CN104531753B - 共转化Sps、Hmgr和Dxs基因培育花蕾高青篙素含量青蒿的方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种生物技术领域的共转化Sps、Hmgr和Dxs基因培育花蕾高青篙素含量青蒿的方法,该方法从青篙中克隆Anti‑Sps、Anti‑Hmgr和Anti‑Dxs三个基因,构建含Sps、Hmgr和Dxs三个基因两两组合的植物表达载体,用农杆菌介导,将Sps、Hmgr和Dxs三个基因转入青篙并培育筛选再生植株，获得花蕾青篙素含量提高的转基因青篙植株。在非转化对照青篙含量为6.20mg/g干重时,本发明得到的基因工程青篙植株中花蕾青篙素含量最高12.10mg/g干重,其含量是非转化对照青篙含量的1.95倍,本发明的方法对于以青篙为原料的药厂节约成本具有重要意义。

Description

共转化Sps、Hmgr和Dxs基因培育花蕾高青篙素含量青蒿的 方法

技术领域

本发明涉及利用基因工程培养植物领域，具体是一种利用转基因技术培育高青蒿素含量的青蒿的方法。

背景技术

青蒿(Artemisiae annie L.)，菊科，艾属。学名黄花蒿，别名臭蒿、香蒿、苦蒿。生长于山坡、林缘及荒地，为一年生草本。老百姓用于消暑、头痛、退热和感冒等的治疗。提取青蒿素则是利用青蒿地上部分叶片和未开放的花蕾，提取生产的有效生理活性成分如青蒿素等产品，是低毒、高效、速效的抗疟新药(中国药典,2005；钟国跃,等，2007)。影响青蒿青蒿素含量的因素有品种、土壤条件、播种时间、加工方法、收获时间、种植密度、光照条件、施肥水平以及青蒿植株的不同部位等。青蒿素合成和贮存的主要器官是花蕾，青蒿野生资源丰富，但青蒿素含量不高。不同地域的青蒿品种，花蕾中青蒿素含量的变化极显著，其中以重庆地区酉阳和秀山青蒿的花蕾青蒿素含量最佳。为了降低制药厂提取青蒿素的制药成本，除利用传统育种方法，近年来研究利用基因工程方法提高青蒿的青蒿素含量，培育高青蒿素含量的生物工程品种成为热点。

青蒿主要药用成分及作用青蒿素化学结构含有过氧基团，是一种倍半萜内酯，青蒿素的多种衍生物如双氢青蒿索(dihydroanemisin)、青蒿琥酯(anesunatc)、蒿甲醚(ancmether)、蒿乙醚(aneether)，均是治疗疟疾的有效药物.研究表明，二氢青蒿素对大鼠C6细胞有选择性细胞毒作用.还可诱导肺癌细胞系PC-14细胞和SPC-A-1细胞凋亡。青蒿琥酯对人大肠癌细胞有抑制作用，能抑制大肠癌细胞增殖和促进凋亡。蒿甲醚、蒿乙醚和青篙琥酯作用于肿瘤细胞后，表达的mRNA与其对肿瘤细胞的抑制作用之间存在相关性。结果显示青蒿素衍生物的药效作用方式与已知的抗癌药物不尽一致.随着对青蒿素类药物药理作用研究的不断深人，已证实其具有抗纤维化、抗弓形虫、抗疟、抗孕、抗血吸虫、肿瘤细胞毒性和抗心律失常等作用。虽然该类药物作用广泛，但其作用机制、特点和应用仍处于初级阶段，研究表明青蒿素可通过抑制肺组织局部炎性反应来减轻脓毒症大鼠的肺损伤。青蒿还含有挥发性成分，主要是挥发油包括篙酮、倍半褚醇、异篙酮、丁香烯、石竹烯氧化物、按油精、旅烯、左旋樟脑、龙脑等成分。其中，篙酮、樟脑、丁香烯异篙酮、龙脑等含量较高。挥发油具有抗菌消炎、解热镇痛、止咳平喘等功效。

