KR20010042261A

KR20010042261A - 플라본 신타제를 암호화하는 유전자

Info

Publication number: KR20010042261A
Application number: KR1020007010797A
Authority: KR
Inventors: 마사코 미즈타니; 요시카즈 다나카; 다카아키 구스미; 신-이치 아야베; 도모요시 아카시
Original assignee: 도리이 신이치로; 산토리 가부시키가이샤
Priority date: 1999-01-29
Filing date: 2000-01-28
Publication date: 2001-05-25
Also published as: WO2000044907A1; ES2322770T3; EP1067189A1; EP1726653A2; CN1355848A; US7465569B2; CN1644696A; KR100753351B1; DE60042178D1; US20040003431A1; EP1728867A2; EP1728867A3; HK1047765A1; CA2324505A1; DE60036159T2; EP1728867B1; ES2311254T3; EP1067189B1; EP1726653B1; EP1067189A4

Abstract

본 발명은 예를 들면, 금어초속(antirrhinum) 및 토레니아로부터 수득되는, 플라바논을 직접적으로 플라본으로 전환시킬 수 있는 효소를 암호화하는 DNA에 관한 것이다. 이러한 DNA 및 이에 의해 암호화된 효소의 아미노산 서열은, 예를 들어 서열 1, 2, 3 및 4로 제시하였다. 상기 유전자를 식물 내로 도입하면, 예를 들어, 이러한 식물의 꽃의 색상을 변화시킬 수 있다.

Description

플라본 신타제를 암호화하는 유전자{Gene encoding flavone synthase}

〈110〉 SUNTORY LIMITED

〈120〉 Gene encoding flavone synthase

〈130〉 5-1998-096135-9

〈150〉 JP 99-022427

〈151〉 1999-01-29

〈150〉 JP 99-205229

〈151〉 1999-07-19

〈160〉 8

〈170〉 KOPATIN 1.5

〈210〉 1

〈211〉 1724

〈212〉 DNA

〈213〉 Antirrhinum majus

〈220〉

〈223〉 Nucleotide sequence encoding a protein having an activity to dire

ctly convert flavanone to flavone

〈400〉 1

gctttacaca cacacacaca cacacacaca caaacaaaa atg tct aca ctt gtc 54

Met Ser Thr Leu Val

1 5

tac agc aca ctc ttc atc ctc tca acc ctc ctc ctc acc ctc cta acc 102

Tyr Ser Thr Leu Phe Ile Leu Ser Thr Leu Leu Leu Thr Leu Leu Thr

10 15 20

cgc acc cgc cgc aag acc cgc ccg ccc ggc cca tta gcc ctc ccc tta 150

Arg Thr Arg Arg Lys Thr Arg Pro Pro Gly Pro Leu Ala Leu Pro Leu

25 30 35

ata ggc cac tta cac ctc ctc ggc cca aag ctc cac cac acc ttc cac 198

Ile Gly His Leu His Leu Leu Gly Pro Lys Leu His His Thr Phe His

40 45 50

caa ttc tcc caa cgc tac ggc ccg ctc atc cag ctc tac ctc ggc tcc 246

Gln Phe Ser Gln Arg Tyr Gly Pro Leu Ile Gln Leu Tyr Leu Gly Ser

55 60 65

gtc cca tgc gtc gtc gct tcc acg ccc gaa ctc gcc cgc gaa ttc ctc 294

Val Pro Cys Val Val Ala Ser Thr Pro Glu Leu Ala Arg Glu Phe Leu

70 75 80 85

aag acg cac gaa ctc gac ttc tcg tcc cgc aag cac tcc acc gcc atc 342

Lys Thr His Glu Leu Asp Phe Ser Ser Arg Lys His Ser Thr Ala Ile

90 95 100

gac atc gtc acg tac gac tcc tcg ttc gcc ttc gcg ccg tac ggg ccg 390

Asp Ile Val Thr Tyr Asp Ser Ser Phe Ala Phe Ala Pro Tyr Gly Pro

105 110 115

tac tgg aaa ttc atc aag aaa tta tgt act tac gag cta ctg ggt gcc 438

Tyr Trp Lys Phe Ile Lys Lys Leu Cys Thr Tyr Glu Leu Leu Gly Ala

120 125 130

cgg aac ttg agc cat ttc cag ccc att aga gct ttg gag gtc aac agt 486

Arg Asn Leu Ser His Phe Gln Pro Ile Arg Ala Leu Glu Val Asn Ser

135 140 145

ttc ttg aga att ttg tac gag aaa aca gag cag aaa cag agt gtt aat 534

Phe Leu Arg Ile Leu Tyr Glu Lys Thr Glu Gln Lys Gln Ser Val Asn

150 155 160 165

gtg act gag gag ctt gtg aag ctg acg agt aat gtg atc agt aac atg 582

Val Thr Glu Glu Leu Val Lys Leu Thr Ser Asn Val Ile Ser Asn Met

170 175 180

atg ttg ggg atc agg tgt tcg ggg acg gaa ggg gag gcg gag gtg gcg 630

Met Leu Gly Ile Arg Cys Ser Gly Thr Glu Gly Glu Ala Glu Val Ala

185 190 195

agg acg gtg ata agg gag gtg acg cag ata ttt ggg gag ttt gat gtg 678

Arg Thr Val Ile Arg Glu Val Thr Gln Ile Phe Gly Glu Phe Asp Val

200 205 210

tcg gag att gtt tgg ttt tgt aag aat ttg gat ctg cag ggg att agg 726

Ser Glu Ile Val Trp Phe Cys Lys Asn Leu Asp Leu Gln Gly Ile Arg

215 220 225

aag agg tcg gag gat att agg agg agg tat gat gct ttg ttg gag aag 774

Lys Arg Ser Glu Asp Ile Arg Arg Arg Tyr Asp Ala Leu Leu Glu Lys

230 235 240 245

att att agt gat agg gag agg ttg agg ttg agg ggg ggt ggt ggt gga 822

Ile Ile Ser Asp Arg Glu Arg Leu Arg Leu Arg Gly Gly Gly Gly Gly

250 255 260

ggg ggt gga gag gtg aag gat ttt ttg gat atg ttg ttg gat gtg atg 870

Gly Gly Gly Glu Val Lys Asp Phe Leu Asp Met Leu Leu Asp Val Met

265 270 275

gag agt gag aaa tcg gag gtg gag ttt acg agg gag cat ctc aaa gct 918

Glu Ser Glu Lys Ser Glu Val Glu Phe Thr Arg Glu His Leu Lys Ala

280 285 290

ttg att ctg gat ttc ttc act gcc ggt aca gac aca aca gca atc aca 966

Leu Ile Leu Asp Phe Phe Thr Ala Gly Thr Asp Thr Thr Ala Ile Thr

295 300 305

aca gaa tgg gca ata gca gaa ctc att agc aat cca aat gta ctc aaa 1014

Thr Glu Trp Ala Ile Ala Glu Leu Ile Ser Asn Pro Asn Val Leu Lys

310 315 320 325

aaa gct caa gaa gag atg gac aaa gtc ata gga tca caa agg ttg ttg 1062

Lys Ala Gln Glu Glu Met Asp Lys Val Ile Gly Ser Gln Arg Leu Leu

330 335 340

caa gaa tcc gac gcc cct aac ttg cct tac ctc aac gcg atc ata aaa 1110

Gln Glu Ser Asp Ala Pro Asn Leu Pro Tyr Leu Asn Ala Ile Ile Lys

345 350 355

gaa acg ttc cgt ctc cac cct cca atc ccc atg ctc act aga aaa tca 1158

Glu Thr Phe Arg Leu His Pro Pro Ile Pro Met Leu Thr Arg Lys Ser

360 365 370

att tct gac gtt gtg gtc aac ggg tac acg atc cct gcc aaa acg cta 1206

Ile Ser Asp Val Val Val Asn Gly Tyr Thr Ile Pro Ala Lys Thr Leu

375 380 385

ttg ttt gtc aac ctt tgg tcc atg gga agg aat cct aac tac tgg gaa 1254

Leu Phe Val Asn Leu Trp Ser Met Gly Arg Asn Pro Asn Tyr Trp Glu

390 395 400 405

aat ccg atg gag ttc cga ccc gag agg ttt ctc gag aaa ggg acc ggg 1302

Asn Pro Met Glu Phe Arg Pro Glu Arg Phe Leu Glu Lys Gly Thr Gly

410 415 420

tcg ata gac gtt aaa ggg cag cat ttc gag ttg ctg ccg ttt ggc acg 1350

Ser Ile Asp Val Lys Gly Gln His Phe Glu Leu Leu Pro Phe Gly Thr

425 430 435

ggc agg cgg ggc tgc ccg ggg atg ttg tta ggc atg cag gag ttg ttt 1398

Gly Arg Arg Gly Cys Pro Gly Met Leu Leu Gly Met Gln Glu Leu Phe

440 445 450

agt att atc ggg gct atg gtg cag tgc ttc gat tgg aaa ctg ccc gat 1446

Ser Ile Ile Gly Ala Met Val Gln Cys Phe Asp Trp Lys Leu Pro Asp

455 460 465

ggt gtg aag tcg gtc gac atg acc gag cgg ccc ggg ttg acg gct cca 1494

Gly Val Lys Ser Val Asp Met Thr Glu Arg Pro Gly Leu Thr Ala Pro

470 475 480 485

cgt gcc aat gat ttg gtg tgc caa ttg gtg cca cgg att gac ccg gtc 1542

Arg Ala Asn Asp Leu Val Cys Gln Leu Val Pro Arg Ile Asp Pro Val

490 495 500

gtt gtc tcc gga ccg tga accttaaggt agtatcgata atctgtttaa 1590

Val Val Ser Gly Pro

505

ttaaattgtt atttgttgtg aggatttgat ttttgttatg tatgattatg cgtggattaa 1650

gataagcctg caaggacaaa ttccctttct ttgattgatg tcaatgagtt tgtgtcaaaa 1710

aaaaaaaaaa aaaa 1724

〈210〉 2

〈211〉 506

〈212〉 PRT

〈213〉 Antirrhinum majus

〈220〉

〈223〉 Amino acid sequence of a protein having an activity to dire

ctly convert flavanone to flavone

〈400〉 2

Met Ser Thr Leu Val Tyr Ser Thr Leu Phe Ile Leu Ser Thr Leu Leu

1 5 10 15

Leu Thr Leu Leu Thr Arg Thr Arg Arg Lys Thr Arg Pro Pro Gly Pro

20 25 30

Leu Ala Leu Pro Leu Ile Gly His Leu His Leu Leu Gly Pro Lys Leu

35 40 45

His His Thr Phe His Gln Phe Ser Gln Arg Tyr Gly Pro Leu Ile Gln

50 55 60

Leu Tyr Leu Gly Ser Val Pro Cys Val Val Ala Ser Thr Pro Glu Leu

65 70 75 80

Ala Arg Glu Phe Leu Lys Thr His Glu Leu Asp Phe Ser Ser Arg Lys

85 90 95

His Ser Thr Ala Ile Asp Ile Val Thr Tyr Asp Ser Ser Phe Ala Phe

100 105 110

Ala Pro Tyr Gly Pro Tyr Trp Lys Phe Ile Lys Lys Leu Cys Thr Tyr

115 120 125

Glu Leu Leu Gly Ala Arg Asn Leu Ser His Phe Gln Pro Ile Arg Ala

130 135 140

Leu Glu Val Asn Ser Phe Leu Arg Ile Leu Tyr Glu Lys Thr Glu Gln

145 150 155 160

Lys Gln Ser Val Asn Val Thr Glu Glu Leu Val Lys Leu Thr Ser Asn

165 170 175

Val Ile Ser Asn Met Met Leu Gly Ile Arg Cys Ser Gly Thr Glu Gly

180 185 190

Glu Ala Glu Val Ala Arg Thr Val Ile Arg Glu Val Thr Gln Ile Phe

195 200 205

Gly Glu Phe Asp Val Ser Glu Ile Val Trp Phe Cys Lys Asn Leu Asp

210 215 220

Leu Gln Gly Ile Arg Lys Arg Ser Glu Asp Ile Arg Arg Arg Tyr Asp

225 230 235 240

Ala Leu Leu Glu Lys Ile Ile Ser Asp Arg Glu Arg Leu Arg Leu Arg

245 250 255

Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Glu Val Lys Asp Phe Leu Asp Met

