CN102617530B - 一种从意大利苍耳提取的化合物及其作为除草剂的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种从意大利苍耳提取纯化苍耳皂素的方法及其作为除草剂的应用。意大利苍耳果实用95％乙醇浸提后经石油醚脱脂及一次硅胶柱层析和一次凝胶柱层析后得到纯度达95％以上的本化合物，将其用95％乙醇溶解后，经稀释10000-20000倍，于杂草出苗前喷洒，喷施浓度500-1000μg/ml。作为植物源除草剂，该化合物在自然界易于分解，不污染环境，并对有害植物进行了废物利用，具有重要的实用价值。
Description
发明领域
本发明涉及除草剂苍耳皂素技术领域，具体的说，本发明涉及一种自有害植物意大利苍耳提取纯化的苍耳皂素并将其作为除草剂应用技术领域。
背景技术
农业生产中大量使用的化学除草剂由于缺乏相应的微生物对其进行分解，容易在自然界长期留存，造成对土壤以及地下水资源的污染。而利用从自然界中提取的天然成分作为除草剂，则因其易于分解、在自然界没有残留而日益受到科研界的重视。苍耳皂素，英文名Xanthinosin，结构参见附图8，为一种倍半萜内酯，主要由苍耳属植物分离得到。利用本专利的提取技术，可从外来有害入侵植物意大利苍耳中分离得到纯度达95％以上的纯品。苍耳皂素被报道具有抑制微生物生长及肿瘤细胞生长和抗溃疡等作用，但是苍耳皂素对其它植物的生长抑制作用(植物毒作用)国内外均未见报道，参见文献1-5。目前已有关于其人工化学合成方法的报道，参见文献6。
用以提取苍耳皂素的外来植物意大利苍耳，于1991年首次在北京发现，目前已扩散至河北、山东、广东、新疆等地，参见文献7。生态模型预测显示，我国大部分地区为其适生区，意大利苍耳具有进一步扩散蔓延的潜力，参见文献8。该植物生长迅速，生物量大，可与本土植物竞争养分和空间，严重危害入侵地的农林牧业生产以及生态系统稳定。用其做原料提取苍耳皂素，既对其进行了利用，又有利于控制其进一步发展。此外，苍耳属的其它植物材料如苍耳等也可用以提取苍耳皂素，因此，原料来源广泛。
参考文献：
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发明内容
针对国内外未见有关从自有害植物意大利苍耳提取苍耳皂素，以及应用于除草剂的技术现状。本发明的目的在于提供一种从自有害植物意大利苍耳提取苍耳皂素的方法，以及作为除草剂的应用，这种作为除草剂来源于植物，可以在自然界分解，不污染环境，同时对有害植物进行了废物利用。
本发明具体提供一种从自有害植物意大利苍耳提取苍耳皂素的方法，具体提取步骤如下：
(1)采集成熟期的意大利苍耳植株，将果实与其它部位分离，晾干后粉碎备用。
(2)将粉碎后的意大利苍耳果实用五倍体积的95％在室温下浸泡七天；将浸泡液经过滤后去除残渣，然后将滤液用旋转蒸发仪蒸至无醇味；
(3)取上述步骤(2)浓缩后的提取物，用蒸馏水搅拌得混悬液；加入等体积石油醚萃取三次，弃掉石油醚部位；
(4)上述步骤(3)脱脂后的混悬液再用等体积的三氯甲烷萃取三次，合并三氯甲烷相并用旋转蒸发仪浓缩至干；
(5)将三氯甲烷萃取物用100-200目硅胶柱层析进行分离，采用三氯甲烷：甲醇按比例为98∶2(v/v)洗脱；
(6)洗脱组分浓缩后，取含黄色油状物组分上Sephadex LH-20柱层析，用三氯甲烷：甲醇按比例为1∶1洗脱(v/v)，即可得到纯度达95％以上的苍耳皂素。