青蒿萜类化合物的合成主要通过MVA和DXP两个途径，即甲羟戊酸(mevalonatepathway，MVA)途径和1-脱氧木酮糖5-磷酸合酶(1-deoxy-D-xylulose-5-phosphatesynthase，DXS)或甲基赤藓醇4-磷酸(methylerythritol 4-phosphatepathway，MEP)DXP途径。3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A还原酶(3-hydroxy-3-methyl glutaryl coenzyme Areductase,HMGR)是MVA途径重要的限速酶，而1-脱氧木酮糖5-磷酸合酶(1-deoxy-D-xylulose-5-phosphate synthase，DXS)是DXP途径的关键性酶。在3种直接前体物质法呢基二磷酸(farnesyl diphosphate,FPP),香叶基二磷酸(geranyl diphosphate，GPP)和香叶基香叶基二磷酸(geranyl geranyl diphosphate，GGPP)合成之后，即进入萜烯合成过程，几种萜烯合酶(terpene synthase，TPS)在此过程发挥着重要的作用。GPP在单萜烯合酶(monoteterpene synthase)作用下生成单萜烯(monoterpene，C10)，FPP在倍半萜烯合酶(sesquiterpene synthase，SPS)作用下生成倍半萜烯(sesquiterpene，C15)，GGPP在二萜烯合酶(diterpene synthase)作用下成二萜烯(diterpene，C20)。

青蒿素是治疗疟疾的最主要的有效的临床用药，此外,药理学的深入研究表明，青蒿素及其衍生物是一种广谱性的天然药物。研究表明,每年世界上有超过100万人死于疟疾。疟原虫耐药性,使得抗疟药物氯喹的药物效果受限,而青蒿素对疟疾具有低毒和速效的特点。目前青蒿素是公认有效的治疗疟疾首选药物,这使得提取青蒿素的原材料青蒿需求量非常大。生物工程技术成为提高青蒿素含量的可行途径之一。Chen等利用在青蒿中能够过量表达PEP基因,转化的青蒿植株中青蒿素含量比对照高3-5倍。Teoh等认为cyp71av1基因在青蒿素生物合成途径中是关b键的限速基因，并从特异cDNA中克隆到cyp71av1基因。Ro等也克隆cyp71av1基因及其氧还伴侣基因cpr,并将cyp71av1基因和cpr基因导入酵母并成功地提高了青蒿素含量。文献中有利用AOC基因(唐克轩，等)以及ADS,CYP71AV1,CPR(唐克轩，等)三个基因通过根瘤农杆菌介导获得生物工程青蒿的报道，均是利用目的基因提高青蒿素含量的方法。

从中药材青蒿花蕾中提取的青蒿素(Artemisia annua L.)用于抗疟疾,原材料青蒿需求量大,但野生青蒿得青蒿素含量很低,只占青蒿植株干重0.01-0.1％，如何提高青蒿素含量，成为热点课题,通过生物工程办法改造提高青蒿素含量是一种有效途径。

发明内容

针对现有生产中对高青蒿素含量青蒿的需求，本发明所要解决的技术问题是在青蒿基因组中导入能增加青蒿素合成的基因，并增强其原有基因的表达，获得转基因青蒿新品系，以提高其青蒿素合成能力，使其花蕾中能超量蓄积青蒿素，使这种转基因青蒿品系成为工业化大规模生产的原材料。

倍半萜烯合酶(sesquiterpene synthase，Sps,EC4.3.1.8)是青蒿植株合成青蒿素的关键酶，而3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A还原酶(3-hydroxy-3-methyl glutarylcoenzyme A reductase,HMGR,EC:1.1.1.34)，1-脱氧木酮糖5-磷酸合酶(1-deoxy-D-xylulose 5-phosphate synthase，DXS,EC 4.1.3.37)，是合成青蒿素的限速酶。增强Sps,HMGR和DXS三个酶的活性，可以提高植株青蒿素的含量，本发明将关键酶基因Sps,Hmgr和Dxs三基因转化青蒿，提高青蒿中的青蒿素合成，获得高青蒿素含量的基因工程青蒿品种，为培育高青蒿素含量的青蒿提供一种新的方法。本发明旨在构建Sps,Hmgr和Dxs三基因的两两组合构建植物表达载体,并获得重组工程植株,利用生物工程技术培育高青蒿素含量的青蒿奠定基础。

为实现上述目的，本发明采用的技术方案是：共转化Sps、Hmgr和Dxs基因培育花蕾高青篙素含量青蒿的方法，包括如下步骤：

1)克隆倍半萜烯合酶的基因片段，记为Sps基因片段，并将Sps基因片段构建成Anti-Sps基因植物表达载体；

2)克隆3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A还原酶的基因片段，记为Hmgr基因片段，并将Hmgr基因片段构建成Anti-Hmgr基因植物表达载体；