260 265 270

Leu Leu Asp Val Met Glu Ser Glu Lys Ser Glu Val Glu Phe Thr Arg

275 280 285

Glu His Leu Lys Ala Leu Ile Leu Asp Phe Phe Thr Ala Gly Thr Asp

290 295 300

Thr Thr Ala Ile Thr Thr Glu Trp Ala Ile Ala Glu Leu Ile Ser Asn

305 310 315 320

Pro Asn Val Leu Lys Lys Ala Gln Glu Glu Met Asp Lys Val Ile Gly

325 330 335

Ser Gln Arg Leu Leu Gln Glu Ser Asp Ala Pro Asn Leu Pro Tyr Leu

340 345 350

Asn Ala Ile Ile Lys Glu Thr Phe Arg Leu His Pro Pro Ile Pro Met

355 360 365

Leu Thr Arg Lys Ser Ile Ser Asp Val Val Val Asn Gly Tyr Thr Ile

370 375 380

Pro Ala Lys Thr Leu Leu Phe Val Asn Leu Trp Ser Met Gly Arg Asn

385 390 395 400

Pro Asn Tyr Trp Glu Asn Pro Met Glu Phe Arg Pro Glu Arg Phe Leu

405 410 415

Glu Lys Gly Thr Gly Ser Ile Asp Val Lys Gly Gln His Phe Glu Leu

420 425 430

Leu Pro Phe Gly Thr Gly Arg Arg Gly Cys Pro Gly Met Leu Leu Gly

435 440 445

Met Gln Glu Leu Phe Ser Ile Ile Gly Ala Met Val Gln Cys Phe Asp

450 455 460

Trp Lys Leu Pro Asp Gly Val Lys Ser Val Asp Met Thr Glu Arg Pro

465 470 475 480

Gly Leu Thr Ala Pro Arg Ala Asn Asp Leu Val Cys Gln Leu Val Pro

485 490 495

Arg Ile Asp Pro Val Val Val Ser Gly Pro

500 505

〈210〉 3

〈211〉 1730

〈212〉 DNA

〈213〉 Torenia hybrida

〈220〉

〈223〉 Nucleotide sequence encoding a protein having an activity to dire

ctly convert flavanone to flavone

〈400〉 3

atcgaaaccg ctatatcatt acatttacaa cagcgctaaa aaaatatata taaagc 56

atg gac aca gtc tta atc aca ctc tac acc gcc ctg ttc gtc atc acc 104

Met Asp Thr Val Leu Ile Thr Leu Tyr Thr Ala Leu Phe Val Ile Thr

1 5 10 15

acc acc ttc ctc ctc ctc ctc cgc cga agg gga cca ccg tct ccg ccc 152

Thr Thr Phe Leu Leu Leu Leu Arg Arg Arg Gly Pro Pro Ser Pro Pro

20 25 30

ggt cct ctc tcc cta ccc ata att ggc cac ctc cac ctc ctc ggc cca 200

Gly Pro Leu Ser Leu Pro Ile Ile Gly His Leu His Leu Leu Gly Pro

35 40 45

aga ctc cac cac acg ttc cat gaa ttc tca ctc aaa tac ggc cca ttg 248

Arg Leu His His Thr Phe His Glu Phe Ser Leu Lys Tyr Gly Pro Leu

50 55 60

atc cag ctc aag ctc ggc tcg atc ccg tgc gtc gtg gcc tcg acg ccc 296

Ile Gln Leu Lys Leu Gly Ser Ile Pro Cys Val Val Ala Ser Thr Pro

65 70 75 80

gag ctc gcg aga gag ttt ctt aag acg aac gag ctc gcg ttc tcc tct 344

Glu Leu Ala Arg Glu Phe Leu Lys Thr Asn Glu Leu Ala Phe Ser Ser

85 90 95

cgc aag cac tct acg gcc ata gac atc gtc acc tac gac tcg tcc ttt 392

Arg Lys His Ser Thr Ala Ile Asp Ile Val Thr Tyr Asp Ser Ser Phe

100 105 110

gct ttc tct ccg tac gga ccc tac tgg aag tac atc aag aaa ctg tgt 440

Ala Phe Ser Pro Tyr Gly Pro Tyr Trp Lys Tyr Ile Lys Lys Leu Cys

115 120 125

acc tac gag ctg ctc gga gcg agg aac ctc gga cac ttt cag ccc att 488

Thr Tyr Glu Leu Leu Gly Ala Arg Asn Leu Gly His Phe Gln Pro Ile

130 135 140

agg aat ctc gag gtc agg tcc ttt ctg cag ctt ctg atg cac aag agc 536

Arg Asn Leu Glu Val Arg Ser Phe Leu Gln Leu Leu Met His Lys Ser

145 150 155 160

ttt aag ggc gag agt gtg aat gtg aca gac gag ctg gtg agg ctg acg 584

Phe Lys Gly Glu Ser Val Asn Val Thr Asp Glu Leu Val Arg Leu Thr

165 170 175

agc aat gtg ata tcc cac atg atg ctg agc ata agg tgc tcg gaa gat 632

Ser Asn Val Ile Ser His Met Met Leu Ser Ile Arg Cys Ser Glu Asp

180 185 190

gaa ggc gat gct gag gcg gcg aga aca gtg ata cgc gag gtg acg cag 680

Glu Gly Asp Ala Glu Ala Ala Arg Thr Val Ile Arg Glu Val Thr Gln

195 200 205

ata ttt ggg gaa ttc gat gtt acg gac ata ata tgg ttt tgc aag aaa 728

Ile Phe Gly Glu Phe Asp Val Thr Asp Ile Ile Trp Phe Cys Lys Lys

210 215 220

ttc gat ctg cag ggg ata aag aag agg tca gag gat att cag agg agg 776

Phe Asp Leu Gln Gly Ile Lys Lys Arg Ser Glu Asp Ile Gln Arg Arg

225 230 235 240

tat gat gct ttg ctc gag aag att att agt gat aga gag aga tcg agg 824

Tyr Asp Ala Leu Leu Glu Lys Ile Ile Ser Asp Arg Glu Arg Ser Arg

245 250 255

agg caa aat cgt gat aag cat ggt ggc ggt aac aat gag gag gcc aag 872

Arg Gln Asn Arg Asp Lys His Gly Gly Gly Asn Asn Glu Glu Ala Lys

260 265 270

gat ttt ctt gat atg ttg ctt gat gtg atg gag agt ggg gac acg gag 920

Asp Phe Leu Asp Met Leu Leu Asp Val Met Glu Ser Gly Asp Thr Glu

275 280 285

gtc aaa ttc act aga gag cat ctc aag gct ttg att ctg gat ttc ttc 968

Val Lys Phe Thr Arg Glu His Leu Lys Ala Leu Ile Leu Asp Phe Phe

290 295 300

acg gcc ggt acg gac aca aca gcc ata gcc acc gag tgg gcc atc gcc 1016

Thr Ala Gly Thr Asp Thr Thr Ala Ile Ala Thr Glu Trp Ala Ile Ala

305 310 315 320

gag ctc atc aac aac ccg aac gtc ttg aag aag gcc caa gaa gaa ata 1064

Glu Leu Ile Asn Asn Pro Asn Val Leu Lys Lys Ala Gln Glu Glu Ile

325 330 335

tcc cgg atc atc gga acc aag cgg atc gta caa gaa tcc gac gcc cca 1112

Ser Arg Ile Ile Gly Thr Lys Arg Ile Val Gln Glu Ser Asp Ala Pro

340 345 350

gac cta ccc tac ctc cag gcc atc atc aag gag acg ttc cgg ctc cac 1160

Asp Leu Pro Tyr Leu Gln Ala Ile Ile Lys Glu Thr Phe Arg Leu His

355 360 365

cca ccg atc ccg atg ctc tcg cgt aag tcc acc tcc gat tgc acg gtc 1208

Pro Pro Ile Pro Met Leu Ser Arg Lys Ser Thr Ser Asp Cys Thr Val

370 375 380

aac ggc tac aaa atc caa gcc aag agc ctc ttg ttc gtg aac ata tgg 1256

Asn Gly Tyr Lys Ile Gln Ala Lys Ser Leu Leu Phe Val Asn Ile Trp

385 390 395 400

tcc atc ggt cga aac cct aat tac tgg gaa agc cct atg gag ttc agg 1304

Ser Ile Gly Arg Asn Pro Asn Tyr Trp Glu Ser Pro Met Glu Phe Arg

405 410 415

ccc gag cgg ttc ttg gag aag gga cgc gag tcc atc gac gtc aag ggc 1352

Pro Glu Arg Phe Leu Glu Lys Gly Arg Glu Ser Ile Asp Val Lys Gly

420 425 430

cag cac ttt gag ctc ttg cct ttt ggg acg ggc cgc agg ggc tgt ccc 1400

Gln His Phe Glu Leu Leu Pro Phe Gly Thr Gly Arg Arg Gly Cys Pro

435 440 445

ggt atg ttg ctg gct ata caa gag gtg gtc agc atc att ggg acc atg 1448

Gly Met Leu Leu Ala Ile Gln Glu Val Val Ser Ile Ile Gly Thr Met

450 455 460

gtt cag tgc ttc gac tgg aaa ttg gca gat ggt tcg ggc aat aat gtg 1496

Val Gln Cys Phe Asp Trp Lys Leu Ala Asp Gly Ser Gly Asn Asn Val

465 470 475 480

gac atg acc gaa cgg tct gga ttg acc gct ccg aga gcg ttc gat ctg 1544

Asp Met Thr Glu Arg Ser Gly Leu Thr Ala Pro Arg Ala Phe Asp Leu

485 490 495

gtt tgc cgg ttg tat cca cgg gtt gac ccg gcc aca ata tcg ggt gct 1592

Val Cys Arg Leu Tyr Pro Arg Val Asp Pro Ala Thr Ile Ser Gly Ala

500 505 510

tgatgtag tagggtgagg cgcgtgttgg tgttttatct ttcggttttg ttctgttagt 1650

attattatgg tctgtgttga agcctcaagg attttaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 1710

aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 1730

〈210〉 4

〈211〉 512

〈212〉 PRT

〈213〉 Torenia hybrida

〈220〉

〈223〉 Amino acid sequence of a protein having an activity to dire

ctly convert flavanone to flavone

〈400〉 4

Met Asp Thr Val Leu Ile Thr Leu Tyr Thr Ala Leu Phe Val Ile Thr

1 5 10 15

Thr Thr Phe Leu Leu Leu Leu Arg Arg Arg Gly Pro Pro Ser Pro Pro

20 25 30

Gly Pro Leu Ser Leu Pro Ile Ile Gly His Leu His Leu Leu Gly Pro

35 40 45

Arg Leu His His Thr Phe His Glu Phe Ser Leu Lys Tyr Gly Pro Leu

50 55 60

Ile Gln Leu Lys Leu Gly Ser Ile Pro Cys Val Val Ala Ser Thr Pro

65 70 75 80

Glu Leu Ala Arg Glu Phe Leu Lys Thr Asn Glu Leu Ala Phe Ser Ser

85 90 95

Arg Lys His Ser Thr Ala Ile Asp Ile Val Thr Tyr Asp Ser Ser Phe

100 105 110

Ala Phe Ser Pro Tyr Gly Pro Tyr Trp Lys Tyr Ile Lys Lys Leu Cys

115 120 125

Thr Tyr Glu Leu Leu Gly Ala Arg Asn Leu Gly His Phe Gln Pro Ile

130 135 140

Arg Asn Leu Glu Val Arg Ser Phe Leu Gln Leu Leu Met His Lys Ser

145 150 155 160

Phe Lys Gly Glu Ser Val Asn Val Thr Asp Glu Leu Val Arg Leu Thr

165 170 175

Ser Asn Val Ile Ser His Met Met Leu Ser Ile Arg Cys Ser Glu Asp

180 185 190

Glu Gly Asp Ala Glu Ala Ala Arg Thr Val Ile Arg Glu Val Thr Gln

195 200 205

Ile Phe Gly Glu Phe Asp Val Thr Asp Ile Ile Trp Phe Cys Lys Lys

210 215 220

Phe Asp Leu Gln Gly Ile Lys Lys Arg Ser Glu Asp Ile Gln Arg Arg

225 230 235 240

Tyr Asp Ala Leu Leu Glu Lys Ile Ile Ser Asp Arg Glu Arg Ser Arg

245 250 255

Arg Gln Asn Arg Asp Lys His Gly Gly Gly Asn Asn Glu Glu Ala Lys

260 265 270

Asp Phe Leu Asp Met Leu Leu Asp Val Met Glu Ser Gly Asp Thr Glu

275 280 285

Val Lys Phe Thr Arg Glu His Leu Lys Ala Leu Ile Leu Asp Phe Phe

290 295 300

Thr Ala Gly Thr Asp Thr Thr Ala Ile Ala Thr Glu Trp Ala Ile Ala

305 310 315 320

Glu Leu Ile Asn Asn Pro Asn Val Leu Lys Lys Ala Gln Glu Glu Ile

325 330 335

Ser Arg Ile Ile Gly Thr Lys Arg Ile Val Gln Glu Ser Asp Ala Pro

340 345 350

Asp Leu Pro Tyr Leu Gln Ala Ile Ile Lys Glu Thr Phe Arg Leu His

355 360 365

Pro Pro Ile Pro Met Leu Ser Arg Lys Ser Thr Ser Asp Cys Thr Val

370 375 380

Asn Gly Tyr Lys Ile Gln Ala Lys Ser Leu Leu Phe Val Asn Ile Trp

385 390 395 400

Ser Ile Gly Arg Asn Pro Asn Tyr Trp Glu Ser Pro Met Glu Phe Arg

405 410 415

Pro Glu Arg Phe Leu Glu Lys Gly Arg Glu Ser Ile Asp Val Lys Gly

420 425 430

Gln His Phe Glu Leu Leu Pro Phe Gly Thr Gly Arg Arg Gly Cys Pro

435 440 445

Gly Met Leu Leu Ala Ile Gln Glu Val Val Ser Ile Ile Gly Thr Met

450 455 460

Val Gln Cys Phe Asp Trp Lys Leu Ala Asp Gly Ser Gly Asn Asn Val

465 470 475 480

Asp Met Thr Glu Arg Ser Gly Leu Thr Ala Pro Arg Ala Phe Asp Leu

485 490 495

Val Cys Arg Leu Tyr Pro Arg Val Asp Pro Ala Thr Ile Ser Gly Ala

500 505 510

〈210〉 5

〈211〉 31

〈212〉 DNA

〈213〉 Artificial Sequence

〈220〉

〈223〉 Primer

〈400〉 5

aaataggatc caagcatgga cacagtctta a 31

〈210〉 6

〈211〉 35

〈212〉 DNA

〈213〉 Artificial Sequence

〈220〉

〈223〉 Primer

〈400〉 6

cccttctaga tcaagcaccc gatattgtgg ccggg 35

〈210〉 7

〈211〉 1770

〈212〉 DNA

〈213〉 Perilla frutescens

〈220〉

〈223〉 Nucleotide sequence encoding a protein having an activity to dire

ctly convert flavanone to flavone

〈400〉 7

tgtcgacgga gcaagtggaa atg gca ctg tac gcc gcc ctc ttc ctc ctg tcc 53

Met Ala Leu Tyr Ala Ala Leu Phe Leu Leu Ser

1 5 10

gcc gcc gtg gtc cgc tcc gtt ctg gat cga aaa cgc ggg cgg ccg ccc 101

Ala Ala Val Val Arg Ser Val Leu Asp Arg Lys Arg Gly Arg Pro Pro

15 20 25

tac cct ccc ggg ccg ttc cct ctt ccc atc atc ggc cac tta cac ctc 149

Tyr Pro Pro Gly Pro Phe Pro Leu Pro Ile Ile Gly His Leu His Leu

30 35 40

ctc ggg ccg aga ctc cac caa acc ttc cac gat ctg tcc caa cgg tac 197

Leu Gly Pro Arg Leu His Gln Thr Phe His Asp Leu Ser Gln Arg Tyr

45 50 55

ggg ccc tta atg cag ctc cgc ctc ggg tcc atc cgc tgc gtc att gct 245

Gly Pro Leu Met Gln Leu Arg Leu Gly Ser Ile Arg Cys Val Ile Ala

60 65 70 75

gcc tcg ccg gag ctc gcc aag gaa tgc ctc aag aca cac gag ctc gtc 293

Ala Ser Pro Glu Leu Ala Lys Glu Cys Leu Lys Thr His Glu Leu Val

80 85 90

ttc tcc tcc cgc aaa cac tcc acc gcc att gat atc gtc acc tac gat 341

Phe Ser Ser Arg Lys His Ser Thr Ala Ile Asp Ile Val Thr Tyr Asp

95 100 105

tca tcc ttc gct ttc tct ccc tac ggg cct tac tgg aaa ttc atc aag 389

Ser Ser Phe Ala Phe Ser Pro Tyr Gly Pro Tyr Trp Lys Phe Ile Lys

110 115 120

aaa tta tgc acc tac gag ctg ctc ggg gcc cga aat ctc gcc cac ttt 437

Lys Leu Cys Thr Tyr Glu Leu Leu Gly Ala Arg Asn Leu Ala His Phe

125 130 135

cag ccc atc agg act ctc gaa gtc aag tct ttc ctc caa att ctt atg 485

Gln Pro Ile Arg Thr Leu Glu Val Lys Ser Phe Leu Gln Ile Leu Met

140 145 150 155

cgc aag ggt gaa tcg ggg gag agc ttc aac gtg act gag gag ctc gtg 533

Arg Lys Gly Glu Ser Gly Glu Ser Phe Asn Val Thr Glu Glu Leu Val

160 165 170

aag ctg acg agc aac gtc ata tcg cat atg atg ctg agc ata cgg tgt 581

Lys Leu Thr Ser Asn Val Ile Ser His Met Met Leu Ser Ile Arg Cys

175 180 185

tca gag acg gag tcg gag gcg gag gcg gcg agg acg gtg att cgg gag 629

Ser Glu Thr Glu Ser Glu Ala Glu Ala Ala Arg Thr Val Ile Arg Glu

190 195 200

gtc acg cag ata ttt ggg gag ttc gac gtc tcc gac atc ata tgg ctt 677

Val Thr Gln Ile Phe Gly Glu Phe Asp Val Ser Asp Ile Ile Trp Leu

205 210 215

tgt aag aac ttc gat ttc caa ggt ata agg aag cgg tcc gag gat atc 725

Cys Lys Asn Phe Asp Phe Gln Gly Ile Arg Lys Arg Ser Glu Asp Ile

220 225 230 235

cag Asp Leu Gln Gly Ile Lys Lys Arg Ser Glu Asp Ile Gln Arg Arg

225 230 235 240

Tyr Asp Ala Leu Leu Glu Lys Ile Ile Ser Asp Arg Glu Arg Ser Arg

245 250 255

Arg Gln Asn Arg Asp Lys His Gly Gly Gly Asn Asn Glu Glu Ala Lys

260 265 270

Asp Phe Leu Asp Met Leu Leu Asp Val Met Glu Ser Gly Asp Thr Glu

275 280 285

Val Lys Phe Thr Arg Glu His Leu Lys Ala Leu Ile Leu Asp Phe Phe

290 295 300

Thr Ala Gly Thr Asp Thr Thr Ala Ile Ala Thr Glu Trp Ala Ile Ala

305 310 315 320

acc gcc ggc acc gac acg acg gcg atc gtg tgt gaa tgg gcg ata gca 965

Thr Ala Gly Thr Asp Thr Thr Ala Ile Val Cys Glu Trp Ala Ile Ala

300 305 310 315

gaa gtg atc aac aat cca aat gtg ttg aag aaa gct caa gaa gag att 1013

Glu Val Ile Asn Asn Pro Asn Val Leu Lys Lys Ala Gln Glu Glu Ile

320 325 330

gcc aac atc gtc gga ttc gac aga att ctg caa gaa tcc gac gcc cca 1061

Ala Asn Ile Val Gly Phe Asp Arg Ile Leu Gln Glu Ser Asp Ala Pro

335 340 345

aat ctg ccc tac ctt caa gcc ctc atc aaa gaa aca ttc cgg ctc cac 1109

Asn Leu Pro Tyr Leu Gln Ala Leu Ile Lys Glu Thr Phe Arg Leu His

350 355 360

cct cca atc cca atg ctg gcg agg aaa tcg atc tcc gac tgc gtc atc 1157

Pro Pro Ile Pro Met Leu Ala Arg Lys Ser Ile Ser Asp Cys Val Ile

365 370 375

gac ggc tac atg att ccg gcc aac acg ctg ctc ttc gtc aac ctc tgg 1205

Asp Gly Tyr Met Ile Pro Ala Asn Thr Leu Leu Phe Val Asn Leu Trp

380 385 390 395

tcc atg ggg cgg aac cct aaa atc tgg gac tac ccg acg gcg ttc cag 1253

