CN103695460B - 一种获得植物高花青素含量毛状根的方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种获得植物高花青素含量毛状根的方法，它涉及植物技术领域，将植物中调控花青素合成代谢的MYB基因AmROS1和bHLH基因AmDEL分别构建到载体PJAM1502和载体pK7WG2D中获得PJAM1502：：AmROS1和pK7WG2D：：AmDEL；并将PJAM1502：：AmROS1和pK7WG2D：：AmDEL转化到发根农杆菌中，获得包含质粒PJAM1502：：AmROS1和pK7WG2D：：AmDEL的发根农杆菌；利用转化后的发根农杆菌侵染植物组织器官，共培养和筛选培养后，诱导出高花青素含量的毛状根。本发明在植物毛状根中同时表达调控花青素合成代谢的转录因子MYB基因和bHLH基因，获得特定植物高花青素含量的毛状根。

Description

一种获得植物高花青素含量毛状根的方法

技术领域：

本发明涉及一种获得植物高花青素含量毛状根的方法，属于植物技术领域。

背景技术：

花青素是一类陆生植物特有并普遍存在的水溶性色素，赋予植物器官红、粉红、蓝和紫等色彩。作为食物，花青素不仅是优良的食品添加剂，而且具有抗心率失调，抗癌的功能，降低心血管疾病，肥胖症，糖尿病的发病率。

花青素属于酚类化合物中的类黄酮类化合物。基本结构单元是2-苯基苯并吡喃型阳离子，即花色基元。花色基元所带羟基数、甲基化、醣基化数目、种类和连接位置的差异，形成200多种不同的化合物。这些不同结构的花青素会呈现不同颜色，具有不同的保健功能和药用价值(范和邱，1998)。花色基元的羟基化，甲基化，糖基化等修饰由不同的基因控制。由于系统发生上的差异，不同植物可能所具有的花青素修饰基因有所差异，因此其所含有的花青素也有可能不同。例如，大牵牛天堂蓝花中的一种花青素含有6个葡萄糖和3个咖啡酸，是目前发现的最大的花青素类化合物，还没有在其它植物中发现。

目前花青素主要来源于产量较高的水果和蔬菜的块茎和果实中，如紫甘薯、越橘、酸果蔓、黑枸杞、蓝莓、葡萄、接骨木红、黑加仑、紫胡萝卜和红甘蓝。由于植物的来源较为单一，所以所获得花青素的种类也就不是十分丰富。从更多植物中获取花青素，是扩大花青素资源库的重要手段。但是许多植物需要在特殊的环境下才能完成发芽，生长，开花，结果等生长发育过程，同时花青素也仅仅在植物特定器官中，如花中积累，其本身生物量较小，极大地限制了更多种类的花青素被人们使用。

毛状根是发根农杆菌侵染宿主植物受伤部位的细胞产生的大量不定根。其生长迅速，激素自主，分化水平高，遗传性状稳定，是理想的生产次生代谢物质的组织。但自然情况下植物毛状根中花青素的合成代谢积累较少。植物中花青素合成代谢的结构基因受MYB基因和bHLH基因的调控。已有研究者将分别过量表达MYB基因和bHLH基因的转基因植株进行杂交，获得同时过量表达MYB基因和bHLH基因的转基因植株，该植株中花青素合成代谢的结构基因被诱导表达，在植物体内积累大量的花青素。毛状根不能进行有性杂交，并且在一个载体中同时过量表达两个基因的构建工作较为困难，因此高花青素含量的植物毛状根的获得较为困难。

发明内容：

针对上述问题，本发明要解决的技术问题是提供一种获得植物高花青素含量毛状根的方法。

本发明的一种获得植物高花青素含量毛状根的方法，它获得的步骤如下：

(一)、设计包含AttB1adapter和AttB2adapter的引物，将植物中调控花青素合成代谢的MYB基因AmROS1和bHLH基因AmDEL通过Gateway克隆的BP反应连接到载体pDONR207；然后利用Gateway克隆的LR反应将AmROS1和AmDEL分别连接到载体PJAM1502(卡那霉素抗性)和载体pK7WG2D(壮观霉素抗性)中获得PJAM1502：：AmROS1和pK7WG2D：：AmDEL；

(二)、利用电转化的方法将PJAM1502：：AmROS1和pK7WG2D：：AmDEL转化到发根农杆菌Ar1193(利福平抗性)中，通过利福平、卡那霉素和壮观霉素抗生素筛选，获得PJAM1502：：AmROS1和pK7WG2D：：AmDEL的发根农杆菌；

