CN105400805A - 一个参与桃果实脂肪酸形成的基因及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一个来源于桃果实的基因PpFAD3-1，具有SEQ:NO.1所示的核苷酸序列。通过PCR扩增获得PpFAD3-1全长序列。在酵母中进行的体外功能验证表明，PpFAD3-1可以将亚油酸转化为亚麻酸(18:3)，具有ω-3脂肪酸去饱和酶功能。在烟草中过量表达PpFAD3-1，转基因植株的亚油酸含量显著下降而亚麻酸含量则增加，脂肪酸组分发生显著变化。同时，转基因烟草的香气物质组分和抗冷性也发生了变化。主要表现为转基因烟草的己醛含量显著降低，导致了己烯醛和己醛比例显著提高；过量表达PpFAD3-1的转基因植株在低温下的存活率显著高于非转基因烟草。

Description

一个参与桃果实脂肪酸形成的基因及其应用

技术领域

本发明属于植物分子生物技术和基因工程领域，涉及一个参与桃果实脂肪酸形成的基因及其应用。

背景技术

果实香气是桃的重要感官品质之一，不仅是直接影响消费者食用前的购买行为，且协同影响食用时的味觉感受，从而影响对桃果实的综合评价。来源于脂肪酸途径的己烯醛具有青香型的香气特征，是桃果实的特征香气之一。研究显示脂肪酸，尤其是不饱和的亚麻酸是果实香气物质生物合成的重要前体物质。通过亚麻酸处理番茄和猕猴桃等果肉组织可以显著促进己烯醛等香气物质的生物合成。同时，在番茄中过量表达脂肪酸去饱和酶基因FAD，果实亚麻酸含量显著增加，香气物质己烯醛含量亦显著增加。因此，通过改变植物组织的亚麻酸等底物供应，能显著影响香气物质含量。

作为脂肪酸重要组分的亚麻酸亦影响桃果实的低温适应性，进而对低温下的贮藏品质和货架品质产生影响。在低温、高盐和干旱等非生物逆境胁迫下，植物体中亚麻酸的含量增加，以维持膜的流动性和稳定性，降低逆境对膜结构和功能的损害。不饱和脂肪酸亚麻酸含量在应对低温胁迫过程中具有重要作用，因此提高亚麻酸含量有利于减轻植物组织冷害和冻害等低温伤害症状。

同时，桃果实中的亚麻酸可作为人类必须脂肪酸的补充来源。亚麻酸与人类生命活动息息相关，它是调节血脂的功能因子，其在人体内可代谢生成二十二碳六烯酸(DHA)和二十碳五烯酸(EPA)。实验证明，亚麻酸可用于治疗和预防心脑血管疾病，并在抗癌、抗氧化、延缓衰老、免疫调节等方面具有重要的生理作用。富含亚麻酸的植物既可作为食用油以满足人体脂肪酸的摄入需求，也可用于生产药品、保健食品，具有广阔的开发应用前景。

鉴别出参与桃果实亚麻酸生物合成相关的脂肪酸去饱和基因，对于阐明桃果实香气品质形成以及低温抗性具有重要意义，且可用于其他作物基于基因工程技术的脂肪酸组分及香气品质改良，对提高食物中的亚麻酸含量，增加风味品质和提高低温等环境适应性，具有重要应用价值。

发明内容

本发明的目的是提供一个参与桃果实脂肪酸形成的基因，是一个来源于桃的ω-3脂肪酸去饱和酶基因PpFAD3-1，具有SEQ:NO.1所示的核苷酸序列。

本发明的另一个目的是提供所述的PpFAD3-1基因在植物中的遗传转化中的用途。利用基因工程技术将PpFAD3-1_SK重组载体转化普通烟草，获得的转基因烟草植株相较于野生型植株，亚油酸含量显著降低而亚麻酸含量显著增加。通过改变脂肪酸的组分，过表达桃FAD3-1的转基因烟草香气物质组分发生显著改变，同时显著提高了转基因烟草植株在低温环境下的存活能力。

