CN103045642B - 一种培育富含花青苷烟草的方法及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明提供一种培育富含花青苷烟草的方法。以杨梅果实中已确认的可调控花青苷合成的两个基因MrMYB1和MrbHLH1重组，构建成表达质粒，采用烟草叶片瞬时表达技术筛选可调控花青苷合成的基因，将确认功能的基因转化到烟草，培育出富含花青苷的烟草。本发明提供了一种培育富含花青苷烟草的方法，使得减轻吸烟带来的健康危害成为可能。本方法同样适用于杨梅以外的MYB和bHLH基因。
Description
技术领域
本发明属于植物分子生物技术和基因工程领域，涉及一种培育富含花青苷烟草的方法及其应用。
背景技术
吸烟严重影响人体健康。吸烟不仅可诱导心血管病、慢性肺病和癌症，而且会增加传染病的发生概率，直接导致严重流行性感冒、侵入性肺炎和结核病的发病几率上升；引起众多的生殖并发病，包括不育、自发性流产、婴儿体重过轻和夭折等综合症状；使人体产生胰岛素抗性，是糖尿病发病的重要因素，而且会加速吸烟者患血管病的进程；还会影响手术后身体的恢复，包括延缓伤口愈合和增加伤口感染的几率等。
随着人们健康观念的不断提升，发达国家中烟民的数量有所减少，然而在较多发展中国家中，仍有超过40% 人口的烟民。多数烟民都有严重的烟瘾，从而无法通过戒烟来避免吸烟引起的疾病。对于这部分烟民来说，选择含较少有害物质的烟草可能是一个可行的策略。
花青苷属于黄酮类化合物，广泛存在于绝大部分陆生植物的液泡中，是红色、蓝色和紫色色泽的主要构成物。花青苷具有多种重要功能。除作为天然色素外，花青苷还具有很强的抗氧化、清除氧自由基的能力，是具有保健功能的天然活性物质，被誉为继水、蛋白质、脂肪、碳水化合物、维生素、矿物质之后的第七大必需营养。长期以来，花青苷已成为植物营养素或食品健康的重要标志。由于其具有极高的抗氧化活性，花青苷对心血管疾病、神经元和衰老相关疾病和癌症等均具一定预防功效。本实验室研究发现，杨梅果实中花青苷等酚类物质的含量与抗氧化活性呈显著正相关关系，其中矢车菊素-3-O-葡萄糖苷是杨梅果实中主要的抗氧化物质；通过口服糖耐量试验(OGTT)发现，杨梅果实花青苷粗提物可显著降低大鼠血糖，改善糖尿病鼠的糖耐量能力；杨梅果实花青苷可抑制肿瘤细胞MMP-2蛋白的表达，从而抑制胃癌肿瘤细胞的活性。此外，花青苷还可有效抑制肥胖和降低血脂，改善血糖平衡，促进视紫红质再生进而增强视力敏锐性，预防大脑中枢栓塞和缺血症状。因而花青苷成为天然色素中最具有发展前景的一类色素。
花青苷的代谢途径已较为透彻，目前研究已达到转录调控的水平。即在花青苷的合成代谢过程中，相关的合成基因呈现较严格的时间和空间上的协同表达现象，经研究发现，这种现象是由转录调控基因统一调节的。花青苷合成相关的转录调控基因主要涉及三大转录因子家族，分别是R2R3-MYB转录因子、basic helix-loop-helix（bHLH）转录因子和WD40蛋白。由这三大转录因子构成的MYB-bHLH-WD40（MBW）转录复合体，对花青苷生物合成的后期合成基因的表达的转录调控尤为显著。其中，MBW 转录复合体中MYB 和bHLH 转录因子对花青苷的合成调控较为特异。
发明内容
本发明的目的是提供一种培育富含花青苷烟草的方法，使得减轻吸烟带来的健康危害成为可能。以杨梅果实中已确认可调控花青苷合成的MrMYB1 和MrbHLH1为例，对该发明方法进行具体阐述。本发明方法同样适用于杨梅以外其他可调控花青苷合成的MYB 和bHLH 基因。
本发明的具体实施步骤如下：
1、表达载体构建：根据已确认的MrMYB1（SEQ：NO. 1）的序列全长设计含限制性内切酶酶切位点的引物对SEQ：NO. 2和SEQ：NO. 3，根据已确认的MrbHLH1（SEQ：NO. 4）的序列全长设计含限制性内切酶酶切位点的引物对SEQ：NO. 5和SEQ：NO. 6。以杨梅成熟果实cDNA为模板，PCR扩增两个基因的开放性阅读框，产物经1%琼脂糖凝胶电泳，回收后经相应限制性内切酶处理，酶切产物再次用1%琼脂糖凝胶电泳，回收，然后连接到同样经相应限制性内切酶处理的pGreenII SK表达载体上，分别进行MrMYB1和MrbHLH1过量表达载体的构建。
