CN109997698B - 一种以茎段为外植体的樟叶越桔组织培养方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种以茎段为外植体的樟叶越桔组织培养方法，包括以下步骤：步骤一：培养基配置，以WPM为基本培养基，加入NAA和TDZ；步骤二：茎段愈伤诱导，取茎段健壮的樟叶越桔组培苗，在无菌操作台内去除叶片，将茎段切成长茎段，并对表面进行划伤处理后置于由步骤一所配置的培养基中进行培养；步骤三：不定芽诱导培养，将经步骤二诱导长成幼苗转入不定芽诱导培养基中进行不定芽诱导培养；步骤四：樟叶越桔组培苗的生根诱导，将步骤三不定芽诱导培养的长成的健壮的樟叶越桔组培苗接种于生根培养基中进行诱导生根，得到樟叶越桔生根苗。本发明方法周期短，成本低，完全能满足大面积规模化栽培的需求，具有良好的应用前景。
Description
技术领域
本发明属于植物组织培养技术领域，具体涉及一种以茎段为外植体的樟叶越桔组织培养方法。
背景技术
樟叶越桔(原变种)V.dunalianumWight.为杜鹃花科越桔属常绿灌木，别名饭米果(云南昆明)、长尾越桔(中国高等植物图鉴)。樟叶越桔叶片革质或厚革质，顶端尾状渐尖；总装花絮，腋生；浆果球形，成熟时紫黑色，被白粉。分布于中国四川、贵州、云南、西藏，常生于山坡灌丛、阔叶林下或石灰山灌丛中，国外分布于锡金、不丹、印度(东北部)、缅甸(东北部)至越南(中国植物志)。樟叶越桔作为雀嘴茶的原材料尚未有人工种植，制作雀嘴茶的顶芽全部从野生樟叶越桔植株上采摘而来，而樟叶越桔生长周期长，数量有限，过度的采摘对樟叶越桔的嫩芽对野生种群产生了破坏。樟叶越桔干燥嫩芽中的主要成分6’-O-咖啡酰熊果苷CA是许多国内外护肤产品的主要植物天然美白剂，具有极高的经济价值。
樟叶越桔作为雀嘴茶的原料和护肤产品的主要植物天然美白剂被广泛使用，但目前樟叶越桔繁殖周期长，无法有效在短期内获取大量樟叶越桔幼苗。
发明内容
本发明的目的在于针对现有技术存在的不足，利用樟叶越桔组培苗的茎段为外植体获得樟叶越桔组织苗的培养方法。该方法具有外植体材料易获得、产生丛芽量多、繁殖速度快、周期短等优点，是短期内获取大量樟叶越桔幼苗的有效途径。
为实现本发明的目的，本发明提供的以茎段为外植体的樟叶越桔组织培养方法以樟叶越桔的茎段为外植体进行樟叶越桔组培苗进行培养，包括以下步骤：
步骤一：培养基配置，以WPM为基本培养基，加入NAA和TDZ；
步骤二：茎段愈伤诱导，取茎段健壮的樟叶越桔组培苗，去除叶片，将茎段切成长茎段，并对表面进行划伤处理后置于由步骤一所配置的培养基中进行培养；
步骤三：不定芽诱导培养，将经步骤二诱导长成幼苗转入不定芽诱导培养基中进行不定芽诱导培养；
步骤四：樟叶越桔组培苗的生根诱导，将步骤三不定芽诱导培养的长成的健壮的樟叶越桔组培苗接种于生根培养基中进行诱导生根，得到樟叶越桔生根苗。
其中，步骤一中配置的培养基为：WPM+NAA0.01～0.1mg/L+TDZ0.1～1.5mg/L，pH为5.8，最优浓度为：NAA0.05mg/L，TDZ0.6mg/L、TDZ0.8mg/L或TDZ1.5mg/L。
步骤三中的不定芽诱导培养基为：WPM+NAA0.01～0.1mg/L+TDZ0.1～1.5mg/L，pH为5.8，最优浓度为：NAA0.05mg/L，TDZ0.6mg/L、TDZ0.8mg/L或TDZ1.5mg/L。
其中，所述步骤四中的生根培养基为：WMP+6-BA1.5mg/L+NAA0.5mg/L。
具体的，所述培养基和所述不定芽诱导培养基的pH值用1mol/LNaOH或HCl来调节。
