およびｐＹＥＳ２は、Invitrogenから入手
した。 挿入物およびベクターｐＣＲ２．１のライゲーション、ならびに細菌の形質転
換はそれぞれ、メーカーの使用説明書にしたがって実行した。
en , Groningen, Netherlandsから）。さらに、以下の酵母菌株を用いた：ＩＮ
ＶＳｃ１（Invitorgen）。 クローニングベクターｐＣＲ２．１およびｐＹＥＳ２は、Invitrogenから入手
した。 挿入物およびベクターｐＣＲ２．１のライゲーション、ならびに細菌の形質転
換はそれぞれ、メーカーの使用説明書にしたがって実行した。
【００６６】 植物材料 化学遺伝的に定義されたガーベラクローン変種（Tyrach and Horn, 1997）お
よび「Ｔｈ５８」系統の自家生殖子孫が利用可能であった。さらに、最新切断ガ
ーベラ変種「Ｒｅｇｉｎａ」（Terra Nigra社、DeKwakel, Netherlands）および
「Ｄｅｌｐｈｉ」（Florist社、DeKwakel, Netherlands ）を含んだ。植物材料
の詳細な説明は、表２中に見出し得る。
よび「Ｔｈ５８」系統の自家生殖子孫が利用可能であった。さらに、最新切断ガ
ーベラ変種「Ｒｅｇｉｎａ」（Terra Nigra社、DeKwakel, Netherlands）および
「Ｄｅｌｐｈｉ」（Florist社、DeKwakel, Netherlands ）を含んだ。植物材料
の詳細な説明は、表２中に見出し得る。
【００６７】
【表２】
【００６８】例２ 植物栽培、交雑方法および花段階 実際上共通の条件下で温室内で、ガーベラGerbera hybridsの植物を栽培した
。日長は、１０，０００ルクスの光強度で２２℃で少なくとも１４時間であった
。同一花序内で、または同一植物の花序間で、変種「Ｔｈ５８」（遺伝子型ｆｎ
ｓ＋ｆｎｓ）の自家生殖を実行した。この自家生殖実験は、Ｆｎｓ遺伝子座に関
してヘテロ接合性である任意の変種または系統を用いて実行され得る。対応する
化学遺伝子学的および生化学的方法は、Tyrach and Horn（1997）およびMartens
and Forkmann（1998）に詳述されている。花全体に被せたグラシン紙袋により
、開花制御を達成した。理想的には、毎日４回までの間隔で、授粉を繰り返した
。ガーベラにおける授粉方法および花の形態に関するさらなる説明は、Maurer（
1967）に見出し得る。
。日長は、１０，０００ルクスの光強度で２２℃で少なくとも１４時間であった
。同一花序内で、または同一植物の花序間で、変種「Ｔｈ５８」（遺伝子型ｆｎ
ｓ＋ｆｎｓ）の自家生殖を実行した。この自家生殖実験は、Ｆｎｓ遺伝子座に関
してヘテロ接合性である任意の変種または系統を用いて実行され得る。対応する
化学遺伝子学的および生化学的方法は、Tyrach and Horn（1997）およびMartens
and Forkmann（1998）に詳述されている。花全体に被せたグラシン紙袋により
、開花制御を達成した。理想的には、毎日４回までの間隔で、授粉を繰り返した
。ガーベラにおける授粉方法および花の形態に関するさらなる説明は、Maurer（
1967）に見出し得る。
【００６９】 以下のように定義された異なる発育段階（Martens and Forkmann, 1998による
）で、ガーベラの花を収穫した： 段階１：堅いつぼみ、花弁は５ｍｍより小さい； 段階２：周辺花可視的、長さ５〜１０ｍｍ； 段階３：周辺花、長さ１０〜１５ｍｍ； 段階４：色素沈着開始、長さ１５〜２３ｍｍ； 段階５：色素沈着した周辺花の小舌、長さ２３〜２６ｍｍ； 段階６：周辺花、長さ２６〜３５ｍｍ； 段階７：花序半開、長さ３５〜４０ｍｍ； 段階８：花序全開、長さ４０〜５０ｍｍ； 段階９：周辺花、長さ５０〜５５ｍｍ； 段階１０：周辺花、長さ５５〜６０ｍｍ； 段階１１：老衰花序、長さ５５〜６０ｍｍ。
）で、ガーベラの花を収穫した： 段階１：堅いつぼみ、花弁は５ｍｍより小さい； 段階２：周辺花可視的、長さ５〜１０ｍｍ； 段階３：周辺花、長さ１０〜１５ｍｍ； 段階４：色素沈着開始、長さ１５〜２３ｍｍ； 段階５：色素沈着した周辺花の小舌、長さ２３〜２６ｍｍ； 段階６：周辺花、長さ２６〜３５ｍｍ； 段階７：花序半開、長さ３５〜４０ｍｍ； 段階８：花序全開、長さ４０〜５０ｍｍ； 段階９：周辺花、長さ５０〜５５ｍｍ； 段階１０：周辺花、長さ５５〜６０ｍｍ； 段階１１：老衰花序、長さ５５〜６０ｍｍ。
【００７０】例３ 自家生殖子孫の生化学的および酵素学的特性化 フラボノイドの抽出および同定のために、既知の標準的方法（Marbry 他, 197
0; Harborne, 1967）を用いた。アンモニアによる気化の前後に、ＵＶ光（２４
３ｎｍ）下で、フラボンをさらに検出した。ホウ水素化ナトリウムによる還元と
その後の塩酸蒸気による処理によって、フラバノンを同定した（Eigen et al.,
1957）。
0; Harborne, 1967）を用いた。アンモニアによる気化の前後に、ＵＶ光（２４
３ｎｍ）下で、フラボンをさらに検出した。ホウ水素化ナトリウムによる還元と
その後の塩酸蒸気による処理によって、フラバノンを同定した（Eigen et al.,
1957）。
【００７１】 Schleicher & Schull社（Dassel, Germany）の前被覆化セルロースプレートＧ
１４４０上で、薄層クロマトグラフィーを実行した。この目的のために、以下の
溶離剤を用いた：（１）クロロホルム−酢酸−水（１０：９：１）；（２）３０
％酢酸；（３）酢酸−塩酸−水（３０：３：１０）；および（４）ｔｅｒｔ−ブ
タノール−酢酸−水（３：１：１）。
１４４０上で、薄層クロマトグラフィーを実行した。この目的のために、以下の
溶離剤を用いた：（１）クロロホルム−酢酸−水（１０：９：１）；（２）３０
％酢酸；（３）酢酸−塩酸−水（３０：３：１０）；および（４）ｔｅｒｔ−ブ
タノール−酢酸−水（３：１：１）。
【００７２】 エチルアセテートを用いて、異なる段階の花弁からの色素の抽出により、発育
中の蕾および花のフラボン含量を確定した。組織対抽出剤の比は１：４０（ｇ／
ｍｌ）で、抽出期間は暗所で４℃で４８時間であった。ＨＰＬＣを用いて、特性
化および定量を実施した。１０μｌの７５％メタノール性抽出物をSpherisorb O
DS IIカラム（粒子サイズ５μｍ、２５０ｘ４．６ｍｍ、Bischoff, Leonberg, G
ermany）に適用し、その上で分離した（Lange et al., 1994）。ダイオードアレ
イ検出器モデル１６８（Beckman, Munich, Germany）を用いて、検出を実行した
。
中の蕾および花のフラボン含量を確定した。組織対抽出剤の比は１：４０（ｇ／
ｍｌ）で、抽出期間は暗所で４℃で４８時間であった。ＨＰＬＣを用いて、特性
化および定量を実施した。１０μｌの７５％メタノール性抽出物をSpherisorb O
DS IIカラム（粒子サイズ５μｍ、２５０ｘ４．６ｍｍ、Bischoff, Leonberg, G
ermany）に適用し、その上で分離した（Lange et al., 1994）。ダイオードアレ
イ検出器モデル１６８（Beckman, Munich, Germany）を用いて、検出を実行した
。
【００７３】 Martens and Forkmann（1998）に記載されているように、酵素調製およびＦＮ
Ｓ ＩＩ検定を実施した。１．０ｇの花弁、０．５ｇのDowex（トリス緩衝液、
ｐＨ７．５中で平衡）および０．５ｇの海砂を用いて、４℃で、２８ｍｍｏｌ／
ｌの２−メルカプトエタノールおよび１０ｍｍｏｌ／ｌのアスコルビン酸ナトリ
ウムを含有する６．０ｍｌのトリス−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ７．５）中で、調製を
実施した。冷却乳鉢中で均質化後、ホモジネートをエッペンドルフ管に移して、
１０，０００ｘｇで５分間、２回遠心分離した。透明上清を生抽出物として用い
るか、またはDiesperger 他, （1974）にしたがって、ＭｇＣｌ２によるミクロ
ソームの沈澱のために用いた。Bradford（1976）の方法により、調製物のタンパ
ク質含量を確定した。
Ｓ ＩＩ検定を実施した。１．０ｇの花弁、０．５ｇのDowex（トリス緩衝液、
ｐＨ７．５中で平衡）および０．５ｇの海砂を用いて、４℃で、２８ｍｍｏｌ／
ｌの２−メルカプトエタノールおよび１０ｍｍｏｌ／ｌのアスコルビン酸ナトリ
ウムを含有する６．０ｍｌのトリス−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ７．５）中で、調製を
実施した。冷却乳鉢中で均質化後、ホモジネートをエッペンドルフ管に移して、