2、双价表达载体的构建：首先以表达质粒pGreenII SK为模板，设计引物对SEQ：NO. 8和SEQ：NO. 9扩增CaMV 加尾信号序列，引物对SEQ：NO. 10和SEQ：NO. 11扩增35S启动子序列。以‘荸荠’种杨梅的cDNA为模板，引物对SEQ：NO. 12和SEQ：NO. 13扩增MrMYB1的开放性阅读框片段，引物对SEQ：NO. 14和SEQ：NO. 15扩增MrbHLH1的开放性阅读框片段。第二轮PCR时，不加引物，扩增出融合这些片段的中间产物；最后一轮PCR，以中间产物为模板，SEQ：NO. 8和SEQ：NO. 15为引物对，扩增出融合的MrMYB1 - CaMV term - CaMV 35S - MrbHLH1片段。将所得融合片段插入到的表达质粒pGreenII SK的多克隆位点内，完成双价表达载体的构建。
将重组的表达质粒用电穿孔的方法转化到GV3101::pSoup农杆菌感受态细胞中，筛选阳性克隆保存成甘油农杆菌形式，用于进一步的烟草瞬时表达和转基因实验。
3、基因的功能预测：将存放于-80oC的各个甘油农杆菌划线接种于含25 μg/ml庆大霉素、5 μg/ml四环素和50 μg/ml卡那霉素的LB固体培养基上，28oC培养48 h，挑取少量菌落涂布到另一个含相同抗生素的LB固体培养基上，28oC培养24 h。用10 mM MgCl2，10 mM生物缓冲液（MES），150 mM 乙酰丁香酮，pH 为5.6的渗透液悬浮，使其OD600为0.2。含不同基因的菌株渗透液分别于含p19质粒的菌株渗透液等比例混匀，然后用无针头注射器将渗透液注入6周大的、有6-8片真叶的普通烟草叶片中，注射部位为远离叶片中心叶脉的表皮细胞内。烟草于16h：8h光暗周期、25oC、75%空气湿度的条件下培养8天后，观察叶片的注射部位有无花青苷的积累，依此鉴定注射的基因有无调控花青苷合成的功能。
4、烟草转基因技术：将含有烟草叶片瞬时表达技术筛选的可调控花青苷合成的基因的甘油农杆菌划线接种于含25 μg/ml庆大霉素、5 μg/ml四环素和50 μg/ml卡那霉素的LB固体培养基上，28oC培养48 h，挑取少量菌落涂布到另一个含相同抗生素的LB固体培养基上，28oC培养24 h。刮取少许菌落置于含25 μg/ml庆大霉素、5 μg/ml四环素和50 μg/ml卡那霉素的LB液体培养基中，28oC 100 rpm过夜培养。室温、5000 rpm离心收集菌落，用烟草转基因浸染液悬浮后备用。取无菌烟草组织培养苗的幼嫩真叶叶片，置于浸染液中，并切成2-3 mm长宽的叶片。将叶片上的农杆菌菌液用无菌滤纸吸干后，置于共培养基上培养2天，然后将叶片依次置于不定芽诱导培养基和根诱导培养基上培养，约2月后可得到完整转基因烟草植株。
5、转基因烟草植株的检测：用终点法PCR技术分析外源基因表达模式，确认转基因是否成功。参考CTAB方法提取转基因烟草植株的总RNA，逆转录合成cDNA后，采用外源基因特异引物进行外源基因的扩增。PCR体系为25 μl，包含2.5 μl 10×PCR Buffer，0.5μl 10 mM dNTP，上下游引物各1μl，1μl 50 mM MgCl2，0.2μl Invitrogen Platinum Taq (Invitrogen)，1μl cDNA和17.8μl PCR级水。PCR程序为：95 oC 5 min，28个循环（95 oC 30s，58 oC 30s，72 oC 2 min），72 oC 10 min。
本发明的另一个目的是提供所述方法在培育富含花青苷的烟草中的应用。
经过实验，已成功从杨梅果实中分离出可调控花青苷合成的MrMYB1 和MrbHLH1 两个转录因子，采用本发明阐述的方法培育了富含花青苷的烟草。本发明阐述的方法同样适用于杨梅以外其他可调控花青苷合成的MYB 和bHLH 基因。
本发明将从杨梅果实中分离的与花青苷合成相关的MYB 和bHLH 基因重组构建成表达质粒，采用烟草叶片瞬时表达技术筛选可调控花青苷合成的基因，将确认功能的基因转化到烟草在，培育出富含花青苷的烟草。本发明提供了一种培育富含花青苷烟草的方法，使得减轻吸烟带来的健康危害成为可能。
附图说明
图1：含MrMYB1-MrbHLH1双价表达载体示意图。
图2：烟草叶片瞬时表达技术分析各个基因的功能。
图3：转基因烟草植株。
图4：转基因烟草植株外源基因的表达分析。