在培养过程中，所述步骤二中培养条件为：培养温度23±2℃，光照强度1500～2500lx，光照周期比12h:12h；所述步骤三中不定芽诱导培养的条件为：培养温度25±2℃，光照强度1500～2500lx，光照周期比12h:12h；所述步骤四中诱导生根的条件为：培养温度25±2℃，光照强度1500～2500lx，光照周期比12h:12h。
与现有技术相比，本发明的优异性在于：
(1)以樟叶越桔茎段为外植体；
(2)所使用的药品价格低廉，成本低；
(3)激素配比简单，以WPM为基本培养基，可靠调节植物生长调节剂NAA、TDZ、6-BA的浓度配比，对樟叶越桔茎段不定芽诱导进行分析，以得到诱导茎段产生不定芽至生根的最佳配方；
(4)本发明方法外植体诱导率达79.19％，并且成苗效果好，得到的幼苗健壮，芽苗健壮，生长快，芽苗生根率达94％，且根系健壮；本发明方法周期短，成本低，完全能满足大面积规模化栽培的需求，具有良好的应用前景，可为樟叶越桔优良快繁苗的规模化生产提供可靠的技术依据。
附图说明
图1为本发明樟叶越桔茎段切成约1cm～1.5cm长茎段，并对表面进行划伤处理的示意图；
图2为本发明B1(WPM+0.05mg/LNAA+0.6mg/LTDZ)组樟叶越桔茎段诱导愈伤组织示意图；
图3为本发明B1(WPM+0.05mg/LNAA+0.6mg/LTDZ)组樟叶越桔茎段愈伤组织诱导不定芽示意图；
图4为本发明B1(WPM+0.05mg/LNAA+0.6mg/LTDZ)组樟叶越桔茎段愈伤组织诱导成苗示意图；
图5为本发明B1(WMP+6-BA1.5mg/L+NAA0.5mg/L)组樟叶越桔茎段愈伤组织诱导成苗后生根示意图。
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合附图为本发明做进一步的详细描述，在此通过以下实施例对本发明做进一步的详细说明，但本发明的内容并不局限于此。
本发明提供的以茎段为外植体的樟叶越桔组织培养方法以樟叶越桔的茎段为外植体进行樟叶越桔组培苗进行培养，包括以下步骤：
步骤一：培养基配置，以WPM为基本培养基，加入激素，并调节培养基的pH在灭菌后的pH为5.8；加入的激素为NAA和TDZ，NAA和TDZ的浓度根据培养情况设定，在此采用NAA0.01mg/L～0.1mg/L，具体为0.01mg/L、0.05mg/L或0.1mg/L；TDZ0.1～1.5mg/L，具体为0.1mg/L、0.5mg/L、0.6mg/L、0.8mg/L、1.0mg/L或1.5mg/L；
步骤二：茎段愈伤诱导，取长成5cm左右的茎段健壮的樟叶越桔组培苗，在无菌操作台内去除叶片，将茎段切成1cm～1.5cm长茎段，并对表面进行划伤处理后置于愈伤诱导培养基表面，如图1所示；按照步骤一配置的培养基中对茎段进行愈伤诱导；可以根据培养要求同时进行多组培养，如培养2组以上，每组5瓶，每瓶接种茎段6段。如图2所示，经过5～10天长出愈伤组织；
步骤三：不定芽诱导，将经步骤二诱导40～50天长成2～3片叶片的幼苗转入不定芽诱导培养基中进行继续培养，形成樟叶越桔茎段愈伤组织诱导不定芽和樟叶越桔茎段愈伤组织诱导成苗，分别如图3和图4所示；该不定芽诱导培养基为：WPM+NAA0.01～0.1mg/L+TDZ0.1～1.5mg/L，pH为5.8；NAA和TDZ的浓度根据培养情况设定，在此采用NAA0.01mg/L～0.1mg/L，具体为0.01mg/L、0.05mg/L或0.1mg/L；TDZ0.1～1.5mg/L，具体为0.1mg/L、0.5mg/L、0.6mg/L、0.8mg/L、1.0mg/L或1.5mg/L；