本发明提供的基因特征功能如下：

1.基因表达特征：随着桃果实成熟，PpFAD3-1表达持续增加，基因表达与果实不饱和脂肪酸亚麻酸的积累呈正相关关系。

2.基因功能特征：(1)在酿酒酵母中表达pYES-PpFAD3-1重组载体，通过饲喂底物亚油酸(18:2)产生了野生酿酒酵母中不存在的亚麻酸(18:3)，证明PpFAD3-1的编码蛋白能将亚油酸转化为亚麻酸。(2)利用基因工程技术获得过量表达PpFAD3-1的转基因烟草植株，显著降低了叶片组织的亚油酸含量显著，同时显著增加了亚麻酸含量。(3)过量表达PpFAD3-1的转基因烟草植株，显著减少了青香型香气物质己醛的含量，增加了己烯醛含量；(4)通过PpFAD3-1的过量表达，转基因烟草植株在低温下的存活率得到了显著提高，增加了烟草植株的抗冷性。

本发明提供一个来源于桃果实的基因PpFAD3-1。通过PCR扩增获得PpFAD3-1全长序列。在酵母中进行的体外功能验证表明，PpFAD3-1可以将亚油酸转化为亚麻酸(18:3)，具有ω-3脂肪酸去饱和酶功能。在烟草中过量表达PpFAD3-1，转基因植株的亚油酸含量显著下降而亚麻酸含量则增加，脂肪酸组分发生显著变化。同时，转基因烟草的香气物质组分和抗冷性也发生了变化。主要表现为转基因烟草的己醛含量显著降低，导致了己烯醛和己醛比例显著提高；过量表达PpFAD3-1的转基因植株在低温下的存活率显著高于非转基因烟草。

附图说明

图1：桃果实的PpFAD3-1表达增强伴随有亚麻酸含量的增加。

图2：真核表达结果显示PpFAD3-1的编码蛋白催化亚麻酸合成；其中16:0-棕榈酸；16:1-棕榈油酸；16:2-十六碳二烯酸；17:0-十七烷酸；18:0-硬脂酸；18:1-油酸；18:2-亚油酸；18:3-亚麻酸。

图3：过量表达PpFAD3-1显著改变烟草的脂肪酸组分。

图4：过量表达PpFAD3-1显著改变烟草的香气物质含量。

图5：过量表达PpFAD3-1的显著增加烟草植株低温条件下的存活率。

具体实施方式

下面结合具体实施例和附图对本发明做进一步阐述，但实施例不限制本发明的保护范围。

实施例1：PpFAD3-1基因克隆

(一)实验方法

以拟南芥中具有ω-3脂肪酸去饱和功能的AtFAD3氨基酸序列为参考序列，应用blastp算法在桃基因组数据库PeachGenomeV1.0中，查找桃的同源序列，选取匹配度最高的序列，设计引物对SEQ:NO.2和SEQ:NO.3，以桃cDNA为模板，进行PCR扩增获得PpFAD3-1序列SEQ:NO.1，并进行测序验证。PCR反应体系为50μl，成分分别为：0.5μlTaq酶(Roche)，5μl缓冲液(10×)，4μldNTP(2.5mM)，上下游引物(10μM，Invitrogen)各2μl，4μlcDNA，32.5μlH₂O。RT-qPCR反应程序为95℃反应5min；95℃反应30s，58℃反应30s，72℃延伸1.5min，35个循环；最后72℃延伸7min，4℃保存。