Ser Met Gly Arg Asn Pro Lys Ile Trp Asp Tyr Pro Thr Ala Phe Gln

400 405 410

ccg gag agg ttt ctg gag aag gaa aag gcc gcc atc gat gtt aaa ggg 1301

Pro Glu Arg Phe Leu Glu Lys Glu Lys Ala Ala Ile Asp Val Lys Gly

415 420 425

cag cat ttt gag ctg cta ccg ttc gga acg ggc agg aga ggc tgc cca 1349

Gln His Phe Glu Leu Leu Pro Phe Gly Thr Gly Arg Arg Gly Cys Pro

430 435 440

ggg atg ctt tta gcc att cag gag gtg gtc atc ata att ggg acg atg 1397

Gly Met Leu Leu Ala Ile Gln Glu Val Val Ile Ile Ile Gly Thr Met

445 450 455

att caa tgc ttc gat tgg aag ctg ccc gac ggc tcc ggc cat gtt gat 1445

Ile Gln Cys Phe Asp Trp Lys Leu Pro Asp Gly Ser Gly His Val Asp

460 465 470 475

atg gca gaa cgg cca ggg ctc acg gca ccg cga gag acc gat ttg ttt 1493

Met Ala Glu Arg Pro Gly Leu Thr Ala Pro Arg Glu Thr Asp Leu Phe

480 485 490

tgc cgt gtg gtg ccg cga gtt gat ccg ttg gtt gtt tcc acc cag tg 1540

Cys Arg Val Val Pro Arg Val Asp Pro Leu Val Val Ser Thr Gln

495 500 505

atcaccccct ttaaatttat taatgatata tttttatttt gagaaaaaat aaaaatgcta 1600

attgttttgt ttcatgatgt aattgttaat tagtttctat tgtgcgctgt cgcgtgtcgc 1660

gtggcttaag ataagattgt atcattggta cctaggatgt attttcattt tcaataaatt 1720

attttgtgct gtgtatatta aaaaaaaaaa agaaaaaaaa aaaaaaaaaa 1770

〈210〉 8

〈211〉 506

〈212〉 PRT

〈213〉 Perilla frutescens

〈220〉

〈223〉 Amino acid sequence of a protein having an activity to dire

ctly convert flavanone to flavone

〈400〉 8

Met Ala Leu Tyr Ala Ala Leu Phe Leu Leu Ser Ala Ala Val Val Arg

1 5 10 15

Ser Val Leu Asp Arg Lys Arg Gly Arg Pro Pro Tyr Pro Pro Gly Pro

20 25 30

Phe Pro Leu Pro Ile Ile Gly His Leu His Leu Leu Gly Pro Arg Leu

35 40 45

His Gln Thr Phe His Asp Leu Ser Gln Arg Tyr Gly Pro Leu Met Gln

50 55 60

Leu Arg Leu Gly Ser Ile Arg Cys Val Ile Ala Ala Ser Pro Glu Leu

65 70 75 80

Ala Lys Glu Cys Leu Lys Thr His Glu Leu Val Phe Ser Ser Arg Lys

85 90 95

His Ser Thr Ala Ile Asp Ile Val Thr Tyr Asp Ser Ser Phe Ala Phe

100 105 110

Ser Pro Tyr Gly Pro Tyr Trp Lys Phe Ile Lys Lys Leu Cys Thr Tyr

115 120 125

Glu Leu Leu Gly Ala Arg Asn Leu Ala His Phe Gln Pro Ile Arg Thr

130 135 140

Leu Glu Val Lys Ser Phe Leu Gln Ile Leu Met Arg Lys Gly Glu Ser

145 150 155 160

Gly Glu Ser Phe Asn Val Thr Glu Glu Leu Val Lys Leu Thr Ser Asn

165 170 175

Val Ile Ser His Met Met Leu Ser Ile Arg Cys Ser Glu Thr Glu Ser

180 185 190

Glu Ala Glu Ala Ala Arg Thr Val Ile Arg Glu Val Thr Gln Ile Phe

195 200 205

Gly Glu Phe Asp Val Ser Asp Ile Ile Trp Leu Cys Lys Asn Phe Asp

210 215 220

Phe Gln Gly Ile Arg Lys Arg Ser Glu Asp Ile Gln Arg Arg Tyr Asp

225 230 235 240

Ala Leu Leu Glu Lys Ile Ile Thr Asp Arg Glu Lys Gln Arg Arg Thr

245 250 255

His Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Glu Ala Lys Asp Phe Leu Asp Met

260 265 270

Phe Leu Asp Ile Met Glu Ser Gly Lys Ala Glu Val Lys Phe Thr Arg

275 280 285

Glu His Leu Lys Ala Leu Ile Leu Asp Phe Phe Thr Ala Gly Thr Asp

290 295 300

Thr Thr Ala Ile Val Cys Glu Trp Ala Ile Ala Glu Val Ile Asn Asn

305 310 315 320

Pro Asn Val Leu Lys Lys Ala Gln Glu Glu Ile Ala Asn Ile Val Gly

325 330 335

Phe Asp Arg Ile Leu Gln Glu Ser Asp Ala Pro Asn Leu Pro Tyr Leu

340 345 350

Gln Ala Leu Ile Lys Glu Thr Phe Arg Leu His Pro Pro Ile Pro Met

355 360 365

Leu Ala Arg Lys Ser Ile Ser Asp Cys Val Ile Asp Gly Tyr Met Ile

370 375 380

Pro Ala Asn Thr Leu Leu Phe Val Asn Leu Trp Ser Met Gly Arg Asn

385 390 395 400

Pro Lys Ile Trp Asp Tyr Pro Thr Ala Phe Gln Pro Glu Arg Phe Leu

405 410 415

Glu Lys Glu Lys Ala Ala Ile Asp Val Lys Gly Gln His Phe Glu Leu

420 425 430

Leu Pro Phe Gly Thr Gly Arg Arg Gly Cys Pro Gly Met Leu Leu Ala

435 440 445

Ile Gln Glu Val Val Ile Ile Ile Gly Thr Met Ile Gln Cys Phe Asp

450 455 460

Trp Lys Leu Pro Asp Gly Ser Gly His Val Asp Met Ala Glu Arg Pro

465 470 475 480

Gly Leu Thr Ala Pro Arg Glu Thr Asp Leu Phe Cys Arg Val Val Pro

485 490 495

Arg Val Asp Pro Leu Val Val Ser Thr Gln

500 505

꽃의 색상이 다양한 것은 사람의 정신과 심성을 풍요롭게하는 생활의 즐거운 측면 중 하나이다. 미생물과의 공생을 통하여 식물의 생장을 촉진시키거나 질소-고정 콩과 세균의 수를 증가시킴으로써 토양 중의 질소 함량을 증가시킨 결과로 식물 생산량을 증진시켜 미래의 인구 증가를 충족시키는 식량 생산의 증가가 기대된다. 보다 환경 친화적인 농업을 이루기 위해서는 농업용 화학물질의 사용을 금지하거나 줄이는 것이 또한 바람직하며, 이를 위해서는 상기 언급된 생물학적 수단에 의해서 뿐만 아니라 미생물 감염에 대한 보다 높은 내성을 갖는 식물 의해 토양을 개선시킬 필요가 있다. 또 다른 목적은 식물을 오존 층의 파괴로부터 보호하기 위한 수단으로서 자외선에 대해 높은 보호 기능을 지닌 식물을 수득하는 것이다.

"플라보노이드"는 C6-C3-C6 탄소 골격을 지닌 화합물 그룹에 대한 일반명이고, 이는 식물 세포 전반에 걸쳐 넓게 분포되어 있다. 플라보노이드는 곤충과 기타 수분인자(pollinator)를 유인하고, 자외선으로부터 식물을 보호하며, 토양 미생물과의 상호작용에 관여하는 것과 같은 기능을 지니는 것으로 공지되어 있다[참조: BioEssays, 16 (1994), Koes et al., p. 123; Trends in Plant Science, 1 (1997), Shirley, B.W., p.377].

플라보노이드 중에서, 플라본이 특히 콩과 식물에서 식물과 미생물간의 상호작용에 중요한 역할을 하는데, 여기서 이들은 콩과 세균과의 공생 초기 단계에 관여한다[참조: Plant Cell, 7 (1995), Dixon and Paiva, p.1085; Annu. Rev. Phytopathol., 33 (1995), Spaink, p.345]. 꽃잎의 플라본은 곤충이 인식하는데 중요한 역할을 수행하고 안토시아닌과 복합체를 형성하는 보조 색소로서 작용한다[참조: Gendai Kagaku(May, 1998), Honda and Saito, p.25; Prog. Chem. Org. Natl. Prod., 52 (1987), Goto, T., p.114]. 플라본이 안토시아닌과 복합체를 형성하는 경우에, 안토시아닌의 최대 흡광도가 보다 긴 파장 쪽으로, 즉 청색쪽으로 이동한다는 것은 공지되어 있다.

플라보노이드의 생합성 경로는 광범위하게 연구되어 왔으며[참조: Plant Cell, 7 (1995), Holton and Cornish, p.1071], 예를 들어 안토시아니딘 3-글루코시드 및 플라보놀의 생합성에 관련된 모든 효소에 대한 유전자가 분리되었다. 그러나, 플라본의 생합성에 관련된 유전자는 아직까지 분리하지 못하였다. 플라본을 합성하는 효소로는 2-옥소글루타르산에 의존하는 디옥시게나제 계열에 속하는 효소(플라본 신타제 I) 및 시토크롬 P450 계열에 속하는 모노옥시게나제 효소(플라본 신타제 II)가 있다. 이들 그룹의 효소는 구조적 상동성을 지니고 있지 않은 전혀 상이한 효소이다.

파슬리에서는 2-옥소글루타르산-의존적 디옥시게나제가 플라바논인 나린게닌으로부터 플라본인 아피게닌을 생성시키는 반응을 촉매한다고 보고되었다[참조: Z. Naturforsch., 36c (1981), Britsch et al., p.742; Arch. Biochem. Biophys., 282(1990), Britsch, p. 152]. 다른 유형인 플라본 신타제 II는 금어초[참조: Z. Naturforsch., 36c (1981), Stotz and Forkmann, p.737] 및 대두[참조: Z. Naturforsch., 42c (1987), Kochs and Grisebach, p.343; Planta, 171(1987), Kochs et al., p.519]에 존재하는 것으로 공지되어 있다. 솜나물 꽃잎에서의 유전자 위치와 플라본 신타제 II 활성간의 상관관계가 최근에 보고되었다[참조: Phytochemistry, 49 (1998), Martens and Forkmann, p.1953]. 그러나, 이들 플라본 신타제 I 및 II에 대한 유전자를 분리하였거나 플라본 신타제 II를 고도로 정제하였다는 것은 아직 보고되지 않았다.

감초(Glycyrrhiza echinata)의 배양 세포를 유도인자(elicitor)로 처리한 경우에 유도되는 리코디온 합성 활성을 지닌 시토크롬 P450 단백질의 특성은 연구되었다. 이러한 단백질은 5-데옥시플라바논인 리퀴리티게닌의 2-위치의 하이드록시화를 촉매한 후, 리코디온을 생성시키기 위한 비-효소적 헤미아세탈 개환 반응이 일어나는 것으로 여겨진다[참조: Plant Physiol., 105 (1994), Otani et al., p.1427]. 리코디온 신타제를 클로닝하기 위해서, 유도인자-처리된 글리시리자(Glycyrrhiza) 배양 세포로부터 cDNA 라이브러리를 제조하고, 시토크롬 P450을 암호화하는 8개 유전자 단편을 클로닝하였다[참조: Plant Science, 126 (1997), Akashi et al., p.39].

이들 단편으로부터, 2개의 상이한 완전한 길이의 cDNA 서열을 수득하였는데, 이들 각각은 그 때까지 공지된 적이 없는 시토크롬 P450을 암호화한다. 구체적으로 언급하면, 이들은 CYPGe-3(시토크롬 P450 No.CYP81E1) 및 CYPGe-5(시토크롬 P450 No.CYP93B1; 이는 CYP93B1로서 후술됨)이다[참조: Plant Physiol., 115 (1997), Akashi et al., p.1288]. 배양된 곤충 세포를 사용하여 특정 시스템에서 CYP93B1 cDNA를 추가로 발현시킴으로써, 이러한 유전자로부터 유도된 단백질이 플라바논인 리퀴리티게닌으로부터 리코디온을 합성하는 반응 및 플라바논인 나린게닌으로부터 2-하이드록시나린게닌을 합성하는 반응을 촉매하는 것으로 밝혀졌다.