步骤四：樟叶越桔组培苗的生根诱导，经步骤三不定芽诱导培养40天左右，长成3cm左右健壮的樟叶越桔组培苗接种于生根培养基中进行诱导生根，得到樟叶越桔生根苗，如图5所示；生根培养基为：WMP+6-BA1.5mg/L+NAA0.5mg/L；诱导生根的时间根据樟叶越桔组培苗生长情况而定，一般为30～40天。
以上步骤二中培养条件为：培养温度23±2℃，光照强度1500～2500lx，光照周期比12h:12h；步骤三中不定芽诱导培养的条件为：培养温度25±2℃，光照强度1500～2500lx，光照周期比12h:12h；步骤四中诱导生根的条件为：培养温度25±2℃，光照强度1500～2500lx，光照周期比12h:12h。
本发明提供的培养方法中的步骤一中培养基和不定芽诱导培养基的pH值用1mol/LNaOH或HCl来调节。
本发明通过不定芽诱导技术使用樟叶越桔组培苗的茎段作为外植体，进行直接诱导不定芽，完善樟叶越桔组织培养体系，为樟叶越桔转基因体系的建立奠定基础，并未生产大量富含CA的樟叶越桔组培苗提供理论基础。
以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，本领域普通技术人员对本发明的技术方案所做的修改或等同替换，只要不脱离本发明的技术方案的精神和范围，均涵盖在本发明的权利要求范围内。
Claims (5)
1.一种以茎段为外植体的樟叶越桔组织培养方法，其特征在于：该方法以樟叶越桔的茎段为外植体进行樟叶越桔组培苗进行培养，该方法外植体诱导率达79.19％，芽苗生根率达94％；包括以下步骤：
步骤一：培养基配置，以WPM为基本培养基，加入0.01mg/L～0.1mg/LNAA和0.1～1.5mg/LTDZ，并调节培养基的pH在灭菌后的pH为5.8；
步骤二：茎段愈伤诱导，取茎段健壮的樟叶越桔组培苗，去除叶片，将茎段切成长茎段，并对表面进行划伤处理后置于由步骤一所配置的培养基中进行愈伤诱导培养；
步骤三：不定芽诱导培养，将经步骤二诱导40～50天长成2～3片叶片的幼苗转入不定芽诱导培养基中进行不定芽诱导培养，形成樟叶越桔茎段愈伤组织诱导不定芽和樟叶越桔茎段愈伤组织诱导成苗；不定芽诱导培养基为：WPM+0.01～0.1mg/LNAA+0.1～1.5mg/LTDZ，pH为5.8；
步骤四：樟叶越桔组培苗的生根诱导，将步骤三不定芽诱导培养40天，长成3cm健壮的樟叶越桔组培苗接种于生根培养基中进行诱导生根，诱导生根的时间为：30～40天得到樟叶越桔生根苗；生根培养基为：WPM+6-BA 1.5mg/L+NAA 0.5mg/L。
2.根据权利要求1所述的以茎段为外植体的樟叶越桔组织培养方法，其特征在于：所述培养基和所述不定芽诱导培养基的pH值用1mol/L NaOH或HCl来调节。
3.根据权利要求1所述的以茎段为外植体的樟叶越桔组织培养方法，其特征在于：所述步骤二中培养条件为：培养温度23±2℃，光照强度1500～2500lx，光照周期比12h:12h。
4.根据权利要求1所述的以茎段为外植体的樟叶越桔组织培养方法，其特征在于：所述步骤三中不定芽诱导培养的条件为：培养温度25±2℃，光照强度1500～2500lx，光照周期比12h:12h。
5.根据权利要求1所述的以茎段为外植体的樟叶越桔组织培养方法，其特征在于：所述步骤四中诱导生根的条件为：培养温度25±2℃，光照强度1500～2500lx，光照周期比12h:12h。
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