2)克隆1-脱氧木酮糖5-磷酸合酶的基因片段，记为Dxs基因片段，并将Dxs基因片段构建成Anti-Dxs基因植物表达载体；

4)将利用转基因技术将Anti-Sps、Anti-Hmgr和Anti-Dxs导入青蒿，获得包含Sps、Hmgr基因和Dxs基因的青蒿植株。该步中可以将Anti-Sps、Anti-Hmgr和Anti-Dxs同时导入同一青蒿，获得包括Sps、Hmgr和Dxs基因片段的转基因青蒿。还可以采用电击法将Anti-Sps、Anti-Hmgr和Anti-Dxs导入同一农杆菌感受态细胞LBA4404，然后采用农杆菌介导法将所述农杆菌感受态细胞LBA4404导入青蒿，构成包含Sps、Hmgr和Dxs基因的青蒿植株。

本发明所述的构建Sps、Hmgr和Dxs基因植物表达载体包括:从亚克隆中酶切出目的基因片段，电泳回收后与植物表达载体，例如pCAMBIA2301连接成转化质粒，然后转化(AgrobacteriumTumefaciens)大肠杆菌DH5a感受态细胞，并进行抗性筛选。按照英文影印版5拟南芥实验手册6.DetlefweigelandJaneGlaZebrook.化学工业出版社.2004年3月第1版,第1次印刷的方法制备)

本发明所述的生物工程方法，采用农杆菌介导法。其中，优选农杆菌介导法(参见Sambrook T,TanaKaK,Monma T.Molecular Cloning:A Laboratory Manual.Cold SpringHarbor Laboratory press,New York,1989)。经由农杆菌感受态细胞LBA4404感染的青蒿外植体(如无菌苗下胚轴)再生为正常植株。

本发明用于作为Sps、Hmgr和Dxs基因受体亲本的青蒿素含量相对高的青蒿是同一品种。利用本发明获得花蕾青篙素含量提高的转基因青篙植株，在非转化对照青篙含量为6.20mg/g干重时,本发明得到的基因工程青篙植株中花蕾青篙素含量最高12.10mg/g干重,其含量是非转化对照青篙含量的1.95倍,本发明的方法对于以青篙为原料的药厂节约成本具有重要意义。

附图说明

图1植物双元表达载体载体结构图；

图中A为pCAMBIA2301-Sps-Hmgr，B为pCAMBIA2301-Sps-Dxs，C为pCAMBIA2301-Hmgr-Dxs；

图2为候选转基因植株的PCR特异性扩增结果示意图；

图中M标示Marker,V为仅转染Vector，三泳道为3株不同对照植株，P为候选阳性植株(Positive Plants),即转染Sps，Hmgr和Dxs基因的阳性植株，三泳道为3株不同株系转基因植株；

图3为候选转基因植株的实时定量PCR检测结果；

其中，Vector表示对照植株，Sps+Hmgr+Dxs表示候选转基因植株；

图4为阳性转基因植株与对照植株花蕾青蒿素含量的数据统计数据图；

图中，Vector表示对照，Sps+Hmgr+Dxs表示候选转基因植株。

具体实施方式

下面结合附图和实施例对本发明作进一步说明，但不应该理解为本发明上述主题范围仅限于下述实施例。在不脱离本发明上述技术思想的情况下，根据本领域普通技术知识和惯用手段，做出各种替换和变更，均应包括在本发明的保护范围内。

材料：采用花蕾高青蒿素含量的常规野生青蒿，2008年来源于重庆秀山县，在重庆医药高等专科学校以高青蒿素为目标常规选育了5代。

菌株和质粒:大肠杆菌DH5a感受态,pMDl9-T Simple Vector,pZP211UB Ⅰ,质粒载体pCAMBIA2301,农杆菌LBA4404，。

酶和化学试剂:DNA Taq聚合酶、小牛肠碱性磷酸酶、T4-DNA连接酶购自大连TaKara公司；限制性内切酶BamH Ⅰ，琼脂糖各组份，大肠杆菌DH5a感受态，氨苄青霉素，pMDl9-T Simple Vector，限制性内切酶BamH Ⅰ，T4DNA ligase，壮观霉素，农杆菌感受态细胞LBA4404，乙酰丁香酮(AS)购于Roche公司。pCAMBIA2301，Swa Ⅰ和pst Ⅰ，购于大连TaKara公司，BamH Ⅰ，Swa Ⅰ和pst Ⅰ,限制性内切酶EcoR Ⅰ,PCR Marker购自亚辉生物术公司，PCR引物由Sangon生物技术公司合成，随机引物标记试剂盒购自Roche公司。