１０，０００ｘｇで５分間、２回遠心分離した。透明上清を生抽出物として用い
るか、またはDiesperger 他, （1974）にしたがって、ＭｇＣｌ２によるミクロ
ソームの沈澱のために用いた。Bradford（1976）の方法により、調製物のタンパ
ク質含量を確定した。
【００７４】 総容量２００μｌ：１７５μｌのトリス−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ７．５）、０．
３ｎｍｏｌの放射能標識化基質（８３Ｂｑ；ナリンゲニン）、２．０ｎｍｏｌの
非標識化基質、１０μｌの２０ｍｍｏｌ／ｌのＮＡＤＰＨおよび１５μｌの生抽
出物またはミクロソーム調製物：中に含入されたＦＮＳ ＩＩに関する標準検定
。２５℃で２０分間のインキュベーション後、対応するフラボノイドの混合物を
含有する２０μｌのメタノールの付加により、反応を停止した。１００および５
０μｌのエチルアセテートを用いて、反応混合物の抽出を２回実行した。溶離剤
１中のセルロース薄層プレート上で上部相をクロマトグラフィー処理した（上記
参照）。Ｆｕｊｉ ＢＡＳ １０００ Ｂｉｏ−Ｉｍａｇｉｎｇ分析機（Fuji Phot
o Film Co., Tokio, Japan）およびＴＩＮＡソフトウェアパッケージ（Raytest,
Straubenhardt, Germany）を用いて、放射能を局在化し、定量した。図２は、
ガーベラ変種「Ｔｈ５８」ならびに「１４７−１５０」および「１４７−１４６
」系統を用いて実行した酵素検定の結果を例示的に示す。対応する遺伝子型を表
２に示す。
３ｎｍｏｌの放射能標識化基質（８３Ｂｑ；ナリンゲニン）、２．０ｎｍｏｌの
非標識化基質、１０μｌの２０ｍｍｏｌ／ｌのＮＡＤＰＨおよび１５μｌの生抽
出物またはミクロソーム調製物：中に含入されたＦＮＳ ＩＩに関する標準検定
。２５℃で２０分間のインキュベーション後、対応するフラボノイドの混合物を
含有する２０μｌのメタノールの付加により、反応を停止した。１００および５
０μｌのエチルアセテートを用いて、反応混合物の抽出を２回実行した。溶離剤
１中のセルロース薄層プレート上で上部相をクロマトグラフィー処理した（上記
参照）。Ｆｕｊｉ ＢＡＳ １０００ Ｂｉｏ−Ｉｍａｇｉｎｇ分析機（Fuji Phot
o Film Co., Tokio, Japan）およびＴＩＮＡソフトウェアパッケージ（Raytest,
Straubenhardt, Germany）を用いて、放射能を局在化し、定量した。図２は、
ガーベラ変種「Ｔｈ５８」ならびに「１４７−１５０」および「１４７−１４６
」系統を用いて実行した酵素検定の結果を例示的に示す。対応する遺伝子型を表
２に示す。
【００７５】例４ オリゴヌクレオチド合成 オリゴヌクレオチドは、Metabion社（Martinsried, Germany）により合成され
た。以下のオリゴヌクレオチド（５’−３’）を用いた：
た。以下のオリゴヌクレオチド（５’−３’）を用いた：
【００７６】
【外１】
【００７７】 Schopfer and Ebel（1998）にしたがって、３つのオリゴマーおよび８つのデ
カマーを合成した。
カマーを合成した。
【００７８】例５ ガーベラ(Gerbera hybrids)からのＰ４５０断片のクローニング ガーベラ花弁からの総ＲＮＡの単離 ＦＮＳ ＩＩ活性が増大する段階２〜４の種々の限定遺伝子型（ｆｎｓ＋ ．
またはｆｎｓｆｎｓ；表２）から、Guiliano 他（1993）に記載された方法にし
たがって、ガーベラ花弁からの総ＲＮＡを単離した（図３）。液体窒素中で凍結
させた１．２ｇの植物材料を、冷却乳鉢中で微粉末に粉砕して、冷却コレックス
管中に移した。４Ｍのグアニジニウムチオシアネート、０．１５Ｍの酢酸ナトリ
ウム（ｐＨ５．３）、０．２％ナトリウムサルコシネートおよび０．７％βメル
カプトエタノールからなる３ｍｌの負荷抽出緩衝液および２．４ｍｌの水平衡フ
ェノール（０．１Ｍクエン酸塩緩衝液、ｐＨ４．３で飽和、Sigma, Deisenhofen
, Germany）中で十分撹拌することにより、組織を均質化した。０．６ｍｌのク
ロロホルムの付加後、十分に混合したホモジネートを氷上に２０分間保持し、次
に、１５，０００ｘｇで遠心分離した（Sorvall RC-5B plus; SS34）。取り出し
た上部相を１容積のイソプロパノールとともに付加し、氷上でさらに６０分間イ
ンキュベートした。１５，０００ｘｇで３０分間遠心分離（Sorvall、上記参照
）後、上部相を捨て、ペレットを滅菌Ｈ２Ｏ中に再懸濁させた。多糖を取り出す
ために、溶液を１００％エタノール（最終濃度２０％（ｖ／ｖ））とともに付加
し、氷上で２０分間インキュベートして、４℃で１０，０００ｘｇで１０分間、
遠心分離した。核酸を含有する上清を１／３容積の８Ｍ塩化リチウムとともに付
加した。氷上で３０分間インキュベーション後、１５，０００ｘｇで２０分間の
遠心分離を実行し、上清を捨てた。沈澱ＲＮＡを１ｍｌの８０％エタノールで各
々２回洗浄し、次に５０μｌのＨ２Ｏ中に再懸濁して、−７０℃で保存した。Ｒ
ＮＡ濃度の確定は、２６０のｎｍの波長で分光測光的に実行した（Pharmacia Bi
ochrome 4060）。 必要な場合、２サイクルのオリゴ（ｄＴ）セルロースクロマトグラフィーによ
り、全体的ＲＮＡからポリ（Ａ）＋ＲＮＡを付加的に単離した（Sambrook et al
., 1989）。
またはｆｎｓｆｎｓ；表２）から、Guiliano 他（1993）に記載された方法にし
たがって、ガーベラ花弁からの総ＲＮＡを単離した（図３）。液体窒素中で凍結
させた１．２ｇの植物材料を、冷却乳鉢中で微粉末に粉砕して、冷却コレックス
管中に移した。４Ｍのグアニジニウムチオシアネート、０．１５Ｍの酢酸ナトリ
ウム（ｐＨ５．３）、０．２％ナトリウムサルコシネートおよび０．７％βメル
カプトエタノールからなる３ｍｌの負荷抽出緩衝液および２．４ｍｌの水平衡フ
ェノール（０．１Ｍクエン酸塩緩衝液、ｐＨ４．３で飽和、Sigma, Deisenhofen
, Germany）中で十分撹拌することにより、組織を均質化した。０．６ｍｌのク
ロロホルムの付加後、十分に混合したホモジネートを氷上に２０分間保持し、次
に、１５，０００ｘｇで遠心分離した（Sorvall RC-5B plus; SS34）。取り出し
た上部相を１容積のイソプロパノールとともに付加し、氷上でさらに６０分間イ
ンキュベートした。１５，０００ｘｇで３０分間遠心分離（Sorvall、上記参照
）後、上部相を捨て、ペレットを滅菌Ｈ２Ｏ中に再懸濁させた。多糖を取り出す
ために、溶液を１００％エタノール（最終濃度２０％（ｖ／ｖ））とともに付加
し、氷上で２０分間インキュベートして、４℃で１０，０００ｘｇで１０分間、
遠心分離した。核酸を含有する上清を１／３容積の８Ｍ塩化リチウムとともに付
加した。氷上で３０分間インキュベーション後、１５，０００ｘｇで２０分間の
遠心分離を実行し、上清を捨てた。沈澱ＲＮＡを１ｍｌの８０％エタノールで各
々２回洗浄し、次に５０μｌのＨ２Ｏ中に再懸濁して、−７０℃で保存した。Ｒ
ＮＡ濃度の確定は、２６０のｎｍの波長で分光測光的に実行した（Pharmacia Bi
ochrome 4060）。 必要な場合、２サイクルのオリゴ（ｄＴ）セルロースクロマトグラフィーによ
り、全体的ＲＮＡからポリ（Ａ）＋ＲＮＡを付加的に単離した（Sambrook et al
., 1989）。
【００７９】 ＲＮＡの逆転写 前記のようにそれぞれ、異なる遺伝子型または花段階から単離した５μｇの全
ＲＮＡまたは５００ｎｇのポリ（Ａ）＋ＲＮＡを、各々、逆転写酵素により、３
つのオリゴ（ｄＴ）プライマーのうちの１つを用いて、２５μｌの試料中でｃＤ
ＮＡに転写した（スーパースクリプトSuperScriptTM; II, GIBCO BRL, Paisley,
Great Britain）。ＲＮＡにそれぞれのオリゴ（ｄＴ）プライマー（最終濃度１
μＭ）１μｌおよび１７μｌ容量までの水を添加した。次に試料を７０℃で１０
分間変性させ、その後、氷上に載せた。４μｌの５ｘスーパースクリプト第１鎖
緩衝液、２μｌの１００ｍＭジチオトレイトール、１μｌの１０ｍＭｄＮＴＰミ
ックスの添加後、試料を４２℃で２分間、予備インキュベートした。１μｌ（２
００Ｕ）のスーパースクリプトSuperScriptTM;逆転写酵素を試料中に直接ピペッ
ト分取した。反応物を４２℃で６０分間、次に７０℃で１５分間インキュベート
した。これは、以下のｃＤＮＡを提供した：ｆｎｓ＋Ａ、ＣまたはＧおよび対応
的に劣性系統ｆｎｓ−Ａ、ＣまたはＧ。これらのｃＤＮＡを、ＰＣＲ試料のため
の鋳型として直接用いた。
ＲＮＡまたは５００ｎｇのポリ（Ａ）＋ＲＮＡを、各々、逆転写酵素により、３
