CN102816784A - 洋甘菊法尼基焦磷酸合酶（fps）基因真核表达载体的构建及转化 - Google Patents
洋甘菊法尼基焦磷酸合酶（fps）基因真核表达载体的构建及转化 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了一种洋甘菊法尼基焦磷酸合酶（FPS）基因真核表达载体的构建及转化方法，从洋甘菊花瓣中提取RNA，以洋甘菊总RNA为模板，反转录为cDNA；然后以cDNA为模板；进行PCR扩增；得到目的片段，目的片段与T4连接酶连接，将连接产物转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，得到真核表达载体PBI121/FPS，然后将重组表达载体导入根癌农杆菌EHA105后，根癌农杆菌EHA105侵染模式植物云烟85等过程，最终获得抗性烟草植株。本发明利用基因工程技术克隆FPS基因，借助根癌农杆菌侵染植株的愈伤组织，通过FPS基因在植物体内的表达为提高母菊薁产量作铺垫。
Description
技术领域
本发明涉及生物技术领域，具体地说是一种洋甘菊法尼基焦磷酸合酶基因克隆及真核表达与应用。
背景技术
洋甘菊(Matricaria chamomilla L.)为菊科母菊属的一年生草本植物，全草芳香，含有芳香性挥发油。洋甘菊具有消炎、抑制真菌、解痉[1-3]、改善肺癌病人症状等作用。洋甘菊原产欧洲，本世纪初引种我国，现北京，上海、江苏、湖南等地少有栽培。洋甘菊含有多种化学成分：挥发油、黄酮苷类、愈创薁内醋类、香豆精素、多糖类、有机酸等成分。洋甘菊挥发油是花序中最主要的有效成分,其挥发油由于独特的香气而广泛用于食品、饮料、烟草、日化、医药等领域中，是一种极具开发价值的药用植物和香料植物。洋甘菊花中精油含量在0.2%～0.8%,最高可达1.9%。洋甘菊挥发油呈暗蓝色,芳香,久置或在日光照射下不久既可变成绿色,直至呈褐色。作为一种很有经济价值的植物,在我国尚未得到充分的开发及利用。
母菊薁（1，4-二甲基-7-乙基薁）属于倍半萜类物质，是母菊挥发油中最有价值的成分之一,欧洲各国常根据它在挥发油中的含量,作为评定药材质量的标准。因产地、生长条件的差异及化学变种的存在，各地洋甘菊挥发油中的蓝香油薁的含量往往变化很大,据欧洲某些国家的资料,蓝香油薁在挥发油中的含量可在0～18.8%之间。母菊薁在花盛开时的含量最高。母菊薁及其合成衍生物愈创薁均有消炎作用。愈创薁对大鼠的右旋糖配性浮肿有显著抑制作用对透明质酸酶、甲醛、组织胺性浮肿仅有中等程度的抑制。为了更好地开发利用我国引种的洋甘菊资源,杨彦松等对新疆洋甘菊头状花序中的黄酮类化学成分进行了研究,从其95%乙醇提取物中分离得到2个黄酮类化合物。目前，虽然国内外很多文章报道了洋甘菊挥发油成分分析,及洋甘菊挥发油抗炎，抗肿瘤及对小鼠伤口愈合的促进作用等。但尚未有洋甘菊挥发油中控制母菊薁代谢途径有关酶类及基因的研究。母菊薁的代谢途径为异戊二烯生物合成途径，此过程有三个比较重要的限速酶，分别是HMG-CoA还原酶（HMGR），法尼基焦磷酸合酶（FPS）和倍半萜合酶。法尼基焦磷酸合酶（FPS）是控制母菊薁合成的关键酶，利用基因工程技术克隆FPS基因，借助根癌农杆菌侵染洋甘菊的愈伤组织，可提高母菊薁产量，对医药行业贡献极大。
发明内容
本发明的目的是提供一种洋甘菊法尼基焦磷酸合酶（FPS）基因真核表达载体的构建及转化方法。
本发明采用如下技术方案：
一种洋甘菊法尼基焦磷酸合酶（FPS）基因真核表达载体的构建及转化方法，具体按如下步骤进行：
（1）洋甘菊FPS RNA的提取
从洋甘菊花瓣中提取RNA，保存在-70℃冰箱中备用；
（2）洋甘菊FPS基因RT-PCR扩增
根据洋甘菊法呢基焦磷酸合酶mRNA全长序列设计引物：