(二)实验结果

经测序验证，获得与桃果实基因组数据库相匹配的PpFAD3-1序列SEQ:NO.1。

实施例2：桃果实PpFAD3-1基因表达和亚麻酸含量的检测

(一)实验方法

1.桃果实材料

桃果实商业成熟度采收后置于20℃贮藏3d和6d，果肉组织经液氮冻存后存放于-80℃冰箱待用。设置了3个生物学重复，每个重复5个果实。

2.RNA提取和cDNA合成

利用CTAB法提取桃果实总RNA，用TURBODNaseKit(Ambion)试剂盒去除基因组DNA污染后，取1.0μgRNA按iScriptcDNASynthesisKit(Bio-Rad)试剂说明书操作合成cDNA。

3.实时定量PCR(qPCR)分析基因表达

以桃PpTEF2(SEQ:NO.14)为内参基因，引物为SEQ:NO.15和SEQ:NO.16，PpFAD3-1引物为SEQ:NO.4和SEQ:NO.5。qPCR反应体系包括10μlSsofastEvaGreenSupermix(Bio-Rad)，上下游引物(10μM)各1μl，2μlcDNA，6μlH₂O。反应程序为95℃反应3min；95℃反应10s，60℃反应30s，45个循环。所用仪器为Bio-RadCFX96实时荧光定量PCR仪，每次检测都包括以H₂O作反应模板的阴性对照。

4.桃果实脂肪酸含量分析

桃果实样品用液氮研磨后，转移至50ml离心管中，加入15ml正己烷：异丙醇(v:v＝3:2)溶液和7.5mlNa₂SO₄溶液(m:v＝0.67％)，经过10000g和4℃条件下离心10min后，加入100μl十七烷酸(17:0)作为内标。45℃旋转蒸干溶液，然后加入3ml甲酯化溶液(甲醇：甲苯：浓H₂SO₄＝88:10:2)，涡旋混匀后将其加入4ml带盖玻璃小瓶中，80℃水浴1h，进行甲酯化反应。完成后，加入1ml正庚烷，颠倒混匀，充分静置后，吸取上层300μl上层溶液，加入约0.5g无水硫酸钠，除去多余水分，再用0.22μm有机滤膜除去杂质后进行GC检测。检测所用色谱柱为DB-Wax(30m×0.25mmID，0.25μm)，升温程序为50℃，1min，然后以25℃/min的速率升至200℃，以3℃/min的速度升至230℃，保持3min。

(二)实验结果

PpFAD3-1表达随着桃果实成熟衰老显著增加，伴随有亚麻酸含量的显著增加(图1)。

实施例3：酿酒酵母异源表达PpFAD3-1

(一)实验方法

1.重组载体构建和酵母转化

结合引物对SEQ:NO.6和SEQ:NO.7，利用PCR技术扩增获得PpFAD3-1，PCR体系及反应程序同实施例1。PCR产物和目标载体(pYES2NT/C，Invitrogen)用限制性内切酶BamHI和EcoRI酶切后，分别连接，转化大肠杆菌，挑取阳性菌落后测序验证。将序列确认正确的质粒利用LiAC法(Clontech)转化至酿酒酵母株系INVSc1。

2.诱导表达

挑取3个单菌落于15mlSD–Ura+glucose培养液，在30℃，250rpm摇床上培养至OD₆₀₀为0.4～0.5。将菌液转移至离心管中，离心5min后弃上清，然后加入50mlSD–Ura+galactose悬浮菌体。加入10μl亚油酸标准品(Sigma)，NP-40(鼎国)500μl，培养24h。离心收集菌体后，加入1ml无菌水，12000rpm离心30s，弃上清，然后将收集的菌体于-80℃保存。

3.脂肪酸检测

将收集的菌体用液氮研磨，转移至10ml离心管中，加入5ml正己烷：异丙醇(v:v＝3:2)溶液和2.5mlNa₂SO₄溶液(m:v＝0.67％)，提取过程、甲酯化和检测过程同实施例2中的“桃果实脂肪酸分析”，所添加的内标十七烷酸(17:0)浓度调整为4mg·ml^-1，添加50μl。