2-하이드록시나린게닌을 10% 염산으로 산 처리함으로써(실온, 2시간) 상기 2-하이드록시나린게닌을 플라본인 아피게닌으로 전환시킨다. 또한, 에리오딕티올을 CYP93B1-발현 효모의 마이크로솜(microsome)과 반응시킨 다음 산 처리함으로써, 에리오딕티올을 플라본인 루테올린으로 전환시킨다. 따라서, 시토크롬 P450 유전자가 플라바논 2-하이드록실라제 활성의 기능을 암호화한다는 것이 입증되었다[참조: FEBS Lett., 431 (1998), Akashi et al., p.287]. 여기서, 나린게닌으로부터 아피게닌을 생성시키기 위해서는 CYP93B1 뿐만 아니라 또 다른 공지되지 않은 효소가 필요하기 때문에, 총 2가지 효소가 필요한 것으로 결론지었다.

그러나, 지금까지, 산 처리를 수행하지 않고서 플라바논(예: 나린게닌)으로부터 직접적으로 플라본(예: 아피게닌)을 합성하는 활성을 지닌 효소에 대한 유전자가 동정된 바 없다. 따라서, 플라본이 식물에서 수많은 기능을 지니고 있다는 사실에도 불구하고, 지금까지 식물에서의 이들의 생합성을 조절하고 플라본이 관련된 생체 기능(예: 꽃의 색상)을 개선시키기 위한 어떠한 기술도 보고된 바가 없다. 스스로 플라바논으로부터 플라본을 합성할 수 있는 효소를 발견하고 이의 유전자를 수득하며 이러한 유전자를 식물 내로 도입시키는 것이, 플라바논으로부터 플라본을 합성하는데 관여하는 2가지 효소에 대한 유전자를 식물 내로 도입하는 것 보다 더 실용적이고 산업적으로 응용 가능할 것이다.

본 발명은 유전공학 기술에 의해, 식물에서 꽃의 색상, 자외선으로부터의 보호 및 미생물과의 공생 등에 대해 영향을 미치는 플라본의 생합성 조절 및 이의 용도에 관한 것이다. 보다 상세하게는, 본 발명은 플라바논으로부터 플라본을 합성하는 활성을 지닌 단백질을 암호화하는 유전자 및 이의 용도에 관한 것이다.

도 1은 CYP93B1 및 TFNS5에 의해 암호화된 단백질을 사용하여, 기질인 나린게닌으로부터 수득된 생성물을 HPLC로 분석한 결과를 나타내는 크로마토그램이다:

A 및 B: CYP93B1-발현 효모의 조 효소 분획을 가함으로써 수득됨.

C 및 D: TFNS5-발현 효모의 조 효소 분획을 가함으로써 수득됨.

A 및 C: 효소 분획을 가함으로써 수득된 직접적인 생성물.

B: A의 반응 후에 산 처리함으로써 수득된 생성물.

D: C의 반응 후에 산 처리함으로써 수득된 생성물.

발명을 수행하기 위한 양태

글리시리자 CYP93B1 유전자에 의해 암호화된 플라바논 2-하이드록실라제는 기질로서 플라바논으로부터 2-하이드록시플라바논을 생성시키고, 이러한 생성물은 산 처리에 의해 플라본으로 전환된다. 본 발명자들은, 예를 들어 다량의 플라본을 함유하는 꽃의 cDNA 라이브러리를 스크리닝하기 위하여, 글리시리자-유래된 cDNA인 CYP93B1을 사용하여 본 발명의 목적물인 플라본 신타제 II를 암호하하는 유전자를 수득함으로써, 기질인 플라바논으로부터 직접적으로 플라본을 합성하는 활성을 지니고 있는 단백질을 암호화하는 cDNA를 수득할 수 있을 것으로 전망하였다.

본 발명에 따르면, 프로브로서 글리시리자-유래된 cDNA인 CYP93B1을 사용하여 다량의 플라본을 함유하는 금어초의 cDNA 라이브러리를 스크리닝하여 신규한 시토크롬 P450을 암호화하는 cDNA를 수득한다(실시예 1 참조). 이어서, 이러한 방식으로 수득된 금어초 cDNA인 ANFNS2와 글리시리자 CYP93B1을 혼합 프로브로서 사용하여 토레니아(torenia) 꽃잎의 cDNA 라이브러리로부터 신규한 시토크롬 P450을 암호화하는 cDNA인 TFNS5를 수득한다(실시예 2 참조).

토레니아-유래된 cDNA를 효모에서 발현시키고 기질로서 플라바논인 나린게닌과 반응시키면, 산 처리하지 않고서도 2-하이드록시나린게닌이 아니라 오히려 플라본인 아피게닌이 생성된다(실시예 3 참조). 달리 언급하면, 상기 효소는 산 처리하지 않고서도 플라바논으로부터 플라본을 직접적으로 생성시키며, 이의 유전자는 지금까지 결코 클로닝된 적이 없었던 플라본 신타제 II인 것으로 확인되었다. 실시예 1의 금어초-유래된 ANFNS2에 의해 암호화된 아미노산 서열은 TFNS5에 의해 암호화된 플라본 신타제 II와 77%의 높은 동일성을 나타내고, 플라본 신타제 II의 효소 활성을 나타내었다(실시예 4). 또한, 페릴라(perilla)-유래된 cDNA에 의해 암호화된 아미노산 서열은 또한 TFNS5 및 ANFNS2와 각각 76% 및 75%의 높은 동일성을 나타내기 때문에(실시예 8), 이러한 cDNA에 의해 암호화된 단백질이 TFNS5 및 ANFNS2에 의해 암호화된 플라본 신타제와 동일한 효소적 활성을 또한 보유하고 있다고 여겨진다.

본 발명의 유전자는, 예를 들면 서열 목록의 서열 2, 4 또는 8에 제시된 바와 같은 아미노산 서열을 암호화하는 것일 수 있다. 그러나, 아미노산 서열이 다수의 아미노산 서열의 부가 또는 결실 및/또는 상이한 아미노산으로의 치환에 의해 변형된 단백질은 본래의 단백질과 동일한 효소 활성을 유지할 수 있는 것으로 공지되어 있다. 결과적으로, 아미노산 서열이 하나 이상의 아미노산 서열의 부가 또는 결실 및/또는 상이한 아미노산으로의 치환에 의해 변형된, 서열 목록의 서열 2, 4 또는 8에 제시된 바와 같은 아미노산 서열을 갖는 단백질과 이러한 단백질을 암호화하는 유전자도 또한, 이들이 플라바논으로부터 직접적으로 플라본을 생성하는 활성을 유지하는 한은 본 발명내에 포함된다.

본 발명은 또한, 서열 1, 3 및 7에 제시된 바와 같은 뉴클레오티드 서열과 이에 제시된 아미노산 서열을 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 갖거나, 또는 예를 들어, 이들이 플라바논으로부터 플라본을 생성하는 활성을 보유하는 단백질을 암호화한다면, 5 x SSC, 50℃의 조건하에서 이들의 뉴클레오티드 서열의 일부분과 하이드리드화되는 유전자를 포함한다. 적합한 하이브리드화 온도는 뉴클레오티드 서열 및 뉴클레오티드 서열의 길이에 따라서 상이할 것이며, 예를 들면, 사용된 프로브가 6개 아미노산을 암호화하는 18개 염기를 포함하는 DNA 단편인 경우에는, 상기 온도가 50℃를 초과하지 않는 것이 바람직하다.

이러한 하이브리드화에 의해 선별된 유전자는 천연적으로 유래된 것, 예를 들면, 식물-유래된 유전자, 예를 들어, 금어초, 토레니아 또는 페릴라로부터 유래된 유전자일 수 있으며; 이는 또한 또 다른 식물, 예를 들면, 용담속 식물, 마편초속 식물, 국화속 식물, 붓꽃속 식물 등으로부터의 유전자일 수 있다. 하이브리드화에 의해 선별된 유전자는 cDNA 또는 게놈 DNA일 수 있다.

본 발명은 또한, 서열 목록의 서열 2, 4 또는 8에 제시된 바와 같은 아미노산 서열 중의 어느 하나와 55% 이상, 바람직하게는 70% 이상, 예를 들면, 80% 이상, 심지어 90% 이상의 동일성을 나타내는 아미노산 서열을 갖고 플라바논으로부터 플라본을 합성하는 활성을 보유하는 단백질을 암호화하는 유전자에 관한 것이다.

천연 뉴클레오티드 서열을 갖는 유전자는, 예를 들어, 다음 실시예에 상세히 입증된 바와 같이, cDNA 라이브러리를 스크리닝함으로써 수득할 수 있다. 변형된 아미노산 서열을 갖는 효소를 암호화하는 DNA는 출발 물질로서 천연 뉴클레오티드 서열을 갖는 DNA를 이용하는 통상의 부위-지시된 돌연변이유발법 또는 PCR 방법으로 합성할 수 있다. 예를 들면, 변형이 도입되어질 DNA 단편을 천연 cDNA 또는 게놈 DNA의 제한 효소 처리에 의해 수득한 다음, 이를 부위-지시된 돌연변이유발법에 대한 주형 또는 목적하는 돌연변이가 도입된 프라이머를 사용하는 PCR에 대한 주형으로서 사용하여, 목적하는 변형이 도입된 DNA 단편을 수득할 수 있다. 이어서, 돌연변이-도입된 DNA 단편을 표적 효소의 또 다른 부분을 암호화하는 DNA 단편에 연결시킬 수 있다.

한편, 단축된 아미노산 서열로 이루어진 효소를 암호화하는 DNA를 수득하기 위해서는, 예를 들면, 목적하는 아미노산 서열 보다 긴 아미노산 서열(예: 완전한 길이의 아미노산 서열)을 암호화하는 DNA를 목적하는 제한 엔도뉴클레아제로 절단할 수 있고, 이로써 수득된 DNA 단편이 완전한 표적 아미노산 서열을 암호화하지 않는 경우에는, 이를 상기 서열의 나머지를 포함하는 합성된 DNA와 연결시킬 수 있다.

이로써 수득된 유전자는 이. 콜라이(E. coli) 또는 효모를 사용하여 발현 시스템에서 발현시킬 수 있으며, 이의 효소 활성을 측정하여 상기 수득된 유전자가 플라본 신타제를 암호화하는지를 확인한다. 이러한 유전자를 발현시킴으로써, 유전자 생성물로서 플라본 신타제 단백질을 수득하는 것이 또한 가능하다. 또 다른 방법으로는, 심지어 서열 2, 4 또는 8에 제시된 바와 같은 완전한 또는 부분적 아미노산 서열에 대한 항체를 사용하여서도 플라본 신타제 단백질을 수득하는 것이 가능하며, 이러한 항체는 또 다른 유기체에서 플라본 신타제 유전자를 클로닝하는데 사용할 수 있다.

결과적으로, 본 발명은 전술한 유전자를 함유하는 재조합 벡터, 특히 발현 벡터, 및 이들 벡터에 의해 형질전환된 숙주에 관한 것이다. 사용된 숙주는 원핵 또는 진핵 유기체일 수 있다. 숙주로서 통상 사용될 수 있는 원핵 유기체의 예로는 에스케리챠(Escherichia) 속에 속하는 세균, 예를 들면, 에스케리챠 콜라이(Escherichia coli), 및 바실러스(Bacillus) 속에 속하는 미생물, 예를 들면, 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtillis)가 있다.