同时，本发明提供了一种苍耳皂素作为除草剂的应用。通过将苍耳皂素用95％乙醇溶解后，在使用前稀释10000-20000倍，于杂草出苗前按照喷施浓度500-1000μg/ml喷洒。
通过实施本发明具体的技术内容，可以达到以下有益效果。
1.本发明提供的苍耳皂素在低浓度40μg/ml时，即可对单、双子叶植物生长产生显著抑制。当浓度达到200μg/ml时，其对双子叶植物苋菜的根长抑制率达到78％，对生菜达到89％，对单子叶植物小麦为69％，对黑麦草为67％。此外，受试植物的根扭曲变形，颜色变褐，提示已受到较严重的毒害。对苗高的抑制率为：苋菜58％，生菜67％，小麦36％，40％。幼苗也发生扭曲变形现象。总体来说，本发明提供的苍耳皂素对双子叶植物的抑制作用更为明显；而当浓度升高到1000μg/ml时，可导致所有植物的种子基本完全不发芽而死亡。本发明提供的苍耳皂素和商业除草剂扑草净进行比较实验检测对上述四种植物的生长抑制作用，结果显示，当使用浓度高于200μg/ml时，则苍耳皂素对四种植物的抑制作用显著强于扑草净。
2.当将苍耳皂素与水混悬后，以5mg/kg土壤的比例添加到土壤中进行盆栽实验时，双子叶植物生菜在出土发芽一周后基本停止生长，叶片出现枯黄现象，根系出现死亡，随后植株逐渐死亡；双子叶植物萝卜显示出类似的现象，幼苗出土后生长不良，叶片枯萎变黄，根系首先死亡，植株随后死亡；作为对照，苍耳皂素对单子叶植物小麦的影响很小，在处理六周之后植株生长基本正常。
3.苍耳皂素适合应用于农田中进行杂草的防除；由于其对单子叶植物如小麦等的影响远小于对双子叶植物的作用，因此苍耳皂素更适合作为麦田防除双子叶杂草使用。苍耳皂素提取自外来入侵有害植物意大利苍耳，该植物在野外生长繁茂，高度可达两米以上，生物量高，从中提取除草剂既有利于环保，又对有害植物进行了综合利用，有利于对其进行防控。苍耳皂素为天然成分，在自然界可快速分解，不污染环境，可应用于有机农业的杂草防除。本发明通过除草剂专利可以突出它是来源于植物的，可以在自然界分解，环保不污染环境，同时对有害植物进行了废物利用。
附图说明
图1为苍耳皂素对两种单子叶植物小麦和黑麦草和两种双子叶植物苋菜和生菜根长的抑制作用图，图中，其作用浓度分别为8，40，200，1000μg/ml。
图2为苍耳皂素对两种单子叶植物小麦和黑麦草和两种双子叶植物苋菜和生菜苗高的抑制作用图，图中，其作用浓度分别为8，40，200，1000μg/ml。
图3为扑草净对两种单子叶植物小麦和黑麦草和两种双子叶植物苋菜和生菜根长的抑制作用图，图中，其作用浓度分别为8，40，200，1000μg/ml。
图4为扑草净对两种单子叶植物小麦和黑麦草和两种双子叶植物苋菜和生菜苗高的抑制作用，图中，其作用浓度分别为8，40，200，1000μg/ml。
图5为添加苍耳皂素的生菜幼苗盆栽实验图，图中，左侧三盆为对照，未添加苍耳皂素；右侧为添加苍耳皂素的处理，添加比例为5mg/kg土壤。
图6为添加苍耳皂素的萝卜幼苗盆栽实验图，图中，左侧三盆为对照，未添加苍耳皂素；右侧为添加苍耳皂素的处理，添加比例为5mg/kg土壤。
图7为添加苍耳皂素的小麦幼苗盆栽实验图，图中，左侧三盆为对照，未添加苍耳皂素；右侧为添加苍耳皂素的处理，添加比例为5mg/kg土壤。
图8为苍耳皂素化学结构式。
具体实施方式
下面，举实施例说明本发明，但是，本发明并不限于下述的实施例。