(三)、烟草在无菌培养基上发芽生长19天，在超净台中将烟草叶片剪成小方块，侵染20分钟，共培养2天后，在MS固体培养基(250mg/L塞福隆，50mg/L卡那霉素)培养20天后，在烟草的伤口处出现紫色毛状根；

(四)、将毛状根放入三角瓶中，并加入MS液体培养基(250mg/L塞福隆，50mg/L卡那霉素)，培养28天后，测定毛状根中花青素含量为132mg/100g，接近水果蓝莓中的花青素含量；

(五)、质谱鉴定毛状根中含有3种花青素类化合物，与烟草花中花青素种类与结构相同。

本发明在植物毛状根中同时表达调控花青素合成代谢的转录因子MYB基因和bHLH基因，获得植物高花青素含量的毛状根。

具体实施方式：

本具体实施方式采用以下技术方案：它获得的步骤如下：

(一)、设计包含AttB1adapter和AttB2adapter的引物，将植物中调控花青素合成代谢的MYB基因AmROS1和AmDEL通过Gateway克隆的BP反应连接到载体pDONR207；然后利用Gateway克隆的LR反应将AmROS1和AmDEL分别连接到载体PJAM1502(卡那霉素抗性)和载体pK7WG2D(壮观霉素抗性)中获得PJAM1502：：AmROS1和pK7WG2D：：AmDEL；

(二)、利用电转化的方法将PJAM1502：：AmROS1和pK7WG2D：：AmDEL转化到发根农杆菌(利福平抗性)中，通过利福平、卡那霉素和壮观霉素抗生素筛选，获得PJAM1502：：AmROS1和pK7WG2D：：AmDEL的发根农杆菌；

(三)、烟草在无菌培养基上发芽生长19天，在超净台中将烟草叶片剪成小方块，侵染20分钟，共培养2天后，在MS固体培养基(塞福隆，卡那霉素)培养20天后，在烟草的伤口处出现紫色毛状根；

(四)、将毛状根放入三角瓶中，加入MS液体培养基(250mg/L塞福隆，50mg/L卡那霉素)，培养28天后，测定毛状根中花青素含量为132mg/100g，接近水果蓝莓中的花青素含量(145mg/100g)；

(五)、质谱鉴定毛状根中含有3种花青素类化合物，与烟草花中花青素种类与结构相同。

本具体实施方式将调控花青素合成代谢的MYB基因和bHLH基因同时转化到同一个发根农杆菌中，转化植物组织器官，获得高花青素含量的毛状根。

以上显示和描述了本发明的基本原理和主要特征和本发明的优点。本行业的技术人员应该了解，本发明不受上述实施例的限制，上述实施例和说明书中描述的只是说明本发明的原理，在不脱离本发明精神和范围的前提下，本发明还会有各种变化和改进，这些变化和改进都落入要求保护的本发明范围内。本发明要求保护范围由所附的权利要求书及其等效物界定。

Claims (2)

1.一种获得植物高花青素含量毛状根的方法，其特征在于：它获得的步骤如下：

(一)、设计包含AttB1adapter和AttB2adapter的引物，将植物中调控花青素合成代谢的MYB基因AmROS1和bHLH基因AmDEL通过Gateway克隆的BP反应连接到载体pDONR207；然后利用Gateway克隆的LR反应将AmROS1和AmDEL分别连接到载体PJAM1502和载体pK7WG2D中获得PJAM1502：：AmROS1和pK7WG2D：：AmDEL；

(二)、利用电转化的方法将PJAM1502：：AmROS1和pK7WG2D：：AmDEL转化到发根农杆菌Ar1193中，通过利福平、卡那霉素和壮观霉素抗生素筛选，获得包含PJAM1502：：AmROS1和pK7WG2D：：AmDEL的发根农杆菌；

(三)、烟草在无菌培养基上发芽生长19天，在超净台中将烟草叶片剪成小方块，侵染20分钟，共培养2天后，在250mg/L塞福隆，50mg/L卡那霉素的MS固体培养基培养20天后，在烟草的伤口处出现紫色毛状根；

(四)、将毛状根放入三角瓶后，加入250mg/L塞福隆，50mg/L卡那霉素的MS液体培养基，震荡培养28天；

(五)、质谱鉴定毛状根中含有3种花青素类化合物，与烟草花中花青素种类与结构相同。

2.根据权利要求1所述的一种获得植物高花青素含量毛状根的方法，其特征在于：将调控花青素合成代谢的MYB基因和bHLH基因转化到同一个发根农杆菌中，侵染植物的组织器官，获得高花青素含量的毛状根。