사용할 수 있는 진핵 숙주의 예로는 하등 진핵 유기체, 예를 들면, 진핵 미생물, 예를 들면, 효모 및 사상 진균과 같은 유마이코타(Eumycota)가 있다. 효모로는 삭카로마이세스(Saccharomyces) 속에 속하는 미생물, 예를 들면, 삭카로마이세스 세레비지애(Saccharomyces cerevisiae)가 언급될 수 있고, 사상 진균으로는 아스퍼질러스 오리재(Aspergillus oryzae) 및 아스퍼질러스 니거(Aspergillus niger)와 같은 아스퍼질러스(Aspergillus) 속에 속하는 미생물 및 페니실륨(Penicillium) 속에 속하는 미생물이 언급될 수 있다. 동물 세포 및 식물 세포가 또한 사용될 수 있는데, 동물 세포는 마우스, 햄스터, 원숭이 또는 사람으로부터의 세포주이다. 곤충 세포, 예를 들면, 누에 세포 또는 성체 누에 자체를 사용할 수도 있다.

본 발명의 발현 벡터는 이들이 도입될 숙주의 유형에 따라서 발현 조절 영역, 예를 들면, 프로모터 및 터미네이터, 복제 기점 등을 포함할 것이다. 사용될 수 있는 세균 발현 벡터에 대한 프로모터의 예로는 통상적인 프로모터, 예를 들면, trc 프로모터, tac 프로모터, lac 프로모터 등이 있으며, 사용될 수 있는 효모 프로모터의 예로는 글리세르알데히드-3-포스페이트 데하이드로게나제 프로모터, PH05 프로모터 등이 있으며, 사용될 수 있는 사상 진균 프로모터의 예로는 아밀라제 프로모터, trpC 등이 있다. 사용될 수 있는 동물 세포 숙주 프로모터의 예로는 바이러스 프로모터, 예를 들면, SV40 얼리(early) 프로모터, SV 40 레이트(late) 프로모터 등이 있다.

당해 발현 벡터는 제한 엔도뉴클레아제, 리가제 등을 사용하여 통상적인 방법에 따라서 제조할 수 있다. 발현 벡터를 이용하여 숙주를 형질전환시키는 것은 통상적인 방법에 따라서 또한 수행할 수 있다.

이러한 발현 벡터에 의해 형질전환된 숙주는 배양 또는 성장시킬 수 있으며, 표적 단백질을 통상적인 방법, 예를 들면, 여과, 원심분리형 분리, 세포 파쇄, 겔 여과 크로마토그래피, 이온 교환 크로마토그래피 등에 의해 배양 생성물 등으로부터 회수하고 정제할 수 있다.

본 명세서 전반에 걸쳐 플라바논으로부터 직접적으로 플라본을 합성할 수 있는, 금어초, 토레니아 및 페릴라로부터 유래된 플라본 신타제 II가 논의되어 있으며, 시토크롬 P450 유전자가 슈퍼패밀리(superfamily)를 구성하고 있으며[참조: DNA and Cell Biology, 12 (1993), Nelson et al., p.1], 동일한 패밀리 내의 시토크롬 P450 단백질은 이들의 아미노산 서열에 있어서 40% 이상의 동일성을 나타내는 반면, 서브패밀리 내의 시토크롬 P450 단백질은 이들의 아미노산 서열에 있어서 55% 이상의 동일성을 나타내며, 이들의 유전자는 서로 하이브리드화된다는 것은 공지되어 있다[참조: Pharmacogenetics, 6(1996), Nelson et al., p.1].

시토크롬 P450의 한 유형이고 플라본 합성 경로에 참여하는 플라보노이드 3',5'-하이드록실라제에 대한 유전자는 페투니아(petunia)로부터 최초로 분리되었고[참조: Nature, 366 (1993), Holton et al., p.276], 이러한 페투니아 플라보노이드 3',5'-하이드록실라제 유전자를 프로브로서 사용하여 용담속 식물(참조: Plant Cell Physiol., 37 (1996), Tanaka et al., p.711), 대초원산-용담속 식물, 초롱꽃과 식물(참조: WO93/18155 (1993); Kikuchi et al.), 라벤더, 토레니아 및 마편초속 식물(참조: Shokubutsu no Kagaku Chosetsu, 33(1998), Tanaka et al., p.55)로부터 플라보노이드 3',5'-하이드록실라제 유전자를 먼저 분리하였다.

따라서, 상이한 종의 식물로부터, 플라바논으로부터 직접적으로 플라본을 합성할 수 있는 플라본 신타제 II 유전자를 수득하기 위해, 플라바논으로부터 직접적으로 플라본을 합성할 수 있는, 금어초, 토레니아 또는 페릴라로부터 유래된 본 발명의 플라본 신타제 II 유전자 중의 어느 하나의 일부 또는 전부를 프로브로서 사용할 수 있다. 더우기, 플라바논으로부터 직접적으로 플라본을 합성할 수 있는, 본 명세서에 기재된 금어초-, 토레니아- 또는 페릴라-유래된 플라본 신타제 II 효소를 정제하고 통상적인 방법에 의해 상기 효소에 대한 항체를 수득함으로써, 이러한 항체와 반응하는 상이한 플라본 신타제 II 단백질과 이러한 단백질을 암호화하는 유전자를 수득할 수 있다.

결과적으로, 본 발명은 플라바논으로부터 직접적으로 플라본을 합성할 수 있는 플라본 신타제 II에 대한 금어초-, 토레니아- 또는 페릴라-유래된 유전자로만 제한되지 않고, 추가로 플라바논으로부터 직접적으로 플라본을 합성할 수 있는, 수 많은 다른 식물로부터 유래된 플라본 신타제 II에 관한 것이다. 이러한 플라본 신타제 II 유전자에 대한 공급원은 본원에 기재된 금어초, 토레니아 및 페릴라 이외에도, 또한 용담속 식물, 마편초속 식물, 국화속 식물, 붓꽃속 식물, 코멜리나(commelina), 센타우레아(centaurea), 샐비아, 네모필라(nemophila) 등일 수 있지만, 본 발명의 범위가 이들 식물로 제한되지는 않는다.

본 발명은 또한 추가로, 플라바논으로부터 직접적으로 플라본을 합성할 수 있는 플라본 신타제 II에 대한 유전자(들)를 도입함으로써 색상이 변형되는 식물; 및 이러한 식물의 자손, 또는 절단된 꽃의 형태일 수도 있는 이들의 조직에 관한 것이다. 플라본 신타제 II 또는 본 발명에 따라서 클로닝시킨 이들의 유전자를 사용함으로써, 플라본을 거의 생성하지 않거나 전혀 생성하지 않는 식물 종 또는 변종에서 플라본을 생성시키는 것이 가능하다. 플라본 신타제 II 유전자(들)를 꽃잎에서 발현시켜 이러한 꽃잎에서 플라본의 양을 증가시킬 수 있으므로, 꽃의 색상을, 예를 들면 청색으로 변형시킬 수도 있다.

역으로 말하면, 꽃잎에서 플라본의 합성을 억제함으로써 꽃의 색상을, 예를 들어 적색으로 변형시키는 것이 가능하다. 그러나, 플라본은 꽃의 색상에 대해 무수한 효과를 나타내므로, 꽃의 색상 변화가 본원에 언급된 것들로 제한되지 않는다. 현 기술 수준에 따르면, 유전자를 특정 식물에 도입하고 이러한 유전자를 구성적 또는 조직-특이적 방식으로 발현시키는 것이 가능한 반면, 안티센스 방법 또는 보조억제 방법에 의해 표적 유전자의 발현을 억제시키는 것도 가능하다.

형질전환 가능한 식물의 예로는 장미, 국화속 식물, 카네이션, 금어초, 시클라멘, 난초, 대초원산-용담속 식물, 프리지어, 솜나물, 글라디올러스, 대나물, 칼란쵸(kalanchoe), 백합, 양아욱속, 제라늄, 페투니아, 토레니아, 튤립, 벼, 보리, 밀, 평지, 감자, 토마토, 포플라, 바나나, 유칼립투스, 고구마, 대두, 자주개자리, 루핀(lupin), 옥수수 등이 언급될 수 있지만, 이들로 제한되는 것은 아니다.

플라본은 상기 언급된 바와 같이 각종 생물학적 활성을 지니기 때문에, 이들은 식물에게 새로운 생물학적 활성 또는 경제적 가치를 부여할 수 있다. 예를 들면, 플라본을 생성시키는 유전자를 뿌리에서 발현시킴으로써, 식물에 유익한 미생물의 성장을 증진시켜 식물의 성장을 개선시킬 수 있다. 또한, 사람, 동물 또는 곤충에게서 생물학적 활성을 나타내는 플라본을 합성하는 것이 가능하다.

본 발명의 목적은 플라본 신타제 유전자, 바람직하게는 플라본 신타제 II 유전자, 더욱 바람직하게는 플라바논으로부터 직접적으로 플라본을 합성하는 활성을 지니고 있는 플라본 신타제에 대한 유전자를 제공하는 것이다. 이와 같이 수득된 플라본 신타제 유전자를 식물 내로 도입하고 과발현시켜 꽃의 색상을 변화시킬 수 있다.

더욱이, 천연적으로 다량의 플라본을 함유하는 꽃의 꽃잎에서는, 안티센스 방법 또는 동시억제 방법에 의해 플라본 신타제 유전자의 발현을 조절하여 또한 꽃의 색상을 변화시킬 수 있는 것으로 예측된다. 또한, 플라본 신타제 유전자를 적절한 기관 내에 발현시키는 것은, 플라본의 항균 활성과 이들과 토양 미생물과의 상호작용 측면에서, 근권(rhizosphere) 미생물과의 개선된 공생으로 인한 콩과 식물의 질소 고정 능력 향상과 식물의 항균성 증가 뿐만 아니라 자외선과 빛에 대한 보호 효과도 가져다 줄 것이다.

따라서, 본 발명은 플라바논으로부터 직접적으로 플라본을 합성할 수 있는 단백질을 암호화하는 유전자를 제공한다. 이러한 유전자는, 구체적으로 단일-효소 반응에 의해 플라바논으로부터 플라본을 합성할 수 있는 플라본 신타제 II를 암호화하는 유전자이다("플라본 신타제 II"로서 후술됨).

보다 구체적으로 언급하면, 본 발명은 서열 목록의 서열 2, 4 또는 8에 제시된 바와 같은 아미노산 서열을 갖고 플라바논으로부터 플라본을 합성하는 활성을 보유하는 P450 단백질을 암호화하는 유전자, 또는 상기 아미노산 서열에서 하나 이상의 아미노산의 부가 또는 결실 및/또는 상이한 아미노산으로의 치환에 의해 변형된 아미노산 서열을 갖고 플라바논으로부터 플라본을 합성하는 활성을 보유하는 단백질을 암호화하는 유전자를 제공한다.

본 발명은 추가로, 서열 목록의 서열 2, 4 또는 8에 제시된 바와 같은 아미노산 서열과 55% 이상의 동일성을 지닌 아미노산 서열을 갖고 플라바논으로부터 플라본을 합성하는 활성을 보유하는 단백질을 암호화하는 유전자를 제공한다.