本发明中选用的所有原辅材料、试剂和仪器都为本领域熟知的，其他本领域熟知的一些试剂和设备都可适用于本发明以下实施方式的实施。
实施例一：苍耳皂素的提取
本发明具体提供一种苍耳皂素从自有害植物意大利苍耳提取的方法，具体提取步骤如下：
(1)将意大利苍耳果实干燥后用粉碎机粉碎：首先采集成熟期的意大利苍耳植株，将果实与其它部位分离，晾干后用粉碎机打碎备用；
(2)用五倍体积的95％乙醇浸泡数日并浓缩：将粉碎后的意大利苍耳果实用五倍体积的95％在室温下浸泡七天；将浸泡液经过滤以去除残渣，然后将滤液用旋转蒸发仪蒸至无醇味，95％乙醇为常用乙醇试剂；
(3)浓缩后的物质用石油醚脱脂：取上述浓缩后的提取物，用温水搅拌得混悬液；加入等体积石油醚萃取三次，弃掉石油醚部位；
(4)脱脂后的剩余物用三氯甲烷萃取并浓缩：上述脱脂后的混悬液再用等体积的三氯甲烷萃取三次，合并三氯甲烷相并用旋转蒸发仪浓缩至干；
(5)对三滤甲烷萃取物进行100-200目硅胶柱层析分离：将三氯甲烷萃取物用100-200目硅胶柱层析进行分离，采用三氯甲烷：甲醇按比例为98∶2(v/v)洗脱；
(6)洗脱组分浓缩后，取最先洗脱下来的黄色油状物组分上SephadexLH-20柱层析，用三氯甲烷：甲醇按比例为1∶1洗脱(v/v)，即可得到纯度达95％以上的苍耳皂素，苍耳皂素结构参见附图8。
实施例二：苍耳皂素与商业除草剂的作用比较
具体实验方法：将纯化后的苍耳皂素用三氯甲烷配制成1mg/ml浓度，然后依次稀释至8μg/ml，40μg/ml，200μg/ml.在直径9cm的培养皿中放置滤纸，然后加入3ml的不同浓度的苍耳皂素溶液，依次是8μg/ml，40μg/ml，200μg/ml、1000μg/ml。待三氯甲烷彻底挥发干净后，在每个培养皿中加入3ml蒸馏水，并在每个培养皿中加入10粒苋菜，生菜，小麦，黑麦草种子；用封口膜封好后置于25℃培养箱中培养4天后测量苋菜，生菜，小麦的苗高和根长，5天后测量黑麦草的苗高和根长；采用商业除草剂扑草净用同样方法进行试验。
数据统计方法：首先用单因素方差检测各组数据间的差异是否达到，之后用LSD方法分析数据，标记有*者与对照差异达到显著，水平为＞0.05。
结果：本发明提供的苍耳皂素在浓度较低的40μg/ml时，即对受试植物产生显著抑制作用；当浓度达到200μg/ml时，其对双子叶植物苋菜的根长抑制率达到78％，对生菜达到89％，对单子叶植物小麦为69％，对黑麦草为67％；此外，受试植物的根扭曲变形，颜色变褐，提示已受到较严重的毒害；对苗高的抑制率为：苋菜58％，生菜67％，小麦36％，40％；幼苗也发生扭曲变形现象。
总体来说，本发明提供的苍耳皂素对双子叶植物的抑制作用更为明显。而当浓度升高到1000μg/ml时，可导致所有植物的种子基本完全不发芽而死亡，参见附图1、2。和商业除草剂扑草净进行比较实验检测对上述四种植物的生长抑制作用，结果显示使用浓度低于200μg/ml时，苍耳皂素对四种植物的抑制作用略低于扑草净；但是当使用浓度高于200μg/ml时，则苍耳皂素对四种植物的抑制作用显著强于扑草净，参见附图3、4。
实施例三：苍耳皂素作为除草剂的应用。
具体实验方法：将本发明提供的苍耳皂素纯品与水混悬后，以5mg/kg土壤的比例添加到直径20厘米的花盆中进行盆栽实验。实验用植物为苋菜，生菜，小麦，黑麦草。常规灌溉，未施肥。数周后进行观测。
结果：双子叶植物生菜在出土发芽一周后基本停止生长，叶片出现枯黄现象，根系出现死亡，随后植株逐渐死亡。参见附图5为培养四周后的生菜幼苗。双子叶植物萝卜显示出类似的现象，幼苗出土后生长不良，叶片枯萎变黄，根系首先死亡，植株随后死亡。参见附图6为培养三周后的萝卜幼苗。作为对照，苍耳皂素对单子叶植物小麦的影响很小，在处理六周之后植株生长基本正常。参见附图7为培养六周后的小麦幼苗。
结论：
1.本发明提供的苍耳皂素在低浓度40μg/ml时，即可对单、双子叶植物生长产生显著抑制。当浓度达到200μg/ml时，其对双子叶植物苋菜的根长抑制率达到78％，对生菜达到89％，对单子叶植物小麦为69％，对黑麦草为67％。此外，受试植物的根扭曲变形，颜色变褐，提示已受到较严重的毒害。对苗高的抑制率为：苋菜58％，生菜67％，小麦36％，40％。幼苗也发生扭曲变形现象。总体来说，苍耳皂素对双子叶植物的抑制作用更为明显。而当浓度升高到1000μg/ml时，可导致所有植物的种子基本完全不发芽而死亡。其作用与商业除草剂扑草净相当。效果参见附图1至图4。
2.当将苍耳皂素与水混悬后，以5mg/kg土壤的比例添加到土壤中进行盆栽实验时，双子叶植物生菜在出土发芽一周后基本停止生长，叶片出现枯黄现象，根系出现死亡，随后植株逐渐死亡。双子叶植物萝卜显示出类似的现象，幼苗出土后生长不良，叶片枯萎变黄，根系首先死亡，植株随后死亡。作为对照，苍耳皂素对单子叶植物小麦的影响很小，在处理六周之后植株生长基本正常。效果参见附图5至图7。
将本发明提供的苍耳皂素适合应用于农田中进行杂草的防除；由于其对单子叶植物如小麦等的影响远小于对双子叶植物的作用，因此苍耳皂素更适合作为麦田防除双子叶杂草使用。苍耳皂素提取自外来入侵有害植物意大利苍耳，该植物在野外生长繁茂，高度可达两米以上，生物量高，从中提取除草剂既有利于环保，又对有害植物进行了综合利用，有利于对其进行防控。苍耳皂素为天然成分，在自然界可快速分解，不污染环境，可应用于有机农业的杂草防除。本发明通过提供的苍耳皂素作为除草剂可以突出它是来源于植物的，可以在自然界分解，环保不污染环境，同时对有害植物进行了废物利用。
Claims (2)
1.一种从意大利苍耳提取苍耳皂素的方法，其特征在于，所述的具体提取步骤如下：
(1)采集成熟期的意大利苍耳植株，将果实与其它部位分离，晾干后粉碎备用；
(2)将粉碎后的意大利苍耳果实用五倍体积的95％乙醇在室温下浸泡七天；将浸泡液经过滤以除去残渣，然后将滤液用旋转蒸发仪蒸至无醇味；
(3)取上述步骤(2)浓缩后的提取物，用温水搅拌得混悬液；加入等体积石油醚萃取三次，弃掉石油醚部位；
(4)上述步骤(3)脱脂后的混悬液再用等体积的三氯甲烷萃取三次，合并三氯甲烷相并用旋转蒸发仪浓缩至干；
(5)将三氯甲烷萃取物用100-200目硅胶柱层析进行分离，采用三氯甲烷：甲醇按比例为98∶2(v/v)洗脱；
(6)洗脱组分浓缩后，取最先洗脱下来的黄色油状物组分上Sephadex LH-20柱层析，用三氯甲烷：甲醇按比例为1∶1洗脱(v/v)，即可获得纯度95％以上的苍耳皂素。
2.一种如权利要求1所述的苍耳皂素作为除草剂的应用，其特征在于，通过将权利要求1所提供的苍耳皂素用95％乙醇溶解后，经稀释10000-20000倍，在杂草出苗前按照喷施浓度500-1000μg/ml喷洒。
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