分子生物学技术

除另有说明外，所有分子生物学技术一般按Sambrook T等在分子克隆实验手册(Sambrook T,TanaKa K,Monma T.Molecular Cloning:A Laboratory Manual.ColdSpring Harbor Laboratory press,New York,1989)中提供的方法进行。

步骤与结果:

所述Sps、Hmgr和Dxs三个基因均从青蒿上部幼叶cDNA中扩增获得。

实施例1.青蒿总RNA的提取和纯化。参照Invitrogen公司提供的TRIZOL试剂盒说明进行。用液氮将青蒿上部嫩叶研磨，在EP管中加入3mL Trizol，裂解完全后，5℃下15000r/min离心15min弃沉淀；加3ml水饱和酚后5℃、15000r/min离心10min，取上清液加250μL 5M NaCl溶液，再加300μL氯仿后振荡，混匀4℃、15000r/min离心10min，取上清液。加入0.3mL异丙醇，混匀得RNA粗提物；加75％乙醇洗涤晾干，用DEPC-H2O溶解。按试剂盒RNAiso for polysaccharide-rich plant tissue RNA操作说明进行提取。提取总RNA用琼脂糖凝胶电泳和紫外分光光度计检测其完整性和纯度。所用的研钵、研杵和药匙需在160℃烘烤10h以上，离心管以及枪头用0.1％DEPC处理后160℃灭菌，所述提取试剂和器具均避免环境及操作中RNase影响。去除总RNA中的DNA采取PrimeScript RT reagent with gDNAEraser试剂盒(购自TaKaRa公司)，再取1μg总RNA和反转录酶PrimeScript RT，进行反转录操作，反应体积20μL。

1.2 cDNA基因的获得

RT-PCR所用引物序列按照Sps、Hmgr和Dxs三个基因的编码序列(分别如SEQ IDNO.1、SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3所示)，分别设计扩增出具有完整编码框的上游和下游引物，并在上下游引物上面分别引入限制性内切酶位点(按照选用的载体定)，以便于构建植物表达载体。RT-PCR反应按照AMV反转录酶操作手册(大连TaKara公司)进行，cDNA模板，96℃变性6min后，按92℃45s，52℃1min，72℃延伸10min扩增36循环，72℃保温15min。利用未经反转录的PCR和不加模板的RT-PCR扩增产物作为对照.扩增结束利用1％琼脂糖凝胶电泳检测，样品冻存于-80℃待用。回收并克隆到pMDl9-T vector载体上,送样上海生工公司测序分析表明,该PCR扩增产物具有序列表中SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3的核昔酸序列,检测到是Sps、Hmgr和Dxs的cDNA基因,以作下步实验之用。

1.3 Anti-Sps、Anti-Hmgr、Anti-Dxs基因的克隆

利用反转录所得cDNA为模板，采用以下引物进行PCR扩增:

Sps上游引物SEQ ID NO.4:

5′-TCGGATCCCGTGGATCCGCAATCACATTTCTTAT-3′；

Sps下游引物SEQ ID NO.5:

5′-AAGGATCCGCAGGATAGCCACAGA-3′；

Hmgr上游引物SEQ ID NO.6:

5′-CTGGATCCTCGAGTTCTACCTGAA-3′；

Hmgr下游引物SEQ ID NO.7:

5′-CAGGATCCCGATCAGGAAGTTGTA-3′；

Dxs上游引物SEQ ID NO.8:

5′-CGGGATCCGTGGATGCTAAGGCTGATG-3′；

Dxs下游引物SEQ ID NO.9:

5-′AAGGATCCAGGGCCAGGTTCATTATCCTC-3′；

BamHⅠ酶切位点为横线部分，PCR扩增体系总体积为60μl,分别为5μl cDNA模板，1.5μl Sps上游引物(40pmo1/μL),1.5μl Sps下游引物(40pmo1/μl),5μl 10×PCR buffer,TaqDNA聚合酶0.6μl(50U),6μl dNTP混合液(10mM),加ddH₂0将总体积补充至60μl。扩增条件为:96℃预变性2min；92℃变性2min，62℃退火1min，72℃延伸5min，循环35次；72℃延伸10min。

以上述5μl PCR扩增产物与载体pMDl9-T Simple连接，操作步骤按照产品pMDl9-TSimple Vector说明书进行(大连TaKara公司)。连接后的产物用来转化大肠杆菌DH5a感受态，在含氨苄青霉素(100mg/L)的固体培养基LB上培养过夜。挑取白色菌落群在含氨苄青霉素(100mg/L)的固体培养基LB上培养过夜，采取碱裂解法提取质粒DNA,酶切鉴定后测定序列。扩增产物经测序分析，其序列分别如SEQ ID NO.1所示，说明扩增产物为Sps基因。Anti-Hmgr基因克隆(引物为Hmgr上游引物、Hmgr下游引物)和Anti-Dxs基因克隆(引物为Dxs上游引物、Dxs下游引物)方法与以上所述类似。

1.4植物表达载体pZP211UBⅠ::Sps的构建

利用限制性内切酶BamHⅠ酶切上述扩增获得的基因Sps的DNA片段。采取BamHⅠ单酶切空表达载体pZP211::UBⅠ，二者均需电泳检测后回收目的片段。T4连接酶来连接酶切片段，按照T4连接酶说明书操作步骤进行(大连TaKara公司)。连接产物转化大肠杆菌感受态DH5a细胞，利用含壮观霉素(45mg/L)的固体培养基LB上培养过夜。挑取白色菌落在含壮观霉素(45mg/L)的液体培养基LB中培养过夜。采取碱提取法提取质粒DNA，后酶切鉴定。采用电击法将含有目的DNA片段表达载体pZP211UBⅠ::Sps转化农杆菌感受态细胞LBA4404，获得可以转化使用的农杆菌菌株。培养获得pZP211UBⅠ::Hmgr和pZP211UBⅠ::Dxs的农杆菌菌株与上述方法同。也可用电击法将上述3个或2个同时导入农杆菌感受态细胞LBA4404，导入的植物表达载体的农杆菌菌株用作青蒿转化。

实施例1所述方法中的限制性内切酶、酶切位点以及载体均可有其它方案可以替换；以上实验可以由下述实施例2操作替代。

实施例2含Sps,Hmgr和Dxs三基因的植物双元表达载体的构建。

2.1构建中间载体pMDl9-T-p35s-gfp*gus-nos

采用pMDl9-T和pCAMBIA2301为基本构建元件,构建pMDl9-T-p35s-gfp*gus-nos中间载体。具体实施步骤如下,由pCAMBIA2301上p35s-gfp*gus-nos的碱基序列设计一对引物,并在上、下游引物上分别引入限制性内切酶位点,以便于表达载体的构建。将pCAMBIA2301质粒作为模版,PCR扩增gfp*gus融合基因的表达盒,然后连接到pMD19-T载体,经转化筛选,挑取单克隆测序比对确认。

2.2构建中间载体

pMDl9-T-p35s-Dxs-nos,pMDl9-T-p35s-Sps-nos以及pMDl9-T-p35s-Hmgr-nos的构建。以所述的pMDl9-T-p35s-gfp*gus-nos作为基础,用重组载体pMDl9-T-Dxs、pMDl9-T-Sps和pMDl9-T-Hmgr中的Dxs,Sps和Hmgr三个基因分别替换其上的gfp*gus融合基因。具体实施步骤:用SpeⅠ和BstEⅡ双酶切pMDl9-T-Dxs、pMDl9-T-Sps,pMDl9-T-Hmgr和pMDl9-T-p35s-gfp*gus-nos,回收Dxs,Sps,Hmgr三个基因片段和pMDl9-T-p35s-gfp*gus-nos大片段,Dxs,Sps,Hmgr三个基因片段分别与大片段连接,转化挑取单克隆,提取质粒做PCR检测和酶切验证，确认无误。