본 발명은 추가로, 플라바논으로부터 플라본을 합성하는 활성을 보유하고 있는 단백질을 암호화하고 5 x SSC, 50℃의 조건하에서 서열 목록의 서열 1, 3 또는 7로서 제시된 바와 같은 뉴클레오티드 서열의 전부 또는 일부와 하이브리드화되는 유전자를 제공한다.

본 발명은 추가로, 전술된 유전자 중의 어느 하나를 함유하는 벡터, 특히 발현 벡터를 제공한다.

본 발명은 추가로, 상기 벡터로 형질전환된 숙주를 제공한다.

본 발명은 추가로, 상기 유전자 중의 어느 하나에 의해 암호화된 단백질을 제공한다.

본 발명은 추가로, 상기 숙주를 배양 또는 성장시킨 다음, 이러한 숙주로부터 플라본-합성 활성을 지닌 단백질을 수집함을 특징으로 하여, 전술된 단백질을 제조하는 방법을 제공한다.

본 발명은 추가로, 전술된 유전자 중의 어느 하나를 도입시킨 식물, 또는 동일한 특성을 나타내는 이러한 식물의 자손 또는 이의 특정 조직(예: 절단된 꽃)을 제공한다.

본 발명은 추가로, 전술된 유전자를 사용하여 플라보노이드의 양과 조성을 변화시키는 방법; 전술된 유전자를 사용하여 플라본의 양을 변화시키는 방법; 전술된 유전자를 사용하여 꽃의 색상을 변화시키는 방법; 전술된 유전자를 사용하여 꽃의 색상을 청색으로 변화시키는 방법; 전술된 유전자를 사용하여 꽃의 색상을 적색으로 변화시키는 방법; 전술된 유전자를 사용하여 식물의 감광성을 변형시키는 방법; 및 전술된 유전자를 사용하여 식물과 미생물 간의 상호작용을 조절하는 방법을 제공한다.

본 발명은 다음 실시예를 통하여 추가로 상세히 설명될 것이다. 별도로 언급하지 않는 한, 분자 생물학 방법은 문헌[참조: Molecular Cloning, Sambrook et al., 1989]에 따라서 수행한다.

실시예 1

금어초 플라본 신타제 II 유전자의 클로닝

옐로우 버터플라이(Yellow Butterfly) 금어초(Sakatano-Tane, KK의 제품명)의 어린 싹 약 5g으로부터 RNA를 추출하고, 폴리A+ RNA를 올리고텍스(Oligotex)로부터 입수한다. 이러한 폴리A+ RNA를 주형으로 사용하여, 스트라타진(Stratagene Instruction Manual, Revision #065001)이 권장하는 방법에 의해 람다 ZAPII cDNA 라이브러리 합성 키트(Stratagene)를 사용하여 cDNA 라이브러리를 제조한다. 이러한 cDNA 라이브러리는 프로브로서 완전한 길이의 cDNA CYP93B1을 사용하여 스크리닝한다. 보다 덜 엄격한 조건하에서, 동일한 회사가 권장한 방법을 기준으로 하여 DIG-DNA-표지화 및 검출 키트(Boehringer)를 사용하여 양성 클론의 스크리닝과 검출을 수행한다.

구체적으로 언급하면, 하이브리드화 완충액(5 x SSC, 30% 포름아미드, 50mM 인산나트륨 완충액(pH 7.0), 1% SDS, 2% 차단 시약(Boehringer), 0.1% 라우로일사르코신 및 80㎍/ml 연어 정자 DNA)을 사용하여 42℃에서 2시간 동안 예비하이브리드화한 후, DIG-표지된 프로브를 가하고 상기 혼합물을 밤새 유지시킨다. 상기 막을 1% SDS를 함유하는 5 x SSC 세정 용액에서 65℃ 하에 1.5시간 동안 세정한다. 1개의 양성 클론을 수득하는데 이를 ANFNS1로 명명한다. ANFNS1의 5' 말단에 있는 뉴클레오티드 서열 결정시, ANFNS1은 감초 CYP93B1에 의해 암호화된 플라바논 2-하이드록실라제와 높은 동일성을 나타내는 서열을 암호화하는 것으로 예측되며, 이는 플라바논 2-하이드록실라제의 것과 유사한 기능을 지니는 P450을 암호화하는 것으로 추정된다.

그러나, CYP93B1에 의해 암호화된 플라바논 2-하이드록실라제의 아미노산 서열과 비교한 결과, ANFNS1의 cDNA가 완전한 길이의 cDNA가 아니며, 이는 개시 메티오닌으로부터 대략 65개 아미노산 잔기에 상응하는 부분이 결여되어 있다. 따라서, 금어초 cDNA 라이브러리를 재스크리닝하기 위한 프로브로서 ANFNS1 cDNA를 사용하여 완전한 길이의 아미노산 서열을 포함하는 것으로 여겨지는 cDNA(ANFNS2)를 수득한다. 여기서 수득된 ANFNS2에 의해 암호화된 단백질은 금어초 CYP93B1에 의해 암호화된 플라바논 2-하이드록실라제와 아미노산 수준에서 53%의 동일성을 나타낸다. ANFNS2의 뉴클레오티드 서열은 서열 1로 제시하였고 이로부터 추론된 아미노산 서열은 서열 2로 제시하였다.

실시예 2

토레니아 플라본 신타제 II 유전자의 클로닝

토레니아 변종(변종명: Sunrenive, Variety Registration Application No. according to Seeds and Seedlings Law: 7433; Suntory Ltd.)의 싹 약 2g으로부터 RNA를 추출하고, 폴리A+ RNA를 올리고텍스로부터 입수한다. 이러한 폴리A+ RNA를 주형으로서 사용하여 실시예 1에서 언급된 바와 같이 스트라타진이 권장하는 방법에 의해 람다 ZAPII cDNA 라이브러리 합성 키트(Stratagene)를 사용하여 cDNA 라이브러리를 제조한다. 이러한 cDNA 라이브러리는, 전술된 CYP93B1 cDNA와 ANFNS1 cDNA의 혼합물을 프로브로서 사용하여 스크리닝한다. 실시예 1에서 기재된 바와 같이 보다 덜 엄격한 조건하에서 양성 클론의 스크리닝과 검출을 수행한다.

1개의 양성 클론이 수득되는데, 이를 TFNS5로 명명한다. TFNS5 cDNA의 완전한 뉴클레오티드 서열 결정시, TFNS5 cDNA에 의해 암호화된 단백질이 금어초 CYP93B1에 의해 암호화된 플라바논 2-하이드록실라제와 아미노산 수준에서 52%의 동일성을 나타내는 것으로 밝혀졌다. 이러한 TFNS5 cDNA는 또한, 실시예 1에서 수득된 금어초-유래된 cDNA인 ANFNS2에 의해 암호화된 단백질과 77%의 높은 동일성을 나타낸다. 이와 같이 결정된 뉴클레오티드 서열은 서열 3으로 제시하였고, 이로부터 추론된 아미노산 서열은 서열 4로 제시하였다.

실시예 3

효모에서 토레니아 플라본 신타제 II 유전자의 발현

실시예 2에서 수득된 토레니아 cDNA인 TFNS5에 의해 암호화된 단백질의 효소 활성을 검출하기 위하여 다음 실험을 수행한다. 상기 유전자의 해독된 영역을 벗어난 일부분을 변형시켜 내부에 제한 효소 부위를 도입하여, 센스 프라이머(5'-AAATAGGATCCAAGCatgGACACAGTCTTAA-3'; 밑줄친 부분=BamHI 부위; 소문자: 개시 코돈)(서열 5) 및 안티센스 프라이머(5'-CCCTTCTAGAtcaAGCACCCGATATTGTGGCCGGG-3'; 밑줄친 부분=XbaI 부위; 소문자: 종결 코돈)(서열 6)를 제조하고, 이를 PCR 반응용 KOD 폴리머라제(Toyobo)와 함께 사용한다. PCR 조건은 98℃에서 1분, 98℃에서 15초간, 55℃에서 10초간 및 74℃에서 30초간 20주기에 이어서, 74℃에서 10분이다.

이로써 생성된 PCR 생성물을 pBluescriptII SK(-)(Stratagene)의 EcoRV 부위 내로 도입한 후, 이를 제한 효소 BamHI 및 XbaI로 분해하고 효모 발현 벡터 pYES2(Invitrogen)의 BamHI-XbaI 부위에 도입한다. 이어서, 생성된 플라스미드를 BJ2168 효모(Nihon Gene) 내로 도입한다. 효소 활성은 문헌[참조: Akashi et al., FEBS Lett., 431 (1998), Akashi et al., p.287]에 기재된 방법에 의해 측정한다. 이로써 형질전환된 효모 세포를 선별성 배지(6.7mg/ml 아미노산 비함유 효모 질소 기재(Difco), 20mg/ml 글루코즈, 30㎍/ml 류신, 20㎍/ml 트립토판 및 5mg/ml 카사미노산) 20ml에서 30℃ 하에 24시간 동안 배양한다.

원심분리시켜 효모 세포를 수거한 후, 이와 같이 수거된 효모 세포를 발현 배지(10mg/ml 효모 추출물, 10mg/ml 펩톤, 2㎍/ml 헤민 및 20mg/ml 갈락토즈)에서 30℃하에 48시간 동안 배양한다. 효모 세포를 수집한 후, 이들을 물에 현탁시키고 이들을 수집함으로써 세척한다. 10분간의 파쇄를 위해 유리 비이드를 사용한 후, 상기 세포를 10분 동안 8000 x g로 원심분리시킨다. 상층액을 10분 동안 15,000 x g로 추가로 원심분리시켜 조 효소 분획을 수득한다.

(R,S)-나린게닌(2-메톡시에탄올 30㎕에 용해됨) 15㎍, 조 효소 용액 1ml 및 1mM NADPH의 혼합물(총 반응 혼합물 용적: 1.05ml)을 30℃에서 2시간 동안 반응시킨다. 아세트산 30㎕를 가함으로써 반응을 종결시킨 후, 에틸 아세테이트 1ml를 가하고 이와 혼합한다. 원심분리시킨 후, 에틸 아세테이트 층을 증발기로 건조시킨다. 잔사를 메탄올 100㎕에 용해시키고 HPLC로 분석한다. 이러한 분석은 상기 문헌[참조: Akashi et al.]에 의해 기재된 방법에 따라서 수행한다. 산 처리는 증발기로 건조시킨 샘플을 10% 염산을 함유하는 에탄올 150㎕에 용해시킨 후, 30분 동안 교반시키는 것을 포함한다. 이를 물 1.3ml로 희석시키고, 에틸 아세테이트 800㎕를 추가로 가하여 이와 혼합하고, 원심분리시킨 후, 에틸 아세테이트 층을 회수한다. 이어서, 이를 건조시키고 메탄올 200㎕에 용해시키고 HPLC로 분석한다.

감초 CYP93B1를 발현시키는 효모는 나린게닌으로부터 2-하이드록시나린게닌을 생성시키지만, 아피게닌을 전혀 생성시키지 못한다(도 1, A). 이러한 반응 혼합물을 산 처리시킨 경우에만, 2-하이드록시나린게닌으로부터 아피게닌이 생성된다(도 1, B). 이와는 달리, 토레니아 TFNS5를 발현시키는 효모는 반응 생성물의 산 처리 없이도 나린게닌으로부터 아피게닌을 생성시킨다(도 1, C). 이는 TFNS5가 플라본 신타제 II를 암호화한다는 것을 입증한다.