つのオリゴ（ｄＴ）プライマーのうちの１つを用いて、２５μｌの試料中でｃＤ
ＮＡに転写した（スーパースクリプトSuperScriptTM; II, GIBCO BRL, Paisley,
Great Britain）。ＲＮＡにそれぞれのオリゴ（ｄＴ）プライマー（最終濃度１
μＭ）１μｌおよび１７μｌ容量までの水を添加した。次に試料を７０℃で１０
分間変性させ、その後、氷上に載せた。４μｌの５ｘスーパースクリプト第１鎖
緩衝液、２μｌの１００ｍＭジチオトレイトール、１μｌの１０ｍＭｄＮＴＰミ
ックスの添加後、試料を４２℃で２分間、予備インキュベートした。１μｌ（２
００Ｕ）のスーパースクリプトSuperScriptTM;逆転写酵素を試料中に直接ピペッ
ト分取した。反応物を４２℃で６０分間、次に７０℃で１５分間インキュベート
した。これは、以下のｃＤＮＡを提供した：ｆｎｓ＋Ａ、ＣまたはＧおよび対応
的に劣性系統ｆｎｓ−Ａ、ＣまたはＧ。これらのｃＤＮＡを、ＰＣＲ試料のため
の鋳型として直接用いた。
【００８０】 ｐ４５０特異的プライマーを用いたＰＣＲ増幅 オリゴ（ｄＴ）アンカープライマーの他に、第２の非縮重化Ｐ４５０特異的プ
ライマー（デカマー１〜８）を用いたＰＣＲにより、異なるｃＤＮＡの増幅を実
施した。ＰＣＲ試料は、２０μｌの全容量中に以下の構成成分を含有した：６．
２μｌの水、１μｌの２０ｘポリメラーゼ緩衝液、２．５ｍＭのＭｇＣｌ２、０
．２μＭのｄＮＴＰミックス、１μｌの３５Ｓ−ＡＴＰ［１０００Ｃｉ／ｍｍｏ
ｌ］（ICN Pharmaceuticals, Irvine, USA）、０．５μＭの８つのデカマープラ
イマーのうちの１つ、１μＭのｃＤＮＡに特異的なオリゴ（ｄＴ）プライマー、
４μｌの前記のｃＤＮＡ試料および０．２μｌの５Ｕ／μｌのリプリゼルム(Rep
litherm)ポリメラーゼ（Epicentre, Madison, USA）。以下のＰＣＲパラメータ
ーを用いた：９４℃で１０分の変性工程、次に９４℃で３０秒、４０℃（アニー
リング）で２分および７２℃（伸長）で３０秒を４０サイクル、その後、７２℃
で７分の最終伸長。次に、４μｌのＰＣＲ産物に２μｌのホルムアミドローディ
ング緩衝液（８０％ホルムアミド；１０ｍＭのＥＤＴＡ（ｐＨ８．０）、１ｍｇ
／ｍｌのキシレンシアノールＦＦおよび１ｍｇ／ｍｌのブロモフェノールブルー
）を添加し、混合し、９５℃で２分間変性させた後、氷上に直接載せた。この方
法で調製した試料を５％変性ポリアクリルアミドゲルに載せ、最大４０Ｗで３時
間分離した。その後、ゲルをワットマン紙に移して、ゲル乾燥機中で固定した。
Fuji BAS 1000 Bio-Imaging分析機（Fuji）およびＴＩＮＡソフトウェアパッケ
ージ（Raytest）を用いて、放射能または示差的帯域をそれぞれ局在化した。３
００〜５００ｂｐのサイズで示差的に発現された帯域を鋭利な刃を用いてワット
マン紙と一緒に固定ゲルから切り取って、エッペンドルフチューブに移し、室温
で１０分間、１００μｌの水中で再水和させた。その後、チューブを１００℃で
１０分間インキュベートし、卓上遠心分離器で全速で２分間遠心分離して、残留
ゲルおよび紙を除去した。上清を新しいエッペンドルフチューブに移した。３Ｍ
酢酸ナトリウム１０μｌ、担体として１０ｍｇ／ｍｌグリコゲン５μｌ、および
４００μｌの１００％エタノールを添加後、−７０℃で６０分間、ＤＮＡを沈澱
させた。次に、１４，０００ｒｐｍにて４℃での遠心分離により沈澱ＤＮＡをペ
レット化し、８５％氷冷エタノールで２回洗浄して、風乾し、１０μｌの水中に
再懸濁させた。この方法で得られたｃＤＮＡの再増幅を、以下の成分を含有する
５０μｌのＰＣＲ試料で実行した：２７．８μｌの水、２μｌの２０ｘポリメラ
ーゼ緩衝液、４μｌの２５ｍＭのＭｇＣｌ２、３．２μｌの５００μＭ ｄＮＴ
Ｐミックス、４μｌの５μＭの対応するデカマープライマー、４μｌの２５μＭ
の対応するオリゴ（ｄＴ）プライマー、４μｌの前記の溶離ＤＮＡおよび０．５
μｌの５Ｕ／μｌレプリゼルム(Replitherm)ポリメラーゼ（Epicentre）。ＰＣ
Ｒパラメーターは、第１の増幅の場合と同一であった。１．５％アガロースゲル
を用いてＰＣＲ産物を分離し、対応する増幅物をベクターＴＯＰＯｐＣＲ２．１
中にクローン化し、次に、メーカーの使用説明書にしたがってＴＯＰＯ １０Ｆ
ワンショットコンピテント細胞（Invitrogen）に形質転換した。メーカーの使用
説明書にしたがって、プラスミドミニプレップクオンタムプレップキット（Bio-
Rad, Munich, Germany）を用いて、青−白スクリーニングにより同定した細菌か
らプラスミド単離した。適切な制限酵素（例えば、Ｅｃｏ ＲＩ：Boehringer,
Mannheim, Germany）による消化および３００〜５００ｂｐの長さを有する１．
５％アガロースゲル上での分離後に同定された挿入物を、QUIAEX IIゲル溶離キ
ット（QUIAGEN, Hilden, Germany）を用いてゲルから溶離した。これらのＤＮＡ
断片を、レジプライム ラベリング キット（Amersham, Braunschweig, German
y）を用いて３２Ｐで標識し、ノーザンブロット分析に用いた。シーケナーゼ酵
素バージョン２．１（Amersham, Braunschweig, Germany）を用いて、実質的にS
anger et al.（1977）に記載された方法にしたがって、これらおよびその他のク
ローンのＤＮＡシーケンシングを実行した。
ライマー（デカマー１〜８）を用いたＰＣＲにより、異なるｃＤＮＡの増幅を実
施した。ＰＣＲ試料は、２０μｌの全容量中に以下の構成成分を含有した：６．
２μｌの水、１μｌの２０ｘポリメラーゼ緩衝液、２．５ｍＭのＭｇＣｌ２、０
．２μＭのｄＮＴＰミックス、１μｌの３５Ｓ−ＡＴＰ［１０００Ｃｉ／ｍｍｏ
ｌ］（ICN Pharmaceuticals, Irvine, USA）、０．５μＭの８つのデカマープラ
イマーのうちの１つ、１μＭのｃＤＮＡに特異的なオリゴ（ｄＴ）プライマー、
４μｌの前記のｃＤＮＡ試料および０．２μｌの５Ｕ／μｌのリプリゼルム(Rep
litherm)ポリメラーゼ（Epicentre, Madison, USA）。以下のＰＣＲパラメータ
ーを用いた：９４℃で１０分の変性工程、次に９４℃で３０秒、４０℃（アニー
リング）で２分および７２℃（伸長）で３０秒を４０サイクル、その後、７２℃
で７分の最終伸長。次に、４μｌのＰＣＲ産物に２μｌのホルムアミドローディ
ング緩衝液（８０％ホルムアミド；１０ｍＭのＥＤＴＡ（ｐＨ８．０）、１ｍｇ
／ｍｌのキシレンシアノールＦＦおよび１ｍｇ／ｍｌのブロモフェノールブルー
）を添加し、混合し、９５℃で２分間変性させた後、氷上に直接載せた。この方
法で調製した試料を５％変性ポリアクリルアミドゲルに載せ、最大４０Ｗで３時
間分離した。その後、ゲルをワットマン紙に移して、ゲル乾燥機中で固定した。
Fuji BAS 1000 Bio-Imaging分析機（Fuji）およびＴＩＮＡソフトウェアパッケ
ージ（Raytest）を用いて、放射能または示差的帯域をそれぞれ局在化した。３
００〜５００ｂｐのサイズで示差的に発現された帯域を鋭利な刃を用いてワット
マン紙と一緒に固定ゲルから切り取って、エッペンドルフチューブに移し、室温
で１０分間、１００μｌの水中で再水和させた。その後、チューブを１００℃で
１０分間インキュベートし、卓上遠心分離器で全速で２分間遠心分離して、残留
ゲルおよび紙を除去した。上清を新しいエッペンドルフチューブに移した。３Ｍ
酢酸ナトリウム１０μｌ、担体として１０ｍｇ／ｍｌグリコゲン５μｌ、および
４００μｌの１００％エタノールを添加後、−７０℃で６０分間、ＤＮＡを沈澱
させた。次に、１４，０００ｒｐｍにて４℃での遠心分離により沈澱ＤＮＡをペ
レット化し、８５％氷冷エタノールで２回洗浄して、風乾し、１０μｌの水中に
再懸濁させた。この方法で得られたｃＤＮＡの再増幅を、以下の成分を含有する
５０μｌのＰＣＲ試料で実行した：２７．８μｌの水、２μｌの２０ｘポリメラ
ーゼ緩衝液、４μｌの２５ｍＭのＭｇＣｌ２、３．２μｌの５００μＭ ｄＮＴ
Ｐミックス、４μｌの５μＭの対応するデカマープライマー、４μｌの２５μＭ
の対応するオリゴ（ｄＴ）プライマー、４μｌの前記の溶離ＤＮＡおよび０．５
μｌの５Ｕ／μｌレプリゼルム(Replitherm)ポリメラーゼ（Epicentre）。ＰＣ
Ｒパラメーターは、第１の増幅の場合と同一であった。１．５％アガロースゲル
を用いてＰＣＲ産物を分離し、対応する増幅物をベクターＴＯＰＯｐＣＲ２．１
中にクローン化し、次に、メーカーの使用説明書にしたがってＴＯＰＯ １０Ｆ
ワンショットコンピテント細胞（Invitrogen）に形質転換した。メーカーの使用