图5：转基因烟草植株花青苷含量分析。
图6：转基因烟草植株内源与花青苷合成相关基因的表达分析。
具体实施方式
下面结合附图和具体实施例对本发明做进一步阐述，但实施例不限制本发明的保护范围。
下述实施例中常规的基因操作方法参照《分子克隆实验指南》（第三版）。
实施例1：基因功能预测
（一）实验方法
1、载体构建
首先构建含单个基因的表达载体。根据已确认MrMYB1（SEQ：NO. 1）和MrbHLH1（SEQ：NO. 2）的序列全长设计含限制性内切酶酶切位点的引物SEQ：NO. 3和SEQ：NO. 4及SEQ：NO. 5和SEQ：NO. 6，PCR扩增两个基因的开放性阅读框，然后采用相应的内切酶处理扩增产物和表达质粒pGreenII SK，最后通过连接相对应的PCR产物和质粒，分别进行含MrMYB1或MrbHLH1表达载体的构建。
然后构建同时含MrMYB1和MrbHLH1的双价表达载体：根据融合PCR技术对引物的要求和表达质粒pGreenII SK的序列信息（SEQ：NO. 7），设计引物SEQ：NO. 8和SEQ：NO. 9（扩增MrMYB1开放性阅读框）、SEQ：NO. 10和SEQ：NO. 11（扩增CaMV 加尾信号序列）、SEQ：NO. 12和SEQ：NO. 13（扩增35S启动子序列）及SEQ：NO. 14和SEQ：NO. 15（扩增MrbHLH1开放性阅读框）。第一轮PCR，以杨梅成熟果实cDNA 和质粒pGreenII SK为模板，参照PrimeSTAR 热启动DNA聚合酶说明书，配制终体积为20 μl PCR体系：HS DNA polymerase（2.5 U/μl）0.2 μl，5×Buffer 4 μl，2.5 mmol/l dNTP 1.6 μl，10 μM/l引物各0.5 μl，50 ng/μl cDNA模板1.0 μl，加ddH2O至终体积20 μl。PCR条件为：98oC 5 min；98oC 10 sec，58oC 5 sec，72oC 2 min 30 sec，35个热循环；72oC 10 min，4oC保存。PCR产物经0.8% 琼脂糖凝胶电泳后，割胶回收，然后测定OD260计算各个扩增片段的浓度。第二轮PCR扩增中间产物，体系中引物用ddH2O替换，模板为等摩尔第一轮PCR扩增出的不同目的片段，其他物质与第一轮相同。PCR条件为：98oC 5 min；98oC 10 sec，58oC 5 sec，72oC 7 min，12个热循环；72oC 10 min，4oC保存。PCR产物经0.8% 琼脂糖凝胶电泳后，割胶回收。第三轮PCR扩增最终融合目的片段，体系中引物对为SEQ：NO. 7和SEQ：NO. 14，其他物质同第一轮。PCR条件为：98oC 5 min；98oC 10 sec，58oC 5 sec，72oC 7 min，16个热循环；72oC 10 min，4oC保存。PCR产物经0.8% 琼脂糖凝胶电泳后，割胶回收。最后应用普通的酶切-连接生物学技术，将融合目的片段插入到pGreenII SK质粒的多克隆位点内，重组成含MrMYB1-MrbHLH1的双价表达载体（图1）。
2、农杆菌准备
将构建好的表达载体，通过电穿孔（Bio-Rad）方法转化入GV3101::pSoup农杆菌感受态细胞中，28oC 100rpm培养4 h后，吸取100 μl涂布到含25 μg/ml庆大霉素、5 μg/ml四环素和50 μg/ml卡那霉素的LB固体培养基上，28oC培养48 h，筛选阳性克隆保存成甘油农杆菌形式，用于进一步的烟草瞬时表达和转基因实验。
将存放于-80oC的各个甘油农杆菌划线接种于含25 μg/ml庆大霉素、5 μg/ml四环素和50 μg/ml卡那霉素的LB固体培养基上，28oC培养48 h，挑取少量菌落涂布到另一个含相同抗生素的LB固体培养基上，28oC培养24 h。用10 mM MgCl2，10 mM MES（生物缓冲液），150 mM 乙酰丁香酮，pH 为5.6的渗透液悬浮，使其OD600为0.2。
3、烟草叶片瞬时农杆菌浸染
含不同基因的菌株渗透液分别于含p19质粒的菌株渗透液等比例混匀，然后用无针头注射器将渗透液注入6周大的、有6-8片真叶的普通烟草叶片中，注射部位为远离叶片中心叶脉的表皮细胞内。烟草于16h：8h光暗周期、25oC、75%空气湿度的条件下培养8天后，观察叶片的注射部位有无花青苷的积累，依此鉴定注射的基因有无调控花青苷合成的功能（图2）。