2.3构建植物双元表达载体pCAMBIA2301-Sps

以所述的pMD19-T-p35s-Sps-nos为基础,将含有Sps融合基因的表达盒置于植物双元表达载体pCAMBIA2301中,构建成植物双元表达载体pCAMBIA2301-Sps。具体实施操作:用Sma Ⅰ和pst Ⅰ双酶切pCAMBIA2301,回收大片段,用Swa Ⅰ和Pst Ⅰ双酶切pMD19-T-p35s-Sps-nos,回收Sps的表达盒。将Sps表达盒与pCAMBIA2301大片段连接,转化挑取单克隆,提取质粒做PCR检测和酶切验证。

植物双元表达载体pCAMBIA2301-Hmgr和pCAMBIA2301-Dxs的构建方法类似。

2.4构建植物双元表达载体pCAMBIA2301-Sps-Hmgr

以所述的pMD19-T-p35S-Hmgr-nos为基础,将含有Hmgr基因的表达盒插入植物双元表达载体pCAMBIA2301-Sps中,构建植物双元表达载体pCAMBIA2301-Sps-Hmgr。具体操作步骤:用SmaⅠ和PstⅠ双酶切pCAMBIA2301-Sps,回收大片段,用Swa Ⅰ和pst Ⅰ双酶切pMD19-T-p35s-Hmgr-nos,回收Hmgr基因的表达盒。将Hmgr基因的表达盒与pCAMBIA2301-Sps大片段连接,转化挑取单克隆,提取质粒做PCR检测和酶切验证,获得含有Sps基因和Hmgr基因的植物双元表达载体pCAMBIA2301-Sps-Hmgr。

植物双元表达载体pCAMBIA2301-Sps-Dxs和pCAMBIA2301-Hmgr-Dxs的构建方法类似(如图1)。

本发明将生物合成青篙素途径的三个关键酶基因Dxs,Sps和Hmgr两两组合地连接于同一表达调控序列,形成含Dxs,Sps，Hmgr三基因两两组合的植物双元表达载体,该双元表达载体可用于通过农杆菌感染等办法提高青篙中青篙素的含量。如前所述，转化农杆菌感受态细胞LBA4404，获得可以转化使用的农杆菌菌株。也可用电击法将上述3个或2个同时导入农杆菌感受态细胞LBA4404，导入的植物表达载体的农杆菌菌株分别或同时用作青蒿转化。

实施例3、农杆菌介导的青蒿幼胚转化及抗性植株的获得

利用YEB固体培养基，侵染前夜挑取携带重组质粒的农杆菌单菌落接种在含有45mg/L壮观霉素的YEB培养基上，220rpm摇菌，恒温25℃过夜。在YEB固体培养基上划线培养农杆菌至圆圈直径成约1.5mm的单菌落，经PCR验证，然后又重新在YEB固体培养基上进行划线培养，20℃培养4d，收集菌体，悬浮于IM，用乙酰丁香酮(AS)调节终浓度为180μmol/L，用于制备不同浓度的菌液备用。幼胚利用所述菌液的OD_600nm分别为0.1、0.3、0.5、0.7、0.9、1.1，侵染时间设置1、4、7、10、13分钟，结束侵染后，菌液弃掉，灭菌的滤纸吸掉残余菌液，转移至CM中，注意保护幼胚。20℃黑暗培养2-6天，幼胚经过培养后，分别部分转移到RM1和RM2中，经过恢复培养4天，其余不经过恢复培养的幼胚转移到SM中进行筛选。移到SM1的经过恢复培养后的幼胚，再经14d筛选，然后转移至SM2，筛选3轮，每轮筛选时间14天，然后获得具有抗性的愈伤组织。转化植株的检测：将抗性愈伤组织转移至FM和GM中，经分化，生根培养，得到转化得植株。GUS检测：幼胚用磷缓液清洗，利用GUS染色液染色，37℃恒温水浴24小时，利用显微镜观察带有蓝斑的幼胚，计算GUS瞬时表达率。计算公式：GUS瞬时表达率＝(有蓝斑幼胚/侵染幼胚)×100％。

上述YEB IM M CM RM SM FM GM为各种培养基的缩写：

培养基及成分侵染培养基(IM)是指1/2MS盐(MS指含所有大量元素和微量元素，没添加有机物和激素等)+1/2MS维生素+90mg/L肌醇+510mg/L水解酪蛋白+210μmol/L AS+38g/L蔗糖+70g/L葡萄糖，pH 5.5；