上游引物：5'（BamHI）CG GGATCC ATGAGTATCGTGGATCTGAAATCAAAGTTTT 3'
下游引物：5'（SacI） C GAGCTC CTACTTTTGCCTCTTGTAGATTTTACCCAAG 3'
其中GGATCC与GAGCTC分别为BamHI和SacI的酶切位点；以洋甘菊总RNA为模板，反转录为cDNA；然后以反转录的单链cDNA为模板，采用TransStart Taq DNA Polymerase进行PCR扩增；用PCR纯化回收试剂盒回收目的片段，-20℃保存；
（3）PCR扩增产物的阳性克隆和鉴定
克隆载体：pEASY-T4 Zero Cloning vector
连接：4.5μlPCR产物+0.5μlT载体，25℃连接13分钟；
转化：取50μl DH5a感受态加入5μl上述连接产物，冰上放置20-30min.42℃热激30s，立即放在冰上2-3min,加入400μl不加AMP的液体LB培养基；37℃，200转孵育培养1h；取100μl培养液均匀涂布于AMP,IPTG,X-gal的平板上；37℃倒置培养12-16h；挑白色单菌落于1ml含AMP的LB培养基中，37℃振荡培养5-6h，采用M13引物进行菌液PCR鉴定，以降低假阳性的干扰；筛选阳性重组克隆进行DNA测序,用DNAMAN序列分析软件对测序结果进行分析；
（4）质粒提取
按照质粒提取试剂盒的步骤分别提取克隆载体T和表达载体PBI121；
（5）双酶切
使用BamHI和SacI两种限制性内切酶对T质粒和PBI 121质粒进行切割，20μl体系37℃切3小时，然后加10XBuffer 2ml终止反应，跑胶观察质粒是否被切开；切开后，切胶回收T质粒和PBI121质粒中实验所需要的片段；双酶切体系：BamHI 1μl，SacI 1μl，10x K Buffer 1μl，质粒8μl，灭菌水定容至20μl；
（6）切胶回收
针对双酶切后的克隆载体T和表达载体PBI121，采用切胶回收试剂盒根据实验所需进行回收基因片段；
（7）重组质粒pBI121/FPS的构建
T4连接酶连接体系：T4连接酶1μl，T4Buffer 1μl，表达载体1.5μl，目的片段6.5μl；在PCR仪中16℃连接16h；取上述连接产物5μl加入50μl的DH5a的感受态细胞中进行转化；摇菌1.5h，涂板，37℃倒置培养16h；挑单菌落摇菌，PCR鉴定和酶切验证重组子。
（8）重组子导入感受态农杆菌
取-70℃保存的EHA105农杆菌感受态细胞置于冰上融化，分别向200μl感受态细胞中加入8μl表达载体质粒，混匀；冰浴30min，转入液氮中速冻1min，37℃温育5min，迅速放置冰上2min；然后加入800μlLB液体培养基，28℃，200rpm/min振荡培养5h；取300μl培养液均匀涂布于含80μg/mlKan的平板上，待菌液被吸收后倒置培养皿；28℃暗培养1-2天，挑取单菌落，28℃，200rpm/min振荡培养；取上述转化菌液用PCR法进行检测。
法尼基焦磷酸合酶（FPS）是控制母菊薁合成的关键酶，本发明利用基因工程技术克隆FPS基因，借助根癌农杆菌侵染洋甘菊的愈伤组织，可提高母菊薁产量，对医药行业贡献极大。
以下结合附图通过具体实施方式对本发明技术方案做进一步说明。
附图说明
图1是洋甘菊总RNA电泳图。
图2是洋甘菊FPS基因ORF框的PCR结果。
图2中M为DNA分子量标准1为PCR产物。
图3是切胶纯化回收前后的目的DNA图谱。
图3中M为DNA分子量标准1为胶回收产物。
图4是蓝白斑筛选照片。
图5是M13引物菌液PCR。
图5中M是.DNA分子量标准1是菌液PCR产物。
图6为提取的T质载体电泳图谱。
图6中M为DNA分子量标准；1为提取的T质粒.