（二）实验结果
烟草叶片瞬时表达分析结果显示：单独的MrMYB1或MrbHLH1无法调控花青苷的积累，而当MrMYB1和MrbHLH1同时过量表达时，可强烈诱导烟草叶片花青苷的合成（图2）。
实施例2：烟草转基因技术
（一）实验方法
1、农杆菌菌液准备
将含有MrMYB1-MrbHLH1双价表达质粒的GV3101::pSoup甘油农杆菌株划线到含25 μg/ml庆大霉素、2.5 μg/ml四环素和50 μg/ml 卡那霉素的LB固体培养基上，28oC培养48 h；挑取少量菌落涂布到新的含25 μg/ml庆大霉素、5 μg/ml四环素和50 μg/ml卡那霉素的LB固体培养基上，28oC培养24 h；刮取少许生长良好的菌落，用30 ml含25 μg/ml庆大霉素、5 μg/ml四环素和50 μg/ml卡那霉素的LB液体培养基于28oC 100 rpm培养24 h；室温、5000 rpm离心收集菌落，用10 – 20 ml烟草转基因浸染液（MS + 2%sucrose + NV，pH=6）悬浮后备用。
2、无菌烟草组培苗准备
用10%双氧水对烟草种子进行表面消毒10min，无菌蒸馏水冲洗3次，播种于MS培养基中。将种子置于黑暗、25oC条件下培养，1周后种子萌发，长出子叶。将幼苗置于16h：8h光暗周期、25oC条件下培养，至真叶长出，可用于转基因处理。
3、烟草转基因处理
取无菌烟草组织培养苗的幼嫩真叶叶片，置于浸染液中，并切成2-3 mm长宽的叶片。将叶片上的农杆菌菌液用无菌滤纸吸干后，置于无抗生素的共培养基上培养2天。然后将叶片转移至含50 mg/L Meropenem 和100 mg/L Kanamycin的选择培养基上，进行不定芽诱导，每2周更换培养基，此过程约1个月。将诱导的不定芽转移至含50 mg/L Meropenem 和100 mg/L Kanamycin的生根培养基上，进行根的诱导，每2周更换培养基，此过程约1个月。约2月后可得到完整转基因烟草植株。
4、转基因烟草植株的检测
采取转基因烟草植株叶片，迅速用液氮冷冻后研磨成粉末。参考pH示差法提取叶片中总花青苷，进行花青苷含量的分析。参考CTAB法提取叶片总RNA，合成cDNA后，应用实时定量PCR技术分析烟草内源与花青苷相关的基因表达，终点法PCR技术分析外源导入基因的表达。对转基因技术进行验证。
（二）实验结果
与空载体相比，含MrMYB1-MrbHLH1双价表达载体转化入烟草后，可显著改变烟草植株表型（图3）。基因表达分析显示，外源基因MrMYB1和MrbHLH1在烟草内强烈表达（图4）。进一步分析显示，烟草表型的改变是由于花青苷强烈合成所致（图5），这是由于烟草花青苷合成基因表达被强烈诱导（图6）。
应用本方法得到的烟草，与普通烟草相比，花青苷含量较高，为减轻吸烟带来的健康危害提供了一种可行方案。
对于本领域普通技术人员来说，可以根据上述说明加以改进或变换，而所有这些改进和变换都应属于本发明所附权利要求的保护范围。
<110> 浙江大学
<120>一种培育富含花青苷烟草的方法及其应用
<160> 15
<210> 1
<211> 744
<212> DNA
<213>杨梅（Myrica rubraSieb. and Zucc.）
<400> 1
ATGGAAGGCTCTTTAGGTGTACGAAAAGGCGCATGGACTGTAGAGGAAGATACCCTCCTGAAGCTGTACATTGAGAAGTACGGAGAAGGGAAGTGGCACCAAGTTCCTCCCAGAGCAGGCTTAAATAGATGCCGGAAAAGCTGTAGACTGAGGTGGCTGAATTATCTAAAGCCCAACATCAAGAGAGGAGAGTTTAAAGCGGACGAAGTGGATCTAATGATCAGGCTTCATAAGCTCCTAGGTAACAGATGGTCAATGATAGCTGGTAGGCTTCCAGGAAGAACAGCGAACGATGTGAAGAACTACTGGAATACACACCTGCGCAAGAATGCAATTTCTCGCATCAAAGACGGTGGTGAAAAAGCTCAACAAACGTCGAAAGTGAACATAATAAAACCTCGACCCCGGACCTTCGCCAAAAATTTAACTTGGTTCGGTGGGAAACCAACGATAATGGCAGCGAGCTTTCAACCAAAGGACAATGTTATTAGCGACCTACCTCCAGCACCGTTGCCATCCGAGAATAGTGTAAAATGGGGGGAAAACCTGTTCGATGACAAGGAAGCTGGTGACGAAATAGGCACATACGATGTAGGTGGGTTAAATGAAGAGCCCATCGCAACTTTTCGGTGGGCCGAAGCAGCACCGGCTGAGACAGTGGGAACCCCTCTTGATGAGTTCGGCCCGAGCTTTTGGGCTGAGTTCCCTTCTAATTTGGACGTTTGGGATTTTCTCGATCCATAA
<210> 2
<211> 31
<212> 碱基序列
<213> 人工合成
<400> 2
TAGCGGCCGCATGGAAGGCTCTTTAGGTGTA
<210> 3
<211> 29
<212> 碱基序列
<213>人工合成
<400> 3
GCGGTACCTTATGGATCGAGAAAATCCCA
<210> 4
<211> 2130
<212> DNA
<213>杨梅（Myrica rubraSieb. and Zucc.）
<400> 4
ATGGCTGCACCGCCGAGTAGCCAGCTTCAGAGTATGCTGCAGGCGGCGGTGCAATCGGTTCAATGGACTTACAGTCTCTTCTGGCAACTCTGTCCGCAACAAGGGATCTTAGTTTGGGCAGATGGGTATTACAATGGAGCAATTAAGACTCGGAAGACGGTGCAGCCCATGGAGGTTAGCGCCGAGGAGGCATCCCTACAGAGAAGCCAGCAGCTTAGGGAGCTCTACGATTCTTTGTCCGCCGCGGAGACAAACCAGCCCGCGCGGCGGCCTTGTGCTGCCTTGTCACCTGAAGACTTGACCGAATCGGAATGGTTCTACTTGATGTGCGTCTCGTTCTCTTTTCCTCCTGGGGTTGGGATACCGGGAAAAGCATATGCGAGGCGGCAGCATGTATGGCTCACCGGCGCAAATGATGTGGATAGCAAAACTTTCTCTAGAGCCATTCTTGCCAAGAGTGCTCGTATTCAGACTGTAGTTTGCATTCCCCTACTGGATGGAGTCGTGGAGTTCGGCACAACGGATAAGGTGCAAGAAGACCTTGGCTTTGTCCAACATGTCAAGACTTTCTTCACTGAGCATCCCCACCACCATCAACCTCTCCCACCAAAACCCGCTCTGTCTGAGCACTCCACTTCCAATCGTGCCACGTCTTCCGACCATAGCCGTTTCCACTCTCCTCCAATCCCGGCCATGTATGCTGTGGCGGATCCACCAGTCAATGCAAACCCAGATGACGAGGAGGAAGAAGAGGAGGACGAGGATGAGGACGGCGAGTCTGACTCGGAAGCCGAAACTGGTCGTAACAATCGAGCAATTGAAGCAGCCCAAAGCCCTCAAGGGACAGCAGCACCACCACCAGCTGAGCCGAGCGAACTCATGCAGCTTGAGATGTCGGAGGACATCAGGCTTGGCTCACCGGATGACGGGTCTAATAATTTGGACTCAGATTTTCACATGCTTGCTGTGAGGCAGTCGGCAAACCCGATGAATCACCAGCACCAAGCCGACCTGTACCGAGCTGAGTCTACTCGAAGATGGCCACTAATGCAAGAACCATTGGGTAGCGGGATTCAACATGAACAACCCTCAGGACCCCCATCCCTAGAGGAGCTGACACAGGAGGACACCCACTACTCTCAAACGGTCTCCACCATCCTCCAAACCCAGCCCAGCCGATGGACGGATGCCTCCTCCACCGCCTACGTACCCTACTCCACCCAATCAGCATTTGTCAAGTGGACAACTCGTGCTGAACACCACCTCCACGTCCCCATGGAAGGTACCTCCCAGTGGCTCCTCAAGTACATTCTGTTCAGCGTACCCTTCCTCCACACCAAGTACCGCGACGAAAACTCTCCGAAACTGCGGGACGGCGATGCAACCACTCGGTTCAAGAAGGGAACTCCGCAGGACGAGCTCAGCGCCAATCACGTCCTCGCCGAGCGCCGCCGCCGTGAGAAGCTCAACGAGAGGTTCATTATACTCAGGTCGCTGGTCCCTTTCGTGACCAAAATGGACAAGGCCTCGATCTTAGGTGACACGATCGAGTACCTGAAGCAACTGCGTAAGAAGATTCAGGATCTGGAGGCACGTTACCGACAGATGGAGATTGATCAACGGTCGAGATTAGGGGACCTACAAAGGTCTAGCAGCTTGGGGGACCTACAAAGGTCCAGTAGTTTGAAGGAGCAGCGGAGCGGGGTGACTGCGGTGGAGCGGACCCGAGCGGGAACGGACCGAACGCGGGCGGTTCAAATACCCGGGCCGGATAAGAGGAAGTTGAGGATTGTGGAGGGGAGCGGAGGGTGTGCGAAACCCAAGACGGTTGAGTCGCCACCGCCACCTCCATCGCCGACGTCGACGGGAACCACGGTGCAGGTATCAATCATAGAGAGGGACGCGTTGTTGGAGCTGCAATGCCCGTACAAGGAAGGGCTGTTGCTTGACGTCATGCAAATGCTGCGAGAGCTCCGGATAGAGACCACCACTGTCCAGTCTTCGTTGACCAATGGGCTATTCGTAGCTGAGTTAAGAGCCAAGGTGAAGGAGAACGTGAATGGGAAGAAAACAAGCATTGTGGAGGTGAAGAGGGCAATAAATGAAATTATACCCCACAATGACTCGTAG
<210> 5
<211> 29
<212> 碱基序列
<213> 人工合成
<400> 5
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<211> 29
<212> 碱基序列
<213> 人工合成
<400> 6
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<210> 7
<211> 2247
<212> DNA
<213> pGreenII 0029-62 SK
<400> 7
agatcttggcaggatatattgtggtgtaacgttatcagcttggtacagcttgcatgccggtcgatctagtaacatagatgacaccgcgcgcgataatttatcctagtttgcgcgctatattttgttttctatcgcgtattaaatgtataattgcgggactctaatcaaaaaacccatctcataaataacgtcatgcattacatgttaattattacatgcttaacgtaattcaacagaaattatatgataatcatcgcaagaccggcaacaggattcaatcttaagaaactttattgccaaatgtttgaacgatctgcttgactctagctagagtccgaaccccagagtcccgctcagaagaactcgtcaagaaggcgatagaaggcgatgcgctgcgaatcgggagcggcgataccgtaaagcacgaggaagcggtcagcccattcgccgccaagctcttcagcaatatcacgggtagccaacgctatgtcctgatagcggtccgccacacccagccggccacagtcgatgaatccagaaaagcggccattttccaccatgatattcggcaagcaggcatcgccctgggtcacgacgagatcctcgccgtcgggcatccgcgccttgagcctggcgaacagttcggctggcgcgagcccctgatgctcttcgtccagatcatcctgatcgacaagaccggcttccatccgagtacgtcctcgctcgatgcgatgtttcgcttggtggtcgaatgggcaggtagccggatcaagcgtatgcagccgccgcattgcatcagccatgatggatactttctcggcaggagcaaggtgagatgacaggagatcctgccccggcacttcgcccaatagcagccagtcccttcccgcttcagtgacaacgtcgagcacagctgcgcaaggaacgcccgtcgtggccagccacgatagccgcgctgcctcgtcttggagttcattcagggcaccggacaggtcggtcttgacaaaaagaaccgggcgcccctgcgctgacagccggaacacggcggcatcagagcagccgattgtctgttgtgcccagtcatagccgaatagcctctccacccaagcggccggagaacctgcgtgcaatccatcttgttcaatcatgcctcgatcgagttgagagtgaatatgagactctaattggataccgaggggaatttatggaacgtcagtggagcatttttgacaagaaatatttgctagctgatagtgaccttaggcgacttttgaacgcgcaataatggtttctgacgtatgtgcttagctcattaaactccagaaacccgcggctgagtggctccttcaacgttgcggttctgtcagttccaaacgtaaaacggcttgtcccgcgtcatcggcgggggtcataacgtgactcccttaattctcatgtatcgtacccccctactccaaaaatgtcaaagatacagtctcagaagaccaaagggctattgagacttttcaacaaagggtaatttcgggaaacctcctcggattccattgcccagctatctgtcacttcatcgaaaggacagtagaaaaggaaggtggctcctacaaatgccatcattgcgataaaggaaaggctatcattcaagatgcctctgccgacagtggtcccaaagatggacccccacccacgaggagcatcgtggaaaaagaagacgttccaaccacgtcttcaaagcaagtggattgatgtgacatctccactgacgtaagggatgacgcacaatcccactatccttcgcaagacccttcctctatataaggaagtcatttcatttggagaggacagcccaagctgagctccaccgcggtggcggccgctctagaactagtggatcccccgggctgcaggaattcgatatcaagcttatcgataccgtcgacctcgagggggggcccggtaccaattcgctgaaatcaccagtctctctctacaaatctatctctctctattttctccataaataatgtgtgagtagtttcccgataagggaaattagggttcttatagggtttcgctcatgtgttgagcatataagaaacccttagtatgtatttgtatttgtaaaatacttctatcaataaaatttctaattcctaaaaccaaaatccagtactaaaatccagatccactagccttgacaggatatattggcgggtaaactaagtcgctgtatgtgtttgtttgagatct
<210> 8
<211> 42
<212>碱基序列
<213>人工合成
<400> 8
TGGGATTTTCTCGATCCATAAtcgctgaaatcaccagtctct
<210> 9
<211> 42
<212> 碱基序列
<213>人工合成
<400> 9
ACATTTTTGGAGTAGGGGGGTGATCTGGATTTTAGTACTGGA
<210> 10
<211> 42
<212> 碱基序列
<213>人工合成
<400> 10
tccagtactaaaatccagatcacccccctactccaaaaatgt
<210> 11
<211> 44
<212> 碱基序列
<213>人工合成
<400> 11