YEB培养基是指9g/L酵母提取物+9g/L蛋白胨+6g/L NaCl，pH 7.0；

继代培养基(M)是指MS盐+MS维生素+90mg/L肌醇+510mg/L水解酪蛋白+510mg/LL-脯氨酸+180mg/L L-天门冬酰胺+1.2mg/L 2，4-D+30g/L蔗糖+10g/L琼脂，pH 6.0；

恢复培养基1(RM1)是指继代培养基M加入0.6g/L MES+90mg/L Car，pH 6.0；

恢复培养基2(RM2)是指继代培养基M加入0.6g/L MES+260mg/L Cef，pH 6.0；

生根培养基(GM)是指继代培养基M加入0.4mg/L IBA+5g/L活性炭；

共培养培养基(CM)是指继代培养基M加入90μmol/L AS+900mg/L Ag-NO3，pH 6.0；

选择培养基1(SM1)是指继代培养基M加入1.2mg/L Bialaphos或Glufosinate+90mg/L Car，pH 6.0；

选择培养基2(SM2)是指继代培养基M加入2.9mg/L Bialaphos或Glufosinate+90mg/L Car，pH 6.0；

分化培养基(FM)是指继代培养基M加入0.4mg/L KT，pH 6.0。

实施例4、候选生物工程青蒿转入目的基因的分子检测

4.1候选生物工程青蒿的PCR检测

采用CTAB法提取生物工程青蒿的总DNA，分别设计上下游引物对检测标记基因NPTII以及目的基因Sps、Hmgr、Dxs三个基因，引物如下:

NPTII基因引物:

上游引物SEQ ID NO.10:5′-GTGGAGAGGCTATTCGGCTATGACTG-3′；

下游引物SEQ ID NO.11:5′-AGCTCTTCAGCAATATCACGGGTAGC-3′；

标记基因NPTII扩增条件为:96℃预变性3min；92℃变性2min，60℃退火30S，72℃延伸1min，循环32次；72℃延伸10min。

三个目的基因Sps、Hmgr、Dxs检测引物分别与前面克隆引物相同:目的基因扩增条件为:96℃预变性5min；93℃变性2min，60℃退火30S，72℃延伸1min秒，循环36次；72℃延伸10min.检测结果为阳性即为生物工程青蒿，三个目的基因Sps、Hmgr、Dxs检测结果如图2。

4.2采取Southern杂交方法检测候选生物工程青蒿植株

利用CTAB法提取生物工程青蒿植株嫩叶总基因组DNA，采取Southern杂交方法检测候选生物工程青蒿，检测步骤如地高辛试剂盒的说明书进行(Roche公司)，检测结果为阳性即为生物工程青蒿植株。

检测探针引物为:

上游引物SEQ ID NO.12:5′-AAGGGCAAGAGAGAGCAAGAAT-3′；

下游引物SEQ ID NO.13:5′-GTAGTCAGTAACGAAAGTAGCG-3′。

4.3利用实时定量PCR分析Sps、Hmgr、Dxs三个基因在阳性生物工程青蒿植株中的表达水平

提取PCR检测为阳性生物工程青蒿植株总RNA，反转录为cDNA。

设计内参基因的引物。

上游引物SEQ ID NO.14:

5′-TTCCCCGATCCAGACACTGTACTTCCGCCA-3′；

下游引物SEQ ID NO.15:

5′-ACACAGGTGATGGTGTGAGCCACACATTC-3′。

三个目的基因Sps、Hmgr、Dxs目的基因检测引物如前。

扩增条件:96℃预变性3min；95℃变性30S,58℃(内参基因)或65℃(目的基因可调)退火45S，36个循环，72℃延伸10min，绘制曲线。如图3可以看出，阳性生物工程青蒿植株体内三个目的基因Sps、Hmgr、Dxs基因表达量均高于对照青蒿植株，说明三个目的基因Sps、Hmgr、Dxs基因不仅整合到阳性生物工程青蒿植株的基因组内，且在阳性生物工程青蒿植株体内转录水平得到有效表达。

实施例5、阳性生物工程青蒿植株花蕾青蒿素含量HPLC测定

5.1青蒿素含量测定采用仪器“普析通用”高效液相色谱仪(P680A四元低压梯度泵,PDA2100二极管阵列检测器,TCC2100柱温箱,Chromeleon色谱工作站)。色谱条件：本实验采用的是色谱柱:Dikma Kromasil C18column(10μm,200mm×4.5mm),流动相:甲醇0.01mol/L醋酸钠/醋酸缓冲液(pH＝6.0)(65∶35∶1),流速:0.8ml/min,检测波长:250nm,柱温:32℃。