説明書にしたがって、プラスミドミニプレップクオンタムプレップキット（Bio-
Rad, Munich, Germany）を用いて、青−白スクリーニングにより同定した細菌か
らプラスミド単離した。適切な制限酵素（例えば、Ｅｃｏ ＲＩ：Boehringer,
Mannheim, Germany）による消化および３００〜５００ｂｐの長さを有する１．
５％アガロースゲル上での分離後に同定された挿入物を、QUIAEX IIゲル溶離キ
ット（QUIAGEN, Hilden, Germany）を用いてゲルから溶離した。これらのＤＮＡ
断片を、レジプライム ラベリング キット（Amersham, Braunschweig, German
y）を用いて３２Ｐで標識し、ノーザンブロット分析に用いた。シーケナーゼ酵
素バージョン２．１（Amersham, Braunschweig, Germany）を用いて、実質的にS
anger et al.（1977）に記載された方法にしたがって、これらおよびその他のク
ローンのＤＮＡシーケンシングを実行した。
【００８１】例６ ノーザンブロット分析 例５に記載したように、全ＲＮＡを単離した。１０μｇの異なる全ＲＮＡ試料
を、２．２Ｍのホルムアルデヒド／１．２％（ｗ／ｖ）アガロースゲル上で電気
泳動処理した。実行緩衝液は、２０ｍＭのＭＯＰＳ（ｐＨ７．０）、５ｍＭの酢
酸ナトリウムおよび１ｍＭのＥＤＴＡ（ｐＨ７．０）を含有した。メーカーの使
用説明書にしたがってＲＮＡをHybond-NX膜（Amersham）に移し、３２Ｐ標識Ｅ
ｃｏＲＩ−ＥｃｏＲＩｐＤＤｄ７ａｃＤＮＡ断片とハイブリダイズさせた。予備
ハイブリダイゼーション（４２℃で１〜３時間）およびハイブリダイゼーション
（４２℃で１６〜２４時間）を、５０％脱イオン化ホルムアミド、５ｘＳＳＰＥ
、５ｘデンハルト溶液、０．５％ＳＤＳ中で実施した。変性ニシン精子ＤＮＡ（
１００μｇ／ｍｌ）を３２Ｐ標識プローブと一緒にハイブリダイゼーション工程
で添加した。２ｘＳＳＰＥ、１％ＳＤＳ（ｗ／ｖ）中で４２℃で１５分間を２回
、次に１ｘＳＳＰＥ、１％ ＳＤＳ（ｗ／ｖ）で６５℃で１または２回、該フィ
ルターを洗浄した。Fuji BAS 1000 Bio-Imaging分析機（Fuji）およびＴＩＮＡ
ソフトウェアパッケージ（Raytest）を用いて、放射能を局在化し、定量した。 ノーザンブロット分析は、ｃＤＮＡクローンｐＤＤｄ７ａに対応する遺伝子は
ｆｎｓ＋ ．遺伝子型を有する系統で発現されるだけであることを明示した。劣
性遺伝子型ｆｎｓｆｎｓを有する系統では、ハイブリダイゼーションシグナルは
検出できなかった（図１０）。さらに、異なる花段階全体の発現パターンは、花
で測定される、それぞれ酵素活性およびフラボン蓄積と平行する（Martens and
Forkmann, 1998）。
を、２．２Ｍのホルムアルデヒド／１．２％（ｗ／ｖ）アガロースゲル上で電気
泳動処理した。実行緩衝液は、２０ｍＭのＭＯＰＳ（ｐＨ７．０）、５ｍＭの酢
酸ナトリウムおよび１ｍＭのＥＤＴＡ（ｐＨ７．０）を含有した。メーカーの使
用説明書にしたがってＲＮＡをHybond-NX膜（Amersham）に移し、３２Ｐ標識Ｅ
ｃｏＲＩ−ＥｃｏＲＩｐＤＤｄ７ａｃＤＮＡ断片とハイブリダイズさせた。予備
ハイブリダイゼーション（４２℃で１〜３時間）およびハイブリダイゼーション
（４２℃で１６〜２４時間）を、５０％脱イオン化ホルムアミド、５ｘＳＳＰＥ
、５ｘデンハルト溶液、０．５％ＳＤＳ中で実施した。変性ニシン精子ＤＮＡ（
１００μｇ／ｍｌ）を３２Ｐ標識プローブと一緒にハイブリダイゼーション工程
で添加した。２ｘＳＳＰＥ、１％ＳＤＳ（ｗ／ｖ）中で４２℃で１５分間を２回
、次に１ｘＳＳＰＥ、１％ ＳＤＳ（ｗ／ｖ）で６５℃で１または２回、該フィ
ルターを洗浄した。Fuji BAS 1000 Bio-Imaging分析機（Fuji）およびＴＩＮＡ
ソフトウェアパッケージ（Raytest）を用いて、放射能を局在化し、定量した。 ノーザンブロット分析は、ｃＤＮＡクローンｐＤＤｄ７ａに対応する遺伝子は
ｆｎｓ＋ ．遺伝子型を有する系統で発現されるだけであることを明示した。劣
性遺伝子型ｆｎｓｆｎｓを有する系統では、ハイブリダイゼーションシグナルは
検出できなかった（図１０）。さらに、異なる花段階全体の発現パターンは、花
で測定される、それぞれ酵素活性およびフラボン蓄積と平行する（Martens and
Forkmann, 1998）。
【００８２】例７ ｐＤＤｄ７ａの全長クローンの単離 ｃＤＮＡクローンｐＤＤｄ７ａは、非全長クローンであるが、ヘム結合部位か
らいくつかの終止コドンを含む配列のポリ（Ａ＋）末端（３’末端）までの領域
のみに及ぶ。ｐＤＤｄ７ａの全長クローンを得るために、５’ＲＡＣＥ系バージ
ョン２．０（Gibco BRL）を用いて、Frohmann et al.（1988）によるＰＣＲ支持
ＲＡＣＥ法を用いた。 まず、ｐＤＤｄ７ａを基にしたいくつかの遺伝子特異的５’−ＲＡＣＥプライ
マー（ＧＳＰ７−９），さらにネステッド増幅プライマー「バックレース」を構
築した。例５に記載した方法により、ＧＳＰ７を用いて、全ＲＮＡをｃＤＮＡに
転写した。その後、メーカーの使用説明書にしたがって高純度ＰＣＲ産物精製キ
ット（Boehringer Mannheim）を用いて、第１鎖産物を余分量のヌクレオチドお
よびＧＳＰ７から精製した。ターミナルトランスフェラーゼ（ＴｄＴ）を用いて
、精製ｃＤＮＡにオリゴ−ｄＣ尾部を付加した。テイリング試料を以下に示す：
６．５μｌの水、５．０μｌの５ｘテイリング緩衝液、２．５μｌの２ｍＭのｄ
ＣＴＰおよび１０μｌのｃＤＮＡ。このミックスを９４℃で３分間変性させ、次
に氷上に１分間載せた。１μｌのＴｄＴの添加により反応を開始させ、次に３７
℃で１０分間インキュベートした。６５℃で１０分間のインキュベーションによ
り、酵素を不活性化させた。ｄＣ尾部付きｃＤＮＡのＰＣＲ増幅を、以下のプロ
トコールにしたがって、０．５ｍｌの薄壁化ＰＣＲチューブ中で実施した：９４
℃で２分間の変性を１回、その後、９４℃で１分、５７℃で１分および７２℃で
２分からなるサイクルを３５回。７分間の最終伸長過程も実施した。ＰＣＲ試料
は以下の成分を含有した：３１．５μｌの水、５．０μｌの１０ｘＰＣＲ緩衝液
、３．０μｌの２５ｍＭのＭｇＣｌ２、１．０μｌの１０ｍＭのｄＮＴＰ、２．
０μｌの１０μｍのＧＳＰ８、２．０μｌの１０μＭのＡＡＰ、５．０μｌのｄ
Ｃ尾部付きｃＤＮＡおよび０．５μｌの５Ｕ／μｌのＴａｑＤＮＡポリメラーゼ
（Promega, Madison, USA）。１５μｌの５’−ＲＡＣＥ産物を、適切な長さの
マーカーを用いて、１．５％アガロースゲル上で分析した。１．５ｋｂの領域中
の特定の単一帯域をクローン化し、それぞれノーザンブロットおよび配列分析に
より立証した。 ５’−ＲＡＣＥを用いて、ｆｎｓ＋ ．遺伝子型を有するガーベラ系統の全Ｒ
ＮＡとのみハイブリダイズし、劣性遺伝子型からのＲＮＡとはハイブリダイズし
ない特定の１．５ｋｂ断片（ｐＴＡＢＡＴＡ）を増幅した。ヘム結合部位までの
遺伝子特異的プライマー（ＧＳＰ８）の領域内では、この新規の断片は断片ｐＤ
Ｄｄ７ａと相同である。全長クローン（１６９８ｂｐ）は読み取り枠を含有し、
アミノ酸レベルで、シトクロムＰ４５０クローンＣＹＰ９３Ｂ１と５８％の相同
を示した（Akashi et al., 1998）。
らいくつかの終止コドンを含む配列のポリ（Ａ＋）末端（３’末端）までの領域
のみに及ぶ。ｐＤＤｄ７ａの全長クローンを得るために、５’ＲＡＣＥ系バージ
ョン２．０（Gibco BRL）を用いて、Frohmann et al.（1988）によるＰＣＲ支持
ＲＡＣＥ法を用いた。 まず、ｐＤＤｄ７ａを基にしたいくつかの遺伝子特異的５’−ＲＡＣＥプライ
マー（ＧＳＰ７−９），さらにネステッド増幅プライマー「バックレース」を構
築した。例５に記載した方法により、ＧＳＰ７を用いて、全ＲＮＡをｃＤＮＡに
転写した。その後、メーカーの使用説明書にしたがって高純度ＰＣＲ産物精製キ
ット（Boehringer Mannheim）を用いて、第１鎖産物を余分量のヌクレオチドお
よびＧＳＰ７から精製した。ターミナルトランスフェラーゼ（ＴｄＴ）を用いて
、精製ｃＤＮＡにオリゴ−ｄＣ尾部を付加した。テイリング試料を以下に示す：
６．５μｌの水、５．０μｌの５ｘテイリング緩衝液、２．５μｌの２ｍＭのｄ
ＣＴＰおよび１０μｌのｃＤＮＡ。このミックスを９４℃で３分間変性させ、次
に氷上に１分間載せた。１μｌのＴｄＴの添加により反応を開始させ、次に３７
℃で１０分間インキュベートした。６５℃で１０分間のインキュベーションによ
り、酵素を不活性化させた。ｄＣ尾部付きｃＤＮＡのＰＣＲ増幅を、以下のプロ