GGCTACTCGGCGGTGCAGCCATGTCCTCTCCAAATGAAATGACT
<210>12
<211> 31
<212>碱基序列
<213>人工合成
<400> 12
TAGCGGCCGCATGGAAGGCTCTTTAGGTGTA
<210> 13
<211> 42
<212>碱基序列
<213>人工合成
<400> 13
AGAGACTGGTGATTTCAGCGATTATGGATCGAGAAAATCCCA
<210>14
<211> 42
<212>碱基序列
<213>人工合成
<400> 14
gtcatttcatttggagaggacATGGCTGCACCGCCGAGTAGC
<210> 15
<211> 29
<212>碱基序列
<213>人工合成
<400> 15
CGAAGCTTCTACGAGTCATTGTGGGGTAT
Claims (4)
1.一种培育富含花青苷烟草的方法，其特征在于，通过以下步骤实现：
（1）表达载体构建：根据序列为SEQ ID NO. 1的MrMYB1的序列全长设计含限制性内切酶酶切位点的序列为SEQ ID NO. 2和SEQ ID NO. 3的引物对，根据序列为SEQ ID NO. 4的MrbHLH1的序列全长设计含限制性内切酶酶切位点序列为SEQ ID NO. 5和SEQ ID NO. 6的PCR引物对，以‘荸荠’杨梅果实的cDNA为模板，利用SEQ ID NO. 2和SEQ ID NO. 3、SEQ ID NO. 5和SEQ ID NO. 6两个引物对，扩增MrMYB1和MrbHLH1两个基因的开放性阅读框，然后采用相应的内切酶处理扩增产物和表达质粒pGreenII SK，最后通过连接相对应的PCR产物和质粒，分别进行MrMYB1和MrbHLH1过量表达载体的构建；
（2）双价表达载体构建：首先以序列为SEQ ID NO. 7的表达质粒pGreenII SK为模板，设计序列为SEQ ID NO. 8和SEQ ID NO. 9的引物对扩增CaMV 加尾信号序列，以序列为SEQ ID NO. 10和SEQ ID NO. 11的引物对扩增35S启动子序列，以‘荸荠’种杨梅的cDNA为模板，以序列为SEQ ID NO. 12和SEQ ID NO. 13的引物对扩增MrMYB1的开放性阅读框片段，以序列为SEQ ID NO. 14和SEQ ID NO. 15的引物对扩增MrbHLH1的开放性阅读框片段；然后不加引物，扩增出融合这些片段的中间产物；最后以中间产物为模板，以序列为SEQ ID NO. 8和SEQ ID NO. 15为引物对，扩增出融合的MrMYB1 - CaMV term - CaMV 35S - MrbHLH1片段，将所得融合片段插入到的表达质粒pGreenII SK的多克隆位点内，完成双价表达载体的构建；
（3）基因的功能预测：应用农杆菌介导的烟草叶片瞬时表达技术，将含有各表达载体的农杆菌渗透液，输入烟草叶片表皮细胞内，植株置于温室培养8天后观察叶片中花青苷合成情况，若输入孔周围有花青苷积累，说明输入叶片的基因具有诱导花青苷积累的功能；
（4）烟草转基因技术：将采用瞬时表达技术筛选的含有效基因表达载体的农杆菌菌株浸染带有伤口的无菌烟草组培苗叶片，然后置于含抗生素的不定芽诱导培养基培养4周，再转到含抗生素的根诱导培养基上培养4周，得到完整的转基因植株，最后经过炼苗，将植株置于室外培养至开花结果。
2.根据权利要求1所述的一种培育富含花青苷烟草的方法，其特征在于，所述步骤（3）中基因功能预测的方法为烟草叶片瞬时表达技术；将含有各表达载体的农杆菌菌株，分别与含p19质粒的农杆菌菌株等比例混合，输入到烟草叶片远离中心叶脉的表皮细胞内；烟草植株置于16h：8h光暗周期、25oC、75%空气湿度的条件下培养8天，观察花青苷积累情况。
3.根据权利要求1所述一种培育富含花青苷烟草的方法，其特征在于，所述步骤（4）中的烟草转基因方法为：选取无菌烟草组培苗的幼嫩真叶，置于用浸染液悬浮的农杆菌菌液内，切成2-3 mm长宽的叶片，先在无选择压的培养基上共培养2天，然后经过诱芽、诱根培养成完整植株。
4.根据权利要求1所述的方法在培育富含花青苷的烟草中的应用。
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