图7为提取的表达载体PBI121电泳图谱。
图7中M为DNA分子量标准；1为提取的表达载体PBI121。
图8是双酶切电泳图。
图8中M是DNA分子量标准，1是双酶切的T质粒，2是未酶切的T质粒，3是双酶切的PBI121质粒，4.是未酶切的PBI121质粒。
图9是PBI121/FPS的PCR鉴定电泳图。
图9中M是DNA分子量标准，1是菌液PCR产物。
图10是转化到根癌农杆菌EHA105的PBI121-FPS质粒菌液PCR鉴定电泳图。
图10中M是DNA分子量标准1是菌液PCR产物。
具体实施方式
1.材料与方法
1.1实验材料
1.1.1植物材料：洋甘菊花（采自安徽农业大学农萃园）、云烟85烟草无菌苗（安徽农业大学生命科学学院组织培养室提供）。
1.1.2菌株和质粒：大肠杆菌DH5a感受态细胞购于TAKARA公司，农杆菌EHA105，pBI121载体是安徽农业大学生命科学院江海洋老师惠赠，pEASY-T4 Zero Cloning Vector和Trans1-T1感受态细胞均购自北京全式金生物技术有限公司。
1.1.3主要生物学试剂：限制性内切酶SacI、BamHI，T4DNA连接酶，rtaq均购于TAKARA公司，TransStart Taq DNA Polymerase购自北京全式金生物技术有限公司，RNAiso plus，DNA分子量标准，DNA胶回收试剂盒及质粒提取试剂盒购于TAKARA公司，引物合成及DNA序列测定由英骏生物技术有限公司完成，其他试剂均为国产分析纯。
1.2试验方法
1.2.1RNA的提取
液氮研磨0.2g洋甘菊花瓣至粉末状，2ml RNAiso plus，覆盖样品，室温静置15min。至样品完全融化，再用研杵研磨至裂解液呈透明状。将匀浆转移至离心管，室温静置5min。12000rpm,4℃，15min,吸取上清。加200ul氯仿，剧烈震荡15s，待溶液充分乳化。12000rpm,4℃，15min,吸取上层水相。加600ul异丙醇，上下颠倒混匀，15-30℃下静置10min.12000rpm,4℃，10min,去上清。加1ml75%乙醇，12000rpm,4℃，5min，去乙醇。室温干燥2-5min，加入20ulDEPC水。将提取的RNA保存在-70℃冰箱中备用。
1.2.2洋甘菊中FPS基因RT-PCR扩增
根据洋甘菊法呢基焦磷酸合酶mRNA全长序列设计出引物：
上游引物：5'（BamHI）CG GGATCC ATGAGTATCGTGGATCTGAAATCAAAGTTTT 3'
下游引物：5'（Sac I）C GAGCTC CTACTTTTGCCTCTTGTAGATTTTACCCAAG 3'
其中GGATCC与GAGCTC分别为BamHI和SacI的酶切位点。
以洋甘菊反转录的单链cDNA为模板，设定一定梯度的引物退火温度，采用TransStart Taq DNAPolymerase进行PCR扩增。TransStart Taq DNA Polymerase延伸速度为1-2kb/min，扩增产物3'端带“A”碱基，可直接用于TA载体克隆。反应体系:25μl反应体系
扩增程序:94℃预变性5min,94℃30sec，55℃退火30sec,72℃延伸1min，共33个循环。用PCR纯化回收试剂盒回收目的片段，-20℃保存。
1.2.3PCR扩增产物的阳性克隆和鉴定
克隆载体：pEASY-T4 Zero Cloning vector
连接：4.5μlPCR产物+0.5μlT载体，25℃连接13分钟。
转化：取50μl DH5a感受态加入5μl上述连接产物，冰上放置20-30min.42℃热激30s，立即放在冰上2-3min,加入400μl不加AMP的液体LB培养基。37℃，200转孵育培养1h。取100μl培养液均匀涂布于AMP,IPTG,X-gal的平板上。37℃倒置培养12-16h。
1.2.4蓝白斑筛选
挑白色单菌落于1ml含AMP的LB培养基中，37℃振荡培养5-6h，采用M13引物进行菌液PCR鉴定，以降低假阳性的干扰。筛选阳性重组克隆进行DNA测序,用DNAMAN序列分析软件对测序结果进行分析。
M13引物PCR的扩增程序
1.2.5质粒提取
按照质粒提取试剂盒的步骤分别提取克隆载体T和表达载体PBI121。
1.2.6双酶切
使用BamHI和SacI两种限制性内切酶对T质粒和PBI121质粒进行切割，20μl体系37℃切3小时，然后加10XBuffer 2μl终止反应，跑胶观察质粒是否被切开。切开后，切胶回收T质粒和PBI121质粒中实验所需要的片段。双酶切体系：BamHI 1μl，SacI 1μl，10x K Buffer 1μl，质粒8μl，灭菌水定容至20μl。