トコールにしたがって、０．５ｍｌの薄壁化ＰＣＲチューブ中で実施した：９４
℃で２分間の変性を１回、その後、９４℃で１分、５７℃で１分および７２℃で
２分からなるサイクルを３５回。７分間の最終伸長過程も実施した。ＰＣＲ試料
は以下の成分を含有した：３１．５μｌの水、５．０μｌの１０ｘＰＣＲ緩衝液
、３．０μｌの２５ｍＭのＭｇＣｌ２、１．０μｌの１０ｍＭのｄＮＴＰ、２．
０μｌの１０μｍのＧＳＰ８、２．０μｌの１０μＭのＡＡＰ、５．０μｌのｄ
Ｃ尾部付きｃＤＮＡおよび０．５μｌの５Ｕ／μｌのＴａｑＤＮＡポリメラーゼ
（Promega, Madison, USA）。１５μｌの５’−ＲＡＣＥ産物を、適切な長さの
マーカーを用いて、１．５％アガロースゲル上で分析した。１．５ｋｂの領域中
の特定の単一帯域をクローン化し、それぞれノーザンブロットおよび配列分析に
より立証した。 ５’−ＲＡＣＥを用いて、ｆｎｓ＋ ．遺伝子型を有するガーベラ系統の全Ｒ
ＮＡとのみハイブリダイズし、劣性遺伝子型からのＲＮＡとはハイブリダイズし
ない特定の１．５ｋｂ断片（ｐＴＡＢＡＴＡ）を増幅した。ヘム結合部位までの
遺伝子特異的プライマー（ＧＳＰ８）の領域内では、この新規の断片は断片ｐＤ
Ｄｄ７ａと相同である。全長クローン（１６９８ｂｐ）は読み取り枠を含有し、
アミノ酸レベルで、シトクロムＰ４５０クローンＣＹＰ９３Ｂ１と５８％の相同
を示した（Akashi et al., 1998）。
【００８３】例８ 酵母中でのｐＣＹＰＦＮＳ１の発現 ｐＹｅＣＹＰＦＮＳ１の構築 ｐＣＹＰＦＮＳ１に対応する１．５ｋｂのＢａｍＨＩ−ＥｃｏＲＩ断片をＢａ
ｍＨＩ−ＥｃｏＲＩで開裂した酵母発現ベクターｐＹＥＳ２にライゲーションし
た。その結果生じたｐＹｅＣＹＰＦＮＳ１と呼ばれるプラスミドは、挿入物とし
てセンス配向でｐＣＹＰＦＮＳ１ ｃＤＮＡ断片を含有した。
ｍＨＩ−ＥｃｏＲＩで開裂した酵母発現ベクターｐＹＥＳ２にライゲーションし
た。その結果生じたｐＹｅＣＹＰＦＮＳ１と呼ばれるプラスミドは、挿入物とし
てセンス配向でｐＣＹＰＦＮＳ１ ｃＤＮＡ断片を含有した。
【００８４】 酵母形質転換 Gietz et al.（1992）によるプロトコールにしたがって、酵母菌株ＩＮＶＳｃ
１をプラスミドｐＹｅＣＹＰＦＮＳ１で形質転換した。形質転換した酵母細胞の
選択は、相補マーカーを介して実施した。
１をプラスミドｐＹｅＣＹＰＦＮＳ１で形質転換した。形質転換した酵母細胞の
選択は、相補マーカーを介して実施した。
【００８５】 フラボンシンターゼＩＩ検定用酵母ミクロソームの調製 選択培地ＳＧ１（１リットル当たり２０ｇのグルコース（ｗ／ｖ）、１ｇのペ
プトン（Fluka）、６．７ｇのアミノ酸を含有しない酵母窒素ベース（Difco）お
よび２０ｍｇのＬ−トリプトファン（Fluka））上で成長させたＩＮＶＳｃ１／
ｐＹｅＣＹＰＦＮＳ１およびＩＮＶＳｃ１の個々のクローンを、次に５ｘ５ｍｌ
のＳＧＩ培地中に接種し、２００ｒｐｍで３０℃で２４時間インキュベートした
。予備培養の１：１０稀釈液の０．２〜０．４のＯＤ６００で、それを２５０ｍ
ｌのＹＰＧＥ（１リットル当たり５ｇのグルコース、１０ｇのペプトン、１０ｇ
の酵母抽出物（Fluka）および３容量％のエタノール）中に完全に接種した。主
培養を、３０℃で１２０ｒｐｍでインキュベートした。０．８〜１．２のＯＤ６ ００ で、２７ｍｌの２００ｇ／ｌ滅菌ガラクトース溶液の添加により、誘導を実
行した。
プトン（Fluka）、６．７ｇのアミノ酸を含有しない酵母窒素ベース（Difco）お
よび２０ｍｇのＬ−トリプトファン（Fluka））上で成長させたＩＮＶＳｃ１／
ｐＹｅＣＹＰＦＮＳ１およびＩＮＶＳｃ１の個々のクローンを、次に５ｘ５ｍｌ
のＳＧＩ培地中に接種し、２００ｒｐｍで３０℃で２４時間インキュベートした
。予備培養の１：１０稀釈液の０．２〜０．４のＯＤ６００で、それを２５０ｍ
ｌのＹＰＧＥ（１リットル当たり５ｇのグルコース、１０ｇのペプトン、１０ｇ
の酵母抽出物（Fluka）および３容量％のエタノール）中に完全に接種した。主
培養を、３０℃で１２０ｒｐｍでインキュベートした。０．８〜１．２のＯＤ６ ００ で、２７ｍｌの２００ｇ／ｌ滅菌ガラクトース溶液の添加により、誘導を実
行した。
【００８６】 主培養の１：１０稀釈液の０．６〜１．２のＯＤ６００で１２〜１５時間後、
酵母細胞を遠心分離により収穫し、ＴＥＫ（５０ｍＭのトリス−ＨＣｌ、ｐＨ７
．４、１ｍＭのＥＤＴＡおよび０．１ＭのＫＣｌ）で１回洗浄し、ＴＥＳ−Ｂ＊ （５０ｍＭのトリス−ＨＣｌ、ｐＨ７．４、１ｍＭのＥＤＴＡ、０．６ｍＭのソ
ルビトールおよび２ｍＭのＤＴＴ）中に再懸濁した。試料当たり１５ｇのガラス
ビーズ（Sigma）を用いて、４℃で酵母細胞の粉砕を実施した。次にガラスビー
ズを５ｍｌのＴＥＳ−Ｂ＊で３回洗浄し、合わせた上清を４ＭのＮａＣｌで最終
濃度０．１５Ｍに調整した。２．５ｇのＰＥＧ−４０００（Fluka）の添加によ
りミクロソームを沈澱させ、２ｍｌのＴＥＳ−Ｂ＊による洗浄過程後、ポッター
中の２．５ｍｌのＴＥＳ−Ｂ＊（５０ｍＭのトリス−ＨＣｌ、ｐＨ７．４、１ｍ
ＭのＥＤＴＡ、２ｍＭのＤＴＴ）中で均質化した。その結果生じたホモジネート
は、ＦＮＳ ＩＩ検定用のミクロソーム酵素供給源として役立った。
酵母細胞を遠心分離により収穫し、ＴＥＫ（５０ｍＭのトリス−ＨＣｌ、ｐＨ７
．４、１ｍＭのＥＤＴＡおよび０．１ＭのＫＣｌ）で１回洗浄し、ＴＥＳ−Ｂ＊ （５０ｍＭのトリス−ＨＣｌ、ｐＨ７．４、１ｍＭのＥＤＴＡ、０．６ｍＭのソ
ルビトールおよび２ｍＭのＤＴＴ）中に再懸濁した。試料当たり１５ｇのガラス
ビーズ（Sigma）を用いて、４℃で酵母細胞の粉砕を実施した。次にガラスビー
ズを５ｍｌのＴＥＳ−Ｂ＊で３回洗浄し、合わせた上清を４ＭのＮａＣｌで最終
濃度０．１５Ｍに調整した。２．５ｇのＰＥＧ−４０００（Fluka）の添加によ
りミクロソームを沈澱させ、２ｍｌのＴＥＳ−Ｂ＊による洗浄過程後、ポッター
中の２．５ｍｌのＴＥＳ−Ｂ＊（５０ｍＭのトリス−ＨＣｌ、ｐＨ７．４、１ｍ
ＭのＥＤＴＡ、２ｍＭのＤＴＴ）中で均質化した。その結果生じたホモジネート
は、ＦＮＳ ＩＩ検定用のミクロソーム酵素供給源として役立った。
【００８７】 Martens and Forkmann（1998）の方法により、ＦＮＳ ＩＩ活性を測定した。
フラボンシンターゼＩＩに関する標準検定は、総容量２００μｌ：１４０μｌの
トリス−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ７．５）、０．３ｎｍｏｌの放射能標識基質（８３
Ｂｑ；［１４Ｃ］ナリンゲニン）、１０μｌの２０ｍｍｏｌ／ｌのＮＡＤＰＨお
よび５０μｌの酵母ミクロソーム調製物中で行われた。２５℃で２０分間のイン
キュベーション後、ナリンゲニンおよびアピゲニン（産物）を含有する２０μｌ
のメタノールの添加により反応を停止させた。それぞれ１００または５０μｌの
酢酸エチルを用いて、２回、反応混合物の抽出を実行した。溶離物１〜４中のセ
ルロース薄層板上で上部相をクロマトグラフィー処理した（前記参照）。Fuji B
AS 1000 Bio-Imaging分析機（Fuji）およびＴＩＮＡソフトウェアパッケージ（R
aytest）を用いて、放射能を局在化し、定量した。
フラボンシンターゼＩＩに関する標準検定は、総容量２００μｌ：１４０μｌの
トリス−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ７．５）、０．３ｎｍｏｌの放射能標識基質（８３
Ｂｑ；［１４Ｃ］ナリンゲニン）、１０μｌの２０ｍｍｏｌ／ｌのＮＡＤＰＨお
よび５０μｌの酵母ミクロソーム調製物中で行われた。２５℃で２０分間のイン
キュベーション後、ナリンゲニンおよびアピゲニン（産物）を含有する２０μｌ
のメタノールの添加により反応を停止させた。それぞれ１００または５０μｌの
酢酸エチルを用いて、２回、反応混合物の抽出を実行した。溶離物１〜４中のセ
ルロース薄層板上で上部相をクロマトグラフィー処理した（前記参照）。Fuji B
AS 1000 Bio-Imaging分析機（Fuji）およびＴＩＮＡソフトウェアパッケージ（R
aytest）を用いて、放射能を局在化し、定量した。
【００８８】 ＩＮＶＳｃ１／ｐＹｅＣＹＰＦＮＳ１から調製した酵素抽出物は、明らかなＦ
ＮＳ ＩＩ活性を示したが、一方、非形質転換酵母からの対応する分画は、活性
を示さなかった（図９）。酵母発現の結果は、ｃＤＮＡ挿入物ｐＣＹＰＦＮＳ１
がＦＮＳ ＩＩ酵素をコードすることを確証した。さらに、結果は、ガーベラｃ
ＤＮＡクローンによりコードされる酵素の発現は、フラボンの直接生成を達成す
るために酵母においては十分であることを明示した。これは、Ｃ２およびＣ３間