실시예 4

효모에서 금어초 플라본 신타제 II의 발현

ANFNS2 cDNA를 BamHI 및 SphI로 분해함으로서 수득된 대략 1400bp의 DNA 단편, 상기와 동일한 것을 SphI 및 BamHI로 분해함으로써 수득된 대략 350bp의 DNA 단편, 및 BamHI 및 XhoI로 분해된 pYES2를 연결하여 플라스미드를 수득한 다음, 이를 실시예 3에 기재된 바와 동일한 방법에 의해 효모 내로 도입한다. 이로써 생성된 재조합 효모 세포를 사용하여, 실시예 3에서와 동일한 방법에 의해 플라본 합성 활성을 측정한다. 금어초-유래된 ANFNS2를 발현시키는 효모는 산 처리 없이도 아피게닌을 생성시키는데, 이로써 ANFNS2가 플라본 신타제 II를 암호화한다는 것이 입증된다.

실시예 5

식물에서 발현 벡터의 작제

실시예 2에서 수득된 토레니아 cDNA인 TFNS5를 식물 내로 도입하기 위한 식물 발현 벡터를 작제한다. pBE2113-GUS[참조: Plant Cell Physiol., 37 (1996), Mitsuhara et al., p.49]를 SacI로 분해한 후, 블런팅 키트(blunting kit; Takara)를 사용하여 말단을 평활하게 한 후, XhoI 링커(Toyobo)를 삽입한다. 이어서, 이로써 생성된 플라스미드를 HindIII 및 EcoRI로 분해하고, 대략 3kb의 DNA 단편을 회수한다. 이러한 DNA 단편을 바이너리 벡터(binary vector) pBINPLUS의 HindIII/EcoRI 부위에 연결하여 pBE2113'를 제조한다. 여기서 사용된 벡터 pBINPLUS는 문헌[참조: Transgenic Research, 4 (1995), van Engelen et al., p.288]에 보고된 방법으로, 아그로박테리움(Agrobacterium) 세포를 사용하여 유전자를 식물 내로 도입하는데 광범위하게 사용되는 바이너리 벡터 Bin19[참조: Nucl. Acids Res., 12 (1984), Bevan, p.8711]를 변형시킴으로써 수득한다.

TFNS5 cDNA를 BamHI/XhoI로 절단함으로써 SK(-) 벡터로부터 절단하고, 이로써 수득된 대략 1.7kb의 단편을 전술된 바이너리 벡터 pBE2113'의 BamHI/XhoI 부위에연결한다. 이로써 수득된 작제물인 pSPB441은 인핸서 서열의 이중 반복체를 갖는 35S 콜리플라워(cauliflower) 모자이크 바이러스 프로모터의 조절하에 센스 방향으로 TFNS5 cDNA를 발현시킨다[참조: Plant Cell Physiol., 37 (1996), Mitsuhara et al., p.49].

실시예 6

토레니아 꽃의 색상의 변화

토레니아 변종(변종명: Sunrenive, Variety Registration Application No. according to Seeds and Seedlings Law: 7433; Suntory Ltd.)을 문헌[참조: Breeding Science, 45 (1995), Aida et al., p.71]의 방법에 따라서 상기 실시예 5에서 작제한 pSPB441로 형질전환시킨다. 수득된 형질전환체의 95% 이상이 모 균주의 꽃의 색상이 짙은 자주색에서 밝은 자주색으로 변화된 것으로 나타났다. 4개의 꽃잎 중에서 좌측과 우측 꽃잎 색상을 측정한다. 모 균주의 꽃잎 색상이 기준(Royal Horticultural Society Color Chart)에 따라서 89A번인 반면, 상기 형질전환체의 전형적인 꽃잎 색상은 82C, 87D, 87C, 88D, 91A 등이다. 이들 결과는 TFNS5를 식물 내로 도입하게 되면 꽃의 색상을 변화시킬 수 있다는 것을 지시한다.

형질전환된 개체에서, 플라본의 양이 숙주의 플라본 양의 1/5 내지 1/10의 범위인 반면, 안토시아닌의 양은 숙주의 안토시아닌 양의 약 1/3로 감소되었다. 또한, 숙주에서는 검출되지 않았던 플라본 생합성 전구체인 플라바논(나린게닌, 에리오딕티올 및 펜타하이드록시플라바논)이 검출된다.

실시예 7

페투니아에서 플라본 신타제의 발현

플라스미드 pSPB441을 문헌[참조: Plant Cell, 2, (1990), Napoli et al., p.279]의 방법에 따라서 페투니아 변종(변종명: Revolution Violet Mini; Variety Registration Application No. according to Seeds and Seedlings Law: 9217; Suntory Ltd.) 내로 도입한다. 이로써 생성된 형질전환체 중 2개에서 꽃의 색상 변화가 일어났는데, 여기서 꽃의 색상은 모 균주의 것 보다 더 밝다. 모 균주의 꽃의 색상은 기준(Royal Horticultural Society Color Chart)에 따라서 88A번인 반면, 형질전환체에서는 87A번이다. 또한, 모 균주에서는 플라본이 전혀 검출되지 않은 반면, 형질전환된 균주에서는 플라본인 루테올린이 검출된다.

실시예 8

페릴라 플라본 신타제 II 유전자의 클로닝

실시예 1에 기재된 방법을 사용하여, 벡터로서 λgt10(Stratagene)을 사용하여 문헌[참조: Plant Mol. Biol., 35(1997), Gong et al., p.915]의 방법에 따라서 적색 페릴라(Perilla frutescens)의 잎들로부터 제조된 cDNA 라이브러리를 스크리닝한다. 문헌[참조: Gong etal., Plant Mol. Biol., 35(1997), Gong et al., p.915]의 방법에 따라서, 배양, DNA 제조 및 생성된 파아지 클론 #3의 서브클로닝을 수행하고, 뉴클레오티드 서열을 결정하고 이를 서열 7로 제시하였다. 이러한 뉴클레오티드 서열에 의해 암호화된 추론된 아미노산 서열은 서열 8로 제시하였다. 상기 아미노산 서열은 TFNS5 및 ANFNS2와 각각 76% 및 75%의 동일성을 나타낸다. 이는 또한 CYP93B1과 52%의 동일성을 나타낸다.

실시예 9

효모에서의 페릴라 플라본 신타제 II 유전자의 발현

실시예 8에서 수득된 파아지 클론 #3을, 람다 암 프라이머(Lamda Arm Primer; Stratagene)을 사용하여 실시예 3에 기재된 방법에 의해 PCR용 주형으로서 사용한다. 이와 같이 증폭시킨 DNA 단편을 pBluescript KS(-)의 EcoRV 부위에 서브클로닝시킨다. pBluescript KS(-)의 SalI 부위 상에 페릴라 플라본 신타제 II cDNA의 개시 코돈을 갖는 클론을 선별하고, 이를 pFS3으로 명명한다. pFS3의 cDNA 삽입물의 뉴클레오티드 서열을 결정하고, PCR을 수행하여 오류가 없음을 확인한다.

pFS3을 SalI 및 XbaI로 분해함으로써 수득된 대략 1.8kb의 DNA 단편을, XhoI 및 XbaI로 분해한 pYES2(실시예 3)과 연결시켜 pYES3으로 명명된 플라스미드를 수득하고, 이를 실시예 3에 기재된 방법에 의해 효모 BJ2168 내로 도입한다. 이러한 재조합 효모의 플라본 신타제 활성을 실시예 3에 기재된 방법에 의해 측정한 경우, 나린게닌으로부터의 아피게닌의 생성이 확인되는데, 이는 페릴라 파아지 클론 #3 cDNA가 플라본 신타제 II 활성을 지닌 단백질을 암호화한다는 것을 지시한다.

본 발명의 cDNA를 적절한 식물 발현 벡터에 연결하고 이를 식물 내로 도입하여 플라본 신타제를 발현시키거나 발현을 억제시킴으로써 꽃의 색상을 변화시키는 것이 가능하다. 더우기, 이러한 플라본 신타제 유전자를 꽃잎에서 뿐만 아니라 식물 전체 또는 이의 적절한 기관에서 발현시킴으로써, 식물의 미생물에 대한 내성을 증가시키거나 또는 근권 미생물과의 연합을 증진시킴으로써 콩과 식물의 질소 고정 능력을 개선시킬 뿐만 아니라 자외선과 빛에 대한 식물의 보호 효과도 개선시킬 수 있다.

Claims

플라바논으로부터 플라본을 합성하는 활성을 지닌 단백질을 암호화하는 유전자.
제1항에 있어서, 플라본 신타제 II를 암호화하는 유전자.
제1항 또는 제2항에 있어서, 서열 목록의 서열 2, 4 또는 8에 제시된 바와 같은 아미노산 서열을 가지며 플라바논으로부터 플라본을 합성하는 활성을 나타내는 단백질을 암호화하는 유전자, 또는 상기 아미노산 서열이 하나 이상의 아미노산의 부가 또는 결실 및/또는 상이한 아미노산으로 하나 이상 치환되어 변형된 아미노산 서열 중의 하나를 가지며 플라바논으로부터 플라본을 합성하는 활성을 보유하는 단백질을 암호화하는 유전자.
제1항 내지 제3항 중의 어느 한 항에 있어서, 서열 목록의 서열 2, 4 또는 8로서 제시된 아미노산 서열과 55% 이상의 동일성을 나타내고 플라바논으로부터 플라본을 합성하는 활성을 보유하는 유전자.
제1항 내지 제4항 중의 어느 한 항에 있어서, 5 x SSC, 50℃의 조건하에 서열 목록의 서열 1, 3 및 7로서 제시된 염기 서열 중의 어느 하나의 전부 또는 일부와 하이브리드화되고, 플라바논으로부터 플라본을 합성하는 활성을 보유하는 단백질을 암호화하는 유전자.
제1항 내지 제5항 중의 어느 한 항에 따르는 유전자를 포함하는 벡터.
제6항에 따르는 벡터에 의해 형질전환된 숙주.
제1항 내지 제5항 중의 어느 한 항에 따르는 유전자에 의해 암호화된 단백질.
제7항에 따르는 숙주를 배양 또는 성장시키고 이러한 숙주로부터 단백질을 회수함을 특징으로 하여, 플라본-합성 활성을 지닌 단백질을 제조하는 방법.
제1항 내지 제5항 중의 어느 한 항에 따르는 유전자를 도입시킨 식물, 또는 동일한 특성을 나타내는 상기 식물의 자손 또는 이의 조직.
제10항에 따르는 식물 또는 동일한 특성을 갖는 이의 자손으로부터 절단한 꽃.
제1항 내지 제5항 중의 어느 한 항에 따르는 유전자를 사용하여 플라보노이드 조성 및/또는 이의 양을 변화시키는 방법.
제1항 내지 제5항 중의 어느 한 항에 따르는 유전자를 사용하여 플라본의 양을 변화시키는 방법.
제1항 내지 제5항 중의 어느 한 항에 따르는 유전자를 사용하여 꽃의 색상을 변화시키는 방법.
제1항 내지 제5항 중의 어느 한 항에 따르는 유전자를 사용하여 꽃의 색상을 청색화하는 방법.
제1항 내지 제5항 중의 어느 한 항에 따르는 유전자를 사용하여 꽃의 색상을 적색화하는 방법.
제1항 내지 제5항 중의 어느 한 항에 따르는 유전자를 사용하여 식물의 감광성을 변화시키는 방법.
제1항 내지 제5항 중의 어느 한 항에 따르는 유전자를 사용하여 식물과 미생물 간의 상호작용을 조절하는 방법.