1.2.7切胶回收
针对双酶切后的克隆载体T和表达载体PBI121，采用切胶回收试剂盒根据实验所需进行回收基因片段。
1.2.8重组质粒pBI121/FPS的构建
T4连接酶连接体系：T4连接酶1μl，T4Buffer 1μl，表达载体1.5μl，目的片段6.5μl。在PCR仪中16℃连接16h。表达载体和目的片段的量可适当调整，两者共加入8μl。本实验中加入表达载体1.5μl，目的片段6.5μl，效果较好。
取上述连接产物5μl加入50μl的DH5a的感受态细胞中进行转化。摇菌1.5h，涂板，37℃倒置培养16h。挑单菌落摇菌，PCR鉴定和酶切验证重组子。
1.2.9农杆菌感受态的制备
农杆菌感受态的制备参照卢圣栋（1999）氯化钙法：
（1）从LB平板（含80ug/L利福平）上挑取根癌农杆菌单菌落，接种于5Ml含80μg/L利福平的LB液体培养基中，200rpm/min,28摄氏度培养过夜。
（2）取2ml过夜培养菌液接种于50ml含相同抗生素的YEB液体培养基中，在相同条件下培养至OD600达0.5.
（3）菌液冰浴30min。
（4）4摄氏度，5000rpm/min离心10min收集菌体。
（5）将菌体悬浮于10Ml,0.15mol/L的NaCl中。
（6）再将菌体悬浮于1ml,20mmol/L的CaCl2溶液中。
（7）以0.2ml一份将菌悬浮液分装在1.5ml离心管中，置液氮中速冻1min,-70度冰箱保存备用。
1.2.10重组子导入感受态农杆菌
取-70℃保存的EHA105农杆菌感受态细胞置于冰上（或4℃）融化，分别向200μl感受态细胞中加入8μl表达载体质粒，混匀。冰浴30min，转入液氮中速冻1min，37℃温育5min，迅速放置冰上2min。然后加入800μlLB液体培养基（不含抗生素），28℃，200rpm/min振荡培养5h。取300μl培养液均匀涂布于含80μg/mlKan的平板上，待菌液被吸收后倒置培养皿。28℃暗培养1-2天，挑取单菌落，28℃，200rpm/min振荡培养。取上述转化菌液用PCR法进行检测。
1.2.11FPS基因采用叶盘法转化烟草外植体
农杆菌转化烟草的程序参照Horhsetal，1985的方法，所有的操作均在无菌条件下进行。
将烟草无菌苗叶片切成约0.5cmX0.5cm大小，接种至MS+6-BA(2mg/L)+NAA(0.2mg/L)的固体培养基上，预培养3天。
接种转化的农杆菌菌落于LB(含50mg/LRif和100mg/LKan)中，28℃培养至对数中期。4000rpm离心10分钟，用MS液体培养基(含AS100ug/L)悬浮菌体，OD值为0.6。用农杆菌菌液浸泡预培养的烟草叶片，15分钟后取出，转至无菌滤纸吸干，将吸干的烟草叶片转至MS+6-BA(2mg/L)+NAA(0.2mg/L)固体培养基上，25℃黑暗共培养3天，将共培养的叶片进行脱菌（Cef 400mg/L），放至无菌滤纸吸干，然后，转至MS+6-BA(2mg/L)+NAA(0.2mg/L)+Cef(400mg/L)+Kan(75mg/L)的固体培养基上，25℃光培养，两周后，在叶缘处可见愈伤组织;叶片继续在MS+6-BA(2mg/L)+NAA(0.2mg/L)+Cef(400mg/L)+Kan(75mg/L)的固体培养基中培养，观察脱菌效果，适时脱菌。一个月后可长出小芽。
2.结果与分析
2.1RNA的提取
提取的洋甘菊总RNA，用1%的琼脂糖凝胶电泳检测其完整性。由图1可以看出提取的RNA较清晰的两条带分别为28S和18S，且28S的亮度大于18S，所以RNA的完整性较好，没有发生降解且不存在DNA污染。进一步通过紫外分光光度法测得吸光度A260/A280为1.9，A260/A230为1.9.说明酚类、多糖、蛋白质以及无机盐等杂质已排除，此次提得的RNA较成功。
2.2目的基因的RT-PCR扩增
以洋甘菊总RNA为模板，反转录为cDNA，然后，以此为模板进行PCR扩增反应，得到洋甘菊FPS基因，序列分析FPS基因全长为1098bp,含有1032bp的开放阅读框，如图2。同时，由梯度试验可知，引物最佳退火温度为55℃。
2.3切胶纯化回收前后的目的DNA图谱
将100μlFPS基因的PCR产物加入大的胶孔中，经1%的琼脂糖凝胶电泳，然后，利用TAKARA切胶回收试剂盒回收实验所需目的片段（如图3）。
2.4蓝白斑筛选