5.2对照和测试样本溶液的制备：置索氏提取器中,加石油醚(30～60℃)35ml,回流提取5h,取提取液,水浴蒸干,残渣用无水乙醇溶解并定容至10ml量瓶中摇匀,取1mL置10ml量瓶中,加入0.2％氢氧化钠溶液4ml,摇匀。用0.08mol/L醋酸缓冲溶液稀释后待测。

5.3标准曲线的制作

将上述对照(标准青蒿溶液)在对应的HPLC色谱条件下分别进样1μL,3μL,5μL,7μL,9μL,11μL记录下图谱及色谱参数,分别以峰面积(Y)对标准品含量(X,μg)拟合回归曲线。研究发现,本发明中青篙素在5-25μg范围内的线性曲线回归方程为:Y＝1.311e+OOOX+5.01e+000,R＝0.98853446.测定结果如图4所示，生物工程青蒿植株青蒿素含量均高于对照青蒿。

以上实验操作步骤描述了本发明的实施方法，但实施过程中可以有许多等效的修改或者替换。本发明的权利要求以权利要求书的要求为准。

Claims (6)

1.共转化Sps、Hmgr和Dxs基因培育花蕾高青篙素含量青蒿的方法，其特征在于，包括如下步骤：

1)克隆倍半萜烯合酶的基因片段，记为Sps基因片段，并将Sps基因片段构建成Anti-Sps基因植物表达载体；

所述Sps基因片段的DNA序列为SEQ ID NO.1，由PCR扩增得到；

2)克隆3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A还原酶的基因片段，记为Hmgr基因片段，并将Hmgr基因片段构建成Anti-Hmgr基因植物表达载体；

所述Hmgr基因片段的DNA序列为SEQ ID NO.2，由PCR扩增得到；

3)克隆1-脱氧木酮糖5-磷酸合酶的基因片段，记为Dxs基因片段，并将Dxs基因片段构建成Anti-Dxs基因植物表达载体；

所述Dxs基因片段的DNA序列为SEQ ID NO.3，由PCR扩增得到；

4)将利用转基因技术将Anti-Sps、Anti-Hmgr和Anti-Dxs导入青蒿，获得包含Sps、Hmgr基因和Dxs基因的青蒿植株。

2.根据权利要求1所述共转化Sps、Hmgr和Dxs基因培育花蕾高青篙素含量青蒿的方法，其特征在于：所述步骤4)中将Anti-Sps、Anti-Hmgr和Anti-Dxs同时导入同一青蒿，获得包括Sps、Hmgr和Dxs基因片段的转基因青蒿。

3.根据权利要求1所述共转化Sps、Hmgr和Dxs基因培育花蕾高青篙素含量青蒿的方法，其特征在于：所述步骤4)中采用电击法将Anti-Sps、Anti-Hmgr和Anti-Dxs导入同一农杆菌感受态细胞LBA4404，然后采用农杆菌介导法将所述农杆菌感受态细胞LBA4404导入青蒿，构成包含Sps、Hmgr和Dxs基因片段的青蒿植株。

4.根据权利要求1所述共转化Sps、Hmgr和Dxs基因培育花蕾高青篙素含量青蒿的方法，其特征在于：所述步骤1)中的PCR扩增所用的引物为：Sps上游引物DNA序列为SEQ ID NO.4:Sps下游引物DNA序列为SEQ ID NO.5。

5.根据权利要求1所述共转化Sps、Hmgr和Dxs基因培育花蕾高青篙素含量青蒿的方法，其特征在于：所述步骤2)中的PCR扩增所用的引物为：Hmgr上游引物DNA序列为SEQ IDNO.6:Hmgr下游引物DNA序列为SEQ ID NO.7。

6.根据权利要求1所述共转化Sps、Hmgr和Dxs基因培育花蕾高青篙素含量青蒿的方法，其特征在于：所述步骤3)中的PCR扩增所用的引物为：Dxs上游引物DNA序列为SEQ ID NO.8:Dxs下游引物DNA序列为SEQ ID NO.9。