(二)实验结果

在酿酒酵母中诱导PpFAD3-1_pYES重组载体表达，以亚油酸(18:2)为底物进行喂食，产生了野生型酿酒酵母中不存在的亚麻酸(18:3)(图2)，证明PpFAD3-1编码的去饱和酶具有ω-3去饱和功能，参与了亚麻酸的生物合成。

实施例4：转基因烟草过量表达PpFAD3-1促进了亚麻酸合成并改变了香气物质含量

(一)实验方法

1.载体构建

结合引物对SEQ:NO.11和SEQ:NO.12，利用PCR技术扩增获得PpFAD3-1，PCR体系及反应程序同实施例1。PCR产物和目标载体(pGreen002962-SK)用限制性内切酶BamHI和EcoRI酶切后，分别连接，转化大肠杆菌，挑取阳性菌落后测序验证，将序列确认正确的质粒利用电击法转化农杆菌株系GV3101::pSoup。

2.转基因植株鉴定

经基因工程技术转化普通烟草获得转化植株后，需要进一步通过PCR和qPCR手段进行验证。利用CTAB法提取烟草叶片DNA，利用所得的DNA做模板，结合引物对SEQ:NO.15和SEQ:NO.16，用PCR进行转基因植株鉴定。

取经过PCR鉴定的植株叶片，利用TRIzol(Invitrogen)提取烟草总RNA，合成cDNA过程如实施例1所述。RT-qPCR检测中，PpFAD3-1引物对为SEQ:NO12和SEQNO.13，以普通烟草EF1-α基因(SEQ:NO.17)作为内参基因，引物为SEQ:NO.18和SEQ:NO.19。RT-qPCR反应体系和反应程序同实施例1。

3.脂肪酸和香气物质检测

充分研磨的烟草叶片用于脂肪酸检测，提取和检测过程同实施例2。

取1g烟草叶片加入1mlCaCl₂溶液和EDTA-2Na溶液，再加入辛醇(0.07μg·μl^-1)作为内标，涡旋混匀后用GC-MS(Agilent，7890-5975)自动进样仪进行样品香气测定。分离柱为DB-Wax毛细管色谱柱(0.25mm，30m，0.25μm，J&WScientific)。温度程序为40℃升温到150℃后保持2min再以10℃·min^-1升温至220℃，以氦气1.0ml·min^-1为载气。

(二)实验结果

与野生的烟草植株相比，过量表达PpFAD3-1的转基因烟草植株亚油酸(18:2)含量显著降低，而亚麻酸含量(18:3)显著增加(图3)，证明PpFAD3-1编码的蛋白在植物体内也具有ω-3脂肪酸去饱和功能，参与了亚麻酸的生物合成。同时，过量表达PpFAD3-1改变了烟草叶片的香气组成。主要表现为转基因烟草的己醛含量减少，己烯醛含量增加，己烯醛和己醛含量比值显著增加(图4)。

实施例5：转基因烟草过量表达PpFAD3-1提高低温下的植株存活率

(一)实验方法

1.载体构建和转基因植株鉴定

实验方法见实施例3。

2.低温处理和存活率统计

转基因和非转基因的烟草植株在-5℃低温处理6d后，转移到20℃恢复7d，统计植株的存活率并拍照记录。

(二)实验结果

过量表达PpFAD3-1的转基因烟草植株，经过低温处理后的植株存活率约为93％，显著高于非转基因植株的18％(图5)，表明在烟草中过量表达桃果实的PpFAD3-1基因增强了植株的低温抗性。

对于本领域普通技术人员来说，可以根据上述说明加以改进或变换，而所有这些改进和变换都应属于本发明所附权利要求的保护范围。

Claims (2)

1.一个参与桃果实脂肪酸形成的基因，其特征在于，该基因是一个来源于桃的ω-3脂肪酸去饱和酶基因PpFAD3-1，具有SEQ:NO.1所示的核苷酸序列。

2.根据权利要求1所述的一个参与桃果实脂肪酸形成的基因在植物中的遗传转化中的应用。