如图4，FPS基因连接克隆载体pEASY-T4 Zero Cloning Vector，转入大肠杆菌DH5a中，37℃暗培养16h后，LB平板上出现的蓝色斑点是未转化成功的菌落，白色斑点是转化成功的菌落。
2.5采用M13引物菌液PCR
从LB平板上挑取白色的单菌落，采用M13引物进行菌液PCR，可得到清晰的目的条带（如图5）。
2.6测序结果
对转化成功的大肠杆菌DH5a菌液进行测序分析。洋甘菊FPS基因开放阅读框含有1032bp，编码343个氨基酸残基。
2.7提质粒(T载体和表达载体PBI121)
图6为提取的T质载体电泳图谱，图7为提取的表达载体PBI121电泳图谱，从图上可以看出这两种载体的条带都很清晰，与预期片段大小也一致。
2.8双酶切
使用BamHI和SacI两种限制性内切酶对T质粒和PBI121质粒进行切割，以未切割的T质粒和PBI121质粒做对照，从图8中可以看出，这两种质粒都明显地被切割开。
2.9PBI121/FPS的PCR鉴定
以转化到DH5a的PBI121/FPS质粒菌液为模板，经PCR扩增后电泳检测扩增出一条大小为1Kb左右的DNA片段，与理论上FPS大小一致。测序结果表明重组质粒PBI121/FPS构建成功（如图9）。
2.10表达载体导入感受态农杆菌
以转化到根癌农杆菌EHA105的PBI121-FPS质粒菌液为模板，经PCR扩增后电泳检测扩增出一条大小为1Kb左右的DNA片段，与理论上FPS大小一致（如图10）。
2.11转基因烟草的再生芽
当抗性烟草愈伤组织长出的芽至2-3cm时，切割下来转至新的培养基中进行培养，以获得转基因烟草植株。
3.讨论
洋甘菊挥发油中重要的成分为母菊薁，属于倍半萜类物质。母菊薁的代谢途径为异戊二烯生物合成途径，FPS处于此过程比较重要的分支点，本文从洋甘菊的花中提取基因，并且克隆了FPS基因，测得洋甘菊FPS基因ORF框为1032bp。且本实验成功构建了真核表达载体PBI121/FPS，借助根癌农杆菌EHA105的侵染作用，采用叶盘法在模式植物烟草云烟85中进行了验证，成功地得到抗性烟草植株，并且FPS在烟草中进行了转化。
本实验为获得转基因洋甘菊的研究奠定基础，进而为通过转基因方法提高洋甘菊母菊薁产量提供依据。对某些植物来说,如青蒿,FPS基因的过度表达确实可以提高次级代谢产物的产率。
序列表
<110>安徽农业大学
<120>洋甘菊法尼基焦磷酸合酶（FPS）基因真核表达载体的构建及转化
<130>洋甘菊法尼基焦磷酸合酶（FPS）基因真核表达载体的构建及转化
<160>2
<170>PatentIn version 3.1
<210>1
<211>1032
<212>DNA
<213>Matricaria chamomilla L
<400>1
atgagtatcg tggatctgaa atcaaagttt ttgaaagtgt atgacacgct taaatcggag 60
ttgattaacg accctgcgtt tgaatttgac gatgattctc gtcagtgggt tgagaagatg 120
cttgactaca atgtacctgg aggaaagctg aaccggggat tatctgttgt cgacagttat 180
caactcctta aaggaggaga actgactgat gacgagattt ttctttcatc cgctcttggt 240
tggtgcattg aatggcttca agcgtacttt ctggtgcttg atgatatcat ggacgagtct 300
catacacgca gagggcaacc atgttggttt agattaccaa aggttggtat gattgctgca 360
aacgatggaa ttcttcttcg caaccatgtc ccgagaattc ttaagaatca tttccgagga 420
aagccttact atgtggatct tgtggacctg ttcaacgagg ttgaattcca aacagcctcc 480
ggacagatga tcgatttgat cactacactt gttggagaga aagatctctc aaagtattca 540
ttgtctgttc accgccggat tgttcaatac aagacagctt actactcatt ttaccttcct 600
gttgcctgcg cactccttat gtttggagag gatcttgaca aacacgttga agtgaagaac 660
gtactcgttg aaatgggtac ctattttcaa gttcaggacg attatctaga ctgttttggt 720