の二重結合を導入するためには単一酵素が必要なだけであり（図１Ｂ）、そして
Akashi等（1998）により記載されたｃＤＮＡクローンはＦＮＳ ＩＩを表さず、
むしろフラボン２−ヒドロキシラーゼを表すということを示す。
ＮＳ ＩＩ活性を示したが、一方、非形質転換酵母からの対応する分画は、活性
を示さなかった（図９）。酵母発現の結果は、ｃＤＮＡ挿入物ｐＣＹＰＦＮＳ１
がＦＮＳ ＩＩ酵素をコードすることを確証した。さらに、結果は、ガーベラｃ
ＤＮＡクローンによりコードされる酵素の発現は、フラボンの直接生成を達成す
るために酵母においては十分であることを明示した。これは、Ｃ２およびＣ３間
の二重結合を導入するためには単一酵素が必要なだけであり（図１Ｂ）、そして
Akashi等（1998）により記載されたｃＤＮＡクローンはＦＮＳ ＩＩを表さず、
むしろフラボン２−ヒドロキシラーゼを表すということを示す。
【外２】
【外３】
【外４】
【配列表】
【図１Ａ】 一般的フラボノイド生合成経路およびいくつかのフラボノイドの化学構造の模
式図である。 関与する酵素は、図１Ａでは、以下のように略記する：ＣＨＳ＝カルコンシン
ターゼ；ＣＨＩ＝カルコンイソメラーゼ；ＦＨＴ＝フラバノン−３−ヒドロキシ
ラーゼ；ＤＦＲ＝ジヒドロフラボノール４−レダクターゼ；ＡＮＳ＝アントシア
ニジンシンターゼ；ＦＧＴ＝フラボノイド３−グリコシルトランスフェラーゼ；
ＦＮＳ ＩＩ＝フラボンシンターゼＩＩ；ＦＬＳ＝フラボノールシンターゼ；Ｆ
３’Ｈ＝フラボノイド３’−ヒドロキシラーゼ；Ｆ３’，５’−Ｈ＝フラボノイ
ド３’，５’−ヒドロキシラーゼ。図１Ａで、フラボン生成レベルを特に示す（
＋＋＋＋）。
式図である。 関与する酵素は、図１Ａでは、以下のように略記する：ＣＨＳ＝カルコンシン
ターゼ；ＣＨＩ＝カルコンイソメラーゼ；ＦＨＴ＝フラバノン−３−ヒドロキシ
ラーゼ；ＤＦＲ＝ジヒドロフラボノール４−レダクターゼ；ＡＮＳ＝アントシア
ニジンシンターゼ；ＦＧＴ＝フラボノイド３−グリコシルトランスフェラーゼ；
ＦＮＳ ＩＩ＝フラボンシンターゼＩＩ；ＦＬＳ＝フラボノールシンターゼ；Ｆ
３’Ｈ＝フラボノイド３’−ヒドロキシラーゼ；Ｆ３’，５’−Ｈ＝フラボノイ
ド３’，５’−ヒドロキシラーゼ。図１Ａで、フラボン生成レベルを特に示す（
＋＋＋＋）。
【図１Ｂ】 一般的フラボノイド生合成経路およびいくつかのフラボノイドの化学構造の模
式図である。 関与する酵素は、図１Ｂでは、以下のように略記する：ＣＨＳ＝カルコンシン
ターゼ；ＣＨＩ＝カルコンイソメラーゼ；ＦＨＴ＝フラバノン−３−ヒドロキシ
ラーゼ；ＤＦＲ＝ジヒドロフラボノール４−レダクターゼ；ＡＮＳ＝アントシア
ニジンシンターゼ；ＦＧＴ＝フラボノイド３−グリコシルトランスフェラーゼ；
ＦＮＳ ＩＩ＝フラボンシンターゼＩＩ；ＦＬＳ＝フラボノールシンターゼ；Ｆ
３’Ｈ＝フラボノイド３’−ヒドロキシラーゼ；Ｆ３’，５’−Ｈ＝フラボノイ
ド３’，５’−ヒドロキシラーゼ。図１Ａで、フラボン生成レベルを特に示す（
＋＋＋＋）。図１Ｂの上部には、ＮＡＤＰＨおよびいくつかの一般的フラボンの
存在下でのＦＮＳ ＩＩ反応を示す。下部には、その他の重要なフラボノイドを
示す。
式図である。 関与する酵素は、図１Ｂでは、以下のように略記する：ＣＨＳ＝カルコンシン
ターゼ；ＣＨＩ＝カルコンイソメラーゼ；ＦＨＴ＝フラバノン−３−ヒドロキシ
ラーゼ；ＤＦＲ＝ジヒドロフラボノール４−レダクターゼ；ＡＮＳ＝アントシア
ニジンシンターゼ；ＦＧＴ＝フラボノイド３−グリコシルトランスフェラーゼ；
ＦＮＳ ＩＩ＝フラボンシンターゼＩＩ；ＦＬＳ＝フラボノールシンターゼ；Ｆ
３’Ｈ＝フラボノイド３’−ヒドロキシラーゼ；Ｆ３’，５’−Ｈ＝フラボノイ
ド３’，５’−ヒドロキシラーゼ。図１Ａで、フラボン生成レベルを特に示す（
＋＋＋＋）。図１Ｂの上部には、ＮＡＤＰＨおよびいくつかの一般的フラボンの
存在下でのＦＮＳ ＩＩ反応を示す。下部には、その他の重要なフラボノイドを
示す。
【図１Ｃ】 一般的フラボノイド生合成経路およびいくつかのフラボノイドの化学構造の模
式図である。 図１Ｃは、ガーベラ(Gerbera hybrids)において存在するようなフラボノイド生
合成経路を記載する。異なるフラボノイドに関しては、以下の略号を用いた：Ｔ
ＨＣ＝テトラヒドロキシカルコン；ＰＨＣ＝ペンタヒドロキシカルコン；ＮＡＲ
＝ナリンゲニン；ＥＲＩ＝エリオジクチオール；Ａｐ＝アピゲニン；Ｌｕ＝ルテ
オリン；ＤＨＫ＝ジヒドロケンペロール；ＤＨＱ＝ジヒドロケルセチン；Ｋｍ＝
ケンペロール；Ｑｕ＝ケルセチン；ＬＰｇ＝ロイコペラルゴニジン；ＬＣｙ＝ル
コシアニジン；Ｐｇ＝ペラルゴニジン；Ｃｙ＝シアニジン。
式図である。 図１Ｃは、ガーベラ(Gerbera hybrids)において存在するようなフラボノイド生
合成経路を記載する。異なるフラボノイドに関しては、以下の略号を用いた：Ｔ
ＨＣ＝テトラヒドロキシカルコン；ＰＨＣ＝ペンタヒドロキシカルコン；ＮＡＲ
＝ナリンゲニン；ＥＲＩ＝エリオジクチオール；Ａｐ＝アピゲニン；Ｌｕ＝ルテ
オリン；ＤＨＫ＝ジヒドロケンペロール；ＤＨＱ＝ジヒドロケルセチン；Ｋｍ＝
ケンペロール；Ｑｕ＝ケルセチン；ＬＰｇ＝ロイコペラルゴニジン；ＬＣｙ＝ル
コシアニジン；Ｐｇ＝ペラルゴニジン；Ｃｙ＝シアニジン。
【図２】 異なるガーベラ系統：「Ｔｈ５８」（遺伝子型ｆｎｓ＋ｆｎｓ）、「１４７−
１５０」（ｆｎｓ＋ ．）および「１４７−１４６」（遺伝子型ｆｎｓｆｎｓ）
の花弁からの酵素抽出物中のＦＮＳ ＩＩの活性または活性の欠如をそれぞれ示
す図である。「１４７−１５０」系統および「１４７−１４６」系統は、「Ｔｈ
５８」の自己生殖子孫である。１４Ｃ標識ナリンゲニンの対応するフラボンアピ
ゲニンへの代謝回転により、ＦＮＳ ＩＩ活性を測定した。
１５０」（ｆｎｓ＋ ．）および「１４７−１４６」（遺伝子型ｆｎｓｆｎｓ）
の花弁からの酵素抽出物中のＦＮＳ ＩＩの活性または活性の欠如をそれぞれ示
す図である。「１４７−１５０」系統および「１４７−１４６」系統は、「Ｔｈ
５８」の自己生殖子孫である。１４Ｃ標識ナリンゲニンの対応するフラボンアピ
ゲニンへの代謝回転により、ＦＮＳ ＩＩ活性を測定した。
【図３】 花の異なる発育段階全体の「Ｔｈ５８」（ｆｎｓ＋ｆｎｓ）系統におけるＦＮ
Ｓ ＩＩ活性（■）およびフラボンの蓄積（□）を示す図である。例２で、異な
る花段階を定義する。MartensとForkmann（1998）に記載されたように、酢酸エ
チルによる抽出およびＨＰＬＣ検出によって、フラボン含量を確定した。
Ｓ ＩＩ活性（■）およびフラボンの蓄積（□）を示す図である。例２で、異な
る花段階を定義する。MartensとForkmann（1998）に記載されたように、酢酸エ
チルによる抽出およびＨＰＬＣ検出によって、フラボン含量を確定した。
【図４Ａ】 高配列保存の領域を含有するシトクロムＰ４５０配列の既知の構造を示す（Sc
hopfer and Ebel, 1998による）図である。冨プロリン、酸素結合およびヘム結
合領域を示す。推定ヌクレオチド配列により、８つの非縮重５‘プライマー一組
を調製した。
hopfer and Ebel, 1998による）図である。冨プロリン、酸素結合およびヘム結
合領域を示す。推定ヌクレオチド配列により、８つの非縮重５‘プライマー一組
を調製した。
【図４Ｂ】 高配列保存の領域を含有するシトクロムＰ４５０配列の既知の構造を示す（Sc
hopfer and Ebel, 1998による）。冨プロリン、酸素結合およびヘム結合領域を
示す図である。図４Ｂでは、ＤＤ−ＲＴ ＰＣＲのためのそれから得られるプラ
イマーの他に、ヘム結合領域を詳細に示す。推定ヌクレオチド配列により、８つ
の非縮重５’プライマー一組を調製した。
hopfer and Ebel, 1998による）。冨プロリン、酸素結合およびヘム結合領域を
示す図である。図４Ｂでは、ＤＤ−ＲＴ ＰＣＲのためのそれから得られるプラ
イマーの他に、ヘム結合領域を詳細に示す。推定ヌクレオチド配列により、８つ
の非縮重５’プライマー一組を調製した。
【図５】 生成した異なるシトクロムＰ４５０ ＤＮＡ断片の模式図である。クローンは
すべて、示したヘム結合部位を含有する。ｐＤＤｄ７ａ：示差的発現帯域から回
収したＤＮＡ鋳型によるオリゴヌクレオチド「デカマーｄ７」および「オリゴＡ
」を用いたＰＣＲにより、３５８ｂｐ断片を生成し得た。 ｐＴＡＢＡＴＡ：ガーベラ「Ｔｈ５８」ｃＤＮＡから出発して、ＰＣＲ支持Ｒ
ＡＣＥ法を介して、それぞれオリゴヌクレオチド「ＧＳＰ７」、「ＧＳＰ８」、
「ＧＳＰ９」および「ＡＡＰ」（GIBCO-BRL）を用いて、あるいは「バックレー
ス」により、１５１９ｂｐ断片を単離した。 ｐＣＹＰＦＮＳ１：オリゴヌクレオチド「ＣｙｐＦＮＳ１Ｈ」および「Ｃｙｐ
ＦＮＳ１Ｒ」を用いて、ＰＣＲにより、読み取り枠を含有する１５８９ｂｐ断片
を単離した。ガーベラ「Ｔｈ５８」のｃＤＮＡを鋳型として用いた。
すべて、示したヘム結合部位を含有する。ｐＤＤｄ７ａ：示差的発現帯域から回
収したＤＮＡ鋳型によるオリゴヌクレオチド「デカマーｄ７」および「オリゴＡ
」を用いたＰＣＲにより、３５８ｂｐ断片を生成し得た。 ｐＴＡＢＡＴＡ：ガーベラ「Ｔｈ５８」ｃＤＮＡから出発して、ＰＣＲ支持Ｒ
ＡＣＥ法を介して、それぞれオリゴヌクレオチド「ＧＳＰ７」、「ＧＳＰ８」、
「ＧＳＰ９」および「ＡＡＰ」（GIBCO-BRL）を用いて、あるいは「バックレー
ス」により、１５１９ｂｐ断片を単離した。 ｐＣＹＰＦＮＳ１：オリゴヌクレオチド「ＣｙｐＦＮＳ１Ｈ」および「Ｃｙｐ
ＦＮＳ１Ｒ」を用いて、ＰＣＲにより、読み取り枠を含有する１５８９ｂｐ断片
を単離した。ガーベラ「Ｔｈ５８」のｃＤＮＡを鋳型として用いた。
【図６】 全長クローンの核酸配列およびそれから得られるアミノ酸配列をそれぞれ示す
図である。開始コドンおよび異なる終止コドンを別々に示す。
図である。開始コドンおよび異なる終止コドンを別々に示す。
【図７】 全長クローンの核酸配列およびそれから得られるアミノ酸配列をそれぞれ示す
図である。開始コドンおよび異なる終止コドンを別々に示す。
図である。開始コドンおよび異なる終止コドンを別々に示す。
【図８】 標準制限酵素に関して示した制限部位の図である。
【図９】 酵母ミクロソームを用いたＦＮＳ ＩＩ検定を示す図である。［１４Ｃ］ナリ
ンゲニンを基質として用いた図である。形質転換化酵母（ＩＮＶＳｃ１−Ｃｙｐ
ＦＮＳ１）および非形質転換化酵母（ＩＮＶＳｃ１）から、ミクロソームを調製
した。オートラジオグラフは、形質転換化酵母（ＩＮＶＳｃ１−ＣｙｐＦＮＳ１
）の抽出物を用いた、対応するフラボン［１４Ｃ］アピゲニンへの［１４Ｃ］ナ
リンゲニンの転換を示す。対照実験（ＩＮＶＳｃ１）では、活性は測定されなか
った。４つの異なる溶離物中の真のアピゲニンを用いた同時クロマトグラフィー
により、生成物を同定した。
ンゲニンを基質として用いた図である。形質転換化酵母（ＩＮＶＳｃ１−Ｃｙｐ
ＦＮＳ１）および非形質転換化酵母（ＩＮＶＳｃ１）から、ミクロソームを調製
した。オートラジオグラフは、形質転換化酵母（ＩＮＶＳｃ１−ＣｙｐＦＮＳ１
）の抽出物を用いた、対応するフラボン［１４Ｃ］アピゲニンへの［１４Ｃ］ナ
リンゲニンの転換を示す。対照実験（ＩＮＶＳｃ１）では、活性は測定されなか
った。４つの異なる溶離物中の真のアピゲニンを用いた同時クロマトグラフィー
により、生成物を同定した。
【図１０】 挿入ＣｙｐＦＮＳ１の３２Ｐ標識ｃＤＮＡとハイブリダイズしたＲＮＡゲルブ
ロットのオートラジオグラフィーを示す図である。各レーンは、以下のように適
用した２０μｇの総ＲＮＡを含有する：（１）Ｓｉｍｍ（遺伝子型ｆｎｓ＋ ．
）、（２）Ｄｅｌｐｈｉ（ｆｎｓ＋ ．）、（３）Ｔ３（ｆｎｓ ｆｎｓ）、（
４）１４７−１５０（ｆｎｓ＋ ．）、（５）ｃｌｉｖｉａ（ｆｎｓ ｆｎｓ）
、（６）１４７−１４６（ｆｎｓ ｆｎｓ）、（７）Ｒｅｇｉｎａ（ｆｎｓ＋
．）、（８）ガーベラの葉（ｆｎｓ ｆｎｓ）、（９）１０（ｆｎｓ＋ ．）の
プール、（１０）１０（ｆｎｓ ｆｎｓ）のプール。
ロットのオートラジオグラフィーを示す図である。各レーンは、以下のように適
用した２０μｇの総ＲＮＡを含有する：（１）Ｓｉｍｍ（遺伝子型ｆｎｓ＋ ．
）、（２）Ｄｅｌｐｈｉ（ｆｎｓ＋ ．）、（３）Ｔ３（ｆｎｓ ｆｎｓ）、（
４）１４７−１５０（ｆｎｓ＋ ．）、（５）ｃｌｉｖｉａ（ｆｎｓ ｆｎｓ）
、（６）１４７−１４６（ｆｎｓ ｆｎｓ）、（７）Ｒｅｇｉｎａ（ｆｎｓ＋
．）、（８）ガーベラの葉（ｆｎｓ ｆｎｓ）、（９）１０（ｆｎｓ＋ ．）の
プール、（１０）１０（ｆｎｓ ｆｎｓ）のプール。
【手続補正書】特許協力条約第３４条補正の翻訳文提出書
【提出日】平成１３年７月２日（２００１．７．２）
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】特許請求の範囲
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｎ 9/02 5/10 15/00 ＺＮＡＡ 9/02 5/00 Ｂ Ｃ (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ， ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，Ｋ Ｅ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＴＺ，ＵＧ，ＺＷ )，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ， ＴＪ，ＴＭ)，ＡＥ，ＡＧ，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ， ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，Ｃ Ｎ，ＣＲ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＫ，ＤＭ，ＤＺ，ＥＥ，ＥＳ ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＤ，ＧＥ，ＧＨ，ＧＭ，ＨＲ，ＨＵ， ＩＤ，ＩＬ，ＩＮ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，Ｋ Ｒ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ ，ＭＡ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ， ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，Ｓ Ｉ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＴＺ，ＵＡ ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＡ，ＺＷ Ｆターム(参考） 2B030 AA02 AB03 CA01 CA06 CA17 CA19 CB03 CD03 CD07 CD09 CD10 4B024 AA01 AA08 BA79 BA80 CA01 DA01 DA02 DA12 GA11 HA20 4B050 CC03 DD09 DD13 EE10 LL01 LL10 4B065 AA01X AA72X AA88X AA88Y AA90X AB01 AC14 BA02 CA08 CA28 CA44 CA53 4C086 AA01 AA02 AA04 BA08 MA01 MA04 ZB26
Claims (25)
- 【請求項１】 フラボンシンターゼＩＩ（ＦＮＳ ＩＩ）をコードする核酸
配列であって、以下の： （ａ）配列番号１の核酸配列またはその部分配列、 （ｂ）（ａ）の核酸配列とハイブリダイズし、かつ／またはこの配列と少なく
とも４０％の相同性を有し、かつフラボンシンターゼＩＩの生物学的活性を有す
るタンパク質またはポリペプチドをコードする核酸配列、 （ｃ）（ａ）または（ｂ）に記載の核酸配列に関して縮重される核酸配列 からなる群から選択される、前記核酸配列。 - 【請求項２】 請求項１に記載の核酸配列と相補的である核酸配列。
- 【請求項３】 核酸配列がＤＮＡまたはＲＮＡである、請求項１または２に
記載の核酸配列。 - 【請求項４】 核酸配列が、ガーベラ（Gerbera hybrids）、エゾギク（Cal
listephus chinensis）、キンギョソウ（Antirrhinium majus）、シマカンギク
（Chrysanthemum indicum）、ダリア（Dahlia hybrids）、グロキシニア（Sinni
ngia hybrids）、クマツヅラ（Verbena hybrids）およびウシノシタ（S. hybrid
s）からなる植物群の植物から得られる請求項１に記載の核酸配列。 - 【請求項５】 請求項１〜４のいずれかに記載の核酸配列を含有する、組換
えＤＮＡ分子。 - 【請求項６】 組換えＤＮＡ分子が、ベクターまたはプロモーターを含有す
るベクターである、請求項５に記載の組換えＤＮＡ分子。 - 【請求項７】 請求項６に記載のＤＮＡ分子を含有する宿主細胞。
- 【請求項８】 細菌細胞、酵母細胞、昆虫細胞、植物細胞または哺乳類細胞
である、請求項７に記載の宿主細胞。 - 【請求項９】 請求項１〜４のいずれかに記載の核酸配列によりコードされ
るポリペプチド。 - 【請求項１０】 配列番号２の部分配列もしくは全長アミノ酸配列を含有す
るポリペプチドまたはその誘導体。 - 【請求項１１】 ポリペプチドがフラボンシンターゼＩＩ活性を有する、請
求項１０に記載のポリペプチド。 - 【請求項１２】 ポリペプチドが、ガーベラ（Gerbera hybrids）、エゾギ
ク（Callistephus chinensis）、キンギョソウ（Antirrhinium majus）、シマカ
ンギク（Chrysanthemum indicum）、ダリア（Dahlia hybrids）、グロキシニア
（Sinningia hybrids）、クマツヅラ（Verbena hybrids）およびウシノシタ（S.
hybrids）からなる植物群の植物から得られる、請求項１１に記載のポリペプチ
ド。 - 【請求項１３】 請求項１〜４のいずれかに記載の核酸配列を含有するトラ
ンスジェニック植物。 - 【請求項１４】 核酸配列が発現に適しており、発現が任意に調節され得る
かまたは発育的に調節される、請求項１３に記載のトランスジェニック植物。 - 【請求項１５】 ガーベラ（Gerbera hybrids）、エゾギク（Callistephus
chinensis）、キンギョソウ（Antirrhinium majus）、シマカンギク（Chrysanth
emum indicum）、ダリア（Dahlia hybrids）、グロキシニア（Sinningia hybrid
s）、クマツヅラ（Verbena hybrids）およびウシノシタ（S. hybrids）からなる
植物群から選択される、請求項１３または１４のいずれかに記載のトランスジェ
ニック植物。 - 【請求項１６】 花の色の変化を有するトランスジェニック植物の調製方法
であって、請求項１〜４のいずれかに記載の核酸配列を適切な植物の細胞に導入
すること、細胞からトランスジェニック植物を再生すること、およびこのトラン
スジェニック植物を適切な期間中、導入した核酸配列の発現に適した条件下で栽
培することを包含する、前記方法。 - 【請求項１７】 導入した核酸配列が植物体内で発現される請求項１６に記
載の方法。 - 【請求項１８】 トランスジェニック植物がトウダイグサ（E. pulcherrima
）、シクラメン（Cyclamen persicum）、バラ（Rosa hybrida）、テンジクアオ
イ（P. spec.）、ベゴニア（B. spec.）、カーネーション（D. caryophyllus）
およびチューリップ（Tulipa hybrids）からなる植物群から選択される、請求項
１６または１７に記載の方法。 - 【請求項１９】 植物が、導入した核酸配列の発現中に同時発現される内在
性フラボンシンターゼＩＩ（ＦＮＳ ＩＩ）を発現し得る、請求項１６または１
７に記載の方法。 - 【請求項２０】 トランスジェニック植物が、ガーベラ（Gerbera hybrids
）、エゾギク（Callistephus chinensis）、キンギョソウ（Antirrhinium majus
）、シマカンギク（Chrysanthemum indicum）、ダリア（Dahlia hybrids）、グ
ロキシニア（Sinningia hybrids）、クマツヅラ（Verbena hybrids）およびウシ
ノシタ（S. hybrids）からなる植物群から選択される、請求項１９に記載の方法
。 - 【請求項２１】 内在性フラボンシンターゼＩＩ（ＦＮＳ ＩＩ）活性が核
酸配列の導入により低減される、請求項１９または２０に記載の方法。 - 【請求項２２】 フラボン合成のための請求項９〜１２のいずれかに記載の
ポリペプチドの使用。 - 【請求項２３】 フラボンが薬剤として用いられる、請求項２２に記載の使
用。 - 【請求項２４】 フラボンが癌療法に用いられる、請求項２３に記載の使用
。 - 【請求項２５】 フラボンが生物活性物質として用いられる、請求項２２に
記載の使用。
Applications Claiming Priority (3)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| DE19918365A DE19918365A1 (de) | 1999-04-22 | 1999-04-22 | Genetische Sequenz, die für Flavonsynthase II Enzyme kodiert, und deren Verwendung |
| DE19918365.1 | 1999-04-22 | ||
| PCT/DE2000/001214 WO2000065073A2 (de) | 1999-04-22 | 2000-04-14 | Genetische sequenz, die für flavonsynthase ii enzyme kodiert, und deren verwendung |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JP2002542789A true JP2002542789A (ja) | 2002-12-17 |
Family
ID=7905553
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP2000614407A Pending JP2002542789A (ja) | 1999-04-22 | 2000-04-14 | フラボンシンターゼｉｉ酵素をコードする遺伝子配列およびその使用 |
Country Status (6)
| Country | Link |
|---|---|
| EP (1) | EP1190077A2 (ja) |
| JP (1) | JP2002542789A (ja) |
| AU (1) | AU5207200A (ja) |
| CA (1) | CA2370387A1 (ja) |
| DE (1) | DE19918365A1 (ja) |
| WO (1) | WO2000065073A2 (ja) |
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|---|---|---|---|---|
| JP2012511916A (ja) * | 2008-12-19 | 2012-05-31 | インターナショナル フラワー ディベロプメンツ プロプライアタリー リミティド | 変更された花部を有する植物 |
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| WO2002086110A2 (de) * | 2001-04-20 | 2002-10-31 | Technische Universität München | Flavonsynthase i enzyme und deren verwendung |
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| CN100422336C (zh) * | 2005-06-28 | 2008-10-01 | 北京林业大学 | 根癌农杆菌介导的地被菊花的转基因方法 |
| WO2013125530A1 (ja) * | 2012-02-24 | 2013-08-29 | サントリーホールディングス株式会社 | 花弁で機能するトレニア由来のプロモーター |
| CN114107071A (zh) * | 2021-12-14 | 2022-03-01 | 山西省农业科学院园艺研究所 | 一种仙客来枯萎病病原菌的分离、纯化方法 |
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| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
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| JPS62215581A (ja) * | 1986-03-18 | 1987-09-22 | Koichi Shiyudo | フラボンカルボン酸誘導体 |
| US5126129A (en) * | 1988-05-23 | 1992-06-30 | The Government Of The United States Of America As Represented By The Secretary Of The Department Of Health & Human Services | Cancer therapy using interleukin-2 and flavone compounds |
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