actcccgagg tgattggaaa gattggaacc gatattgaag actttaagtg ctcctggtta 780
gttgtcaaag cattggaact cgctaatgag gaacaaaaga aattcctaca tgagaactat 840
gggaaaaagg accccgcttc cgttgcaaaa gtcaaggaac tataccacac tctcaacctt 900
caggctgtgt ttgaagatta cgaggccaca agctacaaga agctgatcac atcgattgaa 960
aatcacccaa gcaaagcagt ccaagcggtg ttgaaatctt tcttgggtaa aatctacaag 1020
aggcaaaagt ag 1032
<210>2
<211>343
<212>PRT
<213>Matricaria matricarioides
<400>2
Met Ser Ile Val Asp Leu Lys Ser Lys Phe Leu Lys Val Tyr Asp Thr
1 5 10 15
Leu Lys Ser Glu Leu Ile Asn Asp Pro Ala Phe Glu Phe Asp Asp Asp
20 25 30
Ser Arg Gln Trp Val Glu Lys Met Leu Asp Tyr Asn Val Pro Gly Gly
35 40 45
Lys Leu Asn Arg Gly Leu Ser Val Val Asp Ser Tyr Gln Leu Leu Lys
50 55 60
Gly Gly Glu Leu Thr Asp Asp Glu Ile Phe Leu Ser Ser Ala Leu Gly
65 70 75 80
Trp Cys Ile Glu Trp Leu Gln Ala Tyr Phe Leu Val Leu Asp Asp Ile
85 90 95
Met Asp Glu Ser His Thr Arg Arg Gly Gln Pro Cys Trp Phe Arg Leu
100 105 110
Pro Lys Val Gly Met Ile Ala Ala Asn Asp Gly Ile Leu Leu Arg Asn
115 120 125
His Val Pro Arg Ile Leu Lys Asn His Phe Arg Gly Lys Pro Tyr Tyr
130 135 140
Val Asp Leu Val Asp Leu Phe Asn Glu Val Glu Phe Gln Thr Ala Ser
145 150 155 160
Gly Gln Met Ile Asp Leu Ile Thr Thr Leu Val Gly Glu Lys Asp Leu
165 170 175
Ser Lys Tyr Ser Leu Ser Val His Arg Arg Ile Val Gln Tyr Lys Thr
180 185 190
Ala Tyr Tyr Ser Phe Tyr Leu Pro Val Ala Cys Ala Leu Leu Met Phe
195 200 205
Gly Glu Asp Leu Asp Lys His Val Glu Val Lys Asn Val Leu Val Glu
210 215 220
Met Gly Thr Tyr Phe Gln Val Gln Asp Asp Tyr Leu Asp Cys Phe Gly
225 230 235 240
Thr Pro Glu Val Ile Gly Lys Ile Gly Thr Asp Ile Glu Asp Phe Lys
245 250 255
Cys Ser Trp Leu Val Val Lys Ala Leu Glu Leu Ala Asn Glu Glu Gln
260 265 270
Lys Lys Phe Leu His Glu Asn Tyr Gly Lys Lys Asp Pro Ala Ser Val
275 280 285
Ala Lys Val Lys Glu Leu Tyr His Thr Leu Asn Leu Gln Ala Val Phe
290 295 300
Glu Asp Tyr Glu Ala Thr Ser Tyr Lys Lys Leu Ile Thr Ser Ile Glu
305 310 315 320
Asn His Pro Ser Lys Ala Val Gln Ala Val Leu Lys Ser Phe Leu Gly
325 330 335
Lys Ile Tyr Lys Arg Gln Lys
340
Claims (1)
1.一种洋甘菊法尼基焦磷酸合酶（FPS）基因真核表达载体的构建及转化方法，具体按如下步骤进行：
（1）洋甘菊FPS RNA的提取
从洋甘菊花瓣中提取RNA，保存在-70℃冰箱中备用；
（2）洋甘菊FPS基因RT-PCR扩增
根据洋甘菊法呢基焦磷酸合酶mRNA全长序列设计引物：
上游引物：5'（BamHI）CG GGATCC ATGAGTATCGTGGATCTGAAATCAAAGTTTT 3'
下游引物：5'（Sac I）C GAGCTC CTACTTTTGCCTCTTGTAGATTTTACCCAAG 3'
其中GGATCC与GAGCTC分别为BamHI和SacI的酶切位点；以洋甘菊总RNA为模板，反转录为cDNA；然后以反转录的单链cDNA为模板；采用TransStart Taq DNA Polymerase进行PCR扩增；用PCR纯化回收试剂盒回收目的片段，-20℃保存；
（3）PCR扩增产物的阳性克隆和鉴定
克隆载体：pEASY-T4 Zero Cloning vector
连接：4.5ulPCR产物+0.5ulT载体，25℃连接13分钟；
转化：取50μl DH5a感受态加入5μl上述连接产物，冰上放置20-30min.42℃热激30s，立即放在冰上2-3min,加入400μl不加AMP的液体LB培养基；37℃，200转孵育培养1h；取100μl培养液均匀涂布于AMP,IPTG,X-gal的平板上；37℃倒置培养12-16h；挑白色单菌落于1ml含AMP的LB培养基中，37℃振荡培养5-6h，采用M13引物进行菌液PCR鉴定，以降低假阳性的干扰；筛选阳性重组克隆进行DNA测序,用DNAMAN序列分析软件对测序结果进行分析；
（4）质粒提取
按照质粒提取试剂盒的步骤分别提取克隆载体T和表达载体PBI121；
（5）双酶切
使用BamHI和SacI两种限制性内切酶对T质粒和PBI121质粒进行切割，20ul体系37℃切3小时，然后加10XBuffer 2ml终止反应，跑胶观察质粒是否被切开；切开后，切胶回收T质粒和PBI121质粒中实验所需要的片段；双酶切体系：BamHI 1μl，SacI1μl，10x K Buffer 1μl，质粒8μl，灭菌水定容至20μl；
（6）切胶回收
针对双酶切后的克隆载体T和表达载体PBI121，采用切胶回收试剂盒根据实验所需进行回收基因片段；
（7）重组质粒pBI121/FPS的构建
T4连接酶连接体系：T4连接酶1μl，T4Buffer 1μl，表达载体1.5μl，目的片段6.5μl；在PCR仪中16℃连接16h；取上述连接产物5μl加入50μl的DH5a的感受态细胞中进行转化；摇菌1.5h，涂板，37℃倒置培养16h；挑单菌落摇菌，PCR鉴定和酶切验证重组子。
（8）重组子导入感受态农杆菌
取-70℃保存的EHA105农杆菌感受态细胞置于冰上融化，分别向200μl感受态细胞中加入8μl表达载体质粒，混匀；冰浴30min，转入液氮中速冻1min，37℃温育5min，迅速放置冰上2min；然后加入800μlLB液体培养基，28℃，200rpm/min振荡培养5h；取300ul培养液均匀涂布于含80μg/mlKan的平板上，待菌液被吸收后倒置培养皿；28℃暗培养1-2天，挑取单菌落，28℃，200rpm/min振荡培养；取上述转化菌液用PCR法进行检测。
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|---|---|---|---|---|
| CN104694556A (zh) * | 2014-12-14 | 2015-06-10 | 上海勤生缘生物科技有限公司 | 牛樟芝fpps蛋白基因及其克隆和测序方法 |
| CN110476746A (zh) * | 2019-09-02 | 2019-11-22 | 山东省农业科学院作物研究所 | 一种法呢基焦磷酸合酶基因影响小麦籽粒大小的检测方法